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高温诱导大孢子染色体加倍选育毛白杨杂种三倍体

耿喜宁 任勇谕 韩志强 杜康 康向阳

引用本文:
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高温诱导大孢子染色体加倍选育毛白杨杂种三倍体

    作者简介: 耿喜宁,博士生。主要研究方向:林木倍性育种。Email:gengxn@bjfu.edu.cn   地址:100083 北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院.
    通讯作者: 康向阳,教授,博士生导师。主要研究方向:林木倍性育种与细胞遗传学。Email:kangxy@bjfu.edu.cn   地址:同上
  • 基金项目:

    “十三五”国家重点研发计划项目 2016YFD0600403

  • 中图分类号: S792.117

Production of hybrid triploids via inducing chromosome doubling of megaspore with high temperature treatment in Leuce poplar

图(3)表(3)
计量
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出版历程
  • 收稿日期:  2018-07-02
  • 录用日期:  2018-08-19
  • 刊出日期:  2018-11-01

高温诱导大孢子染色体加倍选育毛白杨杂种三倍体

    通讯作者: 康向阳, kangxy@bjfu.edu.cn
    作者简介: 耿喜宁,博士生。主要研究方向:林木倍性育种。Email:gengxn@bjfu.edu.cn   地址:100083 北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院
  • 北京林木分子设计育种高精尖创新中心,林木育种国家工程实验室,林木花卉遗传育种教育部重点实验室,北京林业大学生物科学与技术学院,北京 100083
基金项目:  “十三五”国家重点研发计划项目 2016YFD0600403

摘要: 目的鉴于杨树三倍体具有突出的营养生长优势,针对毛白杨良种选育中母本效应难以充分利用问题,选择毛白杨育性好的雌株诱导大孢子染色体加倍选育白杨杂种三倍体,为毛白杨三倍体育种提供技术支撑。方法本研究以毛白杨无性系MC1和MC2为母本,银腺杨YX1为父本。根据白杨大小孢子发生发育存在相关性的原理,以雄株小孢子发育进程为即时判别大孢子发生进程的参照,当小孢子发育至单核早期、单核靠边期和双核期时,分别施加38、40和42 ℃高温持续处理雌花序4 h。结果两个杂交组合的处理组共得到189株毛白杨杂种三倍体,其中MC1×YX1组合中共获得70株杂种三倍体,平均诱导率为56.45%;MC2×YX1组合中共获得119株杂种三倍体,平均诱导率为47.04%,对照组未获得杂种三倍体。当小孢子发育至单核靠边期,对应大孢子母细胞减数分裂至粗线期至中期Ⅰ,此时施加38和40 ℃高温处理4 h是毛白杨大孢子染色体加倍的最佳处理时期。两个杂交组合的杂种三倍体在平均苗高和地径生长方面均优于二倍体,但组合间存在一定差异,表明三倍体育种同样需要重视亲本选配。结论研究进一步证明高温诱导大孢子染色体加倍是一种高效获得毛白杨杂种三倍体的技术途径,相关技术进步对于推进毛白杨良种选育进程具有重要的意义。

English Abstract

  • 毛白杨(Populus tomentosa)作为我国特有的乡土树种,具有生长迅速,材质优良,适应性强的特点,一直以来是黄河流域及华北平原地区用材林、农田防护林和城乡绿化的主要栽培树种之一[1]

    毛白杨杂交育种始于20世纪40年代,叶培忠在甘肃天水进行了以毛白杨为父本的杂交试验[2]。此后,一系列以毛白杨为母本的杂交试验,受限于毛白杨配子和幼胚败育严重[3],杂交效果均不理想,进而提出了以毛白杨杂种为父本,以毛新杨(P. tomentosa×P. bolleana)雌株为母本进行回交和双杂交的育种策略,并选育出毛新杨×银灰杨(P. canescens)等优良无性系[3-4]。20世纪80年代,朱之悌等[5]利用毛白杨天然2n花粉与毛新杨、银腺杨(P. alba × P. glandulosa)授粉杂交,选育出多个速生、材优的异源三倍体。此后大多都以毛新杨等白杨杂种为父本,理化处理雄花枝诱导花粉染色体加倍,与单倍性雌配子杂交选育三倍体;或者以毛新杨为母本,理化处理雌花枝诱导大孢子和胚囊染色体加倍,再授以单倍性花粉,杂交选育三倍体[6-12]。仅有康宁在选择育性好的毛白杨雌株基础上,通过高温诱导胚囊染色体加倍,获得了一批白杨杂种三倍体[13]。迄今尚未见有关诱导毛白杨大孢子染色体加倍获得多倍体的研究报道。

