Effects of transgenic sense and antisense of BpCCR1 on 7-year-old potted birch and selection of excellent lines
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摘要:目的肉桂酰辅酶还原酶（Cinnamoyl-CoA Reductase，CCR）是催化木质素合成特异途径中的第一个限速酶。通过测定转基因株系和野生型株系（WT）的木质素和单体含量，探究转BpCCR1基因正义链和反义链对白桦木质素含量的影响，进而筛选出转基因优良株系。方法以获得的7年生白桦转BpCCR1正、反义链株系为试验材料，采用PCR及qRT-PCR技术分别对目标基因的稳定性及表达量进行检测，采用改进的Klason法及液相色谱法分别对木质素含量及单体含量进行测定，采用硝酸－氯酸钾法和排水法分别对木纤维长和宽及基本密度进行测定，并调查树高及胸径，以此来分析转BpCCR1正、反义链对白桦上述性状的影响。结果PCR检测表明，5个转正义链株系及14个转反义链株系的目标基因均为阳性；qRT-PCR分析显示，BpCCR1基因不但在转正义链株系中上调表达，而且在转反义链株系中也呈上调表达。转正、反义链白桦株系木质素含量均增加，其中10个转反义链株系的Klason木质素和总木质素含量均值较野生型株系（WT）分别提高了7.46%和7.05%，木质素含量最高的FCR11株系较WT株系分别提高了12.26%和11.81%；转基因株系基本密度虽然有一定的变化，但无明显规律。转正义链株系的木纤维宽明显变小，5个株系均值较WT减少8.82%；而转反义链株系的木纤维长受到明显抑制，有11个株系与WT的差异达到了显著性水平（P < 0.05），其均值较WT减少12.12%。转基因株系与WT的材积差异也达到显著性水平，有11个转反义链株系的材积大于WT，7个株系达到显著性水平（P < 0.05），其平均材积生长量较WT提高77.1%。采用主成分分析法选择FCR2、FCR27和FCR33株系为优良株系。结论转BpCCR1正义链及反义链均提高白桦木质素含量，综合树高、胸径等6个性状筛选出3个优良转基因株系。Abstract:ObjectiveCinnamoyl-CoA Reductase (CCR) is the first rate-limiting enzyme in the specific pathway for the synthesis of lignin and plays a crucial role in the biosynthesis of lignin. Measuring the lignin and monomer content of transgenic lines and wild lines (WT) aims to explore the effects of BpCCR1-sense and BpCCR1-antisense on the lignin of Betula platyphylla.Method7-year-old BpCCR1-sense and BpCCR1-antisense transgenic lines were selected as experimental materials. The expression of BpCCR1 in transgenic lines was determined using PCR and qRT-PCR, respectively. The lignin content and monomer content were determined by the modified Klason method and high performance liquid chromatography (HPLC), respectively. The length and width of the wood fiber and basic density were measured by the method of nitric acid-potassium chlorate and drainage, and the height (H) and diameter at breast height (DBH) of the trees were investigated to investigate the effects of BpCCR1 sense and antisense lines in B. platyphylla.ResultPCR analysis showed that the BpCCR1 was successfully integrated into the birch genome in 5 BpCCR1-sense transgenic lines and 14 BpCCR1-antisense transgenic lines. QRT-PCR analysis revealed that the expression of BpCCR1 was up-regulated in transgenic lines compared with wild type (WT). Lignin content of the transgenic lines was increased. There into, the average Klason lignin and total lignin content of 10 transgenic lines were respectively 7.46% and 7.05% higher than wild type. Compared with WT, FCR11 line had the highest content of average Klason lignin and total lignin, which was respectively increased by 12.26% and 11.81%. Although the wood basic density of transgenic lines had changed, while there was no obvious law. The wood fiber width of BpCCR1-sense transgenic lines was significantly smaller than WT, the average value of which decreased by 8.82% in five transgenic lines. Whereas, the wood fiber length of BpCCR1-antisense transgenic lines was restrained, and the difference between 11 lines and WT reached a significant level (P < 0.05), and the average value was 12.12% shorter than WT. The difference in volume between transgenic lines and WT also reached a significant level. The volume of 11 transgenic lines was larger than WT, and 7 lines reached a significant level, and the average volume growth was 77.1% higher than WT. FCR2, FCR27 and FCR32 lines were selected as excellent lines using principal component analysis.ConclusionBoth the sense and antisense of BpCCR1 can increase the lignin content of B. platyphylla, three excellent transgenic lines were selected by six characters including height and DBH.
