Physiological effects of colchicine on the male germ cells of Ginkgo biloba and Populus tomentosa × P. bolleana
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摘要:目的多倍化是树木遗传改良的重要途径，秋水仙碱诱导生殖细胞是树木多倍体诱变的重要方式，但还存在某些树种多倍体诱导困难、多倍化诱导质量难以判别等问题。因此，探究多倍化诱导机制，找到一种能够对秋水仙碱人工诱导树木生殖细胞多倍化效果进行初步判别的科学方法很有必要。方法本文以银杏和毛新杨雄性生殖细胞为研究对象，采用茚三酮显色法、CBA法、四氮唑蓝法、愈创木酚法、硫代巴比妥酸法，分别测定了受秋水仙碱诱导后其各自细胞内游离脯氨酸（PRO）含量、可溶性蛋白（Protein）的含量，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）的活性、丙二醛（MDA）含量等变化趋势，并对比分析了银杏和毛新杨雄性生殖细胞在秋水仙碱加倍诱导状态下各自生理生化指标差异动态变化节点。结果秋水仙碱处理后，银杏生殖细胞内脯氨酸含量在12 ~ 36 h先增高后降低，可溶性蛋白含量1 ~ 36 h内降低，SOD活性有所降低，POD活性在3 ~ 36 h内大幅度升高，MDA含量6 h开始升高，12 ~ 48 h处在顶峰状态。毛新杨生殖细胞脯氨酸含量0.5 ~ 1 h内升高后期变化趋势不明显，可溶性蛋白含量24 ~ 48 h内略降低，SOD活性在12 ~ 48 h内明显升高，POD活性与空白组变化差异不明显，MDA含量与空白组、对照组相似。结论秋水仙碱诱导对银杏与毛新杨生殖细胞基因表达机制影响不同，对银杏生殖细胞的胁迫强于毛新杨。毛新杨受水分与秋水仙碱胁迫伤害较小，生理指标变化差异不大，但保护酶变化银杏相反，12 ~ 48 h内SOD活性上升明显，POD活性变化不明显。银杏生殖细胞POD活性上升，SOD活性有所降低，在此之前脯氨酸与MDA含量有明显上升趋势，可溶性蛋白含量下降。 所以秋水仙碱胁迫损伤积累后的基因表达调控可能是其生殖细胞多倍化困难的主要原因，对基因表达调控的影响主要在秋水仙碱胁迫后期。研究结果将为探究秋水仙碱诱导过程基因表达调控机制奠定基础，并为初步判别不同树木种质生殖细胞多倍化诱导难易提供了理论和实例参考。Abstract:ObjectivePolyploidization is an important approach to the genetic improvement of trees, colchicine inducing reproductive cells is an important method of tree polyploid induced, but there are problems such as some tree polyploid induction is difficult, and polyploidization induced quality is difficult to distinguish. Therefore, it is necessary to explore the mechanism of polyploidy induction and to find a scientific method for the preliminary discrimination of the polyploidy effect of colchicine artificially induced forest germ cells.MethodTaking ginkgo, Populus tomentosa × P. bolleana male reproductive cells as the research object, by ninhydrin colorimetry, CBA method,tetrazolium blue method,guaiacol method and thiobarbituric acid method, their intracellular free proline (PRO) content, soluble protein (Protein) content, superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD) activity, malondialdehyde (MDA) content changes were determined by colchicine inducing, and then the dynamic change nodes of the physiological and biochemical indexes of the male germ cells of Ginkgo biloba and Populus tomentosa × P. bolleana under the double induction of colchicine were compared and analyzed.ResultAfter colcine treatment, in ginkgo germ cells, proline content increased first at 12−36 hour and then decreased, soluble protein content decreased at 1−36 hour, SOD activity decreased at 12−48 hour, POD activity increased significantly at 3−36 hour, MDA content began to increase at 6 hour and peaked at 12−48 hour. In the Populus tomentosa × P. bolleana, germ cell proline content increased within 0.5−1 hour and the change trend was not obvious at the later stage, the soluble protein content decreased within 24−48 hour, the SOD activity increased significantly within 12−48 hour, the POD activity was not significantly different from the blank group, and the MDA content was similar to the blank group and the control group.ConclusionColchicine induction had different effects on gene expression mechanism of ginkgo and Populus tomentosa × P. bolleana generative cells, and the stress on ginkgo germ cells was stronger than that on poplar. However, the change of protective enzyme of the poplar was opposite to that of ginkgo, and the SOD activity increased significantly during 12−48 hour period, while the POD activity did not change significantly. Therefore, the regulation of gene expression after damage accumulation under colchicine stress may be the main reason for the difficulty of tree germ cell polyploidy, and the influence on gene expression regulation is mainly in the late stage of colchicine stress. The results of this study will lay a foundation for exploring the regulation mechanism of gene expression during colchicine induction and provide theoretical and practical references for the preliminary identification of the difficulty of inducing polyploidy in germplasm of different trees.
