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查耳酮合成酶（CHS）是黄酮类生物合成中的关键酶，自从荷兰芹（Petroselinum crispum）中分离出来第1个CHS基因以来，目前已从桂花（Osmanthus fragrans）、葡萄（Vitis vinifera）、向日葵（Helianthus annuus L.）、越橘（Vaccinium spp.）等700多种植物中克隆获得CHS 基因[1−4] 已知查尔酮合酶广泛存在于多种植物中，它在植物的抗菌机制、抗胁迫、细胞的发育和分化、花色素的积累和外源基因的表达等起着重要的作用[5]，因此，CHS基因备受科研工作者的关注。Zhang等在对马铃薯（Solanum tuberosum）块茎基因表达特性研究中证明了CHS等基因在花色苷生物合成中起着重要的作用 [6]。冷胁迫条件下紫甘薯（Ipomoea batatas）可通过提高花色苷含量增强植物清除活性氧自由基的能力 [7]。诸多实验表明：植株通过应激性地合成花色苷以应对干旱、高盐、强光和冷害等非生物胁迫，增强植物的抗逆性 [8]。研究团队先前对富含花色苷的紫雨桦（Betula pendula ‘Purple Rain’）开展NaCl胁迫试验，结果发现紫雨桦的耐盐性高于垂枝桦（Betula pendula）[9]，紫雨桦和垂枝桦转录组分析发现，紫雨桦中BpCHS表达量明显上调[10]，因此本实验以前期获得转BpCHS3基因白桦为试材，开展NaCl胁迫下的耐盐性分析，为探讨BpCHS的耐盐机理提供参考。
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转BpCHS3基因白桦为研究团队保存[11]。
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采用CTAB法提取白桦总RNA，ReverTra qPCR RT Master Mix with gDNA Remover（Toyobo，Japan）试剂盒反转录为cDNA，将cDNA稀释10倍用于qRT-PCR模板，以18SrRNA 为内参基因（表1）。PCR反应体系为：2 × SYBR Green Realtime PCR Master mix 10 μL（Toyobo，Japan）、模板2.5 μL、上游引物和下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL、用去离子水补足体积20 μL。反应程序为：94 ℃ 30 s，94 ℃ 12 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，循环45次，80.0 ℃读板1 s，收集荧光，绘制熔解曲线，温度由55 ℃开始至99 ℃终止。利用DNA Engine Opticon2 实时定量PCR仪（美国MJ Research公司）完成扩增过程。用2− ΔΔCt方法进行基因的相对定量[12]。
引物名称 Primer name 上游引物序列 Forward primer (5′-3′) 下游引物序列 Reverse primer (5′-3′) 18SrRNA ATCTTGGGTTGGGCAGATCG CATTACTCCGATCCCGAAGG BpCHS1 CCGTGGAGGAAATCCGAAAGGCTC CGCTCTTGGTGATCCGGAAGTAATA BpCHS2 ATGGCGTCCGTCGAAGAAATATTTAA TCGTCTTGGTAGATATAGTTGGATGG BpCHS3 GGCATCTCGGACTGGAACTC CACAACGGTCTCGACGGTAA BpF3′H CTTGAACCACCGCAACCTCAC CCTCGTCCTCGACCCGAATT BpCHI GTATTTGGAGGATACCGCCGTGC GCAAGATCATTGTCACCCGTGTG BpDFR1 TGCCGCCTAGTCTTATTACAGCAC GTGAATTGTGGCATCGGCGG BpDFR2 CATTGGCGTCTTCCACGTGGCTAC CGACAGCTGATCCACTGGTAGTGT BpANR1 AAGGATCGACAATTCCACAAGCAGG CGTATAGCTTGTTGGTGCTGGAGAA BpANR2 GGGGGAAGATTGTGATACGGAGGAT GCGAAATCGTAGAGCTTGCTGGTGC BpANR3 CGACGAGCAGGCAAGTGACTTTCTC TCGTAGAGCCTGCCGGTGCTGGAG BpANS TACTACCCGATCTGCCCTCAGC GGAACACATTTCGCCGTCACCC 表 1 荧光定量PCR引物序列
Table 1. Primer sequences for fluorescent quantitative-PCR
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采用CTAB法提取白桦总RNA，PCR DIG Probe Synthesis Kit标记探针（Roche），按分子克隆实验指南进行Northern杂交检测 [13]。