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Keywords:
- Betula platyphylla /
- CCR /
- lignin /
- fiber /
- excellent line
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坡面薄层流是降雨在扣除截留、填洼、下渗等损失后沿坡面形成的浅层明流[1]，是一种特殊而复杂的水流形态。研究表明，坡面薄层流不同于一般的明渠水流，水深一般只有几毫米甚至零点几毫米，薄层水流流向不稳定，沿程有质量源和动量源汇入，产生能量紊动，且受地表状况、雨强等诸多因素的影响，所以对坡面薄层水流的研究难度较大[2-4]。而坡面流是径流初始阶段和侵蚀演变的初始动力，其水动学特性对阐明土壤侵蚀和坡面产沙机理具有重要理论意义[5-8]。
目前，对于薄层水流特性的研究热点聚焦于坡面流流态及坡面流阻力特性，关于其流态归属问题，Horton等[9]认为坡面薄层水流是紊流中点缀层流的一种混合流区；Emmett[10]认为坡面流虽有紊流特性，但仍展现出较多层流性质，故定义为“扰动流”；Selby[11]认为坡面流是紊流和层流的混合流区。但仍然缺少公认的薄层流流态的界定方法。关于薄层水流阻力规律的研究，已有的研究成果多应用二元流雷诺数判别准则进行流区划分[4-5, 12]。关于降雨对坡面流阻力的影响，大部分的研究都表明，降雨对水流阻力的影响程度与水流流态有关，雨滴的打击作用和动能输入使其阻力增大，降雨在伪层流[4]情况下对水流阻力的影响最为显著，而有的学者认为降雨影响可以忽略[13]。而对于薄层水流特性的研究方法聚焦于人工模拟降雨或者水槽放水冲刷，两者共同作用下的水动力学特性研究十分少见。潘成忠等[13]通过上方来水和模拟降雨试验，研究了不同流量和坡度条件下坡面薄层水流水力学参数和滚波特性，初步探明了降雨和坡度对它们的影响。目前，对于坡面水流特性的探讨虽有不少研究成果，但由于坡度较小、床面光滑、缺少试验资料等因素，其结论的实际应用性也受到很大程度的限制，尤其在山地陡坡、雨量急、大的情况下。坡面流其底坡较天然明渠陡峭得多，重力作用更为突出。自然中，在山地陡坡、大雨条件下会发生超渗产流现象，坡面流冲刷和降雨同时作用于坡面，二者综合作用力对坡面的影响目前尚未明确。在国外，坡面流水动力学特性研究多侧重于缓坡，而国内多侧重于细沟水流，有研究表明，20°~ 25°是坡地土壤侵蚀的临界坡度[14]。目前针对陡坡和降雨对坡面流水流特性的研究尚显不足。与缓坡相比，陡坡条件下的水流动力特性和侵蚀特征具有其特殊性[15-16]。所以研究坡面流冲刷和降雨共同作用下的陡坡坡面流水动力学特性对防治水土流失有重要意义。
本文采用陡坡坡面定床阻力试验，通过人工模拟降雨和放水冲刷试验相结合的方法，定量研究5种流量和4个典型降雨强度(含无降雨)条件下，受4种不同粗糙度影响的水力要素关系及阻力的变化特征。研究陡坡降雨条件下的薄层水流水动力学特性对于揭示坡面薄层水流阻力的内在规律具有重要理论意义。
1. 研究区概况
缙云山位于三峡库区内，是国家级自然保护区，地理坐标为106°17′~106°24′ E、29°41′~29°52′ N，属于典型的亚热带季风湿润气候，植被资源丰富，森林覆盖率达96.6%。占地面积76 km2，海拔350.0~951.5 m，年平均降水量1 611.8 mm，最高年降水量1 683.8 mm。降雨主要发生在4—9月，降水量1 243.8 mm，占全年的77.2%。相对湿度年平均值为87%，年平均气温13.6 ℃。缙云山多雾，日照时数少，年平均雾日数高达89.8 d，年平均日照时数则低于1 293 h。缙云山地形平缓，土层深厚，土壤肥力高，以三叠纪须家河组厚层石英砂岩、灰质页岩和泥质页岩为木质风化而成的酸性黄壤土为主。试验研究林总面积约为33.5 hm2。保护区主要树种为四川大头茶(Gordonia acuminata)、杉木(Cunninghamia lanceolata)、马尾松(Pinus massoniana)、四川山矾(Symplocos setchuensis)、川杨桐(Adinandra bockiana)、广东山胡椒(Lindera kwangtungensis)、毛竹(Phyllostachys heterocycla)、细齿叶柃(Eurya nitida)等。
2. 试验方法
试验时间为2016年7—9月。具有固定的不透水下垫面和一定粗糙度的坡面称为定床阻力坡面，为了便于测量和控制浅层水流的边界条件，本试验采用坡面定床阻力试验，在模拟天然地表粗糙度的同时也消除了床面形态变化对水流紊动的影响[17-22]。试验对降雨和坡面流共同作用下的坡面薄层流水动力学特性进行研究。
试验水槽结构示意图如图 1所示，试验水槽结构尺度为长4.0 m，宽0.4 m，深0.1 m，在进水口管道安装精度为0.001 m3/h的流量计用于测量流量，每次试验开始前进行流量率定，保证在设计流量允许误差范围内。为模拟缙云山陡坡条件下的坡面流，坡度恒定设置为20°。为保证水流波动仅由水砂纸糙度引起，同时减小水槽边壁对水流的影响，故在水槽侧壁刷清漆，在水槽底部黏贴有机玻璃板，有机玻璃板与水槽侧壁的黏合使用玻璃胶，用刀片将边缘刮平，水砂布黏贴在有机玻璃板上。
通过黏贴水砂布设置4种不同下垫面，其中3种分别为40、60、80目水砂布床面，另外一种为光滑坡面。按照尼库拉兹提出的床面粗糙度(ks)表示方法，试验粗糙度(ks)分别为0.009(光滑坡面)、0.180、0.250、0.425 mm，分别对应缙云山不同土壤粒径的裸土表面。根据重庆缙云山的坡面径流小区监测的产流情况，同时也考虑到尽可能使水深取值范围较大，设计进口放水流量为0.486×10-3、0.694×10-3、1.042×10-3、1.389×10-3和1.736×10-3 m3/(s·m)共5个试验处理。根据重庆缙云山典型降雨强度，设计降雨强度分别为30、60和100 mm/h和无降雨。本试验采用侧喷式降雨机模拟天然降雨。天然降雨的主要特性包括降雨分布的均匀性、降雨强度、雨滴直径大小、雨滴的终点速度等。目前大多数科学试验都是以上述降雨特征作为人工模拟降雨的评价标准[23]。在试验区域内用烧杯收集降雨并采用体积法测量雨量，计算降雨均匀度在85%以上，一般要求0.8以上[24]，部分能达到90%。实际降雨强度与设计降雨强度之差与设计降雨强度的比值为降雨强度误差，其值在5%以内。真实降雨雨滴直径通常为0.1~6.5 mm，本试验降雨强度为30~100 mm/h时，雨滴中数直径为1.32~2.05 mm[25]。天然降雨雨滴的终点速度为2.0~2.9 mm/s，研究表明降雨高度为7~8 m时，95%雨滴达到相应的终点速度[26]；高度大于4.3 m时，大雨滴达到终点速度的80%[27]；具有初速度的下喷式喷头，降雨高度达2 m时，不同直径的雨滴可以获得终点速度[25]。本装置采用喷嘴式喷头(具有初速度)，有效降雨高度为6 m，可以满足2.0~2.9 mm/s的终点速度。降雨试验场次设计采用雨强、粗糙度与放水流量的完全组合试验并重复试验一次，共4×4×5×2=160场降雨。
