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NaHCO3胁迫下刚毛柽柳叶片蛋白质差异表达谱的建立

索慧英 刘静 曲冠证 郑密 李莹

引用本文:
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NaHCO3胁迫下刚毛柽柳叶片蛋白质差异表达谱的建立

    作者简介: 索慧英。主要研究方向:林木种质创新与利用。Email: 654706452@qq.com 地址:150040黑龙江省哈尔滨市香坊区和兴路51号东北林业大学科技楼.
    通讯作者: 李莹,讲师。主要研究方向:林木种质创新与利用。Email: xlbtdl@163.com 地址:同上
  • 基金项目:

    东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室创新项目 2013B08

    国家自然科学基金项目 31300554

  • 中图分类号: S718.43;S793.9;Q816

Establishment of protein differential expression map of Tamarix hispida leaves under NaHCO3 stress

图(7)表(3)
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出版历程
  • 收稿日期:  2018-06-20
  • 录用日期:  2018-07-21
  • 刊出日期:  2018-09-01

NaHCO3胁迫下刚毛柽柳叶片蛋白质差异表达谱的建立

    通讯作者: 李莹, xlbtdl@163.com
    作者简介: 索慧英。主要研究方向:林木种质创新与利用。Email: 654706452@qq.com 地址:150040黑龙江省哈尔滨市香坊区和兴路51号东北林业大学科技楼
  • 1. 东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室,黑龙江 哈尔滨 150040
  • 2. 天津大学生命科学学院,天津 300100
基金项目:  东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室创新项目 2013B08国家自然科学基金项目 31300554

摘要: 目的为了研究刚毛柽柳响应盐胁迫的作用机制, 本研究以刚毛柽柳叶片为材料, 对叶片总蛋白质的提取方法进行优化, 探究出适用于双向电泳的刚毛柽柳叶片总蛋白质的提取方法, 并建立NaHCO3胁迫下刚毛柽柳叶片差异蛋白质的表达谱。方法本研究比较了改良Tris-三氯乙酸, 改良Tris-三氯乙酸+PVP40, 改良Tris-三氯乙酸+丙酮和植物蛋白提取试剂盒法4种提取植物蛋白质的方法提取刚毛柽柳叶片总蛋白质的差异, 并利用蛋白质双向电泳用技术研究NaHCO3胁迫后刚毛柽柳叶片蛋白质表达变化, 建立了盐胁迫下刚毛柽柳叶片差异蛋白表达谱。结果采用改良Tris-三氯乙酸法提取刚毛柽柳叶片蛋白质, 利用该方法可获得高质量的蛋白质样品, 所得到的双向电泳凝胶图谱中蛋白质分离效果好、图谱分辨率高, 通过ImageMaster 2D Platinum 7.0凝胶分析软件对NaHCO3处理0和12 h的双向电泳凝胶图谱进行分析, 获得了25个响应盐胁迫的差异表达蛋白质, 并分析了差异表达蛋白量的变化。结论研究结果表明, 利用改良Tris-三氯乙酸法提取刚毛柽柳叶片蛋白质适用于双向电泳体系, 该方法可以用于对刚毛柽柳叶片蛋白质组学的研究。本研究建立了NaHCO3胁迫下刚毛柽柳叶片差异蛋白质的表达谱, 为进一步分析刚毛柽柳耐盐分子机制奠定了基础。

English Abstract

  • 土壤盐碱化严重影响植物的生长和发育,制约着农林业的可持续发展。研究植物响应盐胁迫的作用机制有利于提高植物的耐盐性和培育抗盐新品种。刚毛柽柳(Tamarix hispida)属柽柳科(Tamaricaceae)柽柳属,具有极强的抗逆能力,如耐干旱,抗盐碱[1],是改造盐碱地的优良树种,也是进行抗盐机理研究的理想植物。目前,人们已经利用基因芯片技术鉴定出NaHCO3胁迫下柽柳叶及嫩茎的差异表达的基因[2],运用表达序列标签技术鉴定出刚毛柽柳根部响应盐胁迫的基因[3],并通过基因克隆技术对刚毛柽柳中的ThDREB基因[4]ThZFP1基因[5]ThSAMDC基因[6]的抗逆能力进行分析,初步了解了柽柳响应盐胁迫的生理代谢机制。然而,利用蛋白质组学对柽柳盐胁迫相关蛋白的研究相对较少。各种生物功能,生命现象和生理活动往往都是通过蛋白质来实现的。研究表明基因表达在转录水平上的表达变化常与蛋白质水平上的变化不一致[7-8],因此研究柽柳蛋白质组的变化对于揭示柽柳盐胁迫应答分子机制是非常重要的。