    由于杨树大孢子发生过程处于子房包裹的胚珠组织内部,使得在人工诱导大孢子染色体加倍时,无法对有效处理时期进行即时观察,因此,解决有关大孢子母细胞减数分裂进程的即时判别,是大孢子染色体加倍途径选育三倍体杨树的技术关键[14]。白杨派树种银腺杨雌雄花序发育进程的时序性具有相关性,即当白杨小孢子母细胞减数分裂至四分体时,大孢子母细胞开始进入减数分裂细线期; 而当小孢子发育至单核靠边期时,大孢子母细胞减数分裂达到粗线期, 并以小孢子母细胞减数分裂为参照判别雌配子发育进程,相对准确地解决了大孢子染色体加倍有效处理时期的即时判别[12]。毛白杨大孢子发生与小孢子发育进程也同样存在相似的相关性[15],即当毛白杨小孢子母细胞减数分裂至四分体时,大孢子母细胞开始进入减数分裂细线期; 当小孢子发育至单核早期时,大孢子母细胞减数分裂达到细线期;当小孢子发育至单核靠边期时,大孢子母细胞减数分裂达到粗线期-中期Ⅰ;当小孢子发育至双核期时,大孢子母细胞减数分裂达到中期Ⅰ。这些研究为开展毛白杨大孢子染色体加倍有效时期的判别奠定了一定的基础。

    本研究在实验室前期研究的基础上[16],选择育性较好的毛白杨优良雌株无性系MC1和MC2为母本,以银腺杨雄株YX1为父本,根据毛白杨大小孢子发生发育存在相关性的原理,以雄株小孢子发育进程为即时判别大孢子发生进程的参照,开展高温诱导毛白杨大孢子染色体加倍技术研究,为毛白杨良种选育提供技术支撑。

    • 以毛白杨基因库结实率较高的毛白杨无性系MC1(2n=2X=38)、MC2(2n=2X=38)为母本,银腺杨雄株无性系YX1(2n=2X=38)为父本,以同种源同栽培环境下毛白杨雄株无性系MX1、MX2为参照(以下称参照雄株)。于2016年2月上旬于山东冠县苗圃毛白杨种质资源库内采集雌雄花枝,置于温室内(10~25 ℃)切枝水培。

    • 当同水培条件下参照雄株MX1、MX2的小孢子母细胞发育至单核小孢子早期、单核靠边期和双核期时,利用恒温培养箱,分别对各母本MC1、MC2雌花枝施加38、40、42 ℃的高温处理,处理时长为4 h,每处理8~20个花序。在处理的同时,选取与处理组发育进度一致的10个左右花序标记为对照组。处理结束后,继续置于温室内水培,并适时用YX1花粉授粉,收集处理组以及未经高温处理的对照组种子进行播种育苗。

    • 参考前人的方法[17],利用流式细胞仪检测子代植株倍性。取一小片子代植株幼嫩叶片,加入1 mL冷藏的细胞核分离缓冲液(0.2 mol/L Tris-HCl,45 mmol/L MgCl2,30 mmol/L柠檬酸钠,20 mmol/L 4-磺酸丙基吗啉,1% Triton X-100,pH=7.0),用刀片迅速剁成碎片。包含细胞核的分离缓冲液经40 μm孔径纱网过滤至1.5 mL的离心管中,向滤液中加入100 μL质量浓度为10 μg/mL的DAPI(4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)溶液,震荡离心管使溶液混合均匀。使用PARTEC公司生产的流式细胞仪进行细胞核DNA含量分析(图 1)。

      图  1  毛白杨×银腺杨杂种三倍体倍性鉴定

      Figure 1.  Ploidy identification of P. tomentosa×(P. alba × P. glandulosa) hybrid triploids