沿水槽自上而下设纵向水深观测断面3个，分别距槽顶1.0、2.0和3.0 m，每个观测断面横向设3个间距等分观测点(图 1)，即每个工况下测量9次水深，求平均值获得该工况下的平均水深。水深采用水位测针仪测定，精度为0.1 mm。断面表层流速采用KMnO4染色示踪法测定，选择水槽中部实验段3 m测量流速[28]，在水流表面滴入染色剂并记录时间与试验段距离，以此反映坡面流的表层流速，6次重复，求平均值获得该工况下的平均表层流速。
水动力学参数计算公式如表 1。
表 1 水力参数计算Table 1. Calculation of hydraulic parameters公式序号
Formula order No.公式Formula 符号及其意义Symbol and its meaning (1) u=qh u为断面平均流速，m/s；q为单宽流量，m3/(m·s)；h为实测断面平均水深，cm
u is mean velocity, m/s; q is unit discharge, m3/(m·s); h is measured flow depth, cm(2) α=uus α为流速修正系数；us为表层流速，m/s
α is velocity correction factor; us is velocity, m/s(3) u=ηq1−mJn m为流态指数; J为水流坡降，可近似取sin θ; θ为水槽坡度；η和n为拟合函数中的系数
m is flow-state indicator; J is hydraulic slope which closes to sin θ; θ is slope of flume; η and n are coefficient of the fitting function(4) Re=uRv Re为雷诺数；R为水力半径，m，薄层水流可视为二元流，水力半径近似等于断面平均水深h；υ为运动黏滞系数，cm2/s；υ=0.017 75/(1+0.033 7t+0.000 22t2)，t为水温，℃
Re is Reynolds number; R is hydraulic radius, m, overland flow is regarded as binary stream so R closes to h; υ is coefficient of kinematic viscosity, cm2/s. υ=0.017 75/(1+0.033 7t+0.000 22t2). t is water temperature, ℃(5) Fr=u√gh Fr为弗劳德数；g为重力加速度Fr is froude number and g is gravitational acceleration (6) f=8gRJu2 f为阻力系数f is resistance coefficient 3. 结果与分析
3.1 平均流速及流速修正系数
由流量计测得的流量与水槽宽度之比为单宽流量，不同工况下坡面流的平均流速可以通过公式(1)u=qh计算得到，即单宽流量与实测断面平均水深之比，平均流速精度为0.01 m/s，误差为5%。图 2为不同降雨强度下平均流速随单宽流量的变化规律，由图可知降雨时，水流的平均流速随着单宽流量的增大呈幂函数增加趋势，随粗糙度的增加而减小。一般认为，由于雨滴击溅作用产生的附加阻力会使流速减小，而在本试验坡度条件下，降雨对平均流速有增加作用，但是不同降雨强度影响间差异不明显，这可能与陡坡条件下雨滴动量沿坡面分量较大有关[13]。粗糙度和降雨强度相同时，单宽流量增大一倍时平均流速增加68.7%，说明单宽流量对平均流速影响显著。在无降雨条件下，平均流速增幅较为稳定，水流的平均流速随单宽流量的增加呈幂函数增加，随粗糙度的增加而减小。无降雨时水流平均流速与单宽流量和与粗糙度的定性关系与以往结果一致[15, 19-20]。
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图 2 不同降雨强度下平均流速变化规律Figure 2. Variation of average velocity under different rainfall intensities在本试验给定的降雨和坡面流条件下，流量和粗糙度对平均流速影响显著，降雨主要起到扰动坡面流的作用，有增大坡面平均流速的趋势。
流速修正系数表示坡面流平均流速(u)与表层流速(us)的比值，坡面薄层流的水深较薄，难以直接观测水流垂线流速分布，只能通过探究流速修正系数的变化规律间接研究流速的垂线分布。图 3为不同降雨条件下流速修正系数随平均流速的变化规律，由图可知，无降雨时，流速系数随着平均流速的增加而增加，流速修正系数范围为0.04~0.37，数值偏小，且粗糙度间的流速系数差异较小。说明无降雨时坡面流的流速梯度较大，流速分布不均匀，粗糙坡面对底层流速的阻碍作用明显。降雨时，流速修正系数取值范围为0.42~0.98，随着粗糙度的增大而增大，随着平均流速的增加而增加。降雨条件下的流速修正系数数值相对较大且分布较为分散，最大值接近1。
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图 3 不同降雨强度下流速系数的变化规律Figure 3. Variation of flow velocity coefficient under different rainfall intensities表 2为收集和整理的以往试验数据，由表 2可知，降雨时流速修正系数数值偏大，最大值将近1。降雨对坡面流表层水流产生击溅作用，薄层水流内部产生扰动。当降雨强度增大时，薄层流内部扰动越来越大，水流上下层的流速差异越来越小，流速梯度越小。所以，降雨时流速修正系数整体比无降雨条件下的大。
表 2 收集数据及试验数据概况Table 2. Overview of literature datasets and experimental data资料来源
Source of date中值粒径
Median size
(d50)/mm坡度
Slope degree
(J)/(°)降雨强度
Rainfall intensity
P/(mm·h-1)单宽流量
Unit discharges×
10-3(q)/(m2·s-1)水深
Depth of water
(h)/mm雷诺数
Reynolds
number (Re)流速修正系数
Velocity correction
