Effects of stand density on understory species diversity and soil physicochemical properties after close-to-nature transformation management of Chinese fir plantation
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摘要:目的研究近自然化改造下杉木人工林物种多样性和土壤理化性质的相关关系及其动态变化，探究改造后林下植被—土壤系统之间的相互影响关系，评估人工经营措施对杉木人工林群落的生态影响，为该区未来杉木人工林可持续经营提供科学依据。方法以中国林业科学研究院热带林业实验中心3种不同经营模式的杉木近自然改造林分和未经改造的杉木人工纯林作为对照，分析林下灌木和草本群落物种组成、植物多样性水平和土壤理化性质差异及其之间的相关性。结果改造后灌木层和草本层的丰富度、Shannon-Wiener指数、Simpson指数和均匀度指数均高于未改造纯林。土壤理化指标在不同经营模式下变化特征不同，土壤含水量、有机质、全氮、全钾和速效钾含量受采伐影响明显（P < 0.05），均为改造样地大于对照样地，其中有机质含量最高，达56.68 g/kg。土壤含水量、土壤密度与草本植物多样性表现出一定的相关性，而与灌木层多样性指数无显著相关性；有机质与灌木层的Shannon-Wiener指数和丰富度指数均呈现显著正相关（P < 0.05），与草本无显著相关性；pH值与灌草层多样性指数均无显著相关性。结论改造后杉木人工林土壤全氮、全磷、全钾、速效钾有机质和含水量与林下灌草多样性指数的相关性最为密切，建议采伐后保留450 ~ 600株/hm2配合林下30 ~ 40株阔叶树种补植作为该区域经营指标参考，并重视经营措施下的人工林林下植被多样性与土壤理化性质产生的相互关系。Abstract:ObjectiveThis paper analyzes understory species diversity, soil physicochemical traits and their relationships in the close-to-nature management of Chinese fir (Cunninghamia lanceolata) plantation.MethodPlant species composition and diversity (richness index, Simpson index, Shannon index, and Pielou index) in disturbed communities were measured, and the variation of soil properties and their correlation with diversity were evaluated.ResultThe results showed that species density and composition showed significant difference among the shrub layer and herb layer. With the increases of management intensity, species number and diversity in the tree and herb layers first increased, and then decreased. Both of them increased with the increase of density, with the maximum value presented at the model (450−600 tree/ha). Except for soil pH, the concentrations of total nitrogen, total phosphorus, total potassium, available potassium, and organic matter and soil moisture contents were closely related to shrub and herb layer diversity index.ConclusionOur results indicated that there were correlations between soil environmental factors and plant diversity, with the correlations between soil total phosphorus, total potassium, available potassium, organic matter, and species diversity of community being significant. Meanwhile, the moderate intensity of management could increase species diversity in the understory and improve the soil physicochemical property. The results suggest that the density at 450−600 tree/ha and 30−40 tree broad-leaves replanting would be more beneficial to improve the stability of species diversity and soil fertility．