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（1）组培生根苗NaCl胁迫处理。选取CHS3-1、CHS3-2以及WT白桦长势较一致的组培继代苗，分别转接于质量分数为0.30% NaCl的生根培养基中，每个转化株系处理10株，共3次重复，25 d后记录其生根状况并求算盐害指数。
盐害指数（D） = ∑（盐害级数 × 相应盐害级植株数）/（最高盐害级数 × 检测总株树）。盐害分级标准[14]：0级：无盐害症状；1级：轻度盐害，有少部分叶尖、叶缘、叶脉变黄；2级：中度盐害，约1/2的叶尖、叶缘、叶脉变黄；3级：重度盐害，大部分叶尖、叶缘、叶脉变黄；4级：极重度盐害，几乎所有叶尖、叶缘、叶脉变黄，植株死亡。
（2）田间盆栽转基因白桦NaCl胁迫处理。采用组培微繁技术分别扩繁CHS3-1、CHS3-2、CHS3-4、CHS3-6、CHS3-10等5个转基因株系及非转基因对照（WT），2014年6月初将组培生根苗移栽至育苗杯中，2015年早春每个株系选取长势一致的30株移至21 cm × 21 cm花盆中，基质为草炭土∶河沙∶黑土（v/v） = 4∶2∶2，每个花盆中均加入等量上述基质，盆下放置塑料托盘，苗木置于塑料大棚中进行常规管理。2015年8月初进行NaCl胁迫试验[15]。胁迫试验开始前，测量株高，记为基值。随即用0.4%NaCl漫灌，胁迫期间，停止供水，仅每3 d补充500 mL的 0.4%NaCl。
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利用PAM2500叶绿素荧光仪（WALZ，Germany）测定NaCl处理的第0、3、6、9天参试株系的PSⅡ最大光化学效率（Fv/Fm）、PSⅡ实际光化学效率（ΦPSⅡ）、光化学猝灭系数（qP），每个株系选择第4片健康功能叶片进行测定，测定前叶片暗适应20 min，光照强度为500 μmol/m2·s。
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采用LI-6400便携式光合仪（LI-COR，USA）于NaCl处理的第0、3、6、9天测定转基因白桦叶片的净光合速率，每个转化株系测定3株，每株均测定3片健康功能叶。
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根据文献[11]，利用分光光度计对花青素质量分数进行测定。
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分别提取前期获得的15个白桦转化子总DNA，以反转录的cDNA为模板，采用qRT-PCR技术对BpCHS3基因进行检测，结果显示，与WT株系比较15个转基因白桦中BpCHS3均呈现上调表达，但上调幅度不尽相同，其中CHS3-7、CHS3-15株系BpCHS3表达量是WT的150倍；进而选取3个转基因株系进行Northern Blot检测，3个株系均出现杂交信号，而WT株系未呈现杂交信号，结果表明导入的BpCHS3基因在mRNA水平能够表达（图1、2）。
图 1 转BpCHS3白桦qRT-PCR检测
Figure 1. Relative quantification of each transgenic line BpCHS3 gene mRNA expression level
图 2 转BpCHS3基因白桦Northern Blot检测图谱
Figure 2. Northern Blot pattern of 35S :: BpCHS3 from transgenic birch
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根据BpCHS3相对定量结果，选取表达量大于均值的CHS3-1、CHS3-2株系进行组培苗耐盐试验，即将参试株系接种于含0.3% NaCl的WPM生根培养基中培养25 d后，调查生根情况，结果显示，参试的CHS3-1、CHS3-2转基因株系的生根率为100%，在平均主根数量及主根长方面均高于WT株系，盐害指数分别为43%、35%，二者均值低于WT株系的44%（表2）。
株系
Strain平均主根数
Average number of primary roots/article平均主根长
Average main root length/cm生根率
Rooting rate/%盐害指数
Salt damage index/%WT 1.2 0.27 ± 0.02c 40 83 CH3-1 3.2 1.76 ± 0.03a 100 43 CH3-2 2.8 1.66 ± 0.02b 100 35 注：平均主根长表示方式为“平均值 ± 标准差”，同列不同字母表示差异显著（P < 0.05）。 Notes: Data of average main root length were mean ± SE，different lowercases in the same column represente significant differences (P < 0.05). 表 2 NaCl胁迫下转基因白桦生根情况