factor (α)文献[13] Literature [13] 1.5~15 0 0.08、0.25 0.27~1.37 320~998 0.40~0.70 文献[13] Literature [13] 1.5~15 30 0.08、0.25 0.31~1.48 409~1 097 0.41~0.67 文献[29] Literature [29] 0.4、0.67 1.2 0 0.01~0.06 0.84~1.33 26~102 0.56~0.61 文献[30] Literature [30] 0.74 3.5、5.5 0 0.13~1.46 2.37~5.79 295~3 188 0.33~0.86 本文This paper 0.009~0.425 20 0 0.49~1.74 0.7~5.9 142~842 0.04~0.37 本文This paper 0.009~0.425 20 30、60、100 0.49~1.74 2.0~6.0 514~1 862 0.42~0.98 从流速修正系数角度同样可以得到粗糙度对流速影响显著，降雨主要起到扰动坡面流的作用。
3.2 流态指数
张宽地等[31]提出流态指数概念，m被认为是与流态相关的指数，流态指数反应了单宽流量对坡面水流流速的影响程度，即水流耗能的主要形式。m值范围在0到1之间，m值越大，水流能留转化为动能较少，此时以阻力做功为主，反之，则以水流转化为动能为主。
由表 3可知，本实验条件下，流态多数在过渡流区，少数处于层流区，流态指数范围为0.291~0.538，平均值为0.418。由表 3和图 4可知，无降雨时，流态指数随着粗糙度的增加而明显减小，随着粗糙度的增大其减小程度分别为21%、28%和39%；中小雨强时，流态指数无明显规律，雨强为30 mm/h时，变化程度分别为18%、-29%和12%，雨强为60 mm/h时，变化程度分别为12%、-17%和-16%；大雨强时，流态指数呈现出较为明显下降的趋势，随着粗糙度的增大其变化程度分别为-6%、1%和-11%。降雨扰动造成了流态的复杂性。坡面水流流态指数m值的影响因素比较复杂[1]，无降雨时，影响水流状态的主要因素为粗糙度，粗糙度较小时，水流水面失稳产生滚波，阻力作功耗能居主要地位，粗糙度较大时，坡面凹凸影响滚波发育，水流紊动强度较低，增加水流流速耗能居主要地位。中小雨强时，流态指数无明显规律，说明降雨是造成流态指数不稳定的关键因素(F=4.55>F0.05=3.86)(见表 4)，降雨对水面的击溅作用扰动水面，增加水流的紊动强度。大雨强时，流态指数呈现出较为明显下降的趋势。说明随着粗糙度的增加，水流从阻力做功耗能居主要地位发展到能量转化动能居主要地位，侧面反应出流速梯度逐渐增大，可能是由于陡坡条件下雨强的击溅对流速有促进作用。
表 3 各实验组次流态指数m的实测值Table 3. Measured m value of different experimental groups粗糙度Surface
roughness/mm降雨强度Rainfall intensity/(mm·h-1) 0 30 60 100 0.009 0.477 0.412 0.398 0.532 0.180 0.378 0.486 0.446 0.501 0.425 0.343 0.291 0.331 0.537 0.380 0.290 0.463 0.334 0.473 表 4 各实验组次流态指数m方差分析Table 4. Variance analysis of m of different experimental groups变异来源Source of variation SS df MS F F0.05 F0.01 粗糙度间Among surface roughness 0.021 3 0.006 9 1.895 3.86 6.99 雨强间Among rainfall intensities 0.050 3 0.016 5 4.549* 3.86 6.99 误差Error 0.033 9 0.003 6 总变异Total variation 0.104 15 注：SS表示平方和；MS表示平均平方和；F表示平方和之比；F0.05和F0.01表示显著水平。Notes: SS represents sum of square; MS represents average sum of square; F is ratio of SS; F0.05 and F0.01 represent significant levels. 无降雨时，在试验粗糙度范围内，较大试验坡度的流态指数随着粗糙度的增加而明显减小，这与张宽地等[1]研究中的变化趋势相同，粗糙度继续增大时流态指数是否增加有待进一步研究。分析本试验的流态指数变化趋势，降雨引起水面失稳并产生滚波，其可能会影响水流流态。潘成忠等[13]认为降雨对断面滚波数具有增加效应，而对波高和波长影响不显著。在坡面薄层水流试验中，滚波可能是进一步的研究重点。
3.3 水流流型流态
水流流区是指坡面内的紊动水能，分为层流区、过渡区和紊流区，根据雷诺数Re判断，水流流型是指坡面流是缓流、临界流还是急流，根据弗劳德数Fr判断[22]。张宽地等[31]综合考虑雷诺数和弗劳德数对水流流态的判断标准，Re=500、Re=2 000和Fr=1将水流分为6区流态(图 5)，分别是缓层流、缓过渡流、缓紊流、急层流、急过渡流和急紊流。将判断流态的雷诺数和判断流型的弗劳德数综合体现于一张图中，能够更为清晰地说明降雨、粗糙度和流量对坡面流状态的综合影响。
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图 5 不同降雨条件下水流流态分区A.缓紊流区; B.缓过渡流区；C.急紊流区；D.缓层流区；E.急过渡流区；F.急层流区。Figure 5. Flow state zoning under different rainfall conditionsA, subcritical turbutent flow; B, subcritical transition flow; C, supercritical turbulent flow; D, subcritical laminar flow; E, supercritical transition flow; F, supercritical laminar flow.陡坡时，在降雨和坡面流胁迫下，水流雷诺数为500~2 000，水流流态均属于层紊流过渡区，且多数属于急流区，少数属于缓流区。说明较大坡度增大了重力方向的分力，水流耗能主要以增加流速为主[13]。图 5a中，ks=0.425 mm时，雷诺数数值上是层流，然而实际中存在滚波现象，不符合“层层不混搀”的层流特性，因而属于“伪层流”[4]。模拟降雨条件下的薄层水流流态与流量密切相关，随着流量的增加，水流流态由层流区向过渡流区延伸[31]。
由图 5可知，粗糙度对坡面薄层流流态起重要作用。无雨时，坡面颗粒越大水流越趋近缓流，这与敬向锋等[22]得到的“床面越粗糙坡面流流态越倾向于向层流区延伸”结果一致。在水流运动过程中，遇到颗粒产生绕流，绕流过程中流速方向改变，流速大小减小，动能减少而阻力作功增加，粗糙程度越大，坡面对水流流动形成的阻力越大，流速减缓越显著。降雨时，粗糙度与流态不再具有相关关系。说明降雨对坡面流的击溅作用使薄层流产生扰动，所以水流流态均不处于层流区，多数处于急过渡流区，扰动程度相对削弱粗糙度对流态的影响。