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正常的花器分化发育与果实形成密切相关，围绕植物开花机理国内外均开展了广泛而深入的研究工作。目前，花器分化发育ABCDE模型和四因子模型被人们所熟知并广泛接受[1-3]。花器中的萼片、花瓣、雄蕊、心皮和胚珠由花器官特异性的MIKC型MADS转录因子四聚体复合物所决定，这些转录因子四聚体复合物与相邻的两个DNA顺式元件（CArG盒）相结合，使DNA顺式元件中间的DNA折叠成环[1]。2个A类蛋白APETALA1（AP1）与2个E类蛋白SEPALLATA（SEP）形成的四聚体复合物决定萼片发育；AP1、SEP、B类蛋白APETALA3（AP3）和PISTILLATA（PI）组成的四聚体复合物决定花瓣的发育；SEP、AP3、PI和C类蛋白AGAMOUS（AG）组成的四聚体复合物决定雄蕊的发育；2个SEP与2个AG蛋白组成的四聚体复合物决定心皮的发育；SEP、AG和D类蛋白SHATTERPROOF（SHP）和/或SEEDSTICK（STK）决定胚珠的发育[1]。可见，SEP可能是决定植物胚珠发育的一类重要蛋白。
榛子（Corylus spp.）是桦木科（Betulaceae）榛属（Corylus）植物，由于良好的环境适应性和较高的栽培效益，近年来，榛子成为东北退耕还林后广阔还林地的首选替代树种[4]。正常的胚珠充实是榛子种仁形成的前提与基础，胚珠充实不足可频繁导致瘪仁、空壳果实的形成[5]。清朝梁章钜撰的《巧对录》用“十榛九空”贴切的描述了榛子胚珠充实障碍的频繁程度；实际生产中，东北榛子产区仍采用传统的水选法来筛除空壳、瘪仁果实，通过水选的饱满果实俗称“水漏”。可见，榛子胚珠（种仁）充实障碍是一个历史久远且相当普遍的问题。目前SEP参与榛子胚珠发育的证据还不多。在此前的研究中，已经构建了榛子胚珠不同发育阶段的转录谱[6]；新近，利用PacBio单分子实时测序和Hi-C辅助组装策略，获得并发布了榛子高质量的基因组，并构建了平榛（Corylus heterophylla）基因组数据库HazelOmics，该数据库集成了组装基因组、基因编码序列、蛋白序列和各种注释信息[7]。这些研究为深入研究榛子SEP（ChSEP）基因的功能提供了良好的工作基础。本研究在此基础上，拟鉴定参与榛子胚珠发育的重要作用ChSEP基因，并制备ChSEP的多克隆抗体，开展正常发育与败育胚珠中ChSEP的免疫组织化学分析，以期为深入解析榛子胚珠发育机制提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 研究材料
平欧杂交榛（C. heterophylla × C. avellana）植株种植于吉林省四平市伊通满族自治县榛园，品种为“达维”，树龄12年，株高3.0 ~ 3.5 m。榛子果实有胚珠2枚，未受精时，这2枚胚珠大小相同。受精以后，胚珠大小出现差异，在绝大多数情况下，仅大胚珠发育充实并形成单仁果实，而小胚珠发育停滞，成为败育胚珠。
1.2 研究方法
1.2.1 ChSEP基因家族鉴定及系统发育分析
在榛子基因组数据库HazelOmics（http://122.9.151.76/）中下载蛋白序列，构建本地BioEdit[8]数据库。另外，下载拟南芥（Arabidopsis thaliala）、葡萄（Vitis vinifera）与毛果杨（Populus trichocarpa）的SEP与AGL6（作为外群）蛋白序列。以收集的拟南芥、葡萄与毛果杨的蛋白序列作为查询序列，在自建BioEdit数据库中检索榛子的SEP与AGL6同源蛋白，选择BLASTP程序，参数为E < e−20。同时，使用关键词“SEPALLATA”及“AGL6”在HazelOmics数据库进行序列检索。将检索得到的序列汇总去冗余，于Pfam和CDD[9]在线数据库进行蛋白结构域验证，删除不含SRF-TF结构域和K-box结构域的序列。使用MEGA软件[10]Muscle程序对上述序列进行比对，并用邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建进化树，主要参数设置如下：统计方法为最大似然法，重复次数为1 000次，替换类型为氨基酸，模型为泊松模型。
1.2.2 SEP蛋白特性分析与基因表达热图汇制
此前，以平欧杂交榛（C. heterophylla × C. avellana）‘达维’ 4个发育时期的胚珠为材料，建立了榛子胚珠的基因表达谱[6]，原始测序数据保存于SRA数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=PRJNA591492）。这4个时期包括：胚珠形成期（Ov1），胚珠早期生长期（Ov2）、胚珠快速生长期（Ov3）和胚珠成熟期（Ov4）。使用EvolView[11]绘制ChSEP家族的基因表达热图，基因表达水平根据FPKM（fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments）值确定。采用MEME软件[12]对ChSEP进行蛋白保守结构域预测，motif数量设置为15，长度设置为10 ~ 300 aa。
