Identification of new Populus varieties and screening of core primers based on SSR markers
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摘要:目的利用经过长期筛选的11对SSR引物对50份杨树新品种（系）进行扩增，探究11对引物的品种鉴定能力和核心引物的筛选依据，为杨树新品种的鉴定、育种工作和核心引物的筛选工作奠定基础。方法使用毛细管电泳技术对扩增结果进行检测，计算等位重复序列数、Shannon信息指数和引物多态性信息指数等。按0/1矩阵记录扩增条带的有无，并通过非加权组平均法（UPGMA）进行聚类分析。计算单个引物和11对引物组合的遗传相似系数，分析遗传相似系数之间的相关性，剔除相关性较低的引物，再对剩余的引物组合进行聚类分析。结果11对引物共扩增出122个DNA片段，平均每对引物扩增的等位重复序列数为11.091个；不同引物PIC值的变化范围是0.530 ~ 0.908，平均值为0.803。11对引物的聚类结果显示，当支距为0.40时，参试样品可以分为2个大类；当支距为0.37时，可分为4个亚类，聚类结果与品种（系）的谱系来源基本吻合。在11对现有引物的基础上，通过分析单个引物和11对引物的遗传相似系数之间的相关性，优化得到9对核心引物。相关性分析和聚类分析表明，优化后的9对引物具有高效鉴定能力和亲缘关系聚类效果。结论本研究证实SSR分子标记可以有效鉴定杨树新品种，并较好反映品种之间的亲缘关系；同时，利用遗传相似系数的相关性可优化现有的引物，为杨树的育种及核心引物的筛选工作提供了参考。Abstract:Objective Eleven pairs of SSR primers being screened for a long time were used to amplify 50 new Populus varieties (clone) in order to explore the cultivar identification ability of SSR markers and the screening basis of core primers, which lays a foundation for the identification, breeding and screening of core primers for new Populus varieties.Method Capillary electrophoresis was used to detect the amplified fragments. The number of allelic repeat sequences, Shannon information index, and primer polymorphism information index were calculated based on the electrophoresis. The 0/1 matrix which recorded the absence and the presence of the amplification bands was used for cluster analysis by the unweighted pair-group method with arithmetic means (UPGMA). The genetic similarity coefficients of a single primer and 11 pairs of primer combinations were calculated, and the correlation between the genetic similarity coefficients was analyzed. The primers with low correlation were removed, and then the remaining primers were clustered.Result The results showed that a total of 122 DNA fragments were amplified by 11 pairs of primers, and the average number of allelic repeat sequences amplified by each pair of primers was 11.091. The PIC of different primers varied from 0.530 to 0.908, with an average value of 0.803. The clustering results of 11 pairs of primers showed that when the branch distance was 0.40, the samples could be divided into 2 categories; when the branch distance was 0.37, it could be divided into 4 subcategories and the clustering results were basically consistent with the pedigree sources of the new varieties (clone). On the basis of the existing primers, 9 pairs of core primers were obtained by analyzing the correlation of the genetic similarity coefficients of individual primers and 11 pairs of primers, which has high-efficiency identification ability and clustering effect of genetic relationship.Conclusion This study confirmed that SSR molecular markers could effectively identify new poplar varieties and better reflect the relationship between varieties. Meanwhile, the existing primers could be optimized by the correlation of genetic similarity coefficient, which will provide a reference for poplar breeding and the selection of core primers.