Table 2. Rooting of transgenic birch under salt stress
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（1）盐胁迫下转基因白桦叶绿体荧光参数时序变化。采用0.4%NaCl对1年生盆栽CH3-1、CH3-2、CH3-4 、CH3-6、CH3-10转基因白桦进行胁迫处理，分别在胁迫的第0、3、6、9天测定PSⅡ最大光能转换效率（Fv/Fm）、实际光化学效率（ΦPSⅡ）及光化学猝灭系数（qP）等叶绿素荧光参数。
逆境胁迫下植物的Fv/Fm参数降低程度越高，说明植物PS II中心的受伤害程度越重。参试株系在胁迫的第6、9天时Fv/Fm参数均呈现下降趋势，尤其在第9天时WT的Fv/Fm降至0.66，超出正常值范围，转基因株系除了CHS3-4外，其余4个转基因株系的Fv /Fm参数仍在正常值内（图3A），说明NaCl胁迫已对WT株系PSII反应中心产生了破坏并影响了光合作用，而对多数转基因株系未产生影响或影响较小。
图 3 盐胁迫下参试株系荧光参数及Pn比较
Figure 3. Comparison of fluorescence parameters and Pn of the tested birch under salt stress
ΦPSII参数可以反映逆境胁迫下植物实际光合能力。NaCl胁迫下5个转基因株系及WT的ΦPSII均呈下降趋势，在胁迫的第9天时，WT株系降至0.34，而转基因株系仍在0.43 ~ 0.59之间，转基因株系ΦPSII均值高于WT株系的51.76%（图3B），说明逆境胁迫下转基因株系的光合能力高于WT株系。
qP参数能够反映植物PSII反应中心的开放程度，在一定范围内qP参数越大说明PSII的电子传递活性越强。参试株系在未胁迫前qP参数均大于0.9，随着NaCl胁迫时间的延长，参试株系的qP呈下降的趋势，在胁迫第9天时，WT株系下降至0.71，而转基因株系在0.75 ~ 0.89之间（图3C），表明盐胁迫下转基因株系仍维持较高的光电子传递活性。
（2） 盐胁迫下转基因白桦净光合速率的变化。参试株系的净光合速率分析显示：盐胁迫下Pn均呈现下降趋势，胁迫第6天时，WT株系的Pn降至2.88，显著低于5个转基因株系（P < 0.05），WT的Pn仅是转基因株系均值的30.30%（图3D）。
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为了探明BpCHS3过表达白桦是否伴随白桦叶片花青素质量分数的提高，试验选取3个转基因株系及WT株系，分别测定叶片花青素质量分数，结果显示：3个转基因株系花青素质量分数均显著低于WT株系（P < 0.01），CHS3-1和CHS3-2株系最低，其花青素质量分数均值仅为WT株系的29%和31%（图4）。
图 4 转基因株系与WT株系叶片花青素质量分数比较
Figure 4. Comparison of anthocyanin mass fractions in leaves between transgenic lines and WT lines
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采用qRT-PCR技术分析了转基因株系中BpCHS的2个成员以及黄酮类生物合成途径中的5个关键酶BpF3′H、BpCHI、BpDFR、BpANR、BpANS基因表达情况，结果发现，相对WT株系BpCHS3过表达株系中BpCHS1、BpCHS2等2个成员均呈下调表达，而类黄酮代谢途径中的5个关键酶BpF3′H、BpCHI、BpDFR、BpANR、BpANS等基因均呈现上调表达，其中BpCHI表达量最高，3个转基因株系均值是WT株系的53.33倍，另外，BpF3′H、BpANS相对表达量分别是WT株系22.74倍和32.66倍（图5）。
图 5 黄酮类代谢途径关键酶基因qRT-PCR分析
Figure 5. qRT-PCR of key enzyme genes in flavonoids metabolic pathway
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黄酮类化合物生物合成途径的第1步是由查尔酮合成酶（CHS）催化的，该酶催化三分子丙二酰CoA和一分子p-香豆酰CoA缩合生成四羟基查尔酮，四羟基查尔酮为黄酮、黄酮醇、黄烷酮、花青素糖苷等黄酮类物质合成提供了基本的碳架结构[16]。由于CHS处于类黄酮合成途径的最上游，因此该基因的沉默、超表达都将直接或间接影响到类黄酮合成过程，从而对色素合成、抗逆性等方面产生一定影响[17]。例如，中间锦鸡儿（Caragana intermedia）的CiCHS基因转化拟南芥，过表达株系清除DPPH自由基的能力显著高于野生型拟南芥，增强其耐受UV损伤能力[18]。本试验对获得的BpCHS3过表达白桦耐盐性测定，结果显示，转基因白桦在组培生根过程中，0.3% NaCl胁迫处理25 d后，WT株系的盐害指数高达83%，而转基因白桦平均盐害指数仅为39%，表明转基因株系的耐盐性高于WT。NaCl胁迫下转基因白桦盆栽苗叶绿素荧光参试测定，结果显示：在NaCl胁迫第9天时转基因株系（CHS3-4例外）Fv/Fm仍在正常值内，而WT株系Fv/Fm降至0.66，超出其正常范围，说明NaCl胁迫下WT株系发生了光抑制，致使PSⅡ反应中心原初光能转换效率降低（图3A）；NaCl胁迫第9天时，虽然参试株系的ΦPSII和qP均呈下降趋势，但是WT株系的降幅高于转基因株系（图3B、图3C），认为NaCl胁迫下转基因株系仍维持较高的光电子传递活性。总之，通过NaCl胁迫下转基因白桦组培苗生根情况及及盆栽苗的叶绿素荧光参试比较，认为BpCHS3在白桦中的过量表达能够提高白桦耐NaCl能力。
