Preparation of alcohol extract of Rosa davurica and the correlations between its main active components and antioxidant
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摘要:目的通过对北方林区刺玫果醇提物的制备及其主要活性成分进行研究，为刺玫果的进一步合理利用提供参考。方法采用高剪切乳化技术辅助乙醇提取刺玫果活性成分，在单因素试验基础上，以醇提物得率为指标，采用响应面法对主要工艺参数进行优化。对刺玫果醇提取物中总多酚、总黄酮、槲皮素和绿原酸进行提取，与DPPH·、OH·和·ABTS+的清除能力利用Pearson法做相关性研究。结果回归模型较好的反映了刺玫果黄酮醇提物与料液比、剪切转速、剪切时间的关系；确定最佳提取工艺为：料液比为1:25 g/mL，剪切转速为18 000 r/min，剪切时间为3 min，得率为（14.94 ± 0.47）%，回归模型的失拟值不显著，说明该回归模型模拟较好。绿原酸对DPPH·清除能力最强，在0.150 μg/mL时清除率达到80.84%；总黄酮对OH·清除能力最强，在0.484 μg/mL时清除率为82.32%；槲皮素对·ABTS+清除能力最强，在4.7 μg/mL时清除率达到91.32%。总黄酮与DPPH·、·OH、·ABTS+这3种自由基清除率相关系数最大，并与这3者清除能力的相关系数分别为 0.886、0.976、0.989（P < 0.01）。结论采用高剪切乳化技术辅助乙醇提取的刺玫果醇提物得率比普通超声辅助醇提法效果更好，醇提物得率增加了（2.11 ± 0.51）%，且不破坏刺玫果主要成分活性，刺玫果中总黄酮含量与抗氧化能力相关性最强。Abstract:ObjectiveIn this paper, the preparation of alcohol extract of Rosa davurica of the northern forest area and its main active ingredients were studied to provide reference for further rational utilization of Rosa davurica.MethodHigh-shear emulsification technology was used to assist ethanol extraction of active constituents of Rosa davurica. Based on the single factor experiment, the main process parameters were optimized by the response surface method based on the yield of alcohol extract. The total polyphenols, total flavonoids, quercetin, and chlorogenic acid contents in the extracts of Rosa davurica were determined, and the scavenging capacities of DPPH·, OH·, and ·ABTS+ were studied using the Pearson method.ResultThe regression model better reflected the relationship between the extract of flavonoids and the ratio of material to liquid, shearing speed and shear time. The optimal extraction process was as follows: the ratio of material to liquid was 1:25 g/mL, shearing speed for 18 000 r/min, the shear time was 3 min, and the yield was (14.94 ± 0.47)%. The regression model was not significant, indicating that the regression model was better. Chlorogenic acid had the highest DPPH· scavenging capacity, and the clearance rate reached 80.84% at 0.150 μg/mL; the total flavonoids had the strongest OH· scavenging capacity, and the clearance rate was 82.32% at 0.484 μg/mL; quercetin had the strongest ·ABTS+ scavenging ability. The clearance rate reached 91.32% at 4.7 μg/mL. The correlation coefficients between total flavonoids and DPPH·, OH·, ·ABTS+ free radical scavenging capacity were the highest, and the correlation coefficients between total flavonoids and DPPH·, OH·, ·ABTS+ free radical scavenging capacity were 0.886, 0.976 and 0.989, respectively (P < 0.01), indicating that the content of total flavonoids in Rosa davurica had the strongest correlation with antioxidant capacity.ConclusionThe high-shear emulsification technology assisted ethanol extraction of ethanol extracts was better than ordinary ultrasonic-assisted alcohol extraction, and the alcohol extract increased by (2.11 ± 0.51)%, and the activity of main constituents of Rosa davurica was not destroyed. The total flavonoid content in Rosa davurica has the strongest correlation with antioxidant capacity.