与无降雨的坡面流相比，有降雨水流更趋向急流，说明降雨起到增加流速的作用。一般认为，由于雨滴击溅作用产生的附加阻力会使流速减小，张宽地等[1]通过试验认为在坡度较大(大于10.5%)条件下，基本上降雨均不同程度地增大表层流速，这与本试验结果一致，可能主要是因为陡坡条件下雨滴动量沿坡面的分量较大有关，能量更多地转化为动能。雨强越大，能够转化为动能的能量越多。
3.4 阻力特征
本试验在降雨条件下通过砂纸模拟下垫面，阻力规律只考虑颗粒阻力和降雨阻力的综合体现。
由图 6可知，坡面薄层流阻力系数与雷诺数呈负相关关系，随着雷诺数的增加阻力系数逐渐减小，且减小的幅度越来越小，最后趋于稳定。说明随着流量的增大，水流克服阻力所消耗的能量增加，而用于坡面侵蚀的能量减小。随着流量的增大，水深增加到一定程度后，坡面水砂纸处于完全淹没状态，由于水砂纸引起的坡面粗糙无法影响到主流区，该工况下阻力系数与雷诺数无关，而是趋近于一个常数。
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图 6 不同降雨条件下阻力系数与雷诺数的关系Figure 6. Relationship of resistance coefficient and Reynolds number under different rainfall conditions降雨对坡面水流阻力系数的影响目前并无定论，吴普特等[32]认为降雨减少水流摩阻系数，但潘成忠等[13]认为降雨对坡面阻力系数无显著影响。本实验中与有降雨相比，无降雨时的阻力系数相对稳定，无明显波动。说明本实验条件下，降雨对坡面阻力系数的影响不显著，降雨主要起到扰动坡面流的作用。进一步地，采用逐步回归分析，定量研究糙度(ks)、单宽流量(q)和降雨强度(P) 3个影响因子对坡面流的阻力贡献率，计算结果见表 5。其中，降雨强度被排除，表明其对阻力系数无显著影响；由自变量系数可知，坡面流阻力系数与粗糙度呈正相关，与单宽流量呈负相关，这与上述的讨论相符合。
表 5 达西阻力系数影响因子的逐步回归分析Table 5. Stepwise regression of impact factors of resistance coefficient模型Model 相关变量Related variable 标准系数
Standardized coefficient自变量系数
Independent variable coefficient标准误差Standard error 常量Constant value 3.022 0.611 粗糙度Surface roughness 10.772 1.454 0.533 单宽流量Unit discharge -3 122.434 488.542 -0.460 已有研究成果表明，当颗粒阻力起主要作用时，阻力系数与雷诺数的幂函数关系 f=aRbe 才成立[10]，为进一步研究降雨强度对坡面流阻力的影响，将本试验模拟降雨条件下裸坡薄层流数据进行拟合，得到阻力计算公式。
f′=2108.19R−1.227eP0.257,R2=0.3977 (7) 将降雨强度的因式去除，拟合得到阻力计算公式。
f′=5938.16R−1.227eP0.257,R2=0.3976 (8) 式中：f′为阻力系数；P为降雨强度(mm/h)。
对比式(7)和式(8)，剔除雨强后，相关系数下降0.01%，说明降雨对坡面阻力系数的影响不显著，降雨主要起到扰动坡面流的作用。王俊杰在模拟降雨条件下得到相关系数下降了7.76%，雨强对于阻力系数的影响不能忽视[21]。这可能是由于下垫面因素不同，与降雨强度大小可能也有关系，降雨对坡面流的作用有待进一步研究。
4. 结论
本实验通过开展陡坡不透水下垫面条件下的模拟人工降雨和水槽放水冲刷试验，基于流态指数和紊动能量耗散规律，定性分析了降雨和坡面流共同作用下的坡面薄层流水动力学特性，得到以下结论。
1) 水流的平均流速随着单宽流量的增大呈幂函数增加，随粗糙度的增加而减小。粗糙度和单宽流量相同时，降雨强度增大一倍引起平均流速的变化程度为15.6%。粗糙度和降雨强度相同时，单宽流量增大一倍引起平均流速的变化程度为68.7%。无降雨时，流速系数随着平均流速的增加而增加，流速系数范围为0.04~0.37，粗糙度间的流速系数差异较小。降雨时，流速系数取值范围为0.42~0.98，随着粗糙度的增大而增大，随着平均流速的增加而增加。降雨条件下的流速修正系数数值相对较大且分布较为分散，最大值接近1。试验降雨下对坡面流起到扰动作用，有增大坡面平均流速的趋势。
2) 流态指数范围为0.291~0.538，无降雨时，流态指数随着粗糙度的增加而明显减小，其减小程度分别为21%、28%和39%；中小雨强时，流态指数无明显规律，雨强为30 mm/h时，变化程度分别为18%、-29%和12%，雨强为60 mm/h时，变化程度分别为12%、-17%和-16%；大雨强时，流态指数呈现出较为明显下降的趋势，其变化程度分别为-6%、1%和-11%。粗糙度继续增大时流态指数是否增加有待进一步研究。降雨引起水面失稳并产生滚波会影响水流流态，所以进一步的坡面薄层水流试验中滚波研究是不可忽略的一部分。
3) 水流雷诺数为500~2 000，所有实验工况下水流流型均属于层紊流过渡区；水流流态整体趋于急流状态；无雨时，粗糙度与流态关系明显，其值越小水流越趋近急流，而降雨时，由于降雨的扰动作用二者不再具有相关关系。
4) 定量研究糙度(ks)、单宽流量(q)和降雨强度(P)3个影响因子对坡面流的阻力贡献率，表明降雨对阻力系数无显著影响，坡面流阻力系数与粗糙度呈正相关关系，与单宽流量呈负相关关系，裸坡条件下考虑雨强影响的坡面流阻力计算公式与剔除雨强的公式相比，相关系数下降0.01%，说明降雨对阻力系数无显著影响，主要起到扰动坡面流的作用。另有研究表明模拟降雨条件下的相关系数下降了7.76%，雨强对于阻力系数的影响不能忽视。所以降雨对坡面流的作用有待进一步研究。
坡面薄层流是坡面径流的初始阶段和侵蚀演变的初始动力，本试验为深入研究降雨和坡面流共同作用下的坡面薄层流水动力学特性提供科学依据，对土壤侵蚀预报模型、水土流失治理方法、泥沙灾害及环境工程等问题均有重要的科学及实践意义。
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图 1 转BpCCR1基因株系PCR检测
M. DL2000；1. 阳性质粒；2. 水对照；3. 野生型（WT）；4 ~ 8. 转正义链株系；9 ~ 22. 转反义链株系。M, DL2000; 1, plasmid control; 2, water control; 3, wild type (WT); 4−8, sense BpCCR1 transgenic line; 9−22, antisense BpCCR1 transgenic line.