    双向电泳(two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis,2-DE)技术是蛋白质组学研究的核心技术之一[9],根据蛋白质的等电点和分子量的不同将蛋白质进行分离[10]。双向电泳技术通常与质谱技术联用,具有灵敏、准确、可重复性高的特点,在植物生理学研究[11-12]、人类疾病研究[13-14]、以及微生物学研究[15-16]等领域已有广泛应用。双向电泳技术包括蛋白样品的制备、等电聚焦、聚丙烯酰胺凝胶电泳、凝胶染色及图像的获取与分析等步骤。蛋白样品的制备是双向电泳研究的基础,蛋白样品的质量直接影响双向电泳图谱的分辨率及后期蛋白质的鉴定。由于植物叶片中含有较多的多糖、酚类、色素以及其他次级代谢产物,这些因素都会影响双向电泳中蛋白点的分离[17],因此找到适用于双向电泳的植物叶片蛋白质的提取方法,获得高质量的蛋白质样品是进行植物叶片蛋白质组学研究的前提和基础。

    本研究以刚毛柽柳叶片为材料,探究出了适用于双向电泳的刚毛柽柳叶片总蛋白质的提取方法,并建立了NaHCO3胁迫下刚毛柽柳叶片差异蛋白质的表达谱,获得了25个响应盐胁迫的差异表达蛋白质。该研究结果不仅为刚毛柽柳叶片蛋白质组学的研究奠定了基础,也为进一步研究刚毛柽柳盐胁迫相关蛋白的功能提供基础数据。

    • 本实验以在东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室的温室内种植的刚毛柽柳为材料。刚毛柽柳种子种植培养6个月后,用0.3 mol/L NaHCO3进行盐胁迫处理12 h,分别取50株长势相同的对照和盐处理12 h的叶片,快速用液氮进行处理并放到-80 ℃的冰箱中备用。

    • 植物叶片总蛋白质的提取方法分别为改良Tris-三氯乙酸(Tris-TCA),改良Tris-三氯乙酸+PVP40(Tris-TCA+PVP40),改良Tris-三氯乙酸+丙酮(Tris-TCA+丙酮)和植物蛋白提取试剂盒法。

      其中改良Tris-TCA法为:称取-80 ℃冰箱中保存的植物叶片1 g,在研钵中加液氮进行研磨,将粉末转入到预冷的离心管中,并加入2 mL植物蛋白裂解液(40 mmol/L Tris-HCl (pH7.5),137 mmol/L NaCl,1% Triton X-100,10% Glycerol,1 mol/L DTT,2 mmol/L EDTA,50 mmol/L β-glycerophosphate,0.5 mmol/L benzamidine)。用超声波细胞破碎仪进行样品处理5 min(φ2,25 ℃,3/9 sec)后,再将样品放入低温高速离心机,4 ℃,12 000 g,离心20 min。离心后去除沉淀,留取上清。在上清液中加入5倍体积的冷丙酮溶液(含10%三氯乙酸,0.07% β-巯基乙醇),混匀,在-80 ℃保存1 h。4 ℃,12 000 g,离心20 min,弃除上清液。使用冷丙酮溶液(含0.07% β-巯基乙醇)洗涤沉淀,反复清洗3次。将沉淀置于真空干燥机中干燥5 min后,使用500 μL双向电泳裂解液(2 mol/L硫脲,7 mol/L尿素,4% CHAPS,1% DTT)溶解蛋白。最后将蛋白样品放入液氮中速冻,放入-80 ℃冰箱中保存。

      改良Tris-TCA+PVP40法:取-80 ℃冰箱保存的植物叶片1 g,在研钵中加液氮研磨时按照叶片质量的50%加入0.5 g PVP40,将粉末转入到预冷的离心管中,并加入2 mL植物蛋白裂解液。后续操作参照Tris-TCA法。