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Keywords:
- Rosa davurica /
- alcohol extracts /
- component /
- antioxidant
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刺玫果为蔷薇科（Rosaceae）植物山刺玫（Rosa davurica）的果实，刺玫果是东北地区一种比较特有的山野果，广布于东北和华北地区林地，资源丰富且价廉易得，果实含有多种功效成分，具有较高的保健、医药价值[1]。刺玫果含有14种人体必需的矿质元素，多种维生素、氨基酸、多不饱和脂肪酸、黄酮、皂苷、多糖、鞣质等化合物，其中研究较多的为黄酮类化合物，已鉴定的单体成分有芦丁、金丝桃苷、银锻苷、橙皮苷、槲皮素、山奈素等，刺玫果实具有药食同源的开发价值[2]。
近年来林下浆果在世界范围内受到关注，其产品研发成为热点，但对于刺玫果中活性成分的构效关系及作用机理研究报道较少，市场推广度及民众认知度有限，目前已有的产品形式仅限刺玫果叶茶、复合饮料、果醋及果酒，初级产品的研发对于刺玫果原料的利用率很低，更多的刺玫果资源处于落果荒山的现状，导致北方林区野生刺玫果资源未被开发利用。
由于内源性自由基的影响，人体会被其氧化损害，而抗氧化剂在一定程度上会抵制这种氧化现象。化学合成抗氧化剂普遍具有一定肌体毒副作用，植物源的天然抗氧化剂食品安全性高，愈来愈受到研究者及消费者的关注，从野生浆果中开发天然抗氧化剂具有重要意义。已有研究表明，刺玫果具有多种生理活性，在抗衰老、抗氧化、抗肿瘤、耐缺氧、提高免疫活性和调节心脑血管疾病等方面起到特殊作用[3-6]。
目前刺玫果的提取方法有微波辅助提取法[7]、浸提回流法[8]、酶法辅助提取[9]等。魏颖等[10]通过超声辅助醇提法获得的醇提物得率为6.86%，本研究采用高剪切分散乳化技术对刺玫果醇提物和其主要成分进行提取，这种技术近几年被人们熟知并且渐渐开始使用，亦被许多医学、药物行业等研究[11]，在定子和转子的极速旋转下，物料在其中往复受力，最终，成分从破碎的细胞壁中被提取出来，方便易行、节省时间[12]。设备结构简单，工业可行性强。许继华[13]通过色谱分析，得出高剪切乳化提取黄酮明显高于普通超声提取。本研究旨在通过刺玫果醇提物制备方法的研究，获得低成本、高效率的生产工艺，以刺玫果抗氧化成分与抗氧化效果的相关研究为理论基础，为刺玫果的综合利用和深度开发提供依据[14-15]。
1. 材料与方法
1.1 试验材料及主要仪器
刺玫果鲜果：采集自萝北县林业局下属林场。
试剂：没食子酸标准品（≥ 95%）、芦丁对照品（≥ 98%）、绿原酸标准品（≥ 98%）、槲皮素标准品（≥ 98%）、1,1-二苯基-2-苦肼基（自由基）、ABTS+、邻二氮菲、福林酚试剂、无水乙醇、FeSO4、K2S2O8、Na2CO3、NaNO2、Al(NO3)3，均为分析纯。
仪器：XSE204电子天平（瑞士梅特勒−托利多仪器（中国）有限公司）；T6新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；FA25高剪切分散乳化机（上海弗鲁克流体机械制造有限公司）。
1.2 刺玫果醇提物制备工艺研究
1.2.1 原料处理
鲜刺玫果经清洗去杂，低温干燥后，破碎为60目粉末，冷藏备用。
1.2.2 高剪切辅助提取刺玫果醇提物单因素试验
在前期预试验基础上，选择对醇提物得率有显著影响的因素进行研究，即：料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL），剪切转速（12 000、15 000、18 000、21 000、24 000 r/min），剪切时间（1、2、3、4、5 min），分别考察不同水平条件对醇提物得率（AE）的影响。
AE=m/m0 式中：m为去除溶剂后残渣的质量，mg；m0为用于提取的刺玫果质量，g。
1.2.3 运用中心组合优化提取工艺
根据单因素试验结果，以影响得率的主要因素，料液比、剪切转速、剪切时间为变量，以醇提物的得率为响应值，采取Box-Behnken试验设计方法，利用Design-Expert来设计三因素三水平的响应面工艺优化试验，优化高剪切辅助提取刺玫果醇提物工艺参数，其水平设计见表1。
表 1 响应面因素水平设计表Table 1. Design table of response surface factor level水平 Level 因素 Factor 料液比Solid-liquid ratio/(g·mL− 1) 剪切转速
Shear speed/(r·min− 1)剪切时间
Shear time/min− 1 1∶20 15 000 2 0 1∶25 18 000 3 1 1∶30 21 000 4 1.3 刺玫果醇提物主要活性成分含量分析
