Physiological characteristics and transcriptomics analysis in diploid Ziziphus jujuba Mill. var. spinosa and its autotetraploid
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摘要:目的研究酸枣基因组复制后分子水平的变异机制，为深入探讨枣树多倍体性状、关键调控基因的克隆及基因工程育种提供参考。方法本实验以二倍体及其同源四倍体酸枣为研究材料，比较了二者的叶片相对含水量、叶绿素含量、可溶性糖含量以及可溶性蛋白质含量，对两种材料进行了转录组测序，并参考GO Ontology、KEGG等数据库对差异基因和转录因子进行功能分类与富集分析。结果四倍体的叶绿素含量、可溶性糖含量和可溶性蛋白质含量均显著高于二倍体植株，叶片相对含水量在两种材料中没有显著差异。二倍体与四倍体酸枣共1 329个基因具有显著差异，GO功能分析表明这些差异基因主要参与生长发育和胁迫耐受相关功能。KEGG通路分析显示，大部分差异基因富集在碳水化合物代谢、氨基酸代谢和信号传递过程，其中16个关键基因参与糖和氨基酸的代谢与转运过程，如SPS2、GAE6和PGDH3，这些基因在四倍体中具有较高的表达量；23个基因参与激素信号传导通路，其中与生长素传导、应答相关的基因如ARG7，GH3.6和IAA26在四倍体植株中表达量较高，而与油菜素内酯合成酶（CYP）、乙烯不敏感蛋白（EIN）相关的基因在四倍体植株中表达量较低。在对二倍体与四倍体差异转录因子的分析中发现，四倍体MYB转录因子家族基因表达量高于二倍体。结论四倍体叶片叶绿素含量高是植株叶色加深的原因之一，可溶性糖、可溶性蛋白质含量高为四倍体叶片变大、茎加粗提供了更多能源物质。参与糖、氨基酸代谢和激素合成、信号传导的关键基因在二倍体与四倍体中差异表达，可能与四倍体植株体内能源物质含量高、生长势强的性状相关；具有渗透调节功能的基因在四倍体中表达量较高暗示着四倍体可能具有较强的抗性。进一步对差异转录因子的分析表明，MYB转录因子在二倍体与四倍体植株中的差异表达可能会导致植物在生长发育、形态建成和抗逆过程中的差异，但二者的具体差异性状还需进一步的实验研究。Abstract:ObjectiveThis study helped elucidate the molecular mechanism of polyploid phenotypic variation in sour jujube which can provide a reference for further study on jujube polyploidy traits, cloning of key regulatory genes and genetic engineering breeding.MethodIn this study, Ziziphus jujuba Mill. var. spinosa and its autotetraploid were used as materials to compare the content of leaf relative water, chlorophyll, soluble sugar and soluble protein. The RNA-sequencing of these two materials was carried out. Functional classification and enrichment analysis of differentially expressed genes and transcription factors were performed by reference to GO Ontology, KEGG and others databases.ResultThe chlorophyll content, soluble sugar content and soluble protein content in the autotetraploid were significantly higher than that in diploid. However, there was no obvious difference of the leaf relative water content between these two materials. There were 1 329 differentially expressed genes between diploid and its autotetraploid jujube. GO functional analysis indicated that these different genes were mainly involved in growth and stress tolerance. KEGG pathway analysis showed that the most of different genes were enriched in carbohydrate metabolism, amino acid metabolism and signal transduction process. Sixteen key genes such as SPS2, GAE6 and PGDH3 involving in the metabolism and transport of sugar and amino acids, exhibited higher expression level in the autotetraploid than that in diploid; 23 genes were involved in the plant hormone signaling pathway, in which genes related to auxin conduction and responses such as ARG7, GH3.6 and IAA26 were expressed highly in the autotetraploid plants, while genes related to brassinolide synthesis and ethylene-insensitive proteins showed lower expression level in the autotetraploid than that in diploid. In the analysis of different transcription factors, we found that the expression level of MYB transcription factor family genes was higher in the autotetraploid than that in diploid.ConclusionHigh chlorophyll content resulted in darker leaves in the autotetraploid. High content of soluble sugar and soluble protein content provided more energy substances for autotetraploid to grow large leaves and thick stem. Many important genes encoding sugar and amino acids metabolism and plant hormone synthesis and signal transduction, were differentially expressed in diploid and its autotetraploid. This result may explain the traits of high energy content and strong growth potential of the autotetraploid plants. The highly expressed genes involved in osmotic adjustment in the autotetraploid suggest that the autotetraploid may be superior resistance than that of diploid. Further analysis of different transcription factors shows that the differential expression of MYB transcription factors between diploid and autotetraploid might lead to differences of plant growth and development, morphogenesis and stress resistance, but the specific performance in these materials need to be further investigated by experiments.
