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过表达细叶百合LpNAC6基因增强烟草的耐盐性

刘彬 曹尚杰 王营 崔颖 岳桦 张彦妮

刘彬, 曹尚杰, 王营, 崔颖, 岳桦, 张彦妮. 过表达细叶百合LpNAC6基因增强烟草的耐盐性[J]. 北京林业大学学报, 2020, 42(4): 69-79. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190342
引用本文: 刘彬, 曹尚杰, 王营, 崔颖, 岳桦, 张彦妮. 过表达细叶百合LpNAC6基因增强烟草的耐盐性[J]. 北京林业大学学报, 2020, 42(4): 69-79. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190342
Liu Bin, Cao Shangjie, Wang Ying, Cui Ying, Yue Hua, Zhang Yanni. Overexpression of LpNAC6 gene in Lilium pumilum enhancing salt tolerance in transgenic tobacco[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2020, 42(4): 69-79. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190342
Citation: Liu Bin, Cao Shangjie, Wang Ying, Cui Ying, Yue Hua, Zhang Yanni. Overexpression of LpNAC6 gene in Lilium pumilum enhancing salt tolerance in transgenic tobacco[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2020, 42(4): 69-79. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190342

过表达细叶百合LpNAC6基因增强烟草的耐盐性

doi: 10.12171/j.1000-1522.20190342
基金项目: 中央高校基本科研业务费专项资金项目(2572019BK04),黑龙江省自然科学基金项目(LH2019C004)
详细信息
    作者简介:

    刘彬。主要研究方向:园林植物繁殖栽培及育种。Email:276410256@qq.com 地址:150040 黑龙江省哈尔滨市香坊区和兴路26号东北林业大学园林学院

    通讯作者:

    张彦妮,副教授,博士生导师。主要研究方向:园林植物繁殖栽培及育种。Email:ynzhang808@126.com 地址:同上

  • 中图分类号: S682.29

Overexpression of LpNAC6 gene in Lilium pumilum enhancing salt tolerance in transgenic tobacco

  • 摘要: 目的NAC转录因子是一类具有多种生物功能的新型转录因子,在植物抗逆响应中发挥着重要作用。本文旨在克隆并研究细叶百合LpNAC6基因在逆境胁迫下的表达模式,探究其在烟草中响应盐胁迫的功能。方法本研究采用同源克隆技术克隆得到细叶百合LpNAC6基因,利用生物信息学软件对LpNAC6基因进行分析;通过基因枪法对LpNAC6蛋白进行亚细胞定位;利用实时荧光定量PCR的方法分析LpNAC6基因在不同非生物胁迫和不同组织中的表达模式;构建植物表达载体pBI121-LpNAC6-GFP转化烟草,通过对转基因烟草进行盐胁迫处理验证LpNAC6基因的功能。结果LpNAC6基因长909 bp,编码302个氨基酸,存在一个高度保守的NAM结构域,属于NAC基因家族。LpNAC6为不稳定亲水性蛋白,无信号肽和跨膜结构域,有5个糖基化位点和20个磷酸化位点,亚细胞定位在细胞核。LpNAC6基因与黄褐棉的NAC转录因子进化关系最近。细叶百合中LpNAC6基因对ABA、干旱、低温及盐胁迫均有响应。盐胁迫下,过表达LpNAC6基因的转基因烟草其SOD、POD、CAT的活性和叶绿素、脯氨酸、可溶性蛋白的含量均显著高于野生型。结论细叶百合LpNAC6基因能够响应ABA、干旱、低温、盐胁迫等非生物胁迫,其过表达能够提高转基因烟草在盐胁迫下的代谢活力和抗氧化酶活性,从而增强烟草耐盐性。
  • 图  1  LpNAC6的核苷酸与氨基酸序列

                 下划线部分表示NAM结构域。The underlined part represents the NAM domain.

    Figure  1.  Nucleotide and amino acid sequences of LpNAC6

    图  2  LpNAC6的亲水/疏水性及信号肽分析

    A. LpNAC6的亲水/疏水性分析;B. LpNAC6的信号肽分析。C-score. 剪切位置分值;S-score. 信号肽分值;Y-score. 综合剪切位置分值。A,hydrophilicity / hydrophobicity analysis of LpNAC6;B,signal peptide analysis of LpNAC6. C-score,the score of the original cut site;S-score,the score of signal peptide;Y-score,the score of the integrated cut site.