刺玫果中总多酚含量的测定：采用“福林酚”法测定[16]。刺玫果中总黄酮含量的测定：采用“NaNO2-Al（NO3）3-NaOH”比色法[17]测定。刺玫果中槲皮素含量的测定：根据相关文献[18]测定。刺玫果中绿原酸含量的测定：根据相关文献[19]测定。
1.4 刺玫果提取物的抗氧化活性研究
1.4.1 对DPPH自由基（DPPH·）的清除能力
取不同浓度的供试品溶液4.0 mL，加入0.2 mmoL/L DPPH·溶液2.0 mL，反应完全后，以50%乙醇作为空白，在波长517 nm处测定光密度值（OD样品）。用蒸馏水代替供试品溶液，测定光密度值（OD空白）。用2.0 mL无水乙醇代替DPPH·溶液，测定光密度值（OD对照）[20]。
DPPH⋅清除率=(OD空白−OD样品+OD对照)/OD空白×100% 1.4.2 对羟基自由基（·OH）的清除能力
加入适量邻二氮菲无水乙醇溶液、磷酸盐缓冲液、蒸馏水、硫酸亚铁溶液、H2O2溶液于10 mL试管中，反应完全后于536 nm处测其光密度值（ODp）。用不同质量浓度的供试品溶液替代上述步骤中的蒸馏水，测其光密度值（ODs）。用蒸馏水替代H2O2溶液，于536 nm处测其光密度值（ODb）[21]。
⋅OH清除率=(ODs−ODp)/(ODb−ODp)×100% 1.4.3 对ABTS自由基（·ABTS+）的清除能力
取0.2 mL不同质量浓度的供试品溶液于10 mL具塞试管，再加入7.8 mL·ABTS+工作液，均匀混合，反应完全后，以蒸馏水为空白，测其在734 nm处的光密度值（OD）[22]。
⋅ABTS清除率=(OD空白−OD)/OD空白×100% 1.5 醇提物成分与抗氧化相关性分析
采用Excel和SPSS18.0对2.2.7的数据进行分析（显著性界值为P < 0.05，极显著性界值为P < 0.01），利用Pearson法进行刺玫果生物活性物质含量与抗氧化能力的相关性分析。
2. 结果与分析
2.1 单因素试验结果
不同剪切转速、料液比、剪切时间对刺玫果醇提物得率的影响，结果见图1 ~ 3。
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图 1 料液比对醇提物得率的影响Figure 1. Effects of solid-liquid ratio on the yield of alcohol extracts由图1 ~ 3可知，随着剪切转速、剪切时间的增加和料液比的减小，醇提物得率增加，这可能是由于前期剪切转速和剪切时间的增加，可以更充分地破坏刺玫果组织细胞壁，与此同时也使温度升高，这两者都促使了刺玫果中活性物质溶出。而溶剂的增加，使原料与溶剂接触面积增大，促进刺玫果中的活性成分的溶出并向溶剂扩散，得率呈上升趋势；但当剪切转速、剪切时间分别大于21 000 r/min、3 min和料液比小于1∶25 g/mL时，继续改变因素水平值，醇提物的得率下降或变化不显著，这可能是由于剪切速转过高或剪切时间较长时，产生的热量促进活性物质发生了分解氧化等副反应，导致得率降低。而随着溶剂的增加，也使高剪切的刀头与原料的有效接触剪切的概率降低，得率呈下降的趋势。
2.2 响应面试验结果及数据分析
根据单因素的试验结果，以刺玫果醇提物得率为响应值，以料液比、剪切转速、时间为自变量，进行三因素三水平的17组响应面分析试验，经过Design-Expert 8.0.6 trial设计出的方案及结果如表2所示。
表 2 响应面试验设计及结果Table 2. Response surface test design and results试验号
Test No.料液比
Solid-liquid ratio剪切转速
Shear speed剪切时间
Shear time得率
Yield/%1 0 1 1 12.37 2 − 1 1 0 11.78 3 0 0 0 14.68 4 − 1 − 1 0 11.30 5 0 1 − 1 8.40 6 − 1 0 1 11.90 7 1 − 1 0 11.10 8 0 − 1 1 10.09 9 0 0 0 14.32 10 1 0 1 11.90 11 1 0 − 1 11.80 12 − 1 0 − 1 10.40 13 1 1 0 11.20 14 0 0 0 15.43 15 0 − 1 − 1 10.01 16 0 0 0 15.24 17 0 0 0 15.87 采用Design-Expert 8.0.6软件对试验数据进行回归拟合，回归方程：刺玫果醇提物得率 = 15.11 + 0.077A + 0.16B + 0.71C − 0.095AB − 0.35AC + 0.97BC − 01.24A2 − 2.52B2 − 2.37C2，对模型进行回归分析。
式中：A表示料液比，B表示剪切转速（r/min），C表示剪切时间（min）。