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多倍化是高等植物基因组进化的显著特征之一，大约有75%的被子植物和95%的蕨类植物在进化过程中发生过多倍化事件[1]。许多主要作物，包括小麦（Triticum aestivum，2n = 6x = 42）、土豆（Solanum tuberosum，2n = 4x = 48）、玉米（Zea mays，2n = 4x = 20）、咖啡豆（Coffea arabica，2n = 4x = 44）等，经过漫长的进化过程，最终生存下来的都是多倍体植株[2]。多倍体由于基因剂量效应，重复基因的表达情况也发生变化，导致植物在生长发育、形态生理、遗传适应性及对环境胁迫的耐性等方面与亲本二倍体有很大差异[3-5]。例如，相比二倍体，四倍体柑橘（Citrus limonia）叶片肥厚，茎干加粗，栅栏组织和海绵组织增长，表皮细胞体积增大，在高盐碱的逆境环境下，表现出更强的抗性[6-7]；四倍体毛泡桐（Paulownia tomentosa）叶片面积、叶绿素含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白质含量、净光合速率均大于二倍体，耐盐、耐寒、耐旱能力更强[8]。植物加倍后产生的新表型往往具有实际应用价值，如四倍体葡萄（Vitis vinifera）[9]、三倍体柑橘[10]、三倍体毛白杨（Populus tomentosa）[11]等许多品种都具有优于二倍体的性状，已经广泛应用于农林生产实践。
枣（Ziziphus jujuba）是鼠李科（Rhamnaceae）枣属（Ziziphus）植物，原产于中国，栽培历史悠久，枣果富含维生素和人体必需的氨基酸及多种微量元素[12]，具有重要的营养和保健价值。酸枣（Ziziphus jujuba Mill. var. spinosa）作为枣的变种，果小、味酸，果仁可入药，其果实常用于制作果脯、果汁等，具有重要的经济价值[13]。此外，酸枣根系发达，耐寒、耐旱、耐贫瘠能力强[14]，是重要的生态经济树种。近年来，枣树多倍体育种工作取得了显著的成果。Gu等[15]通过离体加倍获得了四倍体冬枣，相比二倍体，四倍体叶片变大变厚、颜色变深，保卫细胞内叶绿体增多，芽、茎变粗，花变大，花期延迟。刘孟军等[16]经秋水仙素诱变获得四倍体鲜食枣品种‘辰光’，具有果实大，果皮薄，果肉酥脆，早果速丰，枣头节间变短，叶缘锯齿增大，气孔密度减小，保卫细胞增大等特征。但目前尚未在分子水平上对这些变异特征进行深度探讨。
在前期工作中，本实验室以酸枣组培苗为试材进行秋水仙素离体诱导，成功获得了酸枣四倍体种质，并对二倍体和四倍体酸枣进行了表型特征的初步对比[17]。本研究以实验室原有的酸枣二倍体和四倍体组培苗为材料，对二者的生理指标进行测定，同时开展RNA-seq技术的转录组学研究，分析酸枣多倍体化导致的基因表达变化。通过该研究，有利于进一步了解基因组复制后分子水平的变异，深入理解酸枣四倍体性状变异，为今后关键调控基因的克隆及基因工程育种等工作提供参考。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
以北京林业大学林木遗传育种国家工程实验室已有的酸枣二倍体及其四倍体组培苗为试验材料。组培室内温度维持在26 ℃，光周期为16 h光照/8 h黑暗。选取继代60 d的生长健壮的二倍体和四倍体酸枣组培苗，转接到生根培养基上，生根后30 d进行生理指标的测定及转录组测序。
分别随机选取二倍体和四倍体组培苗各5株，采集叶片测定叶绿素含量及叶片相对含水量，重复3次。同时，二倍体和四倍体组培苗分别随机选取5个植株，采集植物的叶片和茎，重复3次，取样后迅速放入液氮中磨成粉末，置于− 80 ℃冰箱保存，用于可溶性糖、可溶性蛋白含量测定以及转录组测序。
1.2 生理指标的测定
1.2.1 测定方法
用SPAD-502Plus仪测定叶绿素含量；用饱和称重法测定植物的叶片相对含水量[18]；采用蒽酮比色法测定可溶性总糖含量[19]；采用考马斯亮蓝染色法测定可溶性蛋白质含量[20]。
1.2.2 数据分析
使用Excel 2010进行数据录入及处理，用SPSS软件对数据进行独立样本t检验（P < 0.05）。
1.3 RNA提取
使用上海天根生化有限公司（Qiagen China, Shanghai, China）生产的RNeasy plant Mini kits试剂盒提取RNA，提取过程按说明书中的操作流程进行。用天根公司生产的RNase-Free DNaseSet对提取的RNA进行纯化。用琼脂糖电泳对提取出来的RNA完整性进行检测，紫外灯下观察是否具有清晰的条带。在进行转录组测序之前，对提取的RNA质量进一步评估，计算A260/A280是否介于1.8 ~ 2.0之间，28S/18S是否介于1.6 ~ 2.0之间，再分别用NanoDrop 2000分析仪（DE, USA）和Agilent 2100生物芯片分析系统检测RNA浓度和完整性，RNA检测合格之后用于后续分析。
1.4 转录组测序
委托北京百迈客生物科技有限公司（Biomarker Technology, Beijing, China）用Illunima HiSeq 2000测序系统进行cDNA文库构建及转录组测序（RNA-seq）。获得raw data后，去除测序接头及引物序列，并将低质量的序列过滤掉（Q30 ≥ 93.96%），得到clean data。利用HISAT2软件（http://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml）将clean data比对到枣树参考基因组（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/15586?genome_assembly_id=219393），得到mapped data，进行插入片段长度检验、随机性检验等文库质量评估。
采用NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）、GO Ontology（http://geneontology.org/）、KEGG（https://www.kegg.jp/）、KOG（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/KOG/）、Pfam（https://pfam.xfam.org/）、Swiss-Prot（https://www.uniprot.org/）数据库对基因组功能进行注释。基于所选参考基因组序列，使用StringTie（https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/index.shtml）软件对mapped reads进行拼接，并与原有的基因组注释信息进行比较，寻找原来未被注释的转录区，过滤掉编码过短肽链（少于50个氨基酸残基）或只包含单个外显子的序列，发掘该物种的新基因，从而补充和完善原有的基因组注释信息。