      改良Tris-TCA+丙酮法:称取-80 ℃冰箱保存的植物叶片1 g,在研钵中加液氮进行研磨,将粉末转入到预冷的离心管中,并加入2 mL冷丙酮,震荡混匀。4 ℃,12 000 g,离心20 min,弃上清。将沉淀真空干燥5 min,加入2 mL植物蛋白裂解液。后续操作参照Tris-TCA法。

      植物蛋白提取试剂盒(美国,Invent Biotechnologies)法:植物蛋白提取试剂盒由蛋白提取缓冲液和离心管柱及2.0 mL接收管组成,蛋白提取缓冲液的作用参照植物蛋白提取试剂盒说明书。称取-80 ℃冰箱中保存的植物叶片200 mg,剪碎,放入预冷的离心柱中,将离心柱放入离心管内并加入少量研磨粉研磨数次,加入100 μL蛋白提取缓冲液研磨50~60次,再加入100 μL蛋白提取缓冲液搅匀,4 ℃孵育10 min,放入低温高速离心机4 ℃,12 000 g,离心3 min,取上清,-80 ℃冰箱保存。

    • 准确的蛋白质定量分析能够保证蛋白的上样量是相同的。在重复性实验或在比较性实验中,保证结果分析更加的可靠。本实验采用Bradford法进行蛋白浓度测定[18]

    • 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)根据蛋白质分子量对其进行分离,可用于测定蛋白质的分子量,初步了解蛋白的降解情况以及蛋白的表达情况,也可用于检测蛋白的纯度。

      取蛋白样品15 μg,用5倍的电泳上样缓冲液处理蛋白样品,99 ℃煮沸5 min,在12%的聚丙烯酰胺凝胶中电泳。电泳条件:浓缩胶15 mA,45 min;分离胶15 mA直至溴酚蓝到达胶底部。

    • 蛋白质组学研究的前提是对蛋白样品进行很好的分离。目前,分离蛋白质样品最基本的方法是双向电泳技术。第一向等电点聚焦(IEF)采用24 cm,pH 3~10的线性IPG胶条,加入IEF上样缓冲液(9.8 mol/L Urea,2% CHAPS,2% IPG buffer,0.002% BPB)至总体积为450 μL进行等电聚焦。将混匀的蛋白样品加入水化槽中,缓慢放入胶条并在胶条上滴加1~2 mL的矿物油,盖上水化槽的盖子,并将水化槽置于等点聚焦电泳仪中。整个聚焦过程在20 ℃下进行。每根胶条的限制电流为50 μA,等电聚焦参数设置如表 1所示。

      表 1  等电聚焦程序

      Table 1.  Program of isoelectric focusing electrophoresis

      步骤Steps 电压Voltage/V 升压模式Boosting mode 时间Time/h
      Step1 50 快速Rapid 24
      Step2 500 快速Rapid 5
      Step3 1 000 线性Linear 1
      Step4 8 000 线性Linear 3
      Step5 8 000 快速Rapid 3.75
      Step6 10 000 线性Linear 3
      Step7 10 000 快速Rapid 2.75

      等电聚焦结束后立即进行胶条平衡。平衡分两步,每次40 min,平衡液Ⅰ:6 mol/L Urea,2% SDS,75 mmol/L Tris-HCl (pH8.8),30% Glycerol,1% DTT。平衡液Ⅱ:6 mol/L Urea,2% SDS,75 mmol/L Tris-HCl (pH8.8),30% Glycerol,2.5%碘乙酰胺。平衡结束后,将平衡好的胶条放置于浓度为12%聚丙烯酰胺凝胶上,并用1%的琼脂糖固定胶条,进行第二向电泳。电泳条件:1 W,30 min;13 W至凝胶中的指示剂到达距凝胶底部1 cm处,将凝胶取出,对其进行银染染色。