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Keywords:
- new Populus variety /
- SSR marker /
- core primers
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杨树是杨柳科（Salicaceae）杨属（Populus）植物落叶乔木的统称，由于其种类丰富、适应性强、极易杂交和繁殖等特点而被世界许多国家和地区培育[1-3]。随着社会需求的不断变化，不同特性的杨树新品种被培育出来，部分优良品种被收入新品种保护名录。但是，由于杨树新品种的遗传基础狭窄，而种内变异丰富，易受外界环境影响，仅靠外部形态来鉴定新品种是不准确的[4-5]。所以，建立一套高效、准确的品种鉴定方法，对于保护杨树新品种的知识产权具有重要的意义。
分子标记技术可以在DNA水平上反映物种间的差异，在鉴定品种和亲缘关系研究中，具有准确、快速，不受环境影响的优势，是分类鉴定生物种类的理想工具[6-8]。意大利帕维亚大学（Università di Pavia）的Castiglione等[9]和我国的尹佟明等[10]的研究表明，利用RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA）和AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphisms，扩增性片段长度多态性）标记，可以鉴定出杨树的不同无性系。同时，借助聚类分析、相关性分析等手段，对分子标记的结果进行挖掘分析，还可以研究不同品种间的遗传距离和亲缘关系，为下一步育种工作提供分子依据。在小麦杂种优势的研究中，SSR（Simple Sequence Repeats，简单重复序列）标记可以鉴别出两个小麦品种的遗传差异，利用遗传差异较大的品种可以提高小麦的杂种优势度[11]。
SSR标记具有重复性好、多态性高、分布广泛等优点，在杨树品种鉴定和遗传多样性研究中应用广泛[12-16]。毛果杨（Populus trichocarpa）全基因组测序工作为杨树SSR标记提供了大量的引物信息。在海量的SSR标记中，并非每个标记都有应用价值。引物数量过少，代表性不足，不能全面反映DNA片段的多态性，进而无法正确反映试验样品的亲缘关系；引物数量过多时，会加大工作量，增加额外试验成本[17-18]。因此，在利用SSR标记技术时，筛选出代表性好、数量较少的核心引物，对快速、准确的鉴定杨树新品种是十分必要的。
1. 材料和方法
1.1 材料收集及处理
2017年3月份收集50份杨树新品种（系）枝条（详见表1），这些品种（系）均被（或曾被）列入国家林业局新品种保护名录。将收集的杨树枝条在温室里水培2 ~ 3个星期，待长出嫩叶后，分别编号采集，并用硅胶保存备用。
表 1 试验材料信息Table 1. Information of experimental materials序号 No. 品种（系） Variety (Clone) 编码 Code 品种权号 Variety rights No. 1 毅杨1号（P. tomentosa × P. bolleana） × P. tomentosa ‘Truncata’ YY1 20120160 2 毅杨2号（P. tomentosa × P. bolleana） × P. tomentosa ‘Truncata’ YY2 20120161 3 毅杨3号（P. tomentosa × P. bolleana） × P. tomentosa ‘LM50’ YY3 20120162 4 景林2号Intraspecific crossing of P. tomentosa JL2 20160187 5 景林4号Intraspecific crossing of P. tomentosa JL4 20160189 6 景林5号Intraspecific crossing of P. tomentosa JL5 20160190 7 景林6号 P. tomentosa ×（P. alba × P. glandulosa） JL6 20160191 8 锦茂杨 P. tomentosa JMY 20150077 9 碧玉杨The hybrids of sect. Aigeiros and sect. Tacamahaca BYUY 20060001 10 碧云杨The hybrids of sect. Aigeiros and sect. Tacamahaca BYUNY 20060002 11 丹红杨 P. deltoides ‘55/65’ × P. deltoides ‘2KEN8’ DHY 20030003 12 鲁白杨1号（P. alba × P. glandulosa） × P. alba var. pyramidalis LB1 20150127 13 鲁白杨3号（P. alba × P. glandulosa） × P. alba var. pyramidalis LB3 20150129 14 红霞杨 P. deltoides ‘I-69/55’ × P. deltoides ‘Shan Hai Guan’ HXY 20120156 15 彩红杨 P. deltoides ‘I-69/55’ × P. deltoides ‘Shan Hai Guan’ CHY 20150163 16 中红杨 P. deltoides ‘I-69/55’ × P. deltoides ‘Shan Hai Guan’ ZHY 20060007 17 全红杨 P. deltoides ‘I-69/55’ × P. deltoides ‘Shan Hai Guan’ QHY 20110002 18 靓红杨 P. deltoides ‘I-69/55’ × P. deltoides ‘Shan Hai Guan’ LHY 20160180 19 林源1号 P. tomentosa ×（P. alba × P. glandulosa） LY1 20160192 20 林源3号 P. tomentosa ×（P. alba × P. glandulosa） LY3 20160193 21 林源4号 P. tomentosa ×（P. alba × P. glandulosa） LY4 20160194 22 林源5号 P. tomentosa ×（P. alba × P. glandulosa） LY5 20160195 23 青山杨 P. pseudo-cathayana × P. deltoides ‘Shan Hai Guan’ QSY — 24 黑青杨（Populus × euramericana ‘N3016’） × P. ussuriensis HQY 20130093 25 鲁林3号杨 P. deltoides ‘I-69/55’ × P. deltoides ‘PE-3-71’ LL3 20080031 26 鲁林9号杨 P. deltoides ‘L324’ × P. deltoides ‘S307-26’ LL9 20130122 27 鲁林16号杨 P. deltoides ‘L323’ ×（Populus × euramericana ‘102/74’） LL16 20130121 28 秦白杨1号 P. alba ×（P. alba × P. glandulosa） QB1 20160183 29 秦白杨2号 P. alba ×（P. alba × P. glandulosa） QB2 20160184 30 秦白杨3号 P. alba ×（P. alba × P. glandulosa） QB3 20160185 31 京2杨（P. deltoides ‘Shan Hai Guan’ × P. deltoides ‘I-63/51’） ×
[（Populus × euramericana ‘I-72/58’） × P. deltoides ‘Shan Hai Guan’]J2Y 20050033 32 南林415杨 P. deltoides ‘T120’ × P. deltoides ‘S3415’ NL415 20160166 33 南林15杨 P. deltoides ‘I-69/55’ × P. deltoides ‘S3244’ NL15 20160164 34 泗杨2号 P. deltoides ‘I-69/55’ × P. deltoides ‘S3239’ SY2 20160165 35 北林1号（P. tomentosa × P. bolleana） ×（P. alba × P. glandulosa） BL1 20090016 36 北林2号（P. tomentosa × P. bolleana） ×（P. alba × P. glandulosa） BL2 20090017 37 北林3号（P. alba × P. glandulosa） × P. tomentosa BL3 20090030 38 北林5号（P. alba × P. glandulosa） × P. tomentosa BL5 20090032 39 北林7号（P. alba × P. glandulosa） × P. tomentosa BL7 20090033 40 北林8号（P. alba × P. glandulosa） × P. tomentosa BL8 20090034 41 北林9号（P. alba × P. glandulosa） × P. tomentosa BL9 20090035 42 北林11号（P. alba × P. glandulosa） × P. tomentosa BL11 20090037 43 G2杨 G2 poplar G2Y — 44 森海1号 P. deltoides ‘55/56’ × P. cathayana SH1 20070014 45 森海2号 P. deltoides ‘55/56’ × P. cathayana SH2 20070015 46 健杨94 Populus × euramericana ‘Robusta 94’ JY94 20070022 47 17−31杨 17−31 poplar 17-31Y — 48 中成1号 P. deltoides ‘Danhong’ × P. deltoides ‘Nanyang’ ZC1 20130001 49 276杨 276 poplar 276Y — 50 17−58杨 17−58 poplar 17-58Y — 1.2 DNA提取及检测
所有参试样品的DNA均采用CTAB法提取[19]，并用紫外分光光度计检测所提取的DNA浓度和OD260/OD280值，将检测结果为1.6 ~ 1.8之间的DNA保存于− 30 ℃的冰箱中备用。
1.3 SSR引物筛选
根据本试验室长期工作，筛选出11对多态性高、重复性好、代表性强的引物用于PCR扩增。所有引物均由上海生物工程有限公司合成，详细信息见表2。
表 2 11对SSR引物信息Table 2. 11 pairs of SSR primer information序号 No. 引物名称 Name of primer 引物序列 Primer sequence (5′−3′) 基序 Motif 退火温度 Annealing temperature/℃ 1 PMGC_2217 F：ATTAGCTTCTTCTAAAGCAGC