    • 小孢子母细胞减数分裂及小孢子发育进程临时观察采用醋酸洋红染色压片法,以占优势比例的发育时期作为该阶段标志性时期。利用OLYMPUS BX61进行显微拍照。

    • 收集种子于温室内点播于盆中,幼苗出现4~6片真叶后移入营养杯,置于室外遮阴网下常规管理,幼苗长至15 cm高后移入大田。待冬季苗木落叶,树体封顶后,利用游标卡尺和卷尺对相同生长条件下的一年生三倍体和二倍体实生苗进行苗高和地径的调查,对两个杂交组合所获得的二、三倍体的苗高和地径数据使用SPSS 20软件进行数据处理和独立样本t检验统计分析,并利用origin 2018软件进行相关绘图分析。

    • 青杨派树种高温有效诱导时期在大孢子母细胞减数分裂的双线期至终变期[18],而在白杨派树种-响叶杨(P. adenopoda)中,高温有效诱导时期在粗线期至终变期[19]。以此,推测毛白杨的有效诱导时期也在粗线期-终变期,以毛白杨大小孢子母细胞减数分裂进程相关性为基础[15],利用醋酸洋红制片法进行显微观察,毛白杨参照雄株无性系小孢子发育进程结果如图 2所示。当参照雄株小孢子发育至单核小孢子早期、单核靠边期和双核期时,分别对应大孢子母细胞进入减数分裂的细线期、粗线期-中期Ⅰ、中期Ⅰ。

      图  2  毛白杨参照雄株MX1、MX2小孢子发育阶段显微观察

      Figure 2.  Microscopical observation on the microspore development stage of reference male MX1 and MX2 of P. tomentosa

      针对大孢子母细胞减数分裂至细线期-中期Ⅰ时对花芽施加高温处理,即小孢子发生发育至单核期、单核靠边期和中期Ⅰ时,分别施加38、40、42 ℃高温处理,处理时长为4 h。以未处理雌花芽为对照,两母本毛白杨无性系MC1和MC2分别授以银腺杨YX1花粉,两个杂交组合处理组共收集种子4 271粒种子,成苗数377株,对照组未处理组合总获得1 567粒种子,成苗数共计78株,结果分别见表 1表 2

      表 1  高温诱导大孢子染色体加倍获得毛白杨MC1×YX1三倍体

      Table 1.  Triploid P. tomentosa MC1× (P. alba×P. glandulosa) YX1 produced by inducing the chromosome doubling of megaspore with high temperature treatment

      小孢子发育状态
      Microspore development status
      处理温度Treatment temperature/℃处理时长Treatment duration/h种子粒数Seed amount成苗株数Seedling amount三倍体株数Triploid amount三倍体得率Triploid yieldrate/%
      小孢子单核早期
      Early stage of single nucleus
      384819778.78
      4038100
      42143181583.33
      单核靠边期
      Late uninucleate stage
      38465922100
      40758864552.33
      420000
      双核期
      Binucleate stage
      38496000
      40281400
      42934125.00
      对照Control8236700
      合计Total2 97219170

      表 2  高温诱导大孢子染色体加倍获得MC2×YX1三倍体

      Table 2.  Triploid P. tomentosa MC2×(P. alba × P. glandulosa) YX1 produced by inducing the chromosome doubling of megaspore with high temperature treatment

      小孢子发育状态Microspore development status处理温度Treatment temperature/℃处理时长Treatment duration/h种子粒数Seed amount成苗株数Seedling amount三倍体株数Triploid amount三倍体得率Triploid yieldrate/%
      小孢子单核早期Early stage of single nucleus3845212866.67
      405833100
      42501111100
      单核靠边期Late uninucleate stage384573604473.33
      40571734054.79
      4257141178.57
      双核期Binucleate stage3844566123.28
      402031900
      42102000
      对照Control7441100
      合计Total2 866264119

