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青黑杨杂种三倍体花粉母细胞减数分裂染色体行为及其花粉变异研究

李代丽 商静 田菊 宋连君 刘春和 李迎春 康向阳 王君

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青黑杨杂种三倍体花粉母细胞减数分裂染色体行为及其花粉变异研究

    作者简介: 李代丽。主要研究方向:林木倍性育种。Email:daili_81@126.com 地址:102601 北京市大兴区礼贤镇东黄垡村北北京市黄垡苗圃.
    通讯作者: 王君,教授,博士生导师。主要研究方向:林木细胞遗传学与染色体工程育种。Email:wangjun@bjfu.edu.cn 地址:100083 北京市海淀区清华东路35号北京林业大学118信箱
  • 中图分类号: S722.3+5;S792.11

Meiotic chromosome behavior of pollen mother cells and pollen variation in triploid hybrid between section Tacamahaca and sect. Aigeiros of Populus

图(3)表(1)
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-02-28
  • 录用日期:  2019-05-04
  • 网络出版日期:  2019-07-01
  • 刊出日期:  2019-07-01

青黑杨杂种三倍体花粉母细胞减数分裂染色体行为及其花粉变异研究

    通讯作者: 王君, wangjun@bjfu.edu.cn
    作者简介: 李代丽。主要研究方向:林木倍性育种。Email:daili_81@126.com 地址:102601 北京市大兴区礼贤镇东黄垡村北北京市黄垡苗圃
  • 1. 北京林业大学林木育种国家工程实验室,林木花卉遗传育种教育部重点实验室,生物科学与技术学院,北京 100083
  • 2. 北京市黄垡苗圃,北京 102601
  • 3. 威县林木良种繁育基地,河北 威县 054700

摘要: 目的本研究通过分析青黑杨杂种三倍体的花粉母细胞减数分裂特征和配子变异规律,为进一步利用三倍体种质作为中介材料进行杨树染色体工程育种奠定基础。方法本研究以雌配子染色体加倍来源的‘哲引3号杨’ × ‘北京杨’杂种三倍体WT-21及杂种二倍体WD-2雄株为材料,基于醋酸洋红染色压片观察,比较分析了两者花粉母细胞减数分裂染色体行为及花粉形态变异。结果(1)无论是三倍体杂种WT-21还是二倍体杂种WD-2,其花粉母细胞减数分裂染色体行为均非常丰富,存在高频率的染色体提前分离、落后染色体、微核等异常现象,反映了亲本基因组间较强的异质性。(2)WT-21和WD-2花粉母细胞减数第二次分裂过程均存在平行纺锤体、融合纺锤体、三极纺锤体等异常定向,而且在WT-21中还发生胞质提前分裂,共同导致减数分裂产物中二分体、三分体等的产生。(3)三倍体WT-21的花粉空瘪率达44.55%,高于二倍体WD-2;WT-21饱满花粉的直径显著大于WD-2,从花粉直径分布可推测出WT-21能产生少量未减数花粉;WT-21的花粉生活力为(1.08 ± 0.44)%,显著低于二倍体WD-2(28.67% ± 2.04%)。结论由于倍性效应和杂合性的双重影响,青黑杨杂种三倍体的花粉母细胞减数分裂存在复杂的染色体行为,并对配子发育造成影响;利用三倍体的花粉进行授粉,可能获得非整倍体和四倍体后代,为杨树染色体操作奠定基础。