回归模型的R2 = 0.961 6，R2Adj = 0.912 3说明该模型预测结果与实际结果吻合较好，由表3可知，A、B、C 3个因素对得率的影响顺序为：C（剪切时间） > B（剪切转速） > A（料液比）。
表 3 方差分析表Table 3. ANOVA of regression analysis方差来源
Source of
variance平方和
Sum of
squares自由度
Degrees of
freedom均方
Mean
squareF 模型 Model 71.42 9 7.94 19.48** A 0.048 1 0.048 0.12 B 0.20 1 0.20 0.48 C 3.99 1 3.99 9.80* AB 0.036 1 0.036 0.089 AC 0.49 1 0.49 1.20 BC 3.78 1 3.78 9.29* A2 6.48 1 6.48 15.90** B2 26.80 1 26.80 65.79** C2 23.61 1 23.61 57.95** 残差 Residual 2.85 7 0.41 失拟项 Lack of fit 1.35 3 0.45 1.19 纯误差 Pure error 1.51 4 0.38 总和 Total 74.27 16 注：**为差异极显著（P < 0.01），*为差异显著（P < 0.05）。A. 料液比；B. 剪切转速；C. 剪切时间。下同。Notes: ** means extremely significant difference, * means significant difference. A, solid-liquid ratio; B, shear speed; C, shear time. Same as below. 2.2.1 响应面分析
通过三维响应曲面图中曲面陡峭度及等高线密集度分析影响因素与其交互作用的显著性。
由图4a可以得出，对得率的影响程度：转速 > 料液比。转速的提高，反应充分，过而高转速导致活性物质的分解，进而影响得率。由图4b可知，料液比（A）和转速（B）等高线图显示两因素交互作用不显著。
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图 4 料液比及剪切转速对得率的响应面及等高线Figure 4. Response surface and contour line of material-liquid ratio and shear speed on yield由图5a可以得出，对得率的影响程度：时间 > 料液比。剪切时间的延长，有利于提取刺玫果醇提物反应更充分，而料液比过大导致原料在溶剂中较分散，降低得率。由图5b可知，料液比（A）和时间（C）两因素交互作用不显著。
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图 5 料液比及剪切时间对得率的响应面及等高线Figure 5. Response surface and contour lines for yield ratio and shear time on yield由图6a可以得出，由陡峭的程度可得，对得率的影响程度：时间 > 转速。由图6b可知，转速（B）和时间（C）等高线图密集且呈椭圆形，说明两因素交互作用显著。
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图 6 剪切时间及剪切转速对得率的响应面及等高线Figure 6. Response times and contour lines for shear rate and shear speed versus yield2.2.2 最佳条件的验证
由Design-Expert软件计算可得出理论最佳工艺条件：料液比为1∶25.03，剪切转速为18 185.57 r/min，时间为3.16 min，得率为（15.17 ± 0.58）%。考虑生产实践中的易操作性，将料液比取值1∶25，剪切转速18 000 r/min，时间3 min，通过验证试验，平均得率为（14.94 ± 0.47）%，结果符合，说明模型优化提取工艺可靠。
2.3 抗氧化能力评价
采用1.4方法分析提取物的抗氧化活性，并计算其IC50值，结果如表4所示。
表 4 刺玫果主要成分抗氧化活性的IC50值Table 4. IC50 values of antioxidant activity of each substance项目
Item总多酚
Total polyphenols总黄酮
Total flavonoids槲皮素
Quercetin绿原酸