    • 银染法的灵敏度比考马斯亮蓝染色法高将近100倍,能够呈现低于2 ng的蛋白质点,大大降低了蛋白质组学分析所需要的蛋白质量,对低丰度蛋白的鉴定更加有利。

      将凝胶放入盛有固定液(40%乙醇,10%冰醋酸)的染色盒中,置于摇床上固定30 min。弃除固定液,加入致敏液(0.2%无水乙酸钠,30%乙醇,0.125%戊二醛,6.8%硫代硫酸钠),致敏30 min。弃除致敏液,用去离子水洗涤3次,每次清洗10 min。弃除去离子水,加入银染液(0.015%甲醛,0.25%硝酸银),染色20 min。弃除银染液,使用去离子水清洗2次,每次1 min。弃除去离子水,再加入显色液(2.5%碳酸钠,0.007 5%甲醛)进行显色,观察蛋白点或蛋白条带显色清晰时便可弃除显色液加入终止液(14.6% EDTA-Na2·2H2O),终止时间为5 min。

    • 银染后的凝胶通过ImageScanner扫描仪(GE)获取图像,分辨率设定为300 dpi。使用ImageMaster 2D Platinum 7.0凝胶分析软件对凝胶图像进行差异分析。

    • 采用SPSS(Statistical Program for Social Sciences)19.0数据分析软件对4种蛋白提取方法提取的刚毛柽柳叶片蛋白质的总量进行方差分析与差异显著性分析。

    • 严冬等人[19]比较了3种植物叶片蛋白质的提取方法,Tris-三氯乙酸法适用于杨树叶片蛋白质双向电泳,本研究在此基础上对适用于双向电泳的刚毛柽柳叶片蛋白质的提取方法进行优化。采用改良Tris-TCA,改良Tris-TCA+PVP40,改良Tris-TCA+丙酮和植物蛋白提取试剂盒法对刚毛柽柳叶片总蛋白质进行提取,每种蛋白提取方法分别进行3次生物学重复,利用Bradford法对所得样品进行了蛋白质浓度测定,通过对提取的蛋白质总量的计算,得出每种方法提取的蛋白质总量的平均值(表 2)。结果表明:采用改良Tris-TCA法,改良Tris-TCA+PVP40法和植物蛋白提取试剂盒法所提取的蛋白质总量可达到3 000 μg以上,其中采用植物蛋白提取试剂盒法所提取的蛋白质总量最多。利用改良Tris-TCA+丙酮法所提取的蛋白质总量为2 202 μg,提取的蛋白质的总量最少,可见在蛋白提取之前使用丙酮清洗叶片会导致蛋白质的损失。

      表 2  4种蛋白质提取方法所提取的刚毛柽柳叶片蛋白质质量浓度及总量

      Table 2.  Protein concentration and total amount of Tamarix hispida leaves by four extracting methods

      提取方法Extracting method 质量浓度Mass concentration/(μg·μL-1) 体积Volume/μL 总量Totalamount/μg
      改良Tris-三氯乙酸法Improved Tris/TCA method 5.50 600 3 300
      改良Tris-三氯乙酸+PVP40法Improved Tris/TCA/PVP40 method 5.25 600 3 150
      改良Tris-三氯乙酸+丙酮法Improved Tris/TCA/Acetone method 3.67 600 2 202
      植物蛋白提取试剂盒法Plant protein extraction kit method 5.83 600 3 498

      利用SPSS 19.0数据处理软件对改良Tris-TCA法、改良Tris-TCA+PVP40法和植物蛋白提取试剂盒法所提取的蛋白质总量与改良Tris-TCA+丙酮法所提取的蛋白质总量进行差异显著性分析(图 1)。结果表明,改良Tris-TCA+丙酮法所提取的蛋白质总量与其他3种蛋白提取方法提取的蛋白质总量差异达极显著水平(P < 0.01)。以上结果说明:改良Tris-TCA,改良Tris-TCA+PVP40和植物蛋白提取试剂盒法从等量的刚毛柽柳叶片中获得蛋白质总量更多,更适用于刚毛柽柳叶片总蛋白质的提取。

      图  1  4种蛋白质提取方法所提取的刚毛柽柳叶片蛋白质总量

      Figure 1.  Total protein amount of Tamarix hispida leaves by four extracting methods