1.2.3 原核表达载体构建及诱导表达
构建目的基因和载体pMD18-T的重组质粒，进行ChSEP多克隆抗体的制备。以重组质粒为模板，对目的基因N端特异性片段进行PCR扩增，纯化PCR产物，再克隆至pGEX-4T-AB1载体（含His标签）。对克隆后的产物进行PCR检测和测序鉴定，提取阳性质粒并转化至Escherichia coli Rosetta菌株，使用氨苄青霉素选择培养基进行筛选及培养。检菌后，挑取单克隆阳性菌株于液体培养基中培养至菌液OD600达到0.6 ~ 1.0。实验组加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至终浓度为0.8 mmol/L，37 ℃摇床培养4 h；空白对照组加入等量无菌水。收集少量菌体进行菌落聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），检测目的蛋白是否表达。若目的蛋白表达，再将剩余全部菌液离心、收集菌体、重悬、超声波破碎至菌液清澈，离心分离上清和沉淀，通过SDS-PAGE判断蛋白的表达形式，用8 mol/L尿素溶解包涵体蛋白，用His标签蛋白纯化试剂盒（碧云天生物技术有限公司，上海）纯化后，SDS-PAGE鉴定蛋白浓度。
1.2.4 抗体制备和纯化及Western Blot检测
将纯化后的蛋白作为抗原分4次对2只实验级雄性日本大耳白兔进行酶联免疫吸附效价检测，免疫流程见表1。取免疫前兔的耳缘静脉血清作阴性对照，59 d后取等量兔的耳缘静脉抗血清为阳性实验组。在聚苯乙烯板中加入200 ng稀释后的抗原，37 ℃孵育6 h。弃孔内液体，加封闭液，37 ℃湿盒孵育6 h，弃反应液，洗涤液洗涤。将抗血清按不同梯度稀释（1∶1 000 ~ 1∶512 000）后加至反应孔，37 ℃水浴45 min，洗涤。加稀释后的二抗（1∶8 000）进行显色反应，酶标仪测定OD450吸光值并进行效价分析[13]。用pGEX-4T-AB1-ChSEP蛋白作抗原对抗血清亲和纯化后，得到浓缩后的抗体。抗体浓度用Nanodrop 2000/2000 C超微量分光光度计进行检测，纯度用SDS-PAGE进行检测。以ChSEP（N-64-216）蛋白作为抗原，取梯度为10 ng、5 ng、1 ng、500 pg的抗原进行SDS-PAGE分析，抗体（1∶1 000）稀释后进行Western Blot（WB）检测[14]，以确定抗体检测下限。
表 1 免疫流程Table 1. Immunization process过程
Process周期
Cycle剂量
Dose/mg弗氏佐剂
Freund’s adjuvant动物状态
Animal state第1次免疫 1st immunization 第1天 1st day 0.30 完全 Completely 良好 Good 第2 ~ 4免疫 2nd to 4th immunization 第12、26、40天 12th, 26th, 40th day 0.15 不完全 Incompletely 良好 Good 免疫动物采血
Blood collection from immunized animal第59天 59th day 采血正常
Blood collection is normal1.2.5 样品采集与免疫组织化学检测
在6月20日—7月20日取榛子完整果实，解剖获得受精后的发育胚珠与败育胚珠，并置于4%多聚甲醛溶液中固定。将胚珠取出，进行石蜡包埋。将包埋好的组织置于切片机上，切出厚度7 ~ 9 μm的切片，于36 ℃摊片机摊平，并于25 ℃电热板上烤干。选择包含完整组织的切片进行免疫组织化学染色，处理流程如下：二甲苯浸泡30 min脱蜡，体积分数为100%、95%、80%、70%的酒精梯度水化处理玻片，蒸馏水洗净；随后用柠檬酸缓冲液（pH = 6.0）浸泡材料，微波炉加热3 min，冷却后，蒸馏水冲洗；PBS缓冲液处理2次，每次5 min，滴加封闭液封闭，37 ℃恒温箱孵育30 min；吸水纸吸干封闭液，处理组与实验组均加制备获得的一抗（1∶100），40 ℃恒温箱保存过夜；将玻片取出，PBS处理，晾干后，实验组加辣根过氧化物酶标记二抗（1∶100），对照组加蒸馏水，37 ℃孵育30 min；PBS洗净，加DAB（3, 3-N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride）显色剂显色。
2. 结果与分析
2.1 ChSEP基因家族鉴定与进化分析
本研究共鉴定到3条榛子的ChSEP蛋白序列（Cor0142960.1、Cor0054610.1、Cor0008190.1），为了研究ChSEP家族成员之间的系统发育关系，与源自拟南芥、葡萄、毛果杨的17条蛋白序列及榛子的2条AGL6蛋白序列（Cor0152110.1、Cor0119400.1）进行序列比对后构建NJ树。全部22条蛋白序列聚类为2组，包括：AGL2-like和AGL6-like（图1）。其中，ChSEP蛋白序列Cor0054610.1与拟南芥的AtSEP1和AtSEP2聚在同一进化分枝中；ChSEP蛋白序列Cor0142960.1和拟南芥的AtSEP4聚在同一进化分枝中；ChSEP蛋白序列Cor0008190.1和拟南芥的AtSEP3聚在同一进化分枝中；AGL6蛋白序列Cor0152110.1、Cor0119400.1与AtAGL6及AtAGL13等聚在同一进化分枝中（图1）。鉴定到的ChSEP与拟南芥、葡萄、毛果杨的SEP序列的平均相似性分别为67.71%、78.72%、77.07%，其中榛子与葡萄的平均相似性最高。