R：TGACTGACTGTCTGTCTTCGGA 55 2 PMGC_2607 F：TTAAAGGGTGGTCTGCAAGC
R：CTTCTTGCACCTCGTTTTGAGGA 55 3 PMGC_2885 F：CATGATCAAATTGGATTTGAATG
R：AAAGATGAACATGGCTAGCTCGA 62 4 GCPM_162 F：GCCCAAACTCTTATTTGATG
R：TGGTGGAGGCTAGGATAGTACTT 52 5 GCPM_1255 F：GAACCTTAAAACCAGAACCC
R：GAGCCACAGAAATACTGCTCAG 52 6 PMGC_649 F：CATCCATGATATCAAACCAAATTAG
R：TGTAATCCAAACATAAAATCCCAAGGA 50 7 PMGC_2525 F：CGAGTCACAAGCTCCCAATAG
R：GCAGGCTGTCCTATCTGCGGA 50 8 GCPM_1599 F：AACAAAACCACCACACAAAT
R：TGTAATGTTCCTACTCCGCTAG 50 9 PMGC_2020 F：TAAGGCTCTGTTTGTTAGTCAG
R：GAGATCTAATAAAGAAGGTCTTCGA 52 10 PMGC_2030 F：TCCACAACTCTTGGCTAACC
R：GGACTACAATGTGCGTGACCGA 52 11 ORPM_248 F：TGTGTGTTTTCGGTGATTATGA
R：CCAAAGCAAATGCCACATTATTGG 50 1.4 PCR扩增及毛细管电泳检测
采用优化后的体系对50份样品进行PCR扩增。扩增体系为：2 × Taq Master Mix 4 μL；RNase-Free Water 4 μL；正反引物各0.5 μL；Template DNA 1 μL，共10 μL。扩增程序为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，50 ~ 62 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环，全部循环完成后72 ℃保温7 min。其中，退火温度随引物的变化进行调整。扩增完成后，将PCR产物稀释10倍放入QIAxcel Advanced全自动核酸蛋白分析仪中进行毛细管电泳，对结果进行保存分析。
1.5 数据分析
用Excel 2013对数据进行整理，剔除非目的条带，核对校准后，用GenAIEx 6.502和Cervus 3.07软件分析数据，计算等位重复序列数（Na）、有效等位重复序列数（Ne）、Shannon信息指数I和引物多态性信息指数PIC等[20-21]。将数据转换为0/1矩阵，用DPS 7.05软件计算Nei & Li遗传相似系数，利用MEGA 10.0.5软件通过UPGAM方法构建系统进化树[22]。分别计算每对引物的Nei & Li遗传相似系数，利用SPSS 24软件计算每对引物和11对引物组合的遗传相似系数的相关性，根据相关系数筛选核心引物。
2. 结果与分析
2.1 杨树新品种（系）遗传多样性及引物多态性分析
利用11对引物对参试品种（系）进行扩增，部分扩增结果见图1，共扩增出122个DNA片段。扩增的等位重复序列数为4 ~ 17个，平均每对引物扩增的等位重复序列数为11.091个。其中引物GCPM_1255最多为17个，引物GCPM_162次之为15个，引物ORPM_248的等位重复序列最少为4个。11对引物PIC值的变化范围是0.530 ~ 0.908，平均值为0.803（见表3）。根据Botstein[23]提出的理论，所有11对引物都具有高度多态性（PIC > 0.5）。以上遗传参数说明，50份杨树品种（系）具有丰富的遗传多样性。且筛选出的11对引物具有高度多态性。
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图 1 引物PMGC_2217在2个杨树品种中的电泳图谱Figure 1. Electropherogram detected by PMGC_2217 for 2 poplar varieties表 3 11对SSR引物多态性分析Table 3. Analysis of 11 pairs of SSR primer polymorphismsNo. N Na Ng Ne I PIC 1 50 13 21 7.974 2.296 0.863 2 50 11 20 7.022 2.140 0.843 3 48 12 21 5.984 2.028 0.815 4 49 15 22 8.747 2.411 0.877 5 49 17 21 11.655 2.584 0.908 6 49 10 19 7.167 2.096 0.845 7 49 11 21 5.254 2.019 0.794 8 50 13 22 7.530 2.222 0.853 9 50 11 23 7.310 2.125 0.848 10 48 5 7 3.465 1.364 0.661 11 49 4 5 2.474 1.031 0.530 合计 Total 122 202 74.583 22.317 8.837 均值 Mean 11.091 18.364 6.780 2.029 0.803 注：N. 样本量；Na. 等位重复序列数；Ng. 基因型数；Ne. 有效等位重复序列数；I. Shannon信息指数；PIC. 多态信息指数。Notes: N, number of samples; Na, number of allelic repeat sequences; Ng, number of genotype; Ne, effective number of allelic repeat sequences; I, Shannon’s information index; PIC, polymorphic information content. 2.2 杨树新品种（系）亲缘关系聚类分析