Figure 1. PCR detection of BpCCR1 transgenic lines
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图 2 转BpCCR1基因株系qRT-PCR检测
WT. 野生型；CR. 转BpCCR1正义链株系；FCR. 转BpCCR1反义链株系；不同小写字母代表差异显著，P < 0.05。下同。WT, wild type; CR, sense BpCCR1 transgenic lines; FCR, antisense BpCCR1 transgenic lines; different lowercase letters represent significant differences at P < 0.05 level. The same below.
Figure 2. Detection of BpCCR1 transgenic lines by qRT-PCR
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图 3 转基因株系内源BpCCR1基因qRT-PCR分析
Figure 3. Detection of endogenous BpCCR1 transgenic lines by qRT-PCR
表 1 BpCCR1基因及内源BpCCR1基因qRT-PCR引物序列
Table 1 qRT-PCR primer sequence for BpCCR1 gene and endogenous BpCCR1 gene
基因名称 Gene name 正向引物（5′→3′） Forward primer (5′→3′) 反向引物（5′→3′） Reverse primer (5′→3′) 18S rRNA GAGGTAGCTTCGGGCGCAACT GCAGGTTAGCGAAATGCGATAC BpCCR1 AGCATGTGCGAGAACACCATC ACTCATCACTCCAGCAGCCA 内源BpCCR1 Endogenous BpCCR1 CAAGAATGCAGCAGGCAGATAC GAGAGAGGTGACATAAACGGCC 
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表 2 转BpCCR1株系木质素含量多重比较
Table 2 Multiple comparisons of lignin content of BpCCR1 transgenic lines
基因
Gene株系
Line木质素含量 Lignin content/% 木质素单体类型 Type of lignin monomer Klason木质素
Klason lignin酸溶性木质素
Acid-soluble lignin总木质素
Total ligninG S S/G H 正义链
SenseCR15 23.098 ± 0.206a 0.744 ± 0.015a 23.841 ± 0.192a 0.261 ± 0.002cd 0.726 ± 0.002c 2.779 ± 0.035cd 0.012 8 CR13 22.827 ± 0.287ab 0.867 ± 0.158a 23.694 ± 0.160ab 0.280 ± 0.006a 0.715 ± 0.006d 2.552 ± 0.070e 0.004 6 CR4 22.683 ± 0.392ab 0.776 ± 0.012a 23.459 ± 0.399abc — — — — CR11 22.472 ± 0.497ab 0.566 ± 0.035b 23.038 ± 0.506bc — — — — WT 22.042 ± 0.337b 0.845 ± 0.046a 22.887 ± 0.331c 0.259 ± 0.002cd 0.736 ± 0.002b 2.841 ± 0.024bc 0.004 3 CR8 21.284 ± 0.648c 0.879 ± 0.025a 22.163 ± 0.626d 0.243 ± 0.002e 0.752 ± 0.002a 3.101 ± 0.026a 0.005 0 反义链
AntisenseFCR11 24.745 ± 0.065a 0.844 ± 0.061abcd 25.589 ± 0.091a 0.257 ± 0.001d 0.738 ± 0.001b 2.873 ± 0.011b 0.005 0 FCR8 24.338 ± 0.109ab 0.816 ± 0.111bcd 25.154 ± 0.190ab — — — — FCR36 24.323 ± 0.116ab 0.799 ± 0.061cde 25.122 ± 0.128ab — — — — FCR25 23.896 ± 0.500bc 0.933 ± 0.026ab 24.829 ± 0.526b — — — — FCR5 23.617 ± 0.164cd 0.960 ± 0.041a 24.578 ± 0.204bc — — — — FCR13 23.411 ± 0.145cd 0.763 ± 0.043de 24.174 ± 0.139cd 0.267 ± 0.003b 0.729 ± 0.003c 2.725 ± 0.048d 0.003 7 FCR15 23.370 ± 0.049cd 0.738 ± 0.096def 24.108 ± 0.145cd — — — — FCR24 23.248 ± 0.022de 0.666 ± 0.143ef 23.914 ± 0.124d — — — — FCR1 23.206 ± 0.432de 0.733 ± 0.089def 23.938 ± 0.371cd — — — — FCR3 22.708 ± 0.566ef 0.898 ± 0.029abc 23.606 ± 0.541de — — — — FCR32 22.385 ± 0.426fg 0.752 ± 0.048de 23.137 ± 0.395ef — — — — WT 22.042 ± 0.337g 0.845 ± 0.046abcd 22.887 ± 0.331fg 0.259 ± 0.002cd 0.736 ± 0.002b 2.841 ± 0.024bc 0.004 3 FCR2 22.016 ± 0.356g 0.669 ± 0.058ef 22.685 ± 0.380fg 0.262 ± 0.001c 0.734 ± 0.001b 2.796 ± 0.017c 0.004 4 FCR33 22.010 ± 0.497g 0.674 ± 0.037ef 22.683 ± 0.534fg — — — — FCR27 21.772 ± 0.579g 0.611 ± 0.055f 22.383 ± 0.571g — — — — 注：“—” 代表未测定的数据；表中不同字母表示在0.05水平上差异显著；表中数据表示形式为均值 ± 标准差。下同。Notes: “—” stands for unmeasured values. Different letters mean significant difference at P < 0.05 level; data in the table are mean ± standard deviation. The same below.