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图 1 拟南芥、葡萄、毛果杨与榛子SEP蛋白的系统发育分析Figure 1. Phylogenetic analysis of A. thaliana, V. vinifera, P. persica and C. heterophylla SEP proteins2.2 SEP蛋白特性分析与胚珠发育过程中的基因表达变化
从序列相似性来看，Cor0054610.1与Cor0142960.1序列相似性较高，Cor0008190.1与上述2个ChSEP家族成员序列相似性相对较低（图2A）。保守结构域分析结果表明：鉴定到的3条榛子所有的ChSEP蛋白序列均含有SRF-TF与K-box结构域，具有SEP蛋白的典型特征，而且，在3条鉴定到的SEP蛋白中SRF-TF与K-box出现的位置相对接近，这表明SRF-TF与K-box结构域在不同的ChSEP蛋白中高度保守（图2B）。在榛子的胚珠形成期（Ov1）、胚珠早期生长期（Ov2）、胚珠快速生长期（Ov3）和胚珠成熟期（Ov4）进行了连续采样与RNA-seq分析，比较了3个ChSEP基因在4个发育时期基因表达丰度的变化（图2C）。其中，胚珠形成期（Ov1）时榛子还没有完成受精，胚珠早期生长期（Ov2）时榛子完成了受精，胚珠尺寸显著增加[6]。如果某个ChSEP基因参与胚珠发育调控，认为该基因表达丰度不应太低，而且在Ov2期的基因表达丰度可能会显著高于Ov1期。按以上标准进行筛选，认为Cor0054610.1和Cor0008190.1的FPKM值较高，而且Ov2期的基因表达丰度远高于Ov1期，推测这2个基因可能参与榛子胚珠发育调控。进一步考虑到K-box结构域是SEP的重要结构域，而Cor0008190.1的K-box结构域短于Cor0054610.1，关键结构域序列的缩短可能影响蛋白的调控功能，推测Cor0054610.1可能对胚珠发育调控起重要调控作用，但不排除Cor0008190.1及Cor0142960.1可能也具有调控胚珠发育的功能。
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图 2 ChSEP基因家族多重序列比对（A）、保守结构域分布（B）与基因表达模式分析（C）Figure 2. Multiple sequence alignment (A) and the conserve domain distribution (B) and gene expression model of ChSEP gene family (C)2.3 原核表达载体的构建及表达
选择Cor0054610.1（ChSEP）的N-64-216作为抗原的特异性片段，N-64-216区段涵盖K-box保守区，也包含抗原的特异性片段（图2B）。以测序正确的pMD18-T-ChSEP质粒为模板DNA，对目的片段进行PCR扩增，获得的PCR扩增产物长度为459 bp，符合预期（图3A）。将该PCR扩增产物克隆到pGEX-4T-AB1表达载体上，构建pGEX-4T-AB1-ChSEP（N-64-216）重组载体，测序鉴定正确，重组载体构建成功。将阳性pGEX-4T-AB1-ChSEP（N-64-216）重组质粒转化至E. coli Rosetta菌株中进行表达，重组蛋白融合了分子量约33 kDa的组氨酸标签。SDS-PAGE分析结果表明：实验组相比于对照组多1条分子量为45 kDa的特异性条带（图3B），和预期大小相符，表明ChSEP（N-64-216）在E. coli Rosetta菌株中获得成功表达。
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图 3 ChSEP（Cor0054610.1）PCR扩增结果与蛋白表达纯化检测A. PCR扩增结果：1. Marker；2. ChSEP（N-64-216）。B. 蛋白表达及可溶性检测：1. pGEX-4T-AB1空载诱导表达；2. 0.4 mg/mL BSA；3. Marker；4. 上清；5. 上清2；6. 包涵体2倍稀释（8 mol/L尿素溶解）；7. 包涵体10倍稀释（8 mol/L尿素溶解）。C. 纯化检测：1. Marker；2. 0.4 mg/mL 牛血清白蛋白； 3. 包涵体10倍稀释液（8 mol/L尿素溶解）；4. 包涵体5倍稀释液（8mol/L尿素溶解）。A, PCR amplification results: 1, marker; 2, ChSEP (N-64-216). B, protein expression and solubility detection: 1, pGEX-4T-AB1 empty-load-induced expression; 2, 0.4 mg/mL BSA; 3, marker; 4, supernatant; 5, supernatant 2; 6, two times dilution of inclusion bodies (dissolved in 8 mol/L urea); 7, ten times dilution of inclusion bodies (dissolved in 8 mol/L urea). C, purification detection:1, marker; 2, 0.4 mg/mL bovine serum albumin; 3, ten times dilution of inclusion bodies (dissolved in 8 mol/L urea); 4, five times dilution of inclusion bodies (dissolved in 8 mol/L urea).Figure 3. ChSEP (Cor0054610.1) PCR amplification results and detection of protein expression and purification2.4 抗原蛋白的可溶性检测及纯化