      表 1可知,在参照雄株小孢子不同发育状态下,对毛白杨无性系MC1雌花枝施加高温处理后,三倍体得率不尽相同。当小孢子发育至单核早期时,毛白杨MC1雌花枝经38和42 ℃处理4 h,获得了较高的三倍体得率,分别达到了78.78%和83.33%;但此时施加高温处理得到的子代数量相对较少,仅获得224粒种子,平均每序11.8粒种子,成苗数分别为9株和18株。当小孢子发育至单核靠边期时,对毛白杨MC1雌花枝施加38和40 ℃处理4 h,获得了较多的种子,其中38 ℃处理仅成苗2株,三倍体诱导率达100%;而施加40 ℃高温处理4 h中得到的子代数量较多,达到86株,其中三倍体45株,诱导率达52.33%。当小孢子发育至双核小孢子时,毛白杨MC1雌花枝经高温处理获得的三倍体得率明显降低,尽管获得470粒种子,成苗8株,但只检出1株三倍体。因此,当参照雄株小孢子发育至小孢子单核靠边期,施加40 ℃高温4 h处理毛白杨无性系MC1大孢子染色体加倍的诱导效果最好。

      在MC2×YX1杂交组合中,三倍体得率随小孢子发育状态的改变而改变(表 2)。当小孢子发育至单核早期时,对雌花枝施加42 ℃高温处理4 h,三倍体得率达到最大值(100%),但处理之后得到子代群体数量较小,该诱导率误差较大。当小孢子发育至单核靠边期时,3个处理中成苗数分别为60、73和14株,其中三倍体分别为44、40和11株,其中最大诱导率达78.57%。但在42 ℃时,得到的种子数量和子代数量较少。当参照雄株小孢子发育至双核小孢子期时,三倍体得率明显降低。因此,当参照雄株小孢子发育至小孢子单核靠边期,施加38 ℃高温4 h处理毛白杨无性系MC2大孢子染色体加倍的处理效果最好。

    • 对毛白杨×银腺杨杂交的一年生二、三倍体实生苗苗高和地径进行统计分析(表 3)。其中,就MC1×YX1杂种三倍体后代的苗高和地径生长而言,其变异系数与二倍体相当,平均值分别比二倍体高24.86%、43.13%;而MC2×YX1杂种三倍体后代的苗高和地径在变异系数与二倍体相当的情况下,平均值分别比二倍体高15.78%、26.17%。t检验结果表明,两个杂交组合的三倍体子代在杂交组合内苗高和地径生长上与二倍体相比具有极显著差异(P<0.01)(表 3)。这表明,获得的三倍体在生长速度上明显优于二倍体。

      表 3  毛白杨×银腺杨杂种二三倍体一年生苗木生长状况分析

      Table 3.  Analysis on growth status of 1-year P. tomentosa × (P. alba × P. glandulosa) diploid and triploid seedlings

      项目ItemMC1×YX1MC2×YX1
      苗高Seedling height/cm相对值Relative value/%地径Ground diameter/cm相对值Relative value/%苗高Seedling height/cm相对值Relative value/%地径Ground diameter/cm相对值Relative value/%
      三倍体平均值Triploid average69.17±23.43124.868.86±2.52143.1355.24±16.17115.786.99±1.71126.17
      二倍体平均值Diploid average55.40±17.73100.006.19±1.56100.0047.71±14.34100.005.54±1.60100.00
      三倍体变异系数Triploid coefficient of variation/%33.8728.4429.2724.46
      二倍体变异系数Diploid coefficient of variation/%32.0025.2030.0629.63
      t检验t testt=2.942**t=6.822**t=3.637**t=6.398**
      注:**表示差异极显著(P<0.01)。Note: ** means extremely significant difference (P<0.01).

      在同一杂交组合中,三倍体子代的一年生苗高、地径也不一致,三倍体也并非株株皆优。对MC2×YX1杂交组合二、三倍体子代苗高和地径进行范围归类(图 3),在苗高生长方面,二倍体子代苗高大多数分布于0~30 cm和30~60 cm范围内(85.27%),这两个范围内的比率明显大于三倍体(66.03%),而在苗高生长突出的60~90 cm和90~120 cm范围内,三倍体的比率(33.97%)明显大于二倍体(14.73%),且二倍体不存在苗高生长超过90 cm的苗木,说明二倍体在苗高生长方面总体低于三倍体。地径生长方面,在0.0~0.3 cm和0.3~0.6 cm范围内,二倍体比率(65.12%)远大于三倍体比率(29.67%),而在地径生长突出的0.6~0.9 cm和0.9~1.2 cm范围内,三倍体的比率(70.33%)大于二倍体的比率(34.88%),说明三倍体地径生长总体优于二倍体。综合而言,获得的杂种三倍体相对于杂种二倍体生长优势表现突出。