1.5 差异基因的鉴定及生物信息学分析
应用DESeq2软件（http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq.htm）进行样品组间的差异表达分析，将差异倍数（FC） > 1.5且错误发现率（FDR） < 0.05作为筛选差异表达基因（DEG）的标准。对筛选出的DEG进行GO Ontology和KEGG Pathway分类，并应用超几何检验对注释到的不同的GO（P < 0.05）和KEGG条目（P < 0.05）进行富集分析。用FPKM值（Fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped）作为衡量基因表达水平的指标，R语言包绘制表达量聚类热图。
2. 结果与分析
2.1 二倍体及其同源四倍体酸枣生理指标对比
植物染色体加倍后，细胞核内的遗传物质相应增加，一些营养物质或其他成分含量显著提高。由表1可知，四倍体酸枣可溶性糖、可溶性蛋白质、叶绿素含量显著高于二倍体，可溶性糖含量是二倍体的2倍；可溶性蛋白质比二倍体高50.1%；叶绿素含量比二倍体高27.2%。但是，四倍体植株叶片相对含水量与二倍体没有显著差异。
表 1 二倍体和四倍体酸枣不同生理指标的比较Table 1. Comparison of different physiological index between diploid and its autotetraploid sour jujube样品
Sample可溶性糖
Soluble sugar可溶性蛋白
Soluble protein叶绿素
Chlorophyll叶片相对含水量
Leaf relative water content二倍体酸枣
Diploid sour jujube25.03 ± 4.73a 4.13 ± 0.63a 29.17 ± 3.02a 0.52 ± 0.01a 四倍体酸枣
Autotetraploid sour jujube41.15 ± 4.45b 6.20 ± 0.62b 37.10 ± 2.82b 0.57 ± 0.01a 注：表内数值表示方式为“平均值 ± 标准差”，同列不同字母表示差异显著（P < 0.05）。Notes: values in table were “mean ± SD”, different letters in the same column represent significant differences (P < 0.05). 2.2 测序结果统计
为进一步理解二倍体酸枣加倍后变异的分子机制，对二倍体和四倍体酸枣共6个样本进行RNA-seq，获得平均7.92 Gb clean reads，Q30均在94%以上，将这些数据比对到枣树基因组，比对效率在82%以上，表明测序结果良好（表2）。
表 2 测序结果统计Table 2. Statistics of sequencing results样品 Sample Clean reads Clean bases Q30/% GC 含量 GC content/% 比对率 Mapped ratio/% D1 25 635 963 7 620 864 926 94.57 45.34 83.31 D2 27 771 165 8 268 560 788 94.43 45.1 83.67 D3 29 668 511 8 501 884 148 94.62 45.41 83.38 T1 27 572 679 7 659 547 606 94.21 45.19 82.92 T2 27 039 014 7 346 405 010 94.52 45.46 83.27 T3 29 816 038 8 096 301 012 94.53 45.32 82.52 注：D1、D2、D3分别为二倍体酸枣的3个重复；T1、T2、T3分别为四倍体酸枣的3个重复。Notes: D1, D2 and D3 are three biological duplicates of diploid sour jujube; T1, T2 and T3 are three biological duplicates of autotetraploid sour jujube. 通过对原有的枣树基因组进行补充和完善，共发掘2 536个新基因。将这些新基因与GO、KEGG、KOG、Pfam、Swiss-Prot、Nr数据库进行序列比对，获得新基因的注释信息（图1）。
2.3 二倍体及其同源四倍体酸枣差异表达基因分析
对二倍体和四倍体酸枣的差异表达基因进行分析。结果表明，二倍体与四倍体酸枣共有1 329个基因差异表达（FC > 1.5, FDR < 0.05），其中四倍体酸枣有636个基因表达量高于二倍体，表达量倍数介于1.5 ~ 18.2之间；693个基因表达量低于二倍体，表达量倍数介于1.5 ~ 11.8之间（图2）。
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图 2 二倍体与四倍体酸枣差异表达基因统计红色的点代表四倍体相对于二倍体表达量上调的基因，绿色的点代表表达量下调的基因，黑色的点代表没有差异的基因；FC代表差异倍数；FDR代表错误发现率。The red point indicates up-regulated genes in autotetraploid than that in diploid, green point indicates down-regulated genes and black point indicates unchanged genes; FC represents fold change; FDR represents false discovery rate.Figure 2. Statistics of differentially expressed genes in diploid and autotetraploid sour jujube2.3.1 差异表达基因GO功能分类与富集分析
为了分析二倍体与四倍体差异基因的生物学功能，分别从生物学过程、细胞组分和分子功能3个方面对注释到GO Ontology数据库中的1 064个差异基因进行功能分类（表3）。在生物学过程分类中，参与细胞过程、单一生物过程和代谢过程的差异基因数目最多，分别为873、851和829个，其次是胁迫应答过程，为753个；在细胞组分分类中，细胞部位和细胞差异基因最多，分别为878和864个，其次是细胞器为714个。在分子功能分类中，参与催化活性的差异基因最多，为655个，其次是参与结合功能的差异基因为620个。