English Abstract

  • 三倍体植物由于减数分裂过程中同源染色体的不规则分离,往往导致高度败育性,容易形成生殖隔离,因此三倍体在一定程度上被认为是植物进化的终点[1]。但是,在杨树(Populus spp.)多倍体育种研究实践中,三倍体也多次被作为桥梁亲本,形成了三倍体、四倍体甚至非整倍体后代,表明杨树三倍体在多倍体种质创新中也可能具有利用价值。其中,Johnsson[2]、Winton等[3]、Harder等[4]均利用三倍体欧洲山杨(P. tremula)与美洲山杨(P. tremuloides)进行杂交,获得了一批三倍体、四倍体和非整倍体种质。康向阳等[5]利用三倍体杂种毛白杨((P. tomentosa × P. bolleana)× P. tomentosa)与毛新杨(P. tomentosa × P. bolleana)、银腺杨(P. alba × P. glandulosa)杂交获得了杂种后代。Wang等[6]研究了三倍体‘银中杨’(P. alba × P. berolinensis ‘Yinzhong’)的花粉变异规律及其细胞学机制,并通过与毛新杨授粉杂交获得了一批倍性水平变异丰富的新种质。然而,这些研究均仅针对白杨派(section Populus)树种,由于研究材料的缺乏,其他杨树的相关研究较少。

    青杨派(sect. Tacamahaca)与黑杨派(sect. Aigeiros)树种之间杂交易产生杂种优势,已有很多杂交品种在林业生产中广泛应用[7]。近年来,青黑杨杂种三倍体育种技术取得突破,获得了一批青黑杨杂种三倍体种质[8-9],为实现杂种优势和倍性优势的综合利用奠定了基础。部分种质定植后已进入生殖发育期,为我们开展青黑杨杂种三倍体的生殖发育特征研究提供了材料,也为利用三倍体种质作为桥梁材料实现染色体剂量操作等提供了可能。本研究以前期通过大孢子染色体加倍途径获得的青黑杨杂种三倍体及相同杂交组合二倍体雄株为材料,比较了它们的花粉母细胞减数分裂过程染色体行为及花粉形态变异等特征,探讨了其配子变异发生的细胞学机制,为青黑杨三倍体种质的有性利用提供了依据。

    • 试验材料为‘哲引3号杨’(P. pseudo-simonii × P. nigra ‘Zheyin3#’)经雌配子染色体加倍后与‘北京杨’(P. × beijingensis)杂交获得的三倍体WT-21以及相同杂交组合的二倍体雄株WD-2[9]。花枝采集于河北威县林木良种繁育基地10年生无性系对比试验林,用塑料薄膜包裹严密,运至北京避风低温贮藏备用。

    • 将花枝水培于温室(10 ~ 20 ℃),促进花芽发育。每隔3 h用卡诺固定液(V(乙醇):V(乙酸) = 3:1)固定3个花芽,4 ℃固定24 h后转移至70%乙醇溶液保存。采用醋酸洋红压片法跟踪小孢子母细胞减数分裂进程,直至减数分裂结束后停止固定。

      对固定的花芽利用醋酸洋红染色压片观察,统计不同减数分裂时期的染色体行为,对染色体提前分离、落后染色体、染色体桥、微核、平行纺锤体等异常的染色体行为进行统计。在四分体时期,对单分体、二分体、三分体等异常减数分裂产物类型进行统计。根据正常减数分裂产物占统计减数分裂产物总数的百分率计算减数分裂指数[10]

    • 将花粉利用醋酸洋红染色,制作临时涂片,在Olympus BX51光学显微镜下随机观察1 000粒以上的花粉,统计空瘪花粉比例,并利用目镜测微尺测量饱满球形花粉的直径。图片采集利用Olympus DP70系统完成。

    • 收集新鲜花粉,利用固体培养基离体萌发法,将花粉均匀撒播于包含3%(w/v)琼脂和15%(w/v)蔗糖的培养基上,置于25 ℃培养箱中培养24 h后观察花粉萌发率,重复3次。

    • 数据统计利用R软件完成[11]。由于三倍体和二倍体无性系的花粉直径方差不齐次,因此,采用Wilcoxon秩和检验比较花粉直径的差异显著性水平;花粉萌发率的比较采用t检验。