菌液经过超声波破碎离心后，分别取上清和沉淀进行ChSEP（N-64-216）抗原蛋白的可溶性检测。SDS-PAGE分析结果显示：在分子量45 kDa处，上清和上清2两条带不清晰，而沉淀中的包涵体经过8 mol/L尿素溶解后，2倍稀释和10倍稀释条件下条带都很清晰。可见，pGEX-4T-AB1-ChSEP（N-64-216）蛋白在包涵体中进行了表达。由于pGEX-4T-AB1-ChSEP（N-64-216）蛋白具有组氨酸标签，所以选择组氨酸蛋白纯化试剂盒对抗原蛋白进行纯化。纯化前，ChSEP（N-64-216）蛋白非特异性条带较多，经过纯化后，非特异性条带基本消失，分子量45 kDa处的特异性条带清晰（图3B和C），包涵体蛋白质量浓度为5 mg/mL时，纯度达到免疫要求，可用于后续免疫实验。
2.5 多克隆抗体的制备及效价分析
2只日本雄性大耳兔注射纯化的ChSEP抗原后，获得ChSEP多克隆抗血清E18305和E18306。将多克隆抗血清按一定浓度梯度稀释后进行酶联免疫吸附检测（表2）。在不同稀释倍数下，抗血清均能与抗原蛋白进行特异性结合并出现显色反应，这表明抗血清均具有较好的免疫原性，根据（OD阳性–OD空白）/（OD阴性–OD空白） > 2.1标准，E18305和E18306抗血清效价均已达到1∶512 000。
表 2 ChSEP（Cor0054610.1）抗血清ELISA效价检测Table 2. ELISA titer detection of ChSEP (Cor0054610.1) antiserum分组 Group 稀释比例 Dilution ratio OD450 （OD阳性−OD空白）/（OD阴性−OD空白）
（ODpositive−ODblank）/（ODnegative−ODblank）E18305 E18306 E18305 E18306 阳性对照 Positive control 1∶1 000 1.365 0 1.448 3 103.48 882.00 1∶4 000 1.230 8 1.384 7 92.25 842.25 1∶8 000 1.082 8 1.247 0 81.43 756.19 1∶16 000 0.902 9 1.142 2 67.38 690.06 1∶32 000 0.720 9 0.968 1 53.16 581.88 1∶64 000 0.533 9 0.767 2 704.86 33.19 1∶128 000 0.352 3 0.548 4 445.43 23.24 1∶256 000 0.2338 0.369 2 276.14 15.10 1∶512000 0.152 3 0.237 2 159.71 9.09 阴性对照 Negative control 1∶1 000 0.053 3 0.038 7 1∶64 000 0.041 2 0.059 1 空白对照 Blank control 0.040 5 0.037 1 2.6 多克隆抗体的纯化及WB检测
亲和纯化用pGEX-4T-AB1-ChSEP蛋白质量浓度为4 mg/mL，与破菌纯化后质量浓度和纯度差异不大，可进行抗原亲和纯化。抗血清用pGEX-4T-AB1-ChSEP蛋白作抗原进行亲和纯化后，得到浓缩后的抗体。多克隆抗血清E18305质量浓度为2.05 mg/mL，E18306质量浓度为2.64 mg/mL，SDS-PAGE电泳后无杂带，纯度高。将抗体按1∶1 000稀释后，加到含10 ng、5 ng、1 ng、500 pg ChSEP抗原的泳道中，进行WB检测（图4）。结果显示：多克隆抗血清E18305和E18306抗体抗原条带分子量在45 kDa左右，与预期相符。多克隆抗血清E18305和E18306抗体经1∶1 000 稀释后，前者在1 ng ChSEP抗原泳道产生清晰条带，在500 pg ChSEP抗原泳道产生模糊条带，认为E18305的检测下限为1 ng ChSEP抗原；E18306抗体在1 ng ChSEP抗原泳道产生的条带较模糊，在5 ng ChSEP抗原泳道产生的条带粗且清晰，认为其检测下限为2 ng左右 ChSEP抗原。
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图 4 ChSEP E18305（A）和E18306（B）抗体的Western Blot检测泳道上方10 ng、5 ng、1 ng、500 pg分别表示该泳道中加有10 ng、5 ng、1 ng、500 pg ChSEP抗原。10 ng, 5 ng, 1 ng and 500 pg above the lane respectively indicate that 10 ng, 5 ng, 1 ng and 500 pg ChSEP antigen have been added to the lane.Figure 4. Western blot detection of ChSEP E18305 (A) and E18306 (B) antibody2.7 正常发育与败育胚珠的免疫组织化学分析