表 3 二倍体与四倍体酸枣差异表达基因的GO分类及富集分析Table 3. GO classification and enrichment analysis of differentially expressed genes in diploid and autotetraploid sour jujubeGO一级分类
GO classify 1GO ID GO二级分类
GO classify 2所有基因
All gene差异基因
Different gene富集P值
Enriched P value生物学过程
Biological processGO:0009987 细胞过程 Cellular process 15 527 873 0.725 1 GO:0008152 代谢过程 Metabolic process 14 536 829 0.983 6 GO:0044699 单一生物过程 Single-organism process 14 286 851 0.004 2 GO:0050896 胁迫应答 Response to stimulus 11 883 753 0.000 0 GO:0065007 生物调控 Biological regulation 9 802 603 0.021 6 GO:0032502 发育过程 Developmental process 8 154 492 0.003 7 GO:0071840 细胞组分或生物合成
Cellular component organization or biogenesis7 166 386 0.373 7 GO:0051179 定位 Localization 6 533 378 0.054 4 GO:0032501 多细胞生物过程 Multicellular organismal process 6 469 372 0.090 1 GO:0000003 生殖 Reproduction 5 573 331 0.070 8 GO:0022414 生殖过程 Reproductive process 5 536 332 0.065 2 GO:0051704 多生物过程 Multi-organism process 4 643 249 0.002 4 GO:0023052 信号传导 Signaling 3 681 237 0.184 7 GO:0040007 生长 Growth 2 639 142 0.016 5 GO:0002376 免疫系统过程 Immune system process 2 446 131 0.001 1 GO:0098754 解毒 Detoxification 550 49 GO:0048511 节律过程 Rhythmic process 294 26 0.064 5 GO:0022610 生物附着 Biological adhesion 134 7 0.413 8 GO:0040011 运动 Locomotion 73 4 0.295 6 GO:0001906 细胞杀伤 Cell killing 15 2 0.556 6 细胞组分
Cellular componentGO:0044464 细胞部位 Cell part 16 088 878 0.000 0 GO:0005623 细胞 Cell 15 666 864 0.713 8 GO:0043226 细胞器 Organelle 12 958 714 0.659 2 GO:0016020 细胞膜 Membrane 8 588 489 0.740 6 GO:0044422 细胞器部位 Organelle part 5 560 302 0.938 5 GO:0044425 细胞膜部位 Membrane part 2 828 163 0.948 7 GO:0032991 高分子复合物 Macromolecular complex 2 285 81 0.999 8 GO:0030054 细胞连接点 Cell junction 2 259 154 0.438 3 GO:0005576 胞外区 Extracellular region 2 091 173 0.000 2 GO:0031974 膜封闭腔 Membrane-enclosed lumen 563 21 0.284 9 GO:0099080 超分子复合物 Supramolecular complex 154 14 GO:0044421 胞外区部位 Extracellular region part 132 11 0.428 4 GO:0009295 拟核 Nucleoid 45 4 0.058 4 分子功能
Molecular functionGO:0005488 结合 Binding 11 517 620 0.983 3 GO:0003824 催化活性 Catalytic activity 10 913 655 0.587 2 GO:0005215 转运活性 Transporter activity 1 496 91 0.801 3 GO:0001071 核酸结合转录因子活性
Nucleic acid binding transcription factor activity1 062 76 0.327 1 GO:0004871 信号传导活性 Signal transducer activity 782 23 0.216 1 GO:0060089 分子传感器活动 Molecular transducer activity 627 21 0.216 1 GO:0005198 结构分子活动 Structural molecule activity 437 16 0.914 3 GO:0009055 电子载体活动 Electron carrier activity 350 27 0.040 0 GO:0098772 分子功能调节剂 Molecular function regulator 285 23 GO:0016209 抗氧化活性 Antioxidant activity 179 15 0.489 6 GO:0000988 转录因子活性，蛋白结合