    • 利用醋酸洋红染色压片法观察发现,无论三倍体杂种WT-21还是二倍体杂种WD-2,其花粉母细胞减数分裂过程均存在丰富的染色体行为异常现象(表1)。减数分裂中期I,染色体提前分离(图1A)的现象普遍发生,在WT-21和WD-2中分别占56.54%和57.49%。后期I,落后染色体(图1B)现象在三倍体WT-21的观察频率为39.02%,低于二倍体WD-2的63.19%;染色体桥(图1C)现象的观察频率在二者间差异不大,分别为15.14%和13.19%。末期I,WT-21和WD-2均观察到较多具有微核(图1D)的花粉母细胞存在,分别占20.98%和42.48%。后期II,在WD-2中观察到较高频率的落后染色体(图1E)和染色体桥现象,分别占36.24%和14.33%,均高于在WT-21上观察到的发生频率(分别为15.08%和3.07%)。末期II,WT-21观察到花粉母细胞内存在微核(图1F)的频率为44.92%,而WD-2为12.60%。

      图  1  杂种三倍体WT-21花粉母细胞减数的异常染色体行为

      Figure 1.  PMC abnormal meiotic chromosome behaviors of triploid hybrid WT-21

      表 1  杂种三倍体WT-21与同组合二倍体WD-2的花粉母细胞减数分裂异常现象

      Table 1.  PMC meiotic abnormalities in triploid hybrid WT-21 and diploid hybrid WD-2

      减数分裂时期
      Meiotic stage
      减数分裂异常现象
      Abnormality of meiotic
      WT-21WD-2
      观察细胞个数
      Number of observed PMCs
      异常细胞比率
      Percentage of abnormal PMCs/%
      观察细胞个数
      Number of observed PMCs
      异常细胞比率
      Percentage of abnormal PMCs/%
      中期 I
      Metaphase I
      染色体提前分向两极
      Precocious chromosome migration
      451 56.54 734 57.49
      后期 I
      Anaphase I
      落后染色体
      Lagging chromosomes
      469 39.02 288 63.19
      染色体桥
      Chromosome bridge
      15.14 13.19
      末期 I
      Telophase I
      微核
      Micronuclei
      448 20.98 452 42.48
      中期 II
      Metaphase II
      胞质分裂提前
      Premature cytokinesis
      509 13.56 564 0.00
      平行纺锤体
      Parallel spindle
      29.27 25.53
      融合纺锤体
      Fused spindle
      1.38 1.24
      三极纺锤体
      Tripolar spindle
      29.67 0.18
      后期 II
      Anaphase II
      胞质分裂提前
      Premature cytokinesis
      358 20.11 356 0.00
      落后染色体
      Lagging chromosomes
      15.08 36.24
      染色体桥
      Chromosome bridge
      3.07 14.33
      末期 II
      Telophase II
      胞质分裂提前
      Premature cytokinesis
      472 6.99 516 0.00
      微核
      Micronuclei
      44.92 12.60
      减数分裂产物
      Meiotic products
      单分体
      Monad
      1 265 1.03 1 230 0.16
      具微小孢子的单分体
      Monad with microcytes
      1.03 0.00
      二分体
      Dyad
      6.72 3.33
      具微小孢子的二分体
      Dyad with microcytes
      25.22 0.57
      三分体
      Triad
      7.35 4.07
      具微小孢子的三分体
      Triad with microcytes
      9.17 0.33
      具微小孢子的四分体
      Tetrad with microcytes
      23.09 0.00
      减数分裂指数
      Meiotic index
      26.39 91.54
    • 减数第二次分裂过程的纺锤体异常定向往往对配子发育造成重要影响。在减数分裂中期II,无论对于三倍体WT-21还是WD-2,均观察到不同频率的平行纺锤体、融合纺锤体和三极纺锤体等异常定向现象存在(图2A2B2C)。3种类型纺锤体定向异常现象在WT-21上的观察频率分别为29.27%、1.38%和29.67%,其中平行纺锤体与融合纺锤体的频率与WD-2(分别为25.53%和1.24%)差别不大,三极纺锤体的频率则远高于WD-2的0.18%。

      图  2  杂种三倍体WT-21花粉母细胞减数第二次分裂的纺锤体定向与胞质分裂异常

      Figure 2.  Abnormal spindle orientation and cytokinesis during the PMC second meiotic division of triploid hybrid WT-21