在本研究中，在二抗辣根过氧化物酶的催化下，DAB会产生棕色沉淀，从而显示ChSEP在组织中的表达情况。此前，我们报道了正常发育与败育胚珠的受精过程[5]，认为榛子含2枚胚珠，多数情况下会形成单仁果实。2枚胚珠均会受精，并发育形成幼胚。但败育胚珠生长停滞，无法完成充实[5]。图A1与A2中同时含有败育胚珠与正常发育胚珠，败育胚珠（左）尺寸小，正常发育胚珠（右）尺寸明显较大。与对照A1相比较，A2中发育胚珠ChSEP主要分布于珠被，也分布于幼胚子叶，但子叶中的ChSEP浓度小于珠被（图5A1和A2，B1和B2）；败育胚珠ChSEP主要分布于珠被，珠被内的幼胚有少量ChSEP分布（图5A1和A2，C1和C2）。因此，正常发育胚珠与败育胚珠ChSEP分布特征差异不明显。
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图 5 榛子正常发育与败育胚珠的免疫组织化学分析A1与A2含正常发育与败育2个胚珠，A1为对照，一抗为清水，A2为处理，一抗为ChSEP抗体。B1与B2为正常发育胚珠，B1为对照，一抗为清水，B2为处理，一抗为ChSEP抗体。C1与C2为败育胚珠，C1为对照，一抗为清水，C2为处理，一抗为ChSEP抗体。ov. 败育胚珠；OV. 正常发育胚珠；Int. 珠被；F. 珠柄。A1 and A2 contain two ovules: normal development and abortive ovules. A1 is the control, the first antibody is distilled water, A2 is treatment, and the first antibody is ChSEP antibody; B1 and B2 are normal ovules, B1 is control, the first antibody is distilled water, B2 is treatment, and the first antibody is ChSEP antibody; C1 and C2 are aborted ovules, C1 is the control, the first antibody is distilled water, C2 is treatment, and the first antibody is ChSEP antibody. ov, abortive ovule; OV, normal development ovule. Int, integument; F, funicle.Figure 5. Immunohistochemical analysis of normal development and abortive ovules of hazelnut3. 讨 论
SEPALLATA是一类MADS转录因子，属同源异型蛋白亚家族，参与花发育过程的调节，决定花器与胚珠发育[15]。拟南芥基因组有4个SEP基因，包括：SEP1、SEP2、SEP3和SEP4[16-17]。在sep1 sep2 sep3三重突变体中，原本会发育为花瓣、雄蕊和心皮的原基结果发育成萼片状器官[16]。此外，在sep1 sep2 sep3三重突变体中，花器官生长受到干扰，花器官在第4个轮花中连续产生[16]。由于在单基因突变中很少观察到这种剧烈变异的表型，因此，一般认为SEP存在基因功能冗余[17-18]。本研究在榛子基因组中鉴定到3个ChSEP基因，所有的ChSEP蛋白序列均含有SRF-TF与K-box结构域，且SRF-TF与K-box出现的位置相对接近，认为这些ChSEP基因应当存在基因冗余。在转录水平上，这3个基因在榛子胚珠发育的不同时期均有表达，推测这些ChSEP基因均有可能参与了榛子胚珠的发育调控；其中，Cor0054610.1和Cor0008190.1的表达丰度相对较高，认为这2个基因可能在榛子胚珠发育中起到更重要的调控作用。进一步，在胚珠形成期（Ov1）、胚珠早期生长期（Ov2）、胚珠快速生长期（Ov3）和胚珠成熟期（Ov4）等4个发育期中，Cor0008190.1仅在Ov2期大量表达，表达量远高于其他3个时期，而Ov1、Ov3和Ov4等3个发育时期表达量相比无显著差异，认为该基因可能对受精后胚珠的早期生长有重要调控作用。Cor0054610.1在Ov1 vs Ov2、Ov1 vs Ov3、Ov1 vs Ov4、Ov2 vs Ov3、Ov2 vs Ov4这5种比较中均存在明显差异，推测Cor0054610.1可能广泛参与胚珠形成、早期生长、快速生长等生物学过程的调控。Cor0054610.1与拟南芥的SEP1与SEP2序列相似性高，成功制备了Cor0054610.1的多克隆抗体，开展了SEP的免疫组化定位分析，结果表明，ChSEP在胚珠的珠被及子叶等部位表达。因此，本研究在转录与蛋白水平上提供了ChSEP参与榛子胚珠发育调控的证据。