Chlorogenic acidDPPH· 6.831 1.675 0.218 0.064 OH· 102.000 0.317 1.417 0.819 ·ABTS+ 32.000 8.000 0.509 138.000 IC50值是指被测量的拮抗剂的半抑制浓度。IC50值越低，表明该物质抗氧化性越强，由表4可知，各物质在DPPH·清除方面的活性：绿原酸 > 槲皮素 > 总黄酮 > 总多酚；在OH·清除方面的活性：总黄酮 > 绿原酸 > 槲皮素 > 总多酚；在·ABTS+清除方面的活性：槲皮素 > 总黄酮 > 总多酚 > 绿原酸。
刺玫果的抗氧化能力与总黄酮、总多酚、槲皮素和绿原酸4者相关性见表5。
表 5 刺玫果主要成分与抗氧化活性的相关性Table 5. Correlations between main components and antioxidant activity of Rosa davurica项目
ItemDPPH·清除能力
DPPH· scavenging capacityOH·清除能力
OH· scavenging capacity·ABTS+清除能力
·ABTS+ scavenging capacity总黄酮
Total flavonoids0.886** 0.976** 0.989** 总多酚
Total polyphenols0.965** 0.884** 0.797** 槲皮素
Quercetin0.365 0.920** 0.595* 绿原酸
Chlorogenic acid0.683* 0.807** 0.840** 通过表5中各主要成分与抗氧化活性的纵向比可知，总黄酮、总多酚含量与DPPH·清除能力、·OH清除能力、·ABTS+的清除能力之间存在极显著相关性；槲皮素与DPPH·清除能力无显著相关性，与·ABTS+的清除能力存在较强相关性，但与·OH清除能力相关性却极显著；绿原酸与DPPH·清除能力相关性较强（P < 0.05），与·OH、·ABTS+的清除能力存在极显著相关。
综上，在3种抗氧化试验中，总黄酮的抗氧化能力强于其余3种活性物质。由此可知，刺玫果在生理上能够发挥其功效，主要原因可能是其具有优于其他物质的抗氧化性。黄酮可以通过抑制自由基产生、直接清除自由基、激活机体抗氧化的体系等方式进行体内的抗氧化作用，并且黄酮类化合物的含量与其抗氧化活性呈正相关，这与相关文献研究结论相符[23-24]。
3. 结 论
本课题通过响应面法优化了刺玫果醇提物的高剪切乳化制备方法。得到了最佳工艺条件：料液比为1∶25 g/mL，剪切转速为18 000 r/min，时间为3 min，得率为（14.94 ± 0.47）%，该方法的运用较普通超声辅助醇提法提高了（2.11 ± 0.51）%。通过对刺玫果醇提取物中总多酚、总黄酮、槲皮素和绿原酸含量与DPPH·、OH·和·ABTS+清除能力做相关性研究，显示出刺玫果中总黄酮与DPPH·清除能力、·OH清除能力和·ABTS+清除能力的相关系数最高（P < 0.01），说明刺玫果中总黄酮含量与抗氧化能力之间的相关性最强。
综上所述，采用高剪切乳化辅助乙醇制备的刺玫果醇提物抗氧化活性得以很好的保持，该工艺投资低，较传统超声提取法效率有所提高，且大大缩短了生产周期，对降低生产成本有积极意义，适宜基层林区初期建设采用。本文为刺玫果资源的综合利用提供理论依据，为刺玫果实现产业转化奠定指导性的研究基础。
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图 1 料液比对醇提物得率的影响
Figure 1. Effects of solid-liquid ratio on the yield of alcohol extracts
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图 4 料液比及剪切转速对得率的响应面及等高线
Figure 4. Response surface and contour line of material-liquid ratio and shear speed on yield
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图 5 料液比及剪切时间对得率的响应面及等高线
Figure 5. Response surface and contour lines for yield ratio and shear time on yield
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图 6 剪切时间及剪切转速对得率的响应面及等高线
Figure 6. Response times and contour lines for shear rate and shear speed versus yield
表 1 响应面因素水平设计表
Table 1 Design table of response surface factor level
水平 Level 因素 Factor 料液比Solid-liquid ratio/(g·mL− 1) 剪切转速