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Keywords:
- Ginkgo biloba /
- Populus tomentosa × P. bolleana /
- male germ cell /
- colchicine /
- physiology
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多倍体是指体细胞中含有3组或3组以上染色体的个体，是植物进化的最重要的方式之一，其广泛存在于自然界中，现有研究结果表明多倍体可以增强植物的适应性和竞争力，并且多倍体树木在提高生长速度，增进遗传品质以及提高目的代谢物含量等方面具有显著优势。随着地球未来环境变化以及木材供应问题的逐渐凸显，目前的常规育种方式潜力有限，被寄予厚望的基因工程技术暂时也难以发挥作用。综合倍性优势和杂交优势的多倍体育种在育种工作中有可能会产生巨大作用[1]。目前多倍体的来源主要分为自然发生、人工诱导和诱发突变3种方式。而人工诱导植物多倍体的方法又可分为生物学诱导方法，物理诱导方法，和化学诱导方法3类[2]。目前，采用秋水仙碱进行多倍体诱导是最常用、最普遍、最有效与最经济的方法[3]。
银杏（Ginkgo biloba）是原产于中国的一种雌雄异株木本裸子植物，属孑遗植物、国家二级保护树种。是优良的园林绿化树种，上等的建筑材料，此外银杏还有极高的药用价值，其根、茎、叶、果实等均可入药，具有极高的研究价值[4-5]。但在秋水仙碱诱导银杏多倍体过程中，二倍体配子得率非常之低最高也只有7%[6-7]。毛新杨（Populus tomentosa × Populus bolleana）是雌雄异株的被子植物，有着分布广、适应性强、生长迅速等特点，是世界上最普遍的树种之一。由于其具有巨大的经济效益、生态效益与社会效益，它的染色体多倍化研究一直是植物进化生物学和遗传育种学研究的热门方向[8]。杨树作为一种模式树种，具有较好的研究基础，其秋水仙碱诱导二倍体花粉得率较高，最高可达90%以上[9]。
植物的抗药性与植物生理密切相关，在秋水仙碱诱导不同树木过程中，由于各树种基因表达调控的差异，其对秋水仙碱的适应性会各有不同，能够适应秋水仙碱阻抗作用的树种便可以实现细胞加倍，不能适应该作用的树种则不能实现加倍,在此过程中，其生理表达调控机制也会做出相应的改变[10]。生理指标测量相对简单，在育种过程中建立一套通过生理变化初步辨别某树种生殖细胞能否进行多倍化的体系十分重要[11]。生理指标的变化对应着基因表达调控的改变，通过对秋水仙碱诱导后，易诱导树种和难诱导树种生理指标变化差异的对比，为以后研究人工诱导多倍化的基因表达调控机制奠定一定的基础[12]。渗透调节是植物对药物胁迫的积极应对机制，脯氨酸、可溶性蛋白是重要的渗透调节物质，可以反映细胞渗透势变化，当细胞受到胁迫时脯氨酸、可溶性蛋白含量改变。抗氧化防御系统是细胞应对胁迫伤害的重要保护机制，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）是清除活性氧自由基的重要酶，当细胞受到伤害产生活性氧自由基后，通过保护酶增加来清除自由基。丙二醛（MDA）是质膜过氧化的重要产物，可以反映细胞膜受伤害程度[13]。
本试验通过比较秋水仙碱诱导银杏生殖细胞与毛新杨生殖细胞多倍体过程中各生理生化变化趋势，分析了银杏和毛新杨生殖细胞对秋水仙碱诱导产生的生理反应与抗逆机制差异，为通过生理指标初步判别部分树木种质生殖细胞能否进行人工诱导多倍化提供理论和数据支持，并为下一步从分子水平揭示秋水仙碱诱导过程中的调控机制和提高树木多倍体得率奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 材 料
本试验以2017年1月份在北京林业大学鹫峰实习林场，采集的花芽饱满、无病虫害的健壮银杏雄性花枝，在中国农业大学西校区采集的长势良好的雄性毛新杨花芽枝为试验材料。
1.2 材料培养
取已采集的银杏，毛新杨雄性枝条于20 ~ 30 ℃的温室内进行水培，每天定期采集花芽样品，通过压片观察检测花粉母细胞所处分裂时期，确定其生殖细胞所处分裂状态。待生殖细胞进入粗线期时开始进行秋水仙碱处理[14]。