    Figure  2.  Hydrophilicity / hydrophobicity and signal peptide analysis of LpNAC6

    图  3  LpNAC6蛋白的跨膜结构域及二级结构预测

    A. LpNAC6跨膜结构域预测;B. LpNAC6二级结构预测。A,prediction of transmembrane domains of LpNAC6;B,prediction of secondary structure of LpNAC6.

    Figure  3.  Prediction of transmembrane domains andsecondary structure of LpNAC6

    图  4  细叶百合LpNAC6与其他物种NAC蛋白的多序列比对

    TYJ30417.1. 黄褐棉;XP_017700768.1. 海枣;OWM84829.1. 石榴;XP_020261897.1. 石刁柏;XP_010907545.3. 油棕;RZS25466.1. 阿比西尼亚红脉蕉;THU44006.1. 野蕉;XP_015940149.1. 蔓花生;XP_024963988.1. 洋蓟;XP_020083042.1. 凤梨;XP_020703744.1. 铁皮石斛。TYJ30417.1,Gossypium mustelinum;XP_017700768.1,Phoenix dactylifera;OWM84829.1,Punica granatum;XP_020261897.1,Asparagus officinalis;XP_010907545.3,Elaeis guineensis;RZS25466.1,Ensete ventricosum;THU44006.1,Musa balbisiana;XP_015940149.1,Arachis duranensis;XP_024963988.1,Cynara cardunculus var. scolymus;XP_020083042.1,Ananas comosus;XP_020703744.1,Dendrobium catenatum.

    Figure  4.  Multiple alignment of LpNAC6 for L. pumilum with the protein sequences of NAC from other plant species

    图  5  LpNAC6蛋白的系统进化树分析

    细叶百合. Lilium pumilum;海枣. Phoenix dactylifera;油棕. Elaeis guineensis;凤梨. Ananas comosus;阿比西尼亚红脉蕉. Ensete ventricosum;野蕉. Musa balbisiana;铁皮石斛. Dendrobium catenatum;黄褐棉. Gossypium mustelinum;石刁柏. Asparagus officinalis;石榴. Punica granatum;蔓花生. Arachis duranensis;洋蓟. Cynara cardunculus var. scolymus

    Figure  5.  Phylogenetic tree analysis of LpNAC6 protein

    图  6  LpNAC6基因在不同组织和非生物胁迫下的表达模式

    A. 150 μmol/L ABA胁迫;B. 20% PEG6000胁迫;C. 2 ℃低温胁迫;D. 200 mmol/L NaCl胁迫。不同小写字母表示在P < 0.05水平上差异显著。下同。A, 150 μmol/L ABA stress;B, 20% PEG6000 stress;C, 2 ℃ low temperature stress;D, 200 mmol/L NaCl stress. Different lowercase letters mean significant difference at P < 0.05 level. The same below.

    Figure  6.  Expression patterns of LpNAC6 in different tissues and under different abiotic stresses

    图  7  LpNAC6蛋白的亚细胞定位

    A. pBI121-GFP蛋白定位;B. pBI121-LpNAC6-GFP融合蛋白定位。A, subcellular localization of pBI121-GFP protein;B, subcellular localization of pBI121-LpNAC6-GFP fusion protein.

    Figure  7.  Subcellular localization of LpNAC6 protein

    图  8  转基因烟草T0代植株PCR鉴定

    A. 鉴定转基因烟草T0代植株DNA;B. 鉴定转基因烟草T0代植株cDNA。M. DL2000 Marker;1. 水对照;2. 野生型对照;3 ~ 8. 转基因阳性植株;9. pBI121- LpNAC6-GFP农杆菌菌液对照。A,DNA identification of transgenic tobacco T0 generation plants;B,cDNA identification of transgenic tobacco T0 generation plants. M,DL2000 Marker;1,water control;2,wide-type control;3−8,positive transgenic plants;9,pBI121- LpNAC6-GFP Agrobacterium solution control.