Transcription factor activity, protein binding78 3 0.763 7 GO:0045735 营养库活动 Nutrient reservoir activity 45 1 0.154 2 利用KS检验，以富集P值小于0.05作为评价标准，在二倍体与四倍体差异表达基因中满足此条件的GO条目即为GO功能显著富集。在生物过程分类中显著富集了包括胁迫应答过程、生物调控、发育过程、生长过程和免疫系统过程等7个条目；在细胞组分类别中显著富集的GO条目有2个，包括细胞部位和胞外区组成；在分子功能类别中，显著富集的条目只有1个，为电子载体活动。结果说明，二倍体与四倍体酸枣在生长发育、细胞代谢过程、逆境胁迫抗性等方面存在差异。
2.3.2 差异表达基因KEGG Pathway富集分析
二倍体与四倍体酸枣共有244个差异表达基因注释到特定的KEGG 通路中，这些通路可以分为细胞过程、环境信息加工、遗传信息加工、代谢和生物系统5类，其中在代谢中注释到的差异基因数目最多，占差异基因总注释数目的73.8%（图3）。有13条通路在KEGG Pathway中显著富集（P < 0.05），（图4），主要包括氨基酸代谢、碳水化合物代谢、信号传导、能量代谢等。碳水化合物代谢通路中，参与淀粉和蔗糖代谢途径的差异表达基因数目最多，占注释的差异表达基因总数的10.66%；信号传导通路中，参与植物激素信号转导途径的差异基因有18个，占注释的差异表达基因总数的7.38%；在氨基酸代谢通路中，丙氨酸，天门冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢以及酪氨酸代谢3个途径差异基因数目分别占注释的差异基因总数的2.5%、3.3%和3.7%；在能量代谢通路中，光合天线蛋白途径中注释的差异基因占注释差异基因总数的1.2%。此外，相比二倍体植株，四倍体植株中表达量增加的差异基因显著富集在淀粉与蔗糖代谢（P < 0.000 9）、植物激素信号传导（P < 0.004 0）等通路中。以上结果表明，二倍体与四倍体酸枣在碳水化合物和氨基酸代谢、信号传递以及能量代谢途径中存在差异，其中，与淀粉和蔗糖代谢、植物激素传导途径相关的基因在四倍体中显著上调。
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图 3 二倍体与四倍体酸枣差异表达基因KEGG分类Figure 3. KEGG classification of differentially expressed genes in diploid and autotetraploid sour jujube![]()
图 4 二倍体与四倍体酸枣差异表达基因显著富集的KEGG通路Figure 4. KEGG pathway with significantly enriched differentially expressed genes in diploid and autotetraploid sour jujube2.3.3 差异基因表达量分析
为进一步解析二倍体及其同源四倍体可溶性物质的差异，对与糖和蛋白质转运、代谢相关的16个基因进行差异表达分析（图5）。结果发现，与糖代谢相关的关键基因，如编码β-呋喃果糖苷酶的INV（CCG007195）基因、编码β-葡萄糖苷酶的BGLU47（CCG000062）基因、编码果胶酯酶的PME35（CCG011493）基因、编码葡糖醛酸异构酶的GAE6（CCG027883）基因、编码α-海藻糖磷酸合成酶的TPS9（CCG011925）基因和编码蔗糖磷酸合成酶的SPS2（CCG011942）基因等均上调表达，差异表达倍数介于1.5 ~ 2.5之间。与氨基酸转运和代谢相关的基因，例如编码丝氨酸乙酰转移酶的SAT1（CCG028964）基因、编码精氨琥珀酸合酶（NewGene3586）和磷酸甘油酸脱氢酶PGDH3（CCG002072）等的基因在四倍体酸枣中上调表达，表达量为二倍体的1.7 ~ 2.0倍。
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图 5 二倍体与四倍体差异基因表达量热图D1、D2、D3分别为二倍体酸枣的3个生物学重复；T1，T2，T3分别为四倍体酸枣的3个生物学重复。方块中不同的颜色表示基于FPKM值的基因表达水平；每行的数据分别进行标准化；蓝色表示在四倍体中表达量下调，红色表示在四倍体中表达量上调。D1, D2 and D3 are the three duplicates of diploid sour jujube; T1, T2 and T3 were the three duplicates of autotetraploid sour jujube. Different colors indicate different levels of gene expression based on the FPKM values; the data in each row were normalized and compared, separately; blue indicates down-regulation in autotetraploid, and red indicates up-regulation.Figure 5. Heat map of differentially expressed genes in the diploid and autotetraploid sour jujube对与内源激素相关的23个差异基因表达量进行比较分析（图5），结果发现，在二倍体植株中，编码油菜素内酯生物合成相关蛋白（CYP）的基因（CCG015397、CCG007876、CCG007877）的表达量是四倍体的1.8 ~ 2.1倍；编码乙烯不敏感蛋白的基因EIN2（CCG001434）的表达量是四倍体的1.5倍。在四倍体植株中，与诱导、响应和转运生长素相关的基因，如ARG7（Addgene2586）、ARF9（CCG010227）、GH3.6（CCG025779）、IAA26（CCG025671、CCG025726）、LAX3（CCG001581）、X15（CCG013493）的表达量是二倍体的1.5 ~ 2.1倍。说明酸枣四倍体在表型上呈现的变异特征可能与这些关键基因的差异表达有关。
2.4 二倍体及其同源四倍体酸枣的差异转录因子分析
转录因子参与了许多生物学进程，在调控下游功能基因方面起重要作用。为了解酸枣加倍后的转录因子变异，对二倍体和四倍体酸枣进行了转录因子功能预测，发现与转录因子相关的差异基因共158个（FC > 1.5, FDR < 0.05），包含14个编码转录抑制子的基因，58个蛋白激酶相关基因和86个编码转录因子的基因，共编码35种转录因子（图6）。编码AP2/ERF-ERF转录因子的基因数目最多，其次为HB-HD-ZIP、LOB和MYB转录因子。四倍体植株中表达量高于二倍体的编码转录因子的基因有102个，属于28种转录因子，其中，编码MYB转录因子的基因最多。