自20世纪90年代初Nappli等提出CHS基因间存在共抑制现象后，人们相继发现了矮牵牛中与色素合成有关的一些基因在转基因后会发生共抑制现象，其中CHS基因的报道较多[19−22]。白桦BpCHS3过表达株系同样也存在共抑制现象，即BpCHS3的过量表达，对CHS的2个家族成员产生共抑制现象，而这2个CHS家族成员可能与花青素合成有关，从而导致转基因株系花青素质量分数显著低于WT株系[11]。本试验结果也说明转基因白桦的耐盐性提高，与花青素质量分数多少无关，认为是其他黄酮类化合物参与抵抗盐胁迫逆境。
转基因白桦的qRT-PCR分析显示，类黄酮代谢途径中的5个关键酶BpF3′H、BpCHI、BpDFR、BpANR、BpANS等基因相对WT株系均呈上调表达趋势（图8）。研究表明，上述基因的高表达能够提高组织细胞中的黄酮化类合物质量分数，例如，番茄（Lycopersicon esculentum）中过量表CHI 可导致其果皮中黄酮类化合物质量分数提高了78倍；过表达CHI基因烟草其总黄酮质量分数升高了5倍[23]，在黄酮类代谢途径中，F3′H基因能够催化二氢堪非醇生成二氢栎皮黄酮，进而产生黄酮醇等次生代谢物，过表达F3′H 基因烟草其耐盐性及酶活性都显著高于对照株系[24]。有研究证明，类黄酮化合物在消除和减轻由高盐、干旱等逆境引发的活性氧伤害方面直接发挥作用，另外，类黄酮在植物抗逆过程中的作用不仅仅局限于清除活性氧，黄酮类次生代谢物还可以作为信号分子对某些生物学过过程进行调控[25−26]。BpCHS3 转基因耐盐性的提高与哪种黄酮类次生代谢物有关，该代谢物与白桦盐逆境应答的分子机制将是我们的后续研究。
白桦BpCHS3转基因植株耐盐性分析
Evaluation of salt tolerant performance of BpCHS3 transgenic plants in Betula platyphylla
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摘要:
目的 查耳酮合成酶（CHS）是黄酮类化合物生物合成途径中的关键酶，其高表达可以促进黄酮类化合物积累，增强植物抵抗盐碱、干旱等非生物胁迫的能力，开展转BpCHS3白桦耐盐性分析，为阐明该基因的功能提供参考。 方法 以前期获得的转BpCHS3白桦为试材，进行转基因白桦qRT-PCR及Northern Blot检测，同时测定了叶片中花青素质量分数。NaCl胁迫处理下，分别测定转BpCHS3白桦的盐害指数、叶绿素荧光参数及光合参数。采用qRT-PCR技术，测定转基因株系的类黄酮代谢途径中CHS下游5个关键酶基因以及BpCHS家族成员相对表达量。 结果 qRT-PCR及Northern Blot检测显示，导入的目标基因BpCHS3在mRNA水平能够表达。转基因白桦组培生根苗在0.3%NaCl胁迫第25天，WT株系盐害指数高达83%，而转基因白桦平均盐害指数仅为39%；白桦转基因盆栽苗在0.4%NaCl胁迫后，叶绿素荧光参数及光合参数测定显示，NaCl胁迫第9天多数转基因株系Fv/Fm仍为正常值，而WT株系降至0.66，胁迫第9天时ΦPSII和qP呈下降趋势，但WT株系的降幅高于转基因株系；NaCl胁迫6 d时，5个转基因株系的Pn平均值仍高于WT的43.47%。认为盐胁迫下BpCHS3基因在白桦中的过量表达能够维持其较高的光电子传递活性，提高PSⅡ反应中心原初光能转换效率，同时也能维持较高的净光合效率。分别以转BpCHS3白桦cDNA为模板qRT-PCR分析显示，相对WT株系CHS下游的5个关键酶基因在转基因株系中均呈不同程度的上调表达，BpCHS家族成员中只有BpCHS3表达量显著上调，而 BpCHS1和BpCHS2均呈下调表达或与WT株系差异不显著。BpCHS3过表达株系花青素质量分数分析发现，转基因白桦叶片中花青素质量分数均显著低于WT株系，推测BpCHS3的过量表达，对另外2个CHS家族成员产生共抑制，且影响花青素的合成。 结论 转BpCHS3白桦的耐盐性提高，与花青素质量分数多少无关，BpCHS3的过表达可能促进其他黄酮类化合物的积累，从而增强白桦的耐盐能力。 