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表 3 转BpCCR1株系纤维长、宽及基本密度多重比较
Table 3 Multiple comparisons of fiber length, width and basic density of BpCCR1 transgenic lines
基因
Gene株系
Line木纤维 Wood fiber 基本密度
Basic density/(g·cm− 3)长 Length/μm 宽 Width/μm 长/宽 Length/width 正义链 Sense CR15 661.2 ± 55.5b 14.4 ± 2.2b 46.7 ± 3.8b 0.365 5 ± 0.001 1d CR13 657.5 ± 42.4bc 14.9 ± 2.3b 45.0 ± 3.8b 0.392 2 ± 0.001 5b CR4 637.0 ± 52.4c 14.2 ± 2.1b 45.7 ± 3.9b 0.382 0 ± 0.003 9c CR11 652.4 ± 37.9bc 14.7 ± 2.5b 45.4 ± 4.7b 0.382 9 ± 0.008 9c WT 650.4 ± 38.8bc 16.1 ± 1.8a 40.8 ± 2.3c 0.381 0 ± 0.001 3c CR8 798.3 ± 48.2a 15.2 ± 1.9b 53.4 ± 3.9a 0.423 5 ± 0.006 7a 反义链 Antisense FCR11 619.6 ± 38.8cd 15.3 ± 1.9def 41.2 ± 5.4a 0.387 7 ± 0.004 5bcd FCR8 622.2 ± 37.1cd 15.4 ± 1.9def 41.0 ± 5.3a 0.371 9 ± 0.001 3g FCR36 605.9 ± 43.9de 16.7 ± 2.1bc 36.5 ± 3.6b 0.382 1 ± 0.007 9def FCR25 562.3 ± 29.9f 15.1 ± 1.5ef 37.5 ± 3.9b 0.376 4 ± 0.005 2fg FCR5 587.1 ± 37.0e 16.3 ± 2.8bcde 37.0 ± 5.9b 0.387 4 ± 0.002 1bcd FCR13 469.6 ± 30.9h 13.5 ± 1.9g 35.3 ± 4.8bc 0.411 0 ± 0.002 6a FCR15 638.1 ± 31.9bc 17.4 ± 2.7b 37.3 ± 4.9b 0.381 6 ± 0.005 3def FCR24 610.4 ± 58.4d 15.1 ± 2.2f 41.1 ± 5.3a 0.378 0 ± 0.000 4efg FCR1 708.6 ± 55.4a 17.3 ± 2.6b 42.3 ± 4.8a 0.373 3 ± 0.003 0fg FCR3 559.2 ± 51.5f 16.0 ± 2.9cdef 35.9 ± 6.0bc 0.379 1 ± 0.001 9defg FCR32 544.7 ± 37.6f 16.3 ± 2.1bcd 33.7 ± 4.4c 0.386 0 ± 0.007 9cde WT 650.4 ± 38.8b 16.1 ± 1.9cdef 40.8 ± 4.3a 0.381 0 ± 0.001 3def FCR2 640.1 ± 43.9bc 15.6 ± 2.9cdef 42.6 ± 4.8a 0.395 6 ± 0.008 0b FCR33 609.3 ± 40.5d 16.6 ± 2.0bc 37.2 ± 4.5b 0.385 7 ± 0.000 3cde FCR27 496.8 ± 37.9g 18.5 ± 2.2a 27.2 ± 3.6d 0.394 0 ± 0.005 7bc
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表 4 转BpCCR1基因株系树高、地径、胸径及材积多重比较
Table 4 Multiple comparisons of tree height, ground diameter, DBH and volume of BpCCR1 transgenic lines
基因 Gene 株系 Line 树高 Tree height/m 地径 Ground diameter/mm 胸径 DBH/mm 材积 Volume/cm3 正义链 Sense CR13 421.5 ± 21.5a 32.4 ± 1.2ab 16.3 ± 1.2b 400.0 ± 32.2a CR4 402.0 ± 11.5ab 33.2 ± 1.3a 17.7 ± 0.8ab 447.3 ± 30.5a CR15 388.3 ± 26.4abc 30.3 ± 0.9ab 18.0 ± 0.9ab 446.0 ± 39.5a WT 368.8 ± 24.8bc 28.1 ± 1.6b 16.7 ± 0.8b 374.0 ± 20.8a CR11 352.0 ± 10.2cd 30.1 ± 0.2ab 19.6 ± 1.0a 473.3 ± 26.8a CR8 310.5 ± 13.5d 28.3 ± 0.9b 13.8 ± 0.8c 217.6 ± 31.8b 反义链 Antisense FCR2 467.5 ± 14.5a 39.1 ± 1.7a 25.1 ± 1.4a 993.4 ± 41.4a FCR11 460.7 ± 16.2ab 36.1 ± 2.9abc 23.8 ± 0.6a 889.3 ± 33.8b FCR8 440.5 ± 12.5abc 38.4 ± 2.5a 20.0 ± 1.2b 612.6 ± 28.9c FCR36 432.5 ± 16.5bc 31.7 ± 1.7cde 17.7 ± 1.0cd 483.5 ± 40.8de FCR33 420.3 ± 6.7cd 33.4 ± 0.5bcd 19.7 ± 0.5b 571.3 ± 20.4cd FCR27 410.0 ± 10.0cd 37.5 ± 2.2ab 20.5 ± 1.3b 597.4 ± 47.8c FCR32 396.0 ± 6.0de 37.1 ± 0.6ab 18.8 ± 0.0bc 489.6 ± 4.9de FCR5 390.7 ± 17.8def 29.6 ± 2.5de 16.9 ± 0.7cde 398.3 ± 27.4ef FCR1 390.5 ± 12.5def 30.2 ± 0.8de 16.7 ± 0.6de 391.6 ± 21.4ef FCR15 389.0 ± 0.0def 30.5 ± 0.0de 17.0 ± 0.0cde 400.9 ± 0.0ef FCR24 373.0 ± 7.0ef 34.3 ± 1.0abcd 17.8 ± 1.3cd 421.6 ± 38.1ef WT 368.8 ± 24.8ef 28.1 ± 1.6ef 16.7 ± 0.8de 374.0 ± 40.8f FCR3 356.7 ± 10.8f 23.9 ± 1.7f 11.9 ± 0.6g 191.1 ± 8.6g FCR25 310.0 ± 5.0g 30.4 ± 2.1de 15.5 ± 0.5ef 268.5 ± 11.8g FCR13 306.0 ± 36.1g 31.5 ± 1.3cde 14.3 ± 1.6f 233.9 ± 43.2g