1.3 材料处理
待银杏与毛新杨花粉母细胞生长至减数分裂粗线期时，开始进行材料处理，具体是将小孢子和花芽先用棉花包裹起来，再在外边包上一层锡纸以防止随后注射的秋水仙碱见光分解。其中1/3花芽注射浓度为0.6%的秋水仙碱溶液作试验组（COLC）。1/3花芽注射蒸馏水溶液作对照组（Control），为进一步比较秋水仙碱处理对生殖细胞的影响，剩余1/3花芽不注射药物，作空白组（Blank）。注射时记录时间为0时刻，在0、0.5、1、3、6、12、24、36、48、72、96 h时刻取样，直接摘取整个花芽的小孢子囊结构，每种处理取10个花芽，标记好组号与时间，立刻送到− 80 ℃冰箱中保存，待测。在处理过程中药液要始终处于饱和状态，所以每8 h补注一次药液。
1.4 测定方法
采用CBA法测定可溶性蛋白含量；采用茚三酮显色法测定游离脯氨酸（PRO）含量；用四氮唑蓝法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性；用愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）活性；用硫代巴比妥酸法测定MDA含量。每种处理从保存的样本中随机选择6个花芽，分别作为生物学重复进行检测，取最接近的3个花芽的测定值作为最终结果，分析银杏与毛新杨生殖细胞在秋水仙碱加倍诱导状态下各自生理生化指标的高差异动态变化。
1.5 数据分析
数据统计采用Excel进行统计，并计算通过PrismDemo软件作图进行不同时期各生理生化指标变化趋势观察与分析。
2. 结果与分析
2.1 秋水仙碱诱导过程中银杏与毛新杨生殖细胞脯氨酸含量变化
图1所示银杏试验组和对照组游离脯氨酸的整体含量高于空白组的脯氨酸含量，对照组脯氨酸含量比空白组平均提高203.90%，秋水仙素处理组脯氨酸含量比空白组平均提高170.28%，比对照组低12.44%。在0 ~ 3 h内对照组与试验组产生瞬时应激反应脯氨酸大量积累，3 h后恢复正常趋势，表明是水分胁迫使细胞产生了应激反应，增加了脯氨酸含量来提高细胞渗透性。试验组在12 ~ 36 h内有脯氨酸大量积累，对照组却没有变化。推测可能是在此阶段内秋水仙碱对细胞产生了药物作用，细胞自身启动了相的应对机制，增加了脯氨酸含量来应对胁迫。图2所示毛新杨脯氨酸含量试验组比空白组14.256%，比对照组高7.759%，而对照组比空白组高6.029%。对照组与空白组变化趋势相似，试验组在0.5 ~ 6 h内与对照组变化趋势相反。毛新杨脯氨酸含量变化差异不大，前期对照组产生的差异可能是毛新杨对秋水仙碱的应激反应造成的。但随后又很快恢复正趋势，表明秋水仙碱处理对毛新杨生殖细胞渗透性影响不大。
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图 1 银杏受秋水仙碱诱导过程中脯氨酸变化趋势Figure 1. Proline change trend of Ginkgo biloba induced by colchicine![]()
图 2 毛新杨受秋水仙碱诱导过程中脯氨酸变化趋势Figure 2. Proline change trend of poplar induced by colchicine2.2 秋水仙碱诱导过程中银杏与毛新杨生殖细胞可溶性蛋白含量变化
图3所示银杏可溶性蛋白蛋白平均含量对照组比空白组高71.42%，试验组可溶性蛋白平均含量比空白组低0.81%，比对照组低72.81%。试验组、对照组与空白组变化趋势相似，但试验组在水分与秋水仙碱双重胁迫下可溶性蛋白含量比对照组低72.81%，且在1 ~ 36 h对照组可溶性蛋白明显高于实验组，推测此阶段内秋水仙碱胁迫可能影响了蛋白质的表达调控。图4所示毛新杨对照组的可溶性蛋白平均含量比空白组要高15.040%，试验组比空白组高0.505%，比对照组低12.635%。0 ~ 24 h内3组可溶性蛋白含量变化趋势相近且均在1 000上下波动，24 ~ 48 h内对照组可溶性蛋白含量增高，试验组可溶性蛋白含量低于对照组，这与银杏1 ~ 36 h所得结果表现出一致性，由此推测秋水仙碱处理使部分蛋白失活或变性。