      整个减数第二次分裂过程中,均在三倍体WT-21的花粉母细胞中观察到不同程度胞质提前分裂(图1E1F图2D)现象的存在,却未发现二倍体WD-2具有胞质提前分裂现象的细胞。进一步对减数分裂产物进行分析,发现三倍体WT-21花粉母细胞经减数分裂后除产生四分体外,还能形成单分体、二分体、三分体,以及具微小孢子的单分体、二分体、三分体和四分体等特殊类型(图2E ~ 2I),其中具微小孢子的二分体和四分体类型最多,观察频率分别为25.22%和23.09%,表明WT-21减数分裂后胞质分裂过程存在明显异常。与之相比,WD-2的减数分裂产物中尽管也观察到了单分体、二分体、三分体以及具微小孢子的二分体和三分体等现象,但其异常频率均相对较低。对比两者的减数分裂指数可知,二倍体WD-2(91.54%)明显高于三倍体WT-21(26.39%)。

    • 对新收集的花粉进行形态观察,发现三倍体杂种WT-21存在较高的空瘪率,达44.55%,而二倍体杂种WD-2的空瘪率为30.29%。对饱满花粉直径进行测量后,发现WT-21的花粉直径在19.5 ~ 68.4 μm之间,平均直径为(34.40 ± 0.20)μm;而WD-2的花粉直径变化范围小于WT-21,为24.9 ~ 43.8 μm,平均直径为(30.55 ± 0.07)μm(图3A3B)。利用Wilcoxon秩和检验发现WT-21和WD-2的花粉直径存在极显著差异(P < 2.2e− 16)。

      图  3  杂种三倍体WT-21与二倍体WD-2的花粉大小和生活力变异

      Figure 3.  Variation of pollen size between triploid hybrid WT-21 and diploid hybrid WD-2

      利用离体萌发法对花粉生活力进行测试,三倍体WT-21花粉活力为(1.08 ± 0.44)%(图3C),二倍体WD-2花粉活力为(28.67 ± 2.04)%(图3D),两者存在极显著差异(P = 0.004 0)。

    • 异源多倍体植物,由于受到杂合性和多倍性因素的双重影响,其减数分裂过程往往具有非常复杂的染色体行为。Wang等[6,12]在对毛白杨异源三倍体以及‘银中杨’的研究中,观察到花粉母细胞减数分裂过程中有高频率的染色体提前分离、落后染色体和微核等现象发生。本研究中,无论是青黑杨杂种二倍体还是三倍体,其花粉母细胞减数分裂过程均可观察到大量的染色体提前分离、落后染色体、染色体桥、微核等现象,表明这些复杂的染色体行为异常现象可能主要与异源基因组融合形成的高度杂合性有关。尤其是二倍体杂种WD-2在后期I和后期II时期落后染色体的发生频率明显高于三倍体杂种WT-21,推测可能是由于形成三倍体后,染色体联会和配对特征受到影响,相对易于形成II + I型染色体联会状态,其中单价体形成落后染色体,而二倍体杂种由于高度杂合性影响,相对易于形成I + I型状态,单价体数量更多。

      对于通常呈现同时型胞质分裂(Simultaneous cytokinesis)的杨树而言,减数第二次分裂过程中胞质分裂提前是一个非常值得探讨的现象。在一些杂种或者杂种起源的杨树以及部分异源三倍体品种中,如毛白杨、‘百九杨’(P. deltoides × P. nigra ‘Baijiu’)、‘群众杨’(P. × popularis)、‘银中杨’等,花粉母细胞减数分裂过程均可观察到不同频率的胞质分裂提前现象[6,10,13-14]。本研究在青黑杨杂种三倍体WT-21的花粉母细胞中观察到了胞质分裂提前现象,但是在杂种二倍体WD-2中却并未观察到该现象的发生,说明胞质分裂提前现象并不与杂种直接相关。在马铃薯(Solanum tuberosum)中,胞质提前分裂被认为是受隐性单基因所控制,并导致第二次胞质分裂缺失,从而形成未减数配子[15]。如果在杨树中存在类似的机制,那么在杂种三倍体和二倍体中,只有在该位点隐性纯合时才表现为胞质提前分裂现象。