聚类结果见图2。50份样品的平均遗传相似性系数为0.745，表明参试品种（系）间存在较高的遗传相似度。聚类结果显示，在分支距离为0.40时，参试样品可以分为白杨和黑杨2个大类；在分支距离为0.37时，可以分为4个亚类。
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图 2 基于SSR结果的50份杨树品种（系）的聚类树状图Figure 2. Dendrogram of 50 poplar varieties（clone）based on SSR results第Ⅰ大类包括北林系列、林源系列、景林系列、毅杨系列和秦白杨系列等25份杨树品种（系），全部属于白杨派系。第Ⅰ大类又可以分为2个亚类：Ⅰ-A亚类包括了北林系列、林源系列、景林系列和毅杨系列，均含有毛白杨（P. tomentosa）的遗传信息。聚类结果说明，这4个系列的遗传相似性较高；Ⅰ-B亚类主要包括了秦白杨系列的3个品种，这3个品种是1-101杨（ P. alba ）和84K杨（P. alba × P. glandulosa）的杂交子代，与其他白杨的亲缘关系较远。
第Ⅱ大类为剩余的25份杨树品种（系），包括了红叶杨系列、南林系列等黑杨派品种（系），以及森海系列和青山杨等黑杨和青杨的派间杂种。第Ⅱ大类也可以分为2个亚类：Ⅱ-A亚类包括了森海1号（P. deltoides × P. cathayana ‘Senhai 1’）、森海2号（P. deltoides × P. cathayana ‘Senhai 2’）、青山杨等6个品种（系），均为黑杨和青杨的派间杂种；2-B亚类包括了红叶杨系列、南林系列、鲁林系列、丹红杨（P. deltoides ‘Danhong’）等黑杨品种（系），聚类结果说明，它们的亲缘关系较近。红叶杨系列均为中林2025杨（P. deltoides ‘2025’）的芽变品种，这些品种之间未检测到差异，也间接证明其起源相同。
2.3 核心引物筛选
分别计算每对引物和11对引物总的遗传相似系数的相关性，相关性见表4。按相关性从低到高的顺序，依次减少引物数量。把减少后的引物（9、7和5对）组合和11对引物组合做相关性分析，取相关性好的引物组合做聚类分析。9对引物和11对引物的遗传相似系数的相关性见图3。线性方程拟合度较好，二者相关性达到0.966，相关性极显著。聚类分析表明（图4），在支距为0.40时，样品可以分为2个大类；当支距为0.36时，可分为4个亚类。与11对引物聚类效果相比，每个类别所包含的品种（系）具有较高一致性（图2、4）。当引物减少到7对和5对时，品种（系）间遗传相似系数有较大差别，且聚类结果出现混乱。综上所述，9对引物可以作为品种（系）鉴定的核心引物。
表 4 遗传相似系数相关性分析Table 4. Correlation analysis of genetic similarity coefficient引物序号 Primer No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 相关系数 Correlation coefficient 0.573** 0.369** 0.486** 0.473** 0.462** 0.466** 0.398** 0.403** 0.399** 0.292** 0.497** 注：**P < 0.01水平上相关性极显著；*P < 0.05水平上相关性显著。Notes: ** means the correlation was extremely significant at P < 0.01 level; * means the correlation was significant at P < 0.05 level. 理论上，SSR引物可区分最大品种数为N = G1 × G2 × ··· × Gn，其中G1···Gn为1···n对引物在试验品种中检测到的基因型[24]。9对引物在50份杨树品种（系）中共检测到175个基因型，理论上可区分最大品种（系）数N = 2.06 × 1011。因此，从理论上来讲，选用这9对引物对50份杨树品种（系）进行鉴定和聚类是可行的。
结合图4和表1，可以看到：景林系列、林源系列和锦茂杨都有毛白杨的遗传背景，它们在支距为0.23时聚在一起，遗传相似性较高。北林系列，都具有银腺杨（ P. alba × P. glandulosa ）和毛白杨的遗传背景，除了北林9号和北林11号外，也可以聚在一起。秦白杨系列是1-101杨和84K杨杂交后代，具有较高的遗传相似性，在分支距离为0.22时可以聚在一起。森海系列、青山杨、黑青杨、碧云杨和碧玉杨作为青杨和黑杨的派间杂种，也可以很好的聚在一起。中红杨、全红杨、靓红杨、彩红杨和红霞杨，都是中林2025杨芽变品种，9对引物未检测到差异。剩余黑杨的聚类结果和11对引物的聚类结果基本相符。因此，将这9对引物作为50份杨树新品种（系）的核心引物是可行的，可较好区分品种（系）及其亲缘关系。
3. 讨 论