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图 6 编码转录因子的差异基因数目统计Figure 6. Statistics of the number of differentially expressed genes encoding transcription factors3. 讨 论
3.1 二倍体与四倍体生理特征差异
四倍体通常较二倍体具有更大的器官、细胞、更多的次生代谢物含量[21]，这使得四倍体成为植物育种专家增加植物产量的重要手段之一。本研究中发现四倍体酸枣的叶绿素含量、可溶性糖和可溶性蛋白含量均显著高于二倍体。这与白桦（Betula platyphylla）[22]和刺槐（Robinia pseudoacacia）[23]基因组加倍后植株的生理表现相同。这些生理指标的差异可能是四倍体植株形态异于二倍体的重要原因之一，叶绿素含量高可能导致四倍体叶色更深，而可溶性糖和可溶性蛋白含量高为植株提供更多的能源物质，从而导致四倍体叶片更大、茎更粗。进一步说明，叶片细胞中的叶绿素含量、可溶性糖含量和可溶性蛋白质含量均可作为初步鉴定四倍体酸枣的辅助指标。但是，研究中发现叶片相对含水量在二倍体与四倍体酸枣中没有显著差异，这与四倍体连翘（Forsythia suspensa）[24]、四倍体甜瓜（Cucumis melo）[25]的研究结果表现一致。
3.2 二倍体与四倍体差异基因分析
植物多倍化后引起表型及生理的变异，这主要是由于基因表达改变引起的。大量研究发现植物中基因表达发生微小的变化都可能引起表型的变异[26]。高通量测序技术已经成为多倍体植物优良性状解析的常用策略[27]，本研究中我们利用RNA-seq技术对酸枣二倍体和四倍体进行转录组学分析，测序数据分析结果表明测序结果良好。基因差异表达是四倍体酸枣变异的分子基础。因此，我们进一步对二倍体与四倍体酸枣的差异表达基因进行分析，二者共有1 329个基因差异表达，通过GO Ontology分析表明在胁迫应答、生物调控、发育、生长过程和免疫系统7个过程中差异基因富集，说明四倍体在生长发育、抗性方面与二倍体存在差异。KEGG通路分析发现差异基因显著富集在碳水化合物和氨基酸代谢、信号传递以及能量代谢方面，其中在淀粉与蔗糖代谢、植物激素传导通路中显著上调表达。这些差异基因在四倍体中的表达量升高可能参与了可溶性糖和内源生长素的积累过程，为四倍体提供更多能源物质，从而增强植株生长势。这一结果与杨树三倍体研究中发现的主要参与碳水化合物代谢、细胞生长的基因上调使其在生长表现上优于二倍体的结果相同[28]。
3.3 二倍体与四倍体差异基因功能分析
酸枣经基因组加倍后，表现为合成更多的可溶性糖和可溶性蛋白，这可能与众多关键基因在四倍体中的差异表达有关。前人研究表明，GAE6催化拟南芥半乳糖醛酸的合成，促进果胶多糖的形成[29]；SPS控制光合产物向蔗糖和淀粉的分配，在蔗糖的形成过程中起正向调节作用[30]。在本研究中GAE6和SPS2在四倍体酸枣中上调表达，可能是导致四倍体植株体内可溶性糖含量增加的关键基因。此外，BGLU47、TPS9和SPS2编码糖代谢过程中的关键酶，可以通过调节植物体内渗透胁迫进而增强植物承受逆境胁迫的能力[31]。本研究对这些关键调控基因分析发现，此类基因在四倍体中具有较高的表达量，推测四倍体酸枣可能具有较强的渗透调节能力，具体性状还需要进一步的实验研究。植物磷酸丝氨酸途径在植物发育和次生代谢产物的生物合成中具有重要作用，PGDH3编码催化这一途径的PGDH酶，与色氨酸的生物合成呈正相关[32]。本研究中四倍体内PGDH3表达量显著高于二倍体，可能是导致四倍体酸枣体内可溶性蛋白含量较高的原因之一。
植物生长发育与内源激素的调节有密不可分的联系，内源激素的水平会显著影响细胞分化、糖合成与代谢等生理过程[33]。青杨（Populus cathayana）三倍体中参与生长素、细胞分裂素、油菜素内酯等激素合成与转导的基因相比二倍体显著上调表达导致三倍体生长势增强[34]；桑树（Morus alba）四倍体与二倍体的差异基因参与了生长素和乙烯等激素的合成及传导过程，使四倍体较二倍体具有更大的生长优势[35]。在本研究中，四倍体与二倍体有18个差异基因显著富集在植物激素信号传导通路中，其中12个基因在四倍体中表达量较高，包括与生长素诱导相关的基因ARG7（SAUR家族）、GH3.6（GH3家族）、X15（SAUR家族），生长素响应基因IAA26（AUX/IAA家族），编码转运蛋白的基因LAX3（AUX1家族）以及生长素应答因子ARF9（ARF家族）等（图7），这些基因不仅正调控IAA的生物合成，还参与了激素的信号转导过程[36-38]。6个基因在四倍体中表达量较低，包括细胞色素P450单加氧酶（CYP）和乙烯不敏感蛋白（EIN）等，CYP参与甾醇催化形成油菜素甾醇的过程，从而促进叶片伸展和茎的伸长生长[39]；EIN2是正调控乙烯信号传导通路的中心元件，与器官的衰老、成熟有关[40-41]。因此，编码内源激素的差异基因表达量的变化可能是导致四倍体生长表型变异的重要原因之一，对此还需要进一步实验验证。
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图 7 与内源生长素相关的表达通路方块内的红色背景代表基因在四倍体中上调表达，蓝色背景代表基因在四倍体中既有上调表达又有下调表达。The red background in the square indicates up-regulated expression of genes in autotetraploid than that of diploid, while the blue background indicates up-regulated and down-regulated expressed genes.Figure 7. Expression pathway related to endogenous auxin3.4 二倍体与四倍体转录因子差异分析
转录因子通过与下游基因相互作用，激活或抑制其他基因的转录，或者与其他转录因子互作调节基因的表达，从而引起一系列的应答反应，改变植物性状[42]。MYB转录因子广泛参与了植物的生长发育与形态建成[43]、次生代谢[44]和环境胁迫应答[45]等过程。在本研究中，我们分析二倍体和四倍体酸枣的差异转录因子，发现四倍体植株中编码MYB转录因子的基因在所有转录因子类型中上调表达数目最多。这一结果与菘蓝（Isatis indigotica）四倍体研究中发现的MYB在根、茎、叶中表达量高于二倍体的结果相一致[46]，因此，四倍体在表型和生理方面的变异特征可能与编码MYB转录因子的基因上调表达有关。此外，MYB转录因子的差异表达还导致了菘蓝四倍体抗性增强，说明酸枣四倍体在对环境胁迫耐受性方面可能高于二倍体。因此，今后应该进一步对酸枣四倍体的抗性进行研究。