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图 3 银杏受秋水仙碱诱导过程中可溶性蛋白变化趋势Figure 3. Soluble protein change trend of Ginkgo biloba induced by colchicine![]()
图 4 毛新杨受秋水仙碱诱导过程中可溶性蛋白变化趋势Figure 4. Soluble protein change trend of poplar induced by colchicine2.3 秋水仙碱诱导过程中银杏与毛新杨生殖细胞SOD含量变化
图5所示银杏对照组SOD平均活性比空白组降低9.04%，试验组比空白组降低28.58%，比对照组降低17.93%。3组变化趋势差别不大，试验组SOD活性在6 ~ 36 h内低于对照组，且对照组水分胁迫使SOD活性增强，综合推测秋水仙碱的胁迫可能降低了银杏生殖细胞SOD活性。图6所示，毛新杨对照组SOD平均活性比空白组低18.651%，比试验组低17.245%，试验组比空白组低1.700%。对照组的试验结果与石进校等[15]的研究结果类似，四川淫羊藿草（Epimedium grandiflorm）SOD活性也是在淹渍初期下降，中期增加，后期下降,并以此为依据判断淫羊藿具有一定的抗涝能力。同样，本试验对照组的结果可以说明毛新杨具有一定的抗涝能力，也说明如果毛新杨长期处于水分胁迫环境下会导致超氧自由基的大量积累从而使得SOD酶活性迅速下降。而试验组SOD活性在12 ~ 48 h内明显高于对照组，在水分胁迫降低SOD活性的情况下，秋水仙碱作用后毛新杨生殖细胞SOD活性还有明显上升趋势，表明秋水仙碱毒害使毛新杨SOD活性增加来清除增加的活性氧自由基。
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图 5 银杏受秋水仙碱诱导过程中SOD活性变化趋势Figure 5. SOD activity change trend of Ginkgo biloba induced by colchicine![]()
图 6 毛新杨受秋水仙碱诱导过程中SOD活性变化趋势Figure 6. SOD activity change trend of poplar induced by colchicine2.4 秋水仙碱诱导过程中银杏与毛新杨生殖细胞POD活性变化
图7所示银杏对照组POD平均活性比空白组高7.34%，试验组POD平均活性比空白组高15.83%，比对照组高9.17%。对照组PDD活性在6 ~ 96 h呈明显上升趋势，表明水分对银杏生殖细胞的胁迫主是长期的且随着时间而加重。试验组POD活性在3 ~ 72 h内也是显著高于空白组状态，且在3 ~ 36 h内高于对照组。表明银杏在水分与秋水仙碱双重胁迫下，除水分胁迫使POD活性上升之外，秋水仙碱胁迫也增加了POD活性。图8所示毛新杨对照组POD平均活性比空白组高1.858%，比试验组高5.446%，试验组比空白组低3.403%。从整体变化趋势来看，无论是长期还是短期，空白组、对照组、试验组变化趋势大体相似，均为降低−升高−降低−升高−降低−升高−降低的趋势。试验组POD活性与对照组、空白组也相差不多。从银杏和毛新杨SOD、POD活性整体水平来看，在秋水仙碱胁迫中SOD与POD起协同作用，且银杏是POD起主要保护作用，毛新杨是SOD起主要保护作用。
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图 7 银杏受秋水仙碱诱导过程中POD活性变化趋势Figure 7. POD activity change trend of Ginkgo biloba induced by colchicine![]()
图 8 毛新杨受秋水仙碱诱导过程中POD活性变化趋势Figure 8. POD activity change trend of poplar induced by colchicine2.5 秋水仙碱诱导过程中银杏与毛新杨生殖细胞MDA含量变化