在本次试验中，所用的11对引物是本试验室在长期工作中筛选出的多态性高、稳定性强、代表性好的高效引物，可以将绝大多数杨树新品种（系）区分开。当引物数量减少到9、7和5对时，其品种鉴定能力基本和11对引物相一致，说明11对引物可以作为品种（系）鉴定的有力工具。研究发现，所有引物无法鉴别5个红叶杨品种之间的差异，和贾会霞等[25]试验结果一致，从侧面证明其起源相同，均为中林2025杨的芽变品种。同时，没有检测出景林5号和景林6号的差异，景林5号为毛白杨种内杂交所得，景林6号为毛白杨和银腺杨的杂交子代，鉴别二者的差异，需增加其他特异性引物来进一步研究。
通过聚类分析，可以较好表现各品种（系）的亲缘关系。研究表明，白杨派的各品种（系）亲缘关系较近，聚类结果基本符合其系谱来源，黑杨和青杨的派间杂种与黑杨派的品种（系）亲缘关系较近。在白杨派里，相同系列杨树最先聚在一起，亲缘关系最近；林源系列、景林系列和北林系列都有毛白杨的遗传背景，亲缘关系较近；秦白杨系列和其他白杨亲缘关系最远。森海系列和青黑杨等派间杂种，虽然和其他黑杨聚在一起，但亲缘关系相对较远。剩余黑杨品种（系）多来源于美洲黑杨，具有较近的亲缘关系。结果证实，SSR标记在鉴定品种的同时，也可以研究物种间的遗传距离和亲缘关系，为杨树的分类研究及新品种的育种工作提供分子基础。
在11对引物的基础上，依据遗传相似系数相关性对筛选出的引物进行优化，最终得到9对可以鉴定杨树新品种（系），并反映亲缘关系的核心引物。结果表明，利用此方法，可以有效剔除效率值较低的引物，精简引物数量，进一步降低成本、提高效率。研究还发现，随着引物数量的减少，品种鉴定能力可以较好保留，但是，遗传关系不能清楚的展现。这一结果符合高伟等[26]和王彪等[27]对作物的相关研究中所提的观点。引物的多态性、代表性、分布情况等均存在差异。在研究遗传变异关系时，引物的代表性是很重要的，只有当引物的变异位点数达到某一范围，才能很好的反映品种之间的遗传关系。选用引物的数量和组合不同，其代表性不同，试验结果往往会存在差异，甚至出现与谱系来源和传统分类不相符的现象。建议在今后研究中，应该针对研究群体和研究内容的不同，筛选具有代表性强、特异性好和分布均匀的核心引物，构建不同类型的核心引物数据库。
QIAxcel Advanced系统具有快速、灵敏和高分辨率的特点，可同时分析96个样本，对小于0.5 kb的片段，最大分辨率可达3 ~ 5 bp。有研究表明，当目的片段相差较小或样品浓度较高时，仪器对DNA片段的判读会出现误差[28-29]。本试验在电泳过程中也发现类似情况，某些标记中非目的条带出现的比例较高，且同一DNA片段在重复试验里会出现1 ~ 3 bp误差，比如引物GCPM_162对红叶杨系列扩增有269 、270和271 bp 3种结果。仪器对SSR结果的判读会直接影响试验结果，需经过人工校准。本试验校准方法依据以下3个原则：（1）对比电泳峰值图，依据Maker的峰值对存在误差的条带进行校准；（2）制定统一阈值，剔除非目的条带和峰值较低的条带；（3）针对同一个标记，在3 bp内连续波动的条带，以试验中出现次数最多的条带为标准，结合文献资料和试验经验，对其进行反复校准。
4. 结 论
利用11对引物对50份杨树新品种（系）做SSR标记检测，进行品种鉴定和遗传多样性分析。证实SSR分子标记可以鉴定杨树新品种并反映品种之间的亲缘关系；利用遗传相似系数相关性对现有的引物进行优化，可以剔除贡献值较低的引物，优化后的引物保留有高效的鉴别能力和聚类效果，研究结果为杨树的育种及核心引物的筛选工作提供了参考。
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图 1 引物PMGC_2217在2个杨树品种中的电泳图谱
Figure 1. Electropherogram detected by PMGC_2217 for 2 poplar varieties
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图 2 基于SSR结果的50份杨树品种（系）的聚类树状图
Figure 2. Dendrogram of 50 poplar varieties（clone）based on SSR results
表 1 试验材料信息
Table 1 Information of experimental materials
序号 No. 品种（系） Variety (Clone) 编码 Code 品种权号 Variety rights No. 1 毅杨1号（P. tomentosa × P. bolleana） × P. tomentosa ‘Truncata’ YY1 20120160 2 毅杨2号（P. tomentosa × P. bolleana） × P. tomentosa ‘Truncata’ YY2 20120161 3 毅杨3号（P. tomentosa × P. bolleana） × P. tomentosa ‘LM50’ YY3 20120162 4 景林2号Intraspecific crossing of P. tomentosa JL2 20160187 5 景林4号Intraspecific crossing of P. tomentosa JL4 20160189 6 景林5号Intraspecific crossing of P. tomentosa JL5 20160190 7 景林6号 P. tomentosa ×（P. alba × P. glandulosa） JL6 20160191 8 锦茂杨 P. tomentosa JMY 20150077 9 碧玉杨The hybrids of sect. Aigeiros and sect. Tacamahaca BYUY 20060001 10 碧云杨The hybrids of sect. Aigeiros and sect. Tacamahaca