    • 利用SDS-PAGE凝胶电泳对改良Tris-TCA,改良Tris-TCA+PVP40和植物蛋白提取试剂盒法提取的刚毛柽柳叶片蛋白质的质量进行比较分析。结果如图 2所示,利用改良Tris-TCA和植物蛋白提取试剂盒所得到的蛋白样品蛋白条带丰富清晰,蛋白分布比较均匀。利用改良Tris-TCA+PVP40法提取的蛋白条带模糊,发生了严重的降解。实验结果表明:采用改良Tris-TCA和植物蛋白提取试剂盒法可以获得质量较好的刚毛柽柳叶片总蛋白质。

      图  2  刚毛柽柳叶片总蛋白质的SDS

      Figure 2.  SDS-PAGE gel electrophoresis of total protein from Tamarix hispida leaves

    • 利用双向凝胶电泳技术对改良Tris-TCA和植物蛋白提取试剂盒法提取的刚毛柽柳叶片蛋白质进一步比较分析。图 3所示,改良Tris-TCA法所提取蛋白质的2-DE图谱分辨率较高,蛋白质分离效果较好,使用ImageMaster 2D Platinum 7.0软件对2-DE图谱进行分析,可检测到616个蛋白质,高分子量的蛋白与等电点偏酸性的蛋白聚焦效果较好。植物蛋白提取试剂盒法所提取蛋白聚焦效果不好,存在严重的水平拖尾现象,可检测到228个蛋白质。实验结果表明:改良Tris-TCA法更加适用于刚毛柽柳叶片的双向电泳蛋白样品的制备。

      图  3  刚毛柽柳叶片总蛋白质的SDS-PAGE凝胶电泳图

      Figure 3.  SDS-PAGE gel electrophoresis of total protein from Tamarix hispida leaves

    • 用0.3 mol/L NaHCO3处理柽柳0和12 h,利用改良Tris-TCA法提取刚毛柽柳叶片总蛋白质,SDS-PAGE凝胶电泳图如图 4所示。盐处理12 h的蛋白样品中共检测到5个蛋白条带发生了变化,蛋白条带1表达量增加,蛋白条带2、3、4、5表达量降低,故进一步通过双向电泳技术建立盐胁迫下刚毛柽柳叶片总蛋白质差异表达谱。

      图  4  盐胁迫下刚毛柽柳叶片差异蛋白SDS-PAGE电泳图

      Figure 4.  SDS-PAGE electrophoresis analysis of differential proteins from Tamarix hispida leaves under salt stress

    • 将0和12 h盐处理的蛋白样品进行双向电泳和银染染色,每个样品进行3次重复。图 5所示,a~c是盐处理0 h 3次重复的蛋白双向电泳图谱,d~f是盐处理12 h 3次重复的蛋白双向电泳图谱。使用ImageMaster 2D Platinum 7.0凝胶分析软件对a~f图中的凝胶图像进行差异分析,通过软件自动匹配及数据分析,当选择蛋白的差异变化倍数大于1.5倍,显著性小于0.05时,盐胁迫条件下共有25个蛋白表达量发生了变化(图 6),其中有2个上调表达蛋白,有23个下调表达蛋白。对差异蛋白的等电点、分子量和表达量的变化进行分析, 由表 3可知差异表达的蛋白等电点在4~9之间,相对分子质量在15~70 kDa之间。分析25个差异蛋白的表达量的变化,有13个蛋白的变化倍数在1.5~2倍之间,其中有2个上调表达蛋白和11个下调表达蛋白。有7个蛋白的变化倍数在2~3之间,都是下调表达蛋白。有5个蛋白的变化倍数大于3倍,都是下调表达蛋白。由差异表达蛋白质表达量的三维图谱(图 7)可知差异表达蛋白质表达量的变化趋势。

      图  5  盐处理不同时间的刚毛柽柳叶片总蛋白质的2-DE图谱

      Figure 5.  2-DE maps of total proteins extracted from the leaves of Tamarix hispida treated with salt

      图  6  NaHCO3胁迫下刚毛柽柳叶片差异表达蛋白质的相对表达水平变化

      Figure 6.  Variety of relative expression level of differentially expressed proteins from Tamarix hispida leaves under NaHCO3 stress

      表 3  NaHCO3胁迫下刚毛柽柳叶片差异表达蛋白信息列表

      Table 3.  Information list of differentially expressed proteins from Tamarix hispida leaves under NaHCO3 stress