      图  3  毛白杨MC2×YX1一年生苗木苗高地径对比

      Figure 3.  Comparison diagram of height and diameter of 1-year-old P. tomentosa×(P. alba × P. glandulosa) seedlings

    • 通过诱导2n配子与异性单倍型配子杂交是选育杨树三倍体的重要途径[14]。与利用2n花粉相比,由于利用2n雌配子不存在单倍性配子竞争优势,受精后可100%形成三倍体,因此采用2n雌配子选育三倍体更具诱惑力[20]。然而,由于杨树的雌配子包被在胚珠组织中,对大孢子的发生发育状态的即时观察造成了困难。利用白杨雌雄花芽发育进程的时序相关性,可以相对准确地解决了大孢子染色体加倍的有效处理时期即时判别的问题[12]。李艳华等[12]分别基于此判别方法,采用一定浓度的秋水仙碱溶液适时处理银腺杨雌花枝,三倍体诱导率最高达到16.7%。毛白杨大小孢子发生发育也存在类似的相关性,相关研究为开展毛白杨大孢子染色体加倍提供了基础[15]。本研究以雄株小孢子发育进程为即时判别大孢子发生进程的参照,开展高温诱导毛白杨大孢子染色体加倍技术研究,两个杂交组合处理组中分别得到了124和253株子代,三倍体分别有70和119株,平均诱导率达47.04%~56.45%。

      秋水仙碱广泛应用于植物多倍体育种[14, 21],但化学处理雌雄花芽时,对花芽均具有一定的毒害作用[22]。高温处理虽然对杨树花芽也有一定的伤害,但与化学处理相比,具有操作简单、处理量大、处理条件均匀一致、作用效果直接等优势[14]。本研究中,经过高温处理的花序平均每序种子数仅为20粒左右,远低于对照62粒左右,但高温诱导配子染色体加倍的优势是可一次处理大量的花枝和花芽,可通过加大处理量获得较多数量的三倍体。当然,处理温度不同,诱导效果和获得的子代数量也存在差异[18-19]。在两个参照雄株发育时期相同时,施加相同的温度,两个毛白杨无性系在结实量方面表现出了差异,这与不同基因型对高温的胁迫响应程度不同有关[23]。在本研究中,当参照雄株小孢子发育至单核靠边期时,施加高温38和40 ℃,得到了较多数量的子代和三倍体,在MC1×YX1杂交组合中分别为88和47株、在MC2×YX1中分别为133和84株,其平均三倍体诱导率分别为53.41%、63.16%。而在MC2×YX1杂交组合中42 ℃处理条件下,虽然平均三倍体诱导率较高,达到78.57%,但得到的种子量和三倍体数相对较少。因此诱导毛白杨大孢子染色体加倍的适宜温度应该在38~40 ℃,处理时长4 h。此外,染色体加倍效果与施加诱变剂的适宜时期密切相关[18],毛白杨大孢子染色体加倍也不例外。在本研究中,当小孢子发育至单核靠边期时,两个杂交组合均获得了处理组中最多的三倍体,此时大孢子发生状态在粗线期-中期Ⅰ[15],与之前的高温诱导其他杨树大孢子染色体加倍的有效处理时期相当[18-19],推测此时是高温诱导毛白杨大孢子染色体加倍的有效处理时期。

      三倍体综合杂种优势和倍性优势,在生长表现方面尤其突出[5, 24-26]。在本研究中,毛白杨杂种三倍体一年生苗高、地径等营养生长均极显著优于二倍体(P<0.01),且生长优势达15%以上;而在同一杂交组合中,三倍体一年生苗的苗高、地径也不一致。相关研究结果与诱导银腺杨、‘哲引3号杨’(Populas pseudosimonii×Populus nigra ‘Zheyin3’)大孢子染色体加倍获得的三倍体表现相似[12, 22],表明对于杨树等类似以收获营养体的树种而言,三倍体育种具有巨大应用潜力。而且,三倍体育种与杂交育种同样需要实行“大群体、强选择”育种。此外,两个杂交组合因母本的基因型不同,其三倍体子代表现也不相同,MC1×YX1组合获得的三倍体生长量更大,说明在三倍体选育时育种亲本的选配也具有重要意义[14]

参考文献 (26)

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