BYUNY 20060002 11 丹红杨 P. deltoides ‘55/65’ × P. deltoides ‘2KEN8’ DHY 20030003 12 鲁白杨1号（P. alba × P. glandulosa） × P. alba var. pyramidalis LB1 20150127 13 鲁白杨3号（P. alba × P. glandulosa） × P. alba var. pyramidalis LB3 20150129 14 红霞杨 P. deltoides ‘I-69/55’ × P. deltoides ‘Shan Hai Guan’ HXY 20120156 15 彩红杨 P. deltoides ‘I-69/55’ × P. deltoides ‘Shan Hai Guan’ CHY 20150163 16 中红杨 P. deltoides ‘I-69/55’ × P. deltoides ‘Shan Hai Guan’ ZHY 20060007 17 全红杨 P. deltoides ‘I-69/55’ × P. deltoides ‘Shan Hai Guan’ QHY 20110002 18 靓红杨 P. deltoides ‘I-69/55’ × P. deltoides ‘Shan Hai Guan’ LHY 20160180 19 林源1号 P. tomentosa ×（P. alba × P. glandulosa） LY1 20160192 20 林源3号 P. tomentosa ×（P. alba × P. glandulosa） LY3 20160193 21 林源4号 P. tomentosa ×（P. alba × P. glandulosa） LY4 20160194 22 林源5号 P. tomentosa ×（P. alba × P. glandulosa） LY5 20160195 23 青山杨 P. pseudo-cathayana × P. deltoides ‘Shan Hai Guan’ QSY — 24 黑青杨（Populus × euramericana ‘N3016’） × P. ussuriensis HQY 20130093 25 鲁林3号杨 P. deltoides ‘I-69/55’ × P. deltoides ‘PE-3-71’ LL3 20080031 26 鲁林9号杨 P. deltoides ‘L324’ × P. deltoides ‘S307-26’ LL9 20130122 27 鲁林16号杨 P. deltoides ‘L323’ ×（Populus × euramericana ‘102/74’） LL16 20130121 28 秦白杨1号 P. alba ×（P. alba × P. glandulosa） QB1 20160183 29 秦白杨2号 P. alba ×（P. alba × P. glandulosa） QB2 20160184 30 秦白杨3号 P. alba ×（P. alba × P. glandulosa） QB3 20160185 31 京2杨（P. deltoides ‘Shan Hai Guan’ × P. deltoides ‘I-63/51’） ×
[（Populus × euramericana ‘I-72/58’） × P. deltoides ‘Shan Hai Guan’]J2Y 20050033 32 南林415杨 P. deltoides ‘T120’ × P. deltoides ‘S3415’ NL415 20160166 33 南林15杨 P. deltoides ‘I-69/55’ × P. deltoides ‘S3244’ NL15 20160164 34 泗杨2号 P. deltoides ‘I-69/55’ × P. deltoides ‘S3239’ SY2 20160165 35 北林1号（P. tomentosa × P. bolleana） ×（P. alba × P. glandulosa） BL1 20090016 36 北林2号（P. tomentosa × P. bolleana） ×（P. alba × P. glandulosa） BL2 20090017 37 北林3号（P. alba × P. glandulosa） × P. tomentosa BL3 20090030 38 北林5号（P. alba × P. glandulosa） × P. tomentosa BL5 20090032 39 北林7号（P. alba × P. glandulosa） × P. tomentosa BL7 20090033 40 北林8号（P. alba × P. glandulosa） × P. tomentosa BL8 20090034 41 北林9号（P. alba × P. glandulosa） × P. tomentosa BL9 20090035 42 北林11号（P. alba × P. glandulosa） × P. tomentosa BL11 20090037 43 G2杨 G2 poplar G2Y — 44 森海1号 P. deltoides ‘55/56’ × P. cathayana SH1 20070014 45 森海2号 P. deltoides ‘55/56’ × P. cathayana SH2 20070015 46 健杨94 Populus × euramericana ‘Robusta 94’ JY94 20070022 47 17−31杨 17−31 poplar 17-31Y — 48 中成1号 P. deltoides ‘Danhong’ × P. deltoides ‘Nanyang’ ZC1 20130001 49 276杨 276 poplar 276Y — 50 17−58杨 17−58 poplar 17-58Y — 