Abstract:Objective Chalcone synthase (CHS) is a key enzyme in the biosynthesis pathway of flavonoids. Overexpression of CHS promotes an accumulation of flavonoids and enhances the ability of plants to resist abiotic stresses such as salinity and drought. The objective of the study is to elucidate the function of BpCHS3 to salt tolerance. Method Our previously obtained transgenic birch plants of BpCHS3 were used in this study. The content of anthocyanins in leaves, salt stress index, chlorophyll fluorescence and photosynthetic parameters under NaCl stress were determined. QRT-PCR and Northern Blot were used to determine the relative expression levels of five key enzyme genes of downstream of CHS and BpCHS family members in the flavonoid metabolic pathway. Result The wild type (WT) had a salt damage index of 83% in the 25th day under 0.3% NaCl stress, whereas transgenic birch was only 39%. The chlorophyll fluorescence and photosynthetic parameters of transgenic Betula platyphylla seedlings under 0.4% NaCl stress showed that the Fv/Fm for most transgenic lines was still normal in the 9th day, while Fv/Fm was reduced to 0.66 and the ΦPSII and qP showed a decreasing trend for WT. The WT strain had a higher decline than the transgenic lines. The mean value of Pn for five transgenic lines was still higher than 43.47% of WT under salt stress in 6 days. It is believed that the overexpression of BpCHS3 gene in Betula platyphylla under salt stress can maintain its higher photoelectron transport activity, increase the primary light energy conversion efficiency of PSII reaction center, and maintain a higher net photosynthetic efficiency. qRT-PCR and Northern Blot showed that the introduced target gene BpCHS3 was expressed in BpCHS3 transgenic lines. All of them showed up-regulated expression in different levels. Only BpCHS3 expression was significantly up-regulated in BpCHS family members. Both BpCHS1 and BpCHS2 were down-regulated or not significantly different from WT lines. Anthocyanin content of BpCHS3 overexpression lines was significantly lower than that of WT lines. It is speculated that overexpression of BpCHS3 results in co-suppression of two other CHS family members affects the synthesis of anthocyanins. Conclusion The salt tolerance of BpCHS3 transgenic birch was increased, which was not related to the content of anthocyanin. The overexpression of BpCHS3 may promote the accumulation of other flavonoids, thus enhancing the salt tolerance of Betula platyphylla. -