图9所示银杏对照组MDA平均含量比空白组低2.95%。试验组比空白组MDA平均含量高15.57%，比对照组高17.99%。对照组与空白组变化趋势不明显，表明水分胁迫并没有对银杏生殖细胞产生伤害。秋水仙碱处理组在6 h时MDA含量开始上升，12 ~ 48 h处于顶峰，48 h开始下降。这与前边4个指标的结果均能对应。秋水仙碱处理在前期0 ~ 36 h不同时间内降低了可溶性蛋白含量、SOD活性，增强了POD活性，秋水仙碱处理使银杏生殖细胞的损伤逐渐加重，导致从12 h开始脯氨酸含量开始大量增加，MDA含量也同时快速增长，在24 h时达到顶峰状态，随后分别于36和48 h恢复正常。这表明在此阶段内银杏生殖细胞受秋水仙碱诱导，伤害累积到一定程度后启动了某些基因表达调控机制来抗拒秋水仙碱诱导产生的影响，且银杏生殖细胞表达调控改变的主要时期12 ~ 48 h。图10所示，毛新杨对照组MDA平均含量比空白组高10.581%，比试验组高7.781%,试验组比空白组高1.938%。3组变化趋势相似，只是在量上有轻微差别。综合前边4个指标结果来看秋水仙碱和水分胁迫会影响毛新杨雄性生殖细胞的表达调控，却不会造成其细胞损伤。
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图 9 银杏受秋水仙碱诱导过程中MDA变化趋势Figure 9. MDA change trend of Ginkgo biloba induced by colchicine3. 讨论与结论
秋水仙碱诱导是人工诱导植物多倍体的重要途径[16]。秋水仙碱处理植物生殖细胞可能会改变生殖细胞的正常代谢，使之趋于积累一些渗透调节物质或者抗氧化性物质，来缓解外界胁迫带来的伤害[17]。可溶性蛋白和脯氨酸都是植物体内非常重要的渗透调节物质，脯氨酸含量是基本的植物抗性指标[18]。超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）的协同作用可以防御活性氧自由基对细胞的伤害[19-21]。丙二醛（MDA）可以反映植物细胞的受损伤程度[21]。当植物受到胁迫时可溶性蛋白和脯氨酸会大量积累，增强细胞膜的渗透性，防止细胞膜损伤，SOD与POD会相互协调，清除细胞内的活性氧自由基，以此来达到维持细胞正常生活[22]。
在本研究中，通过对比对照组与空白组可以发现，秋水仙碱对银杏生殖细胞处理，使脯氨酸含量在12 ~ 36 h内大量增加大量积累，可溶性蛋白含量明显减少，SOD活性有轻微降低，POD活性急剧上升，MDA含量在12 ~ 48 h内显著增高。这些变化均表明秋水仙碱处理严重影响了银杏小孢子生殖细胞的基因表达调控机制，且可溶性蛋白含量，SOD活性以及POD活性变化均发生在脯氨酸、MDA积累之前，可能由于秋水仙碱处理对银杏小孢子生殖细胞的伤害是持续的，随着时间的积累，伤害不断加重，直到12 h时，超出该细胞忍受范围，从而启动了某种拮抗机制，抵消了秋水仙碱的迫害，使各指标恢复到正常范围。在该过程中主要由POD承担细胞保护作用，脯氨酸起调节渗透调节作用。而毛新杨则表现出了很强的适应性，水分和秋水仙碱处理均未对毛新杨雄性生殖细胞产生损伤，但也对该细胞产生了一定的消极作用，造成了部分可溶性蛋白的失活。在秋水仙碱处理过程中，毛新杨生殖细胞SOD活性上升明显，起主要保护作用。对比银杏和毛新杨我们可以发现，秋水仙碱处理影响了基因表达，影响了可溶性蛋白的表达调控。秋水仙处理对银杏生殖细胞产生了长期的胁迫，并在积累到一定程度后造成了细胞损伤。但此处理并没有造成毛新杨雄性生殖细胞的损伤，其通过简单的细胞自身调节就适应了该处理。综合前人研究表明，这可能与银杏自身的某种蛋白有关，在秋水仙碱处理过程中银杏小饱子母细胞的蛋白质可能对秋水仙素诱导银杏2n雄配子的过程产生了影响，并可能最终导致了秋水仙素诱导银杏雄配子得率的降低[5]。