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表 5 特征根及标准化特征向量
Table 5 Characteristic roots and standardized eigenvectors
主成分
Main component特征根
Characteristic root方差贡献率
Variance contribution rate/%累积贡献率
Cumulative contribution rate/%性状
Trait因子载荷1
Factor loading 1特征向量1
Standardized eigenvector 1因子载荷2
Factor loading 2特征向量2
Standardized eigenvector 2Y1 2.852 47.526 47.526 树高
Tree height (X1)0.928 0.549 5 − 0.003 − 0.002 5 Y2 1.402 23.373 70.900 胸径
DBH (X2)0.927 0.548 9 0.278 0.234 8 Y3 0.929 15.482 86.382 材积
Volume (X3)0.949 0.561 9 0.275 0.232 3 Y4 0.602 10.038 96.420 总木质素含量
Total lignin content (X4)0.237 0.140 3 − 0.766 − 0.646 9 Y5 0.203 3.391 99.811 纤维长/宽
Fiber length/
width (X5)− 0.155 − 0.091 8 0.404 0.341 2 Y6 0.011 0.189 100.000 密度
Density (X6)− 0.386 − 0.228 6 0.706 0.596 3
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表 6 参试株系综合评价
Table 6 Comprehensive evaluation of each tested lines
株系
Line标准分 Standardized value Y1 排名
RankY2 排名
RankX1 X2 X3 X4 X5 X6 WT − 0.442 3 − 0.375 1 − 0.453 0 − 0.889 7 0.123 7 − 0.369 8 − 0.755 1 16 0.205 0 8 CR4 0.273 2 − 0.064 3 − 0.088 2 − 0.298 7 0.982 9 − 0.288 1 − 0.001 0 9 0.320 5 7 CR8 − 1.698 6 − 1.323 3 − 1.230 8 − 1.636 2 2.334 0 2.859 3 − 3.448 8 20 2.967 4 1 CR11 − 0.804 3 0.553 2 0.040 8 − 0.733 7 0.933 9 − 0.223 6 − 0.253 0 14 0.801 3 4 CR13 0.693 4 − 0.520 5 − 0.323 7 − 0.056 6 0.854 6 0.482 0 − 0.283 1 15 0.416 5 6 CR15 − 0.021 3 0.037 8 − 0.094 8 0.095 1 1.150 5 − 1.545 1 0.216 7 8 − 0.603 4 13 FCR1 0.025 4 − 0.372 2 − 0.365 3 0.195 1 0.381 9 − 0.951 9 − 0.185 7 13 − 0.735 9 14 FCR2 1.684 7 2.323 2 2.627 7 − 1.097 7 0.432 9 0.735 1 3.315 7 1 2.447 9 2 FCR3 − 0.703 7 − 1.912 8 − 1.362 6 − 0.147 3 − 0.748 8 − 0.510 7 − 2.037 5 18 − 1.228 6 18 FCR5 0.029 0 − 0.326 5 − 0.332 0 0.854 3 − 0.559 7 − 0.719 1 − 0.014 3 10 − 1.326 2 20 FCR8 1.102 8 0.672 5 0.734 0 1.449 5 0.154 5 − 1.054 0 1.817 7 3 − 1.187 8 16 FCR11 1.537 4 1.911 1 2.109 8 1.897 7 0.189 5 0.142 9 3.295 5 2 − 0.142 8 11 FCR13 − 1.795 6 − 1.153 0 − 1.149 7 0.438 4 − 0.861 9 1.909 3 − 2.561 4 19 0.027 6 10 FCR15 − 0.007 0 − 0.286 7 − 0.319 3 0.370 0 − 0.497 0 − 0.321 9 − 0.169 5 11 − 0.742 4 15 FCR24 − 0.351 8 − 0.020 7 − 0.216 0 0.170 4 0.163 6 − 0.596 3 − 0.180 8 12 − 0.464 2 12 FCR25 − 1.709 4 − 0.776 8 − 0.977 4 1.113 5 − 0.469 8 0.119 4 − 1.742 8 17 − 1.214 6 17 FCR27 0.445 6 0.822 4 0.658 3 − 1.409 0 − 2.277 5 0.615 7 0.936 8 4 0.846 5 3 FCR32 0.143 9 0.277 5 0.122 0 − 0.631 6 − 1.131 0 0.010 7 0.312 7 7 0.122 2 9 FCR33 0.668 3 0.590 3 0.528 3 − 1.099 3 − 0.523 0 − 0.009 8 0.884 1 5 0.786 5 5 FCR36 0.930 4 − 0.056 2 0.091 9 1.415 8 − 0.633 3 − 0.284 0 0.853 8 6 − 1.295 5 19
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