多倍体植物在基因组复制后含有新的基因调控网络，完整的RNA-seq数据对于理解新的调控网络至关重要。本研究在检测生理指标的基础上，对酸枣不同倍性植株进行转录组测序并结合性状分析了差异表达基因的功能，为深入理解酸枣四倍体的变异性状提供参考，通过进一步的研究筛选候选基因，为枣树关键调控基因的克隆及基因工程育种提供分子基础。
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图 2 二倍体与四倍体酸枣差异表达基因统计
红色的点代表四倍体相对于二倍体表达量上调的基因，绿色的点代表表达量下调的基因，黑色的点代表没有差异的基因；FC代表差异倍数；FDR代表错误发现率。The red point indicates up-regulated genes in autotetraploid than that in diploid, green point indicates down-regulated genes and black point indicates unchanged genes; FC represents fold change; FDR represents false discovery rate.
Figure 2. Statistics of differentially expressed genes in diploid and autotetraploid sour jujube
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图 3 二倍体与四倍体酸枣差异表达基因KEGG分类
Figure 3. KEGG classification of differentially expressed genes in diploid and autotetraploid sour jujube
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图 4 二倍体与四倍体酸枣差异表达基因显著富集的KEGG通路
Figure 4. KEGG pathway with significantly enriched differentially expressed genes in diploid and autotetraploid sour jujube
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图 5 二倍体与四倍体差异基因表达量热图
D1、D2、D3分别为二倍体酸枣的3个生物学重复；T1，T2，T3分别为四倍体酸枣的3个生物学重复。方块中不同的颜色表示基于FPKM值的基因表达水平；每行的数据分别进行标准化；蓝色表示在四倍体中表达量下调，红色表示在四倍体中表达量上调。D1, D2 and D3 are the three duplicates of diploid sour jujube; T1, T2 and T3 were the three duplicates of autotetraploid sour jujube. Different colors indicate different levels of gene expression based on the FPKM values; the data in each row were normalized and compared, separately; blue indicates down-regulation in autotetraploid, and red indicates up-regulation.
Figure 5. Heat map of differentially expressed genes in the diploid and autotetraploid sour jujube
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图 6 编码转录因子的差异基因数目统计
Figure 6. Statistics of the number of differentially expressed genes encoding transcription factors
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图 7 与内源生长素相关的表达通路
方块内的红色背景代表基因在四倍体中上调表达，蓝色背景代表基因在四倍体中既有上调表达又有下调表达。The red background in the square indicates up-regulated expression of genes in autotetraploid than that of diploid, while the blue background indicates up-regulated and down-regulated expressed genes.
Figure 7. Expression pathway related to endogenous auxin
表 1 二倍体和四倍体酸枣不同生理指标的比较
Table 1 Comparison of different physiological index between diploid and its autotetraploid sour jujube
样品
Sample可溶性糖
Soluble sugar可溶性蛋白
Soluble protein叶绿素
Chlorophyll叶片相对含水量
Leaf relative water content二倍体酸枣
Diploid sour jujube25.03 ± 4.73a 4.13 ± 0.63a 29.17 ± 3.02a 0.52 ± 0.01a 四倍体酸枣
Autotetraploid sour jujube41.15 ± 4.45b 6.20 ± 0.62b 37.10 ± 2.82b 0.57 ± 0.01a 注：表内数值表示方式为“平均值 ± 标准差”，同列不同字母表示差异显著（P < 0.05）。Notes: values in table were “mean ± SD”, different letters in the same column represent significant differences (P < 0.05). 