    Figure  8.  Identification of transgenic tobacco T0 generation plants by PCR

    图  9  转基因烟草种子和幼苗的耐盐性分析

    A. WT、Tr-2和Tr-3烟草种子分布示意图;B. WT、Tr-2和Tr-3烟草种子在1/2MS培养基中的萌发情况;C. WT、Tr-2和Tr-3烟草种子在含150 mmol/L NaCl的1/2MS培养基中的萌发情况;D. WT、Tr-2和Tr-3烟草在150 mmol/L NaCl胁迫下的生根情况;E. 野生型烟草和转基因烟草种子在150 mmol/L NaCl胁迫下的发芽率;F. 野生型烟草和转基因烟草幼苗在150 mmol/L NaCl胁迫下的相对根长。A,distribution of WT,Tr-2 and Tr-3 tobacco seeds;B,germination condition of WT,Tr-2 and Tr-3 tobacco seeds in 1/2MS medium;C,germination condition of WT,Tr-2 and Tr-3 tobacco seeds in 1/2MS medium containing 150 mmol/L NaCl;D,rooting condition of WT,Tr-2 and Tr-3 tobacco under 150 mmol/L NaCl stress;E,germination rate of wild type tobacco and transgenic tobacco seeds under 150 mmol/L NaCl stress;F,relative root length of wild type tobacco and transgenic tobacco seedlings under 150 mmol/L NaCl stress.

    Figure  9.  Analysis of salt tolerance of transgenic tobacco seeds and seedlings

    图  10  盐胁迫下转基因株系和野生型烟草的氧化酶活性变化

    Figure  10.  Changes of oxidase activity of transgenic lines and wild-type tobacco under salt stress

    图  11  盐胁迫下转基因株系和野生型烟草叶绿素、脯氨酸和可溶性蛋白质的含量变化

    Figure  11.  Changes of chlorophyll,proline and soluble protein content of transgenic lines and wild-type tobacco under salt stress

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出版历程
  • 收稿日期:  2019-08-27
  • 修回日期:  2019-12-23
  • 网络出版日期:  2020-04-11
  • 刊出日期:  2020-04-27

过表达细叶百合LpNAC6基因增强烟草的耐盐性

doi: 10.12171/j.1000-1522.20190342
    基金项目:  中央高校基本科研业务费专项资金项目(2572019BK04),黑龙江省自然科学基金项目(LH2019C004)
    作者简介:

    刘彬。主要研究方向:园林植物繁殖栽培及育种。Email:276410256@qq.com 地址:150040 黑龙江省哈尔滨市香坊区和兴路26号东北林业大学园林学院

    通讯作者: 张彦妮,副教授,博士生导师。主要研究方向:园林植物繁殖栽培及育种。Email:ynzhang808@126.com 地址:同上
  • 中图分类号: S682.29

摘要: 目的NAC转录因子是一类具有多种生物功能的新型转录因子,在植物抗逆响应中发挥着重要作用。本文旨在克隆并研究细叶百合LpNAC6基因在逆境胁迫下的表达模式,探究其在烟草中响应盐胁迫的功能。方法本研究采用同源克隆技术克隆得到细叶百合LpNAC6基因,利用生物信息学软件对LpNAC6基因进行分析;通过基因枪法对LpNAC6蛋白进行亚细胞定位;利用实时荧光定量PCR的方法分析LpNAC6基因在不同非生物胁迫和不同组织中的表达模式;构建植物表达载体pBI121-LpNAC6-GFP转化烟草,通过对转基因烟草进行盐胁迫处理验证LpNAC6基因的功能。结果LpNAC6基因长909 bp,编码302个氨基酸,存在一个高度保守的NAM结构域,属于NAC基因家族。LpNAC6为不稳定亲水性蛋白,无信号肽和跨膜结构域,有5个糖基化位点和20个磷酸化位点,亚细胞定位在细胞核。LpNAC6基因与黄褐棉的NAC转录因子进化关系最近。细叶百合中LpNAC6基因对ABA、干旱、低温及盐胁迫均有响应。盐胁迫下,过表达LpNAC6基因的转基因烟草其SOD、POD、CAT的活性和叶绿素、脯氨酸、可溶性蛋白的含量均显著高于野生型。结论细叶百合LpNAC6基因能够响应ABA、干旱、低温、盐胁迫等非生物胁迫,其过表达能够提高转基因烟草在盐胁迫下的代谢活力和抗氧化酶活性,从而增强烟草耐盐性。