未来可以在本研究基础之上，进一步深入分析银杏和毛白杨雄株生殖细胞受秋水仙碱处理影响过程中各自的基因、蛋白质和代谢物差异表达变化情况，并通过各自变化趋势进行物种间对比分析，将从分子生物学角度阐释秋水仙碱加倍诱导过程中树木雄株生殖细胞除细胞多倍化之外的特异性应激基因表达调控机制，为未来有效提高秋水仙碱加倍诱导率提供技术指导和理论支持。而且，在进行其它树木的秋水仙碱加倍诱导探索时，可将待加倍树木种质在受秋水仙碱诱导特定时期的生理生化指标变化曲线与本研究结果进行对比分析，用于初步判别此树木种质对秋水仙碱加倍诱导的适应性，预估其雄株生殖细胞人工诱导多倍化的难易程度，为树木倍性育种研究提供新的初检方法。当然，受试验条件和时间所限，本研究无法对所有树木受秋水仙碱诱导后的生理变化进行全面分析，未来还需通过对更多树木种质在秋水仙碱诱导过程中的生理指标检测来完善和优化这种初筛技术方法。
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图 1 银杏受秋水仙碱诱导过程中脯氨酸变化趋势
Figure 1. Proline change trend of Ginkgo biloba induced by colchicine
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图 2 毛新杨受秋水仙碱诱导过程中脯氨酸变化趋势
Figure 2. Proline change trend of poplar induced by colchicine
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图 3 银杏受秋水仙碱诱导过程中可溶性蛋白变化趋势
Figure 3. Soluble protein change trend of Ginkgo biloba induced by colchicine
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图 4 毛新杨受秋水仙碱诱导过程中可溶性蛋白变化趋势
Figure 4. Soluble protein change trend of poplar induced by colchicine
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图 5 银杏受秋水仙碱诱导过程中SOD活性变化趋势
Figure 5. SOD activity change trend of Ginkgo biloba induced by colchicine
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图 6 毛新杨受秋水仙碱诱导过程中SOD活性变化趋势
Figure 6. SOD activity change trend of poplar induced by colchicine
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图 7 银杏受秋水仙碱诱导过程中POD活性变化趋势
Figure 7. POD activity change trend of Ginkgo biloba induced by colchicine
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图 8 毛新杨受秋水仙碱诱导过程中POD活性变化趋势
Figure 8. POD activity change trend of poplar induced by colchicine
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图 9 银杏受秋水仙碱诱导过程中MDA变化趋势
Figure 9. MDA change trend of Ginkgo biloba induced by colchicine
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期刊类型引用(1)
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