      减数第二次分裂过程中纺锤体定向异常可能导致核复原,从而形成未减数配子[16]。通常,具有融合纺锤体和三极纺锤体的花粉母细胞会分别倾向于发育为二分体和三分体[17]。至于平行纺锤体对于未减数配子形成的作用,则并不绝对。在苜蓿(Medicago sativa[18]和甘薯(Ipomoea batatas[19]等植物中,平行纺锤体的发生频率与二分体的发生频率呈正相关。但是,对于马铃薯[20]、毛白杨[21]等植物,平行纺锤体和二分体的发生频率间则并没有显著相关性。本研究中尽管青黑杨杂种三倍体WT-21和杂种二倍体WD-2均产生了25%以上具有平行纺锤体的花粉母细胞,但是在WT-21的减数分裂产物中却观察到31.94%的二分体和具微小孢子的二分体,其频率与平行纺锤体和融合纺锤体的总和相当,推测在WT-21中,平行纺锤体可能较多地发育成了二分体;而WD-2的减数分裂产物中二分体和具微小孢子的二分体的发生频率和仅为3.90%,推测大部分平行纺锤体并未发育为二分体。该现象可能与多倍化对染色体行为的影响有关。

      本研究发现青黑杨杂种三倍体WT-21和杂种二倍体WD-2的花粉母细胞减数分裂产物中均存在单分体、二分体、三分体以及带有微小孢子的减数分裂产物等变异类型,三倍体表现出更高的变异程度。其中,单分体、二分体及三分体的产生与花粉母细胞减数分裂过程中的胞质分裂异常及纺锤体定向异常等现象相关[15,22]。而微小孢子的形成则可能是落后染色体形成的微核进一步发生胞质分裂的结果[10,12]。微小孢子的形成实际可能是染色体排斥的一种机制和结果。一些异质性较强的染色体由于联会失败或者分裂节律的差异,在细胞周期过程中受到排斥,部分染色体不能形成细胞骨架网络,可能在细胞质中被降解,而另一部分染色体能发育形成辐射状微管系统并发生胞质分裂,从而形成微小孢子[10,12,23]

      众所周知,细胞大小通常伴随着核内DNA含量的增加而增大[16]。本研究中三倍体杂种WT-21的花粉直径在19.5 ~ 68.4 μm之间,变异幅度明显大于相同杂交组合的二倍体杂种WD-2,其正是由于三倍体复杂的染色体分离特征,使得花粉中含有的染色体数目变异更加丰富,从而造成了更大的花粉直径变异。三倍体由于含有奇数倍染色体组,其减数分裂后形成的配子往往包含不平衡数目的染色体,导致高度败育[24]。但是,在之前利用杨树三倍体进行杂交的研究中,子代中也不乏非整倍体的存在[2-6],表明三倍体产生的非整性配子也可能具有一定的育性,并参与受精。在未来研究中,利用青黑杨杂种三倍体资源进行有性杂交,获得非整倍体种质,有望推动杨树染色体工程育种以及基因物理定位等研究进展。

      无论是三倍体杂种WT-21还是二倍体杂种WD-2,我们均观察到一些直径较大的花粉粒存在,推测它们均可能产生一定比例的未减数花粉。其中,三倍体杂种产生的未减数花粉包含3套完整的染色体组,与正常单倍性雌配子受精后将发育形成四倍体后代,而二倍体杂种产生的未减数花粉含有2套完整的染色体组,与正常单倍性雌配子受精后将发育形成三倍体后代。Wang等[6]利用三倍体‘银中杨’的花粉授粉后获得了二倍体、三倍体、四倍体以及非整倍体后代种质,表明‘银中杨’可能产生了可育的未减数花粉参与受精。对青黑杨杂种三倍体WT-21而言,其花粉也具有一定的萌发能力(1.08% ± 0.44%),利用其中萌发的未减数花粉或者非整倍性花粉与正常单倍体雌配子进行杂交,也是选育青黑杨杂种四倍体和非整倍体种质的潜在途径。

参考文献 (24)

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