English Abstract

刘彬, 曹尚杰, 王营, 崔颖, 岳桦, 张彦妮. 过表达细叶百合LpNAC6基因增强烟草的耐盐性[J]. 北京林业大学学报, 2020, 42(4): 69-79. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190342
引用本文: 刘彬, 曹尚杰, 王营, 崔颖, 岳桦, 张彦妮. 过表达细叶百合LpNAC6基因增强烟草的耐盐性[J]. 北京林业大学学报, 2020, 42(4): 69-79. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190342
Liu Bin, Cao Shangjie, Wang Ying, Cui Ying, Yue Hua, Zhang Yanni. Overexpression of LpNAC6 gene in Lilium pumilum enhancing salt tolerance in transgenic tobacco[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2020, 42(4): 69-79. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190342
Citation: Liu Bin, Cao Shangjie, Wang Ying, Cui Ying, Yue Hua, Zhang Yanni. Overexpression of LpNAC6 gene in Lilium pumilum enhancing salt tolerance in transgenic tobacco[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2020, 42(4): 69-79. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190342
  • NAC是一类广泛存在于植物中并参与生长调节的转录因子,全基因组研究发现,在拟南芥(Arabidopsis thaliana[1]、水稻(Oryza sativa[2]、大豆(Glycine max[3]、烟草(Nicotiana tabacum[4]基因组中分别发现了117、151、101、152个NAC基因。目前,已有许多研究报道表明,NAC转录因子在植物的生长发育和胁迫响应中起关键作用。Zhang等[5]对棉花(Gossypium hirsutum)中一种NAC转录因子GhFSN1进行研究,发现GhFSN1在棉花中的上调表达导致次生壁增厚;Huang等[6]研究发现小麦(Triticum aestivum)的NAC转录因子TaNAC29在衰老的叶子中表达水平较高,可能参与衰老过程的调控;Tak等[7]的研究表明NAC转录因子在香蕉(Musa nana)中参与非生物胁迫响应,MusaNAC042的过表达提高了香蕉对干旱和盐胁迫的耐受性。Nakashima等[8]的研究发现水稻中OsNAC6基因可以调节下游胁迫相关基因的表达,OsNAC6基因过表达增强了转基因水稻对干旱和高盐胁迫的耐受性。然而,迄今为止,虽然对NAC转录因子的研究得到了广泛的关注,但大多数NAC转录因子的功能仍不清楚,特别是在非模式植物中。

    细叶百合(Lilium pumilum)分布范围极广,其花朵优美且颜色艳丽,对干旱、盐碱等具有极强的耐受性,在园林中具有很高的应用和观赏价值[9]。由于干旱、低温、高盐等非生物胁迫严重影响着植物的生长发育,从而限制了许多园林观赏植物的应用范围,对细叶百合中NAC转录因子的抗逆分子机制进行研究,鉴定并提取抗逆基因,对于改良园林观赏植物品种具有重要的意义。但是,目前有关于细叶百合中NAC转录因子的研究报道非常有限。本研究以细叶百合为试材,克隆得到LpNAC6基因,对其进行序列分析,检测其在不同胁迫和各组织中的表达模式,并进一步构建植物表达载体转化烟草,通过对盐胁迫处理后的转基因烟草表型及生理指标的分析研究,鉴定LpNAC6基因在植物响应盐胁迫中的功能,为细叶百合NAC转录因子的功能和作用研究提供理论依据。

    • 实验所用细叶百合来自东北林业大学苗圃;所用烟草品种为‘K326’烟草,烟草种子由实验室于4 ℃冰箱低温保存。

    • 采用CTAB法提取细叶百合总RNA并反转录得到cDNA,以cDNA为模板,PCR扩增LpNAC6基因目标片段。使用Primer Premier 5软件设计特异性引物,LpNAC6-F:5′-ATCACAGCAACAGCGGTCAT-3′;LpNAC6-R:5′-ATGACCTGTGTGCACCATCT-3′。反应程序为:94 ℃预变性2 min;(94 ℃ 30 s,55 ~ 65 ℃ 30 s,68 ℃ 1 min)循环35次;最后72 ℃延伸10 min。将PCR产物胶回收提纯,与pMD-18T载体连接后转化大肠杆菌DH5α,PCR检测筛选出阳性单菌落后进行测序,将测序结果正确的克隆菌液提取质粒保存于− 20 ℃,用于后续实验。