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表 2 测序结果统计
Table 2 Statistics of sequencing results
样品 Sample Clean reads Clean bases Q30/% GC 含量 GC content/% 比对率 Mapped ratio/% D1 25 635 963 7 620 864 926 94.57 45.34 83.31 D2 27 771 165 8 268 560 788 94.43 45.1 83.67 D3 29 668 511 8 501 884 148 94.62 45.41 83.38 T1 27 572 679 7 659 547 606 94.21 45.19 82.92 T2 27 039 014 7 346 405 010 94.52 45.46 83.27 T3 29 816 038 8 096 301 012 94.53 45.32 82.52 注：D1、D2、D3分别为二倍体酸枣的3个重复；T1、T2、T3分别为四倍体酸枣的3个重复。Notes: D1, D2 and D3 are three biological duplicates of diploid sour jujube; T1, T2 and T3 are three biological duplicates of autotetraploid sour jujube.
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表 3 二倍体与四倍体酸枣差异表达基因的GO分类及富集分析
Table 3 GO classification and enrichment analysis of differentially expressed genes in diploid and autotetraploid sour jujube
GO一级分类
GO classify 1GO ID GO二级分类
GO classify 2所有基因
All gene差异基因
Different gene富集P值
Enriched P value生物学过程
Biological processGO:0009987 细胞过程 Cellular process 15 527 873 0.725 1 GO:0008152 代谢过程 Metabolic process 14 536 829 0.983 6 GO:0044699 单一生物过程 Single-organism process 14 286 851 0.004 2 GO:0050896 胁迫应答 Response to stimulus 11 883 753 0.000 0 GO:0065007 生物调控 Biological regulation 9 802 603 0.021 6 GO:0032502 发育过程 Developmental process 8 154 492 0.003 7 GO:0071840 细胞组分或生物合成
Cellular component organization or biogenesis7 166 386 0.373 7 GO:0051179 定位 Localization 6 533 378 0.054 4 GO:0032501 多细胞生物过程 Multicellular organismal process 6 469 372 0.090 1 GO:0000003 生殖 Reproduction 5 573 331 0.070 8 GO:0022414 生殖过程 Reproductive process 5 536 332 0.065 2 GO:0051704 多生物过程 Multi-organism process 4 643 249 0.002 4 GO:0023052 信号传导 Signaling 3 681 237 0.184 7 GO:0040007 生长 Growth 2 639 142 0.016 5 GO:0002376 免疫系统过程 Immune system process 2 446 131 0.001 1 GO:0098754 解毒 Detoxification 550 49 GO:0048511 节律过程 Rhythmic process 294 26 0.064 5 GO:0022610 生物附着 Biological adhesion 134 7 0.413 8 GO:0040011 运动 Locomotion 73 4 0.295 6 GO:0001906 细胞杀伤 Cell killing 15 2 0.556 6 细胞组分
Cellular componentGO:0044464 细胞部位 Cell part 16 088 878 0.000 0 GO:0005623 细胞 Cell 15 666 864 0.713 8 GO:0043226 细胞器 Organelle 12 958 714 0.659 2 GO:0016020 细胞膜 Membrane 8 588 489 0.740 6 GO:0044422 细胞器部位 Organelle part 5 560 302 0.938 5 GO:0044425 细胞膜部位 Membrane part 2 828 163 0.948 7 GO:0032991 高分子复合物 Macromolecular complex 2 285 81 0.999 8 GO:0030054 细胞连接点 Cell junction 2 259 154 0.438 3 GO:0005576 胞外区 Extracellular region 2 091 173 0.000 2 GO:0031974 膜封闭腔 Membrane-enclosed lumen 563 21 0.284 9 GO:0099080 超分子复合物 Supramolecular complex 154 14 GO:0044421 胞外区部位 Extracellular region part 132 11 0.428 4 GO:0009295 拟核 Nucleoid 45 4 0.058 4 分子功能
Molecular functionGO:0005488 结合 Binding 11 517 620 0.983 3 GO:0003824 催化活性 Catalytic activity 10 913 655 0.587 2 GO:0005215 转运活性 Transporter activity 1 496 91 0.801 3 GO:0001071 核酸结合转录因子活性
Nucleic acid binding transcription factor activity1 062 76 0.327 1 GO:0004871 信号传导活性 Signal transducer activity 782 23 0.216 1 GO:0060089 分子传感器活动 Molecular transducer activity 627 21 0.216 1 GO:0005198 结构分子活动 Structural molecule activity 437 16 0.914 3 GO:0009055 电子载体活动 Electron carrier activity 350 27 0.040 0 GO:0098772 分子功能调节剂 Molecular function regulator 285 23 GO:0016209 抗氧化活性 Antioxidant activity 179 15 0.489 6 GO:0000988 转录因子活性，蛋白结合
Transcription factor activity, protein binding78 3 0.763 7 GO:0045735 营养库活动 Nutrient reservoir activity 45 1 0.154 2
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