      蛋白序号Protein No. 等电点(分子量)pI(M.W./kDa) 差异倍数Times of differential expression
      17 5.78(15.04) 1.68
      26 9.03(22.39) 1.96
      28 7.34(24.78) -1.99
      37 6.45(25.00) -2.16
      59 5.08(30.00) -1.66
      73 5.70(35.89) -1.51
      80 5.87(36.34) -4.07
      92 5.37(38.13) -1.73
      135 4.47(19.35) -2.06
      137 4.50(20.65) -1.83
      144 5.53(23.48) -2.52
      152 5.56(26.67) -1.70
      159 5.27(28.00) -1.72
      164 4.93(30.33) -3.32
      167 4.76(31.33) -2.52
      170 4.93(31.67) -5.05
      171 5.66(32.33) -1.93
      174 5.22(32.00) -2.39
      182 4.86(36.56) -1.91
      188 4.98(37.01) -1.69
      189 5.51(36.79) -3.17
      218 5.22(39.24) -2.18
      230 6.33(39.91) -2.43
      233 4.98(41.88) -5.84
      289 5.17(71.58) -1.61

      图  7  NaHCO3胁迫下刚毛柽柳叶片差异表达蛋白质表达量的三维图谱

      Figure 7.  3D maps of differentially expressed proteins from Tamarix hispida leaves under NaHCO3 stress

    • 目前,蛋白质组学技术在烟草(Nicotiana tabacum)[20]、拟南芥(Arabidopsis thaliana)[21]、水稻(Oryza sativa)[22]、大豆(Glycine max)[23]等植物的研究中已进行了广泛应用,在推动植物学的发展中起到了重要作用。建立在双向电泳基础上的差异蛋白质组学研究的前提是获得高质量的蛋白质样品,从双向电泳的图谱中获得更多的蛋白质的信息,以便进行后续的检测与分析。因此找到适用于双向电泳的蛋白质的提取方法对于蛋白质组学的研究是非常重要的。

      刚毛柽柳叶片中的多糖、酚类等干扰物质会影响蛋白质的提取、分离和鉴定,从而使刚毛柽柳叶片双向电泳技术和蛋白质组学的研究受到很大的限制。因此,应根据不同的物种、不同的研究目的选择合适的蛋白质提取方法,以获得高分辨率的电泳图谱[24]。本研究拟通过加入PVP40和丙酮去除刚毛柽柳叶片中的色素、酚类等物质,结果表明加入PVP40和丙酮导致蛋白质发生降解且获得的蛋白质的总量较低。本研究探究出的改良Tris-TCA法可获得高质量的蛋白样品,并得到分辨率高、蛋白质的个数较多的双向电泳图谱,此方法适用于刚毛柽柳叶片蛋白质组学的研究,并为其他木本植物叶片蛋白质的提取提供参考资料。

      探索植物逆境应答的网络调控机制已成为当前的研究热点之一[25]。目前,对于柽柳响应盐胁迫基因的表达已有研究,如用0.4 mol/L的NaHCO3溶液对柽柳进行胁迫处理,柽柳响应NaHCO3胁迫的转录组数据表明,与光合作用相关的铁氧化还原蛋白(ferredox-in)基因、金属代谢相关的金属硫蛋白(Metallo-thionein protein)基因、清除活性氧的GST(glutathione S-transferase)基因、代谢相关的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(fructose-1,6-bi-sphosphate aldolase)基因等都呈现出显著上调表达的结果[2]。这些研究初步构建了植物应答盐胁迫的网络框架。但是,由于在蛋白质翻译过程中存在mRNA的可变剪切与蛋白质的翻译后修饰等过程,细胞中mRNA的表达水平与蛋白质的表达水平并不完全一致,因此,研究蛋白质表达的变化对于揭示植物响应盐胁迫的作用机制是非常必要的[26-27]。刚毛柽柳叶片响应盐胁迫的作用机制还有待深入研究,从蛋白质水平上进一步分析刚毛柽柳叶片响应盐胁迫的分子机制,需要对差异表达的蛋白质进行功能分析,阐明这些差异蛋白质参与的代谢途径。本研究建立的NaHCO3胁迫下刚毛柽柳叶片差异蛋白质的表达谱为深入研究刚毛柽柳叶片响应盐胁迫的分子调控网络奠定了基础。

参考文献 (27)

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