    • 使用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的Blastp功能对LpNAC6蛋白进行氨基酸序列及保守结构域分析[10],并进一步使用DNAMAN软件进行多重序列比对;使用MEGA5.0构建系统进化树;使用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)对LpNAC6蛋白的相对分子质量、理论等电点和不稳定系数进行分析[11];使用ProtScale(https://web.expasy.org/protscale)对LpNAC6蛋白进行亲水/疏水性预测;使用TMHMM2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测LpNAC6蛋白的跨膜结构域;使用ProtComp(http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=protcomppl&group=programs&subgroup=proloc)对LpNAC6蛋白进行亚细胞定位预测[12];使用SignalP5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对LpNAC6蛋白进行信号肽预测[13];使用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)预测LpNAC6蛋白的二级结构[14];使用NetGlycate1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGlycate/)和NetPhos2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-2.0/)预测LpNAC6蛋白的糖基化位点和磷酸化位点[15];使用PlantTFDB数据库(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn)对LpNAC6进行功能预测。

    • 将细叶百合幼苗分别置于150 μmol/L ABA溶液、20% PEG6000溶液、2 ℃低温和200 mmol/L NaCl溶液中进行胁迫处理,分别在处理1、3、6、12、24和48 h时取细叶百合的根、茎、叶用液氮速冻并提取总RNA,用反转录试剂盒合成cDNA。使用Primer Premier 5软件设计特异性引物,LpNAC6-Y-F:5′- CGAGCCAAACATGATGCAGT-3′;LpNAC6-Y-R:5′-ATCCCTCCCAGCCTGATAGA-3′,以百合的LilyActin为内参基因。实时荧光定量PCR反应程序为:95 ℃预变性30 s;95 ℃变性5 s,58 ℃退火15 s,72 ℃延伸10 s,循环45次。添加熔解曲线的温度为:95 ℃ 10 s,60 ℃ 1 min,97 ℃ 1 s;最后37 ℃冷却1 min。每个处理做3次重复,采用2− ∆∆Ct[16]进行基因相对表达量的计算。

    • 根据LpNAC6基因序列及pBI121-GFP表达载体的多克隆位点,利用Primer 5软件分析选择LpNAC6基因中没有的酶切位点序列,即Kpn Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位点,设计含酶切位点的特异性引物,LpNAC6-Kpn Ⅰ-F:5′-GGTACCATGAGCAAGGATGGTCATGA-3′(下划线处为Kpn Ⅰ酶切位点);LpNAC6-Sal Ⅰ-R:5′-GTCGACCTTATAACTAGTGTAATCCC-3′(下划线处为Sal Ⅰ酶切位点)。PCR扩增出不包含终止密码子的LpNAC6基因的ORF序列,连接到pBI121-GFP空载体上,构建植物表达载体pBI121-LpNAC6-GFP。采用基因枪法将pBI121-LpNAC6-GFP重组质粒和pBI121-GFP空载体质粒轰击洋葱表皮细胞,然后放在1/2MS固体培养基上暗培养12 ~ 24 h后,置于激光共聚焦显微镜下检测LpNAC6蛋白的亚细胞定位。

    • 将已构建的植物表达载体pBI121-LpNAC6-GFP重组质粒使用电击法转化到根癌农杆菌EHA105中。通过叶盘法转化烟草。经过50 mg/L卡那霉素(Kana)抗性筛选后,PCR鉴定得到阳性转基因烟草T0代,收获种子并播种在1/2MS + 50 mg/L Kana固体培养基上,筛选得到转基因烟草T1代,用于后续实验。

    • 将转基因株系Tr-2、Tr-3和野生型烟草种子消毒后分别点播在含有0 mmol/L NaCl和150 mmol/L NaCl的1/2MS培养基中,每个平板均点播转基因株系Tr-2、Tr-3和野生型烟草种子3种,每种均匀点播15粒,每个处理做3次重复。处理2周后统计发芽率,3周后测量根长并记录。