Key words:
- Betula platyphylla /
- BpCHS3 /
- genetic transformation /
- salt tolerance
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图 1 转BpCHS3白桦qRT-PCR检测
Figure 1. Relative quantification of each transgenic line BpCHS3 gene mRNA expression level
图 2 转BpCHS3基因白桦Northern Blot检测图谱
Figure 2. Northern Blot pattern of 35S :: BpCHS3 from transgenic birch
图 3 盐胁迫下参试株系荧光参数及Pn比较
Figure 3. Comparison of fluorescence parameters and Pn of the tested birch under salt stress
图 4 转基因株系与WT株系叶片花青素质量分数比较
Figure 4. Comparison of anthocyanin mass fractions in leaves between transgenic lines and WT lines
图 5 黄酮类代谢途径关键酶基因qRT-PCR分析
Figure 5. qRT-PCR of key enzyme genes in flavonoids metabolic pathway
表 1 荧光定量PCR引物序列
Table 1. Primer sequences for fluorescent quantitative-PCR
引物名称 Primer name 上游引物序列 Forward primer (5′-3′) 下游引物序列 Reverse primer (5′-3′) 18SrRNA ATCTTGGGTTGGGCAGATCG CATTACTCCGATCCCGAAGG BpCHS1 CCGTGGAGGAAATCCGAAAGGCTC CGCTCTTGGTGATCCGGAAGTAATA BpCHS2 ATGGCGTCCGTCGAAGAAATATTTAA TCGTCTTGGTAGATATAGTTGGATGG BpCHS3 GGCATCTCGGACTGGAACTC CACAACGGTCTCGACGGTAA BpF3′H CTTGAACCACCGCAACCTCAC CCTCGTCCTCGACCCGAATT BpCHI GTATTTGGAGGATACCGCCGTGC GCAAGATCATTGTCACCCGTGTG BpDFR1 TGCCGCCTAGTCTTATTACAGCAC GTGAATTGTGGCATCGGCGG BpDFR2 CATTGGCGTCTTCCACGTGGCTAC CGACAGCTGATCCACTGGTAGTGT BpANR1 AAGGATCGACAATTCCACAAGCAGG CGTATAGCTTGTTGGTGCTGGAGAA BpANR2 GGGGGAAGATTGTGATACGGAGGAT GCGAAATCGTAGAGCTTGCTGGTGC BpANR3 CGACGAGCAGGCAAGTGACTTTCTC TCGTAGAGCCTGCCGGTGCTGGAG BpANS TACTACCCGATCTGCCCTCAGC GGAACACATTTCGCCGTCACCC 
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表 2 NaCl胁迫下转基因白桦生根情况
Table 2. Rooting of transgenic birch under salt stress
株系
Strain平均主根数
Average number of primary roots/article平均主根长
Average main root length/cm生根率
Rooting rate/%盐害指数
Salt damage index/%WT 1.2 0.27 ± 0.02c 40 83 CH3-1 3.2 1.76 ± 0.03a 100 43 CH3-2 2.8 1.66 ± 0.02b 100 35 注：平均主根长表示方式为“平均值 ± 标准差”，同列不同字母表示差异显著（P < 0.05）。 Notes: Data of average main root length were mean ± SE，different lowercases in the same column represente significant differences (P < 0.05).
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