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表 2 11对SSR引物信息
Table 2 11 pairs of SSR primer information
序号 No. 引物名称 Name of primer 引物序列 Primer sequence (5′−3′) 基序 Motif 退火温度 Annealing temperature/℃ 1 PMGC_2217 F：ATTAGCTTCTTCTAAAGCAGC
R：TGACTGACTGTCTGTCTTCGGA 55 2 PMGC_2607 F：TTAAAGGGTGGTCTGCAAGC
R：CTTCTTGCACCTCGTTTTGAGGA 55 3 PMGC_2885 F：CATGATCAAATTGGATTTGAATG
R：AAAGATGAACATGGCTAGCTCGA 62 4 GCPM_162 F：GCCCAAACTCTTATTTGATG
R：TGGTGGAGGCTAGGATAGTACTT 52 5 GCPM_1255 F：GAACCTTAAAACCAGAACCC
R：GAGCCACAGAAATACTGCTCAG 52 6 PMGC_649 F：CATCCATGATATCAAACCAAATTAG
R：TGTAATCCAAACATAAAATCCCAAGGA 50 7 PMGC_2525 F：CGAGTCACAAGCTCCCAATAG
R：GCAGGCTGTCCTATCTGCGGA 50 8 GCPM_1599 F：AACAAAACCACCACACAAAT
R：TGTAATGTTCCTACTCCGCTAG 50 9 PMGC_2020 F：TAAGGCTCTGTTTGTTAGTCAG
R：GAGATCTAATAAAGAAGGTCTTCGA 52 10 PMGC_2030 F：TCCACAACTCTTGGCTAACC
R：GGACTACAATGTGCGTGACCGA 52 11 ORPM_248 F：TGTGTGTTTTCGGTGATTATGA
R：CCAAAGCAAATGCCACATTATTGG 50
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表 3 11对SSR引物多态性分析
Table 3 Analysis of 11 pairs of SSR primer polymorphisms
No. N Na Ng Ne I PIC 1 50 13 21 7.974 2.296 0.863 2 50 11 20 7.022 2.140 0.843 3 48 12 21 5.984 2.028 0.815 4 49 15 22 8.747 2.411 0.877 5 49 17 21 11.655 2.584 0.908 6 49 10 19 7.167 2.096 0.845 7 49 11 21 5.254 2.019 0.794 8 50 13 22 7.530 2.222 0.853 9 50 11 23 7.310 2.125 0.848 10 48 5 7 3.465 1.364 0.661 11 49 4 5 2.474 1.031 0.530 合计 Total 122 202 74.583 22.317 8.837 均值 Mean 11.091 18.364 6.780 2.029 0.803 注：N. 样本量；Na. 等位重复序列数；Ng. 基因型数；Ne. 有效等位重复序列数；I. Shannon信息指数；PIC. 多态信息指数。Notes: N, number of samples; Na, number of allelic repeat sequences; Ng, number of genotype; Ne, effective number of allelic repeat sequences; I, Shannon’s information index; PIC, polymorphic information content.
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表 4 遗传相似系数相关性分析
Table 4 Correlation analysis of genetic similarity coefficient
引物序号 Primer No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 相关系数 Correlation coefficient 0.573** 0.369** 0.486** 0.473** 0.462** 0.466** 0.398** 0.403** 0.399** 0.292** 0.497** 注：**P < 0.01水平上相关性极显著；*P < 0.05水平上相关性显著。Notes: ** means the correlation was extremely significant at P < 0.01 level; * means the correlation was significant at P < 0.05 level.
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