    • 先将转基因株系Tr-2、Tr-3和野生型烟草种子消毒后点播在1/2MS培养基中培养2周,再移至花盆(草炭土、蛭石、珍珠岩的体积比为3∶1∶1)中培养4周,从中选取长势一致的烟草植株,用300 mmol/L的NaCl溶液每隔一天浇灌一次,对照组浇灌相同量的清水,重复3次。15 d后取叶片测定各项生理指标。

      采用分光光度法测定叶绿素含量[17];采用酸性茚三酮法测定游离脯氨酸含量[17];采用考马斯亮蓝G-250染色法测定可溶性蛋白含量[18];采用紫外吸收法测定过氧化氢酶(CAT)活性[18];采用氮蓝四唑(NBT)光化还原法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性[19];采用愈创木酚比色法测定过氧化物酶(POD)活性[19]

    • LpNAC6基因的开放阅读框长度为909 bp,编码302个氨基酸,在第13 ~ 137个氨基酸位置处存在一个高度保守的NAM结构域,属于NAC基因家族(图1)。

      图  1  LpNAC6的核苷酸与氨基酸序列

      Figure 1.  Nucleotide and amino acid sequences of LpNAC6

      氨基酸序列理化性质分析结果表明,LpNAC6蛋白相对分子质量为34 926.52,理论等电点为7.77,不稳定系数为46.94,亲水性平均系数为− 0.783(图2A),推测该蛋白为不稳定的亲水性蛋白。亚细胞定位和信号肽分析结果表明,LpNAC6蛋白定位在细胞核中,不含信号肽,为非分泌蛋白(图2B)。跨膜结构域分析结果表明,LpNAC6不存在跨膜序列(图3A)。二级结构预测结果表明,LpNAC6蛋白二级结构由α螺旋、延伸链、β转角和无规则卷曲组成,分别占26.49%、15.89%、8.94%、48.68%(图3B)。糖基化磷酸化位点分析结果表明,LpNAC6蛋白有5个糖基化位点和20个磷酸化位点。进一步对LpNAC6蛋白功能进行预测,结果表明,LpNAC6在植物生长发育中可能参与转录调控、DNA模板化和花的发育。

      图  2  LpNAC6的亲水/疏水性及信号肽分析

      Figure 2.  Hydrophilicity / hydrophobicity and signal peptide analysis of LpNAC6

      图  3  LpNAC6蛋白的跨膜结构域及二级结构预测

      Figure 3.  Prediction of transmembrane domains andsecondary structure of LpNAC6

    • 将LpNAC6氨基酸序列在NCBI网站上进行BLASTp同源性比对,结果表明,LpNAC6氨基酸序列与选取的11个物种的NAC氨基酸序列在N端具有较高的相似性,而在C端则差别较大,其中有155个氨基酸位点高度一致,说明NAC转录因子具有很高的保守性;与黄褐棉(Gossypium mustelinum)的同源性最高(图4),为83.7%。进化树分析结果表明,LpNAC6与海枣(Phoenix dactylifera)、油棕(Elaeis guineensis)、凤梨(Ananas comosus)的NAC转录因子单独聚为一大支(图5),亲缘关系较近,可能具有类似的蛋白功能。

      图  4  细叶百合LpNAC6与其他物种NAC蛋白的多序列比对

      Figure 4.  Multiple alignment of LpNAC6 for L. pumilum with the protein sequences of NAC from other plant species