榛子是壳斗目（Fagales）植物，果实发育经历特殊的延迟受精过程[19-20]。在雌花开放时，榛子的子房还没有形成，需要等到花粉管进入柱头基部以后，子房原基才逐步发育，开始形成子房。随后，胚珠逐步发育，胚囊成熟，此时，在柱头基部长期驻留的花柱管恢复生长，进入胚囊完成受精作用。因此，榛子花粉管呈间歇性生长特征，受精时间耗时约2个月左右，远长于多数被子开花植物[19]。榛子含有2枚胚珠，可能存在3种情况。（1）1枚胚珠发育充实，1枚胚珠发生败育，形成单仁果实，在多数情况下榛子果实的确只含有1枚可食用的种子。（2）2枚胚珠同时发育充实，形成双仁果实，这种情况偶尔发生。（3）2枚胚珠均不发育充实，形成空壳果实[5]，果园中如果空壳果实大量形成，会导致严重的产量损失。单仁果实中存在1枚败育胚珠，而空壳果实中存在2枚败育胚珠，败育胚珠中均可观察到明显的胚结构，表明它们已经完成了受精，但营养物质运输受阻导致胚珠发育停滞[5, 21]。可见，胚珠败育在榛子果实生长过程中普遍发生。E 类SEP基因可与B、C和D类MADS-box基因进行协作并共同参与植物花果发育的调控[22]。在苹果（Malus pumila）中，SEP1/2的基因敲除导致花瓣变为萼片，果实尺寸变小[23]；枣（Ziziphus jujuba）和桃（Amygdalus persica）的基因组中各有3个SEP基因，实时荧光定量分析表明其在花和果实中表达[22, 24]。因此，目前SEP参与植物育性的证据多来自假果，如苹果、枣和桃等，其表达部位的证据一般来自实时定量分析或遗传转化后花果形态变化，少有SEP蛋白的免疫组织化学证据。榛子果实是真果，由子房发育而来。为确定ChSEP在胚珠败育过程中的调控作用，排除免疫组织化学分析中染色时间差异对研究结果的影响，特别选用同时含有败育胚珠（小胚珠）和正常发育胚珠（大胚珠）榛子幼果为材料，对比研究ChSEP分布特征的差异。结果表明，ChSEP在珠被中的表达量相对较高，而子叶表达量相对较低，认为ChSEP参与榛子珠被、子叶的发育调控，对榛子果实发育有重要影响，这与前人关于SEP基因参与植物花果发育调控的研究结果相一致。SEP参与番茄（Lycopersicon esculentum）育性的调控[25]。番茄的TM29与拟南芥的SEP1/2/3高度同源，在所有四轮花器官的原基中均有mRNA积累。通过共抑制或反义RNA干扰技术抑制了TM29的基因表达，转基因植株的内三轮花器官发生变化，且转基因番茄出现雄蕊和子房不育，还出现单性结实现象[25]。类似的，TM5 RNA表达受干扰后也会导致单性结实现象的发生[26]。综上，认为番茄SEP的直系同源基因通常都会限制单性结实果实的发育[25]。在本研究中，榛子发育胚珠与败育胚珠的ChSEP分布特征类似，意味着ChSEP似乎没有参与胚败育调控，这与番茄中SEP基因敲除导致单性结实（种子不可育）的结论并不一致，这应该与两者在果实结构及果实发育过程的差异有关。本研究完成了Cor0054610.1的抗体制备与免疫组织化学分析，另一个重要的SEP基因（Cor0008190.1）是否参与榛子胚败育调控还需进一步的研究。
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图 1 不同经营模式林下物种多样性指数
S为丰富度指数；H为Shannon-Wiener指数；E为Simpson指数；D为Pielou指数。S, richness index; H, Shannon-Wiener index; E, Simpson index; D, Pielou index.
Figure 1. Species diversity index of understory vegetation under different management models
表 1 样地设置与经营试验设计表
Table 1 General situation and management operation of each sample plot
经营模式
Management model样地
Sample plot坡度
Slope/(°)海拔
Altitude/m改造前株数/
（株·hm− 2）
Pre-thinning density/
(tree·ha− 1)计划保留株数/
（株·hm− 2）
Planed density/
(tree·ha− 1)改造后株数/
（株·hm− 2）
Post-thinning density/
(tree·ha− 1)平均胸径
（2016）
Average DBH/cm平均树高
（2016）
Average tree height/mHT I-B1-B4 20 ~ 40 350 ~ 400 1 245 225 ~ 300 287 14.38 13.55 MT Ⅱ-B1-B4 20 ~ 40 350 ~ 400 1 213 450 ~ 600 559 14.43 12.79 LT Ⅲ-B1-B4 20 ~ 40 350 ~ 400 1 126 600 ~ 750 730 14.55 13.71 CK CK-B1-B4 20 ~ 40 350 ~ 400 1 219 1 219 1 219 14.29 13.11 注：HT代表间伐后保留225 ~ 300 株/hm2；MT代表采伐后保留450 ~ 600 株/hm2；LT代表采伐后保留600 ~ 750 株/hm2；未改造林分为CK；下同。Notes: HT, planed density is 225−300 tree/ha；MT, planed density is 450−600 tree/ha；LT, planed density is 600−750 tree/ha; CK, unthinned stand. The same below. 