Shear speed/(r·min− 1)剪切时间
Shear time/min− 1 1∶20 15 000 2 0 1∶25 18 000 3 1 1∶30 21 000 4 
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表 2 响应面试验设计及结果
Table 2 Response surface test design and results
试验号
Test No.料液比
Solid-liquid ratio剪切转速
Shear speed剪切时间
Shear time得率
Yield/%1 0 1 1 12.37 2 − 1 1 0 11.78 3 0 0 0 14.68 4 − 1 − 1 0 11.30 5 0 1 − 1 8.40 6 − 1 0 1 11.90 7 1 − 1 0 11.10 8 0 − 1 1 10.09 9 0 0 0 14.32 10 1 0 1 11.90 11 1 0 − 1 11.80 12 − 1 0 − 1 10.40 13 1 1 0 11.20 14 0 0 0 15.43 15 0 − 1 − 1 10.01 16 0 0 0 15.24 17 0 0 0 15.87
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表 3 方差分析表
Table 3 ANOVA of regression analysis
方差来源
Source of
variance平方和
Sum of
squares自由度
Degrees of
freedom均方
Mean
squareF 模型 Model 71.42 9 7.94 19.48** A 0.048 1 0.048 0.12 B 0.20 1 0.20 0.48 C 3.99 1 3.99 9.80* AB 0.036 1 0.036 0.089 AC 0.49 1 0.49 1.20 BC 3.78 1 3.78 9.29* A2 6.48 1 6.48 15.90** B2 26.80 1 26.80 65.79** C2 23.61 1 23.61 57.95** 残差 Residual 2.85 7 0.41 失拟项 Lack of fit 1.35 3 0.45 1.19 纯误差 Pure error 1.51 4 0.38 总和 Total 74.27 16 注：**为差异极显著（P < 0.01），*为差异显著（P < 0.05）。A. 料液比；B. 剪切转速；C. 剪切时间。下同。Notes: ** means extremely significant difference, * means significant difference. A, solid-liquid ratio; B, shear speed; C, shear time. Same as below.
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表 4 刺玫果主要成分抗氧化活性的IC50值
Table 4 IC50 values of antioxidant activity of each substance
项目
Item总多酚
Total polyphenols总黄酮
Total flavonoids槲皮素
Quercetin绿原酸
Chlorogenic acidDPPH· 6.831 1.675 0.218 0.064 OH· 102.000 0.317 1.417 0.819 ·ABTS+ 32.000 8.000 0.509 138.000
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表 5 刺玫果主要成分与抗氧化活性的相关性
Table 5 Correlations between main components and antioxidant activity of Rosa davurica
项目
ItemDPPH·清除能力
DPPH· scavenging capacityOH·清除能力
OH· scavenging capacity·ABTS+清除能力
·ABTS+ scavenging capacity总黄酮
Total flavonoids0.886** 0.976** 0.989** 总多酚
Total polyphenols0.965** 0.884** 0.797** 槲皮素
Quercetin0.365 0.920** 0.595* 绿原酸
Chlorogenic acid0.683* 0.807** 0.840**
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