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表 2 样地林下灌木种类与重要值
Table 2 Understorey shrub layer species and important values (IV) of sample plots
物种 Species 重要值 IV CK HT MT LT 合欢 Albizia julibrissin 26.67 11.39 12.50 19.87 大青 Clerodendrum cyrtophyllum 33.70 21.55 81.28 62.09 方叶五月茶 Antidesma ghaesembilla 5.43 35.22 33.21 12.88 野漆 Toxicodendron succedaneum 18.36 8.70 10.4 13.33 大叶算盘子 Glochidion lanceolarium — 22.34 18.21 9.34 猪肚木 Canthium horridum — 9.23 12.98 2.71 水东哥 Saurauia tristyla — 1.11 21.01 3.12 三叉苦 Melicope pteleifolia — 21.04 27.88 23.21 鸭脚木 Schefflera minutistellata — 2.13 5.01 2.51 水锦树 Wendlandia uvarufolia — 2.22 2.28 3.14 九节 Psychotria rubra — 22.41 33.14 13.28 粗叶榕 Ficus hirta — 1.98 0.67 — 山乌桕 Triadica cochinchinensis — 1.51 0.86 — 枫香 Liquidambar formosana — 2.98 1.36 — 毛黄肉楠 Actinodaphne pilosa — — 14.01 — 黄毛榕 Ficus esquiroliana — — 10.48 — 山苍子 Litsea cubeba — — 0.97 — 簕党花椒 Zanthoxylum avicennae — — 1.34 — 油茶 Camellia oleifera — — 1.26 — 杜茎山 Maesa japonica — — 1.44 —
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表 3 样地林下草本种类与重要值
Table 3 Understorey herb layer species and important values of sample plots
物种 Species 重要值 IV CK HT MT LT 铁芒箕 Dicranopteris dichotoma 22.35 32.38 12.79 13.08 半边旗 Pteris semipinnata 97.08 22.13 24.87 38.12 扇叶铁线蕨 Adiantum flabellulatum 37.88 26.74 12.34 20.01 五节芒 Miscanthus floridulus 22.13 58.16 41.49 33.28 蔓生莠竹 Microstegium vagans 12.31 62.61 53.76 62.98 东方乌毛蕨 Blechnum orientale 11.31 15.88 23.11 21.98 淡竹叶 Lophatherum gracile 1.23 — 0.96 1.71 细圆藤 Pericampylus glaucus — — 2.21 — 两面针 Zanthorμlum nitidum — — 2.11 — 酸藤子 Embelia laeta — — 2.81 1.03 蜈蚣草 Pteris vittata — — 1.81 1.22 断肠草 Gelsemium elegans — — 1.51 —
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表 4 样地林分土壤理化性质变化情况
Table 4 Change of soil physicochemical indicators (mean ± SE) in sample plot stand
改造处理 Improved treatment HT MT LT CK pH 3.87 ± 0.13a 3.96 ± 0.11a 4.11 ± 0.21a 4.26 ± 0.15a 含水量 Moisture content 18.34 ± 0.18b 27.13 ± 0.31a 22.33 ± 0.72a 20.62 ± 0.47a 土壤密度 Soil density/(g·cm− 3) 1.77 ± 0.02a 1.52 ± 0.09a 1.42 ± 0.03a 1.48 ± 0.02a 有机质 Organic matter/(g·kg− 1) 29.83 ± 8.9c 56.68 ± 6.7a 47.57 ± 5.9b 26.62 ± 9.3c 全氮 Total nitrogen/(g·kg− 1) 1.54 ± 0.11b 1.69 ± 0.20a 1.59 ± 0.13b 1.53 ± 0.29b 全磷 Total phosphorus/(g·kg− 1) 0.19 ± 0.02a 0.22 ± 0.01a 0.24 ± 0.08a 0.28 ± 0.02a 速效磷 Available phosphorous/(mg·kg− 1) 2.18 ± 1.1a 2.26 ± 1.2a 2.45 ± 1.3a 2.49 ± 0.4a 全钾 Total potassium/(g·kg− 1) 5.04 ± 1.63b 5.81 ± 1.34b 4.97 ± 1.73b 6.18 ± 2.79a 速效钾 Available potassium/(mg·kg− 1) 68.57 ± 21.48b 76.57± 3.1b 74.13 ± 21.4b 88.59 ± 35.2a 注：不同小写字母代表差异显著(P < 0.05)。下同。Notes: different small letters in the same column indicate significant difference. The same below.
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表 5 灌木和草本层多样性指数与土壤理化性质相关分析
Table 5 Correlation analysis between diversity indices of shrub and herb layers and soil physicochemical properties
多样性指数
Diversity indexpH 含水量
Moisture
content土壤密度
Soil density有机质
Organic
matter全氮
Total
nitrogen全磷
Total
phosphorus速效磷
Available
phosphorus全钾
Total
potassium速效钾
Available
potassium灌木层
Shrub layerS − 0.15 0.15 − 0.19 0.58* 0.73** 0.75* 0.45 0.84** 0.81* H − 0.18 − 0.11 − 0.36 0.64* 0.85* 0.54 0.58 0.76* 0.74** D − 0.12 0.33 0.05 0.51 0.62** 0.68* 0.14 0.69* 0.81 E − 0.06 − 0.60 0.41 0.22 0.26 0.39 − 0.27 0.73 0.63 草本层
Herb layerS 0.28 0.76* − 0.73** 0.32 0.83* 0.79* 0.47 0.52* 0.61 H 0.53 0.18 − 0.10 0.21 0.46 0.48 0.49* 0.44 0.55 D 0.17 0.26 − 0.03 − 0.23 0.32 0.39 0.34 0.30 0.41 E 0.32 0.16 0.02 0.31 0.47 0.69 0.57 0.29 0.36 注：*代表相关性达到显著水平，P < 0.05；**代表相关性达到极显著水平，P < 0.01。Notes: * represents significant correlation at P < 0.05 level, ** represents significant correlation at P < 0.01 level.
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