      图  5  LpNAC6蛋白的系统进化树分析

      Figure 5.  Phylogenetic tree analysis of LpNAC6 protein

    • 采用实时荧光定量PCR的方法分析细叶百合LpNAC6基因在ABA、干旱、低温及高盐胁迫下的表达情况,研究该基因对非生物胁迫的响应。结果表明,150 μmol/L ABA胁迫下,处理1 h时,LpNAC6在根和茎中的表达量均达到了最大值,分别约为对照的2.45倍和1.22倍,此后均呈现显著下降的趋势;在叶中,LpNAC6在前12 h表达量无明显变化,处理24 h时显著升高达到最大值,约为对照的4.17倍(图6A)。20% PEG6000胁迫下,根中LpNAC6表达量在处理1 h时显著下降,此后显著升高,在24 h时达到最大值,约为对照的3.25倍;LpNAC6在茎中表达量变化不明显(图6B)。2 ℃低温胁迫下,在根和叶中,LpNAC6的表达量呈现先上升后下降的趋势,并分别在12 h和24 h达到最大值,约为对照的11.03倍和5.17倍;LpNAC6在茎中的表达量变化不明显(图6C)。200 mmol/L NaCl胁迫下,根中LpNAC6表达量呈现上升的趋势,在处理6 h时表达量最高,约为对照的47.05倍;LpNAC6在茎中呈现先下降后上升再下降再上升的表达趋势,在处理12 和24 h分别达到最小值和最大值,分别约为对照的0.44倍和7.31倍;在叶中,LpNAC6的表达量在前12 h变化不明显,在处理24 h时开始呈现显著下降的趋势(图6D)。以上结果表明,LpNAC6基因受非生物胁迫诱导表达。

      图  6  LpNAC6基因在不同组织和非生物胁迫下的表达模式

      Figure 6.  Expression patterns of LpNAC6 in different tissues and under different abiotic stresses

    • 通过观察洋葱表皮细胞中的GFP荧光蛋白表达情况,结果表明,在转入对照pBI121-GFP空载体质粒的洋葱表皮细胞中,绿色荧光信号分布在细胞的各个位置(图7A),而转入pBI121-LpNAC6-GFP质粒的洋葱表皮细胞仅在细胞核中发现绿色荧光信号(图7B),说明LpNAC6蛋白定位在细胞核上。

      图  7  LpNAC6蛋白的亚细胞定位

      Figure 7.  Subcellular localization of LpNAC6 protein

    • 选取转基因烟草和野生型烟草叶片,提取DNA和RNA。以DNA为模板,进行PCR检测,结果表明,得到与目的基因大小相同的条带(图8A),说明LpNAC6基因已被整合到烟草的基因组中。为了进一步验证LpNAC6基因在转基因烟草中的表达情况,以RNA反转录得到的cDNA为模板,进行PCR检测,结果表明,得到与目的基因大小相同的条带(图8B),说明LpNAC6基因已成功转入烟草中并表达。

      图  8  转基因烟草T0代植株PCR鉴定

      Figure 8.  Identification of transgenic tobacco T0 generation plants by PCR

    • 采用不同浓度的NaCl对转基因株系Tr-2、Tr-3和野生型烟草种子进行处理。结果表明,在NaCl浓度为0 mmol/L的1/2MS培养基中,转基因株系和野生型之间的生长情况没有显著性差异(图9BD);在NaCl浓度为150 mmol/L的1/2MS培养基中,转基因株系和野生型的生长都受到显著的抑制(图9CD),但转基因株系的种子萌发率和幼苗根长都显著高于野生型(图9EF),说明过表达LpNAC6基因能够提高烟草的耐盐性。

      图  9  转基因烟草种子和幼苗的耐盐性分析

      Figure 9.  Analysis of salt tolerance of transgenic tobacco seeds and seedlings

    • SOD、POD、CAT等抗氧化酶在清除活性氧过程中发挥着重要的作用,它们互相协同作用,从而增强植物的抗逆性。测定结果表明,在正常浇水的情况下,转基因株系Tr-2、Tr-3和野生型烟草的各抗氧化酶活性无显著性差异;用300 mmol/L的NaCl胁迫处理15 d后,转基因株系Tr-2、Tr-3的各抗氧化酶活性显著高于野生型(图10)。这些结果说明LpNAC6基因在盐胁迫下可以增强抗氧化酶的活性,在调节活性氧平衡中起作用,提高了烟草的耐盐性。

      图  10  盐胁迫下转基因株系和野生型烟草的氧化酶活性变化

      Figure 10.  Changes of oxidase activity of transgenic lines and wild-type tobacco under salt stress

    • 叶绿素是植物进行光合作用的主要色素,脯氨酸和可溶性蛋白都是重要的渗透调节物质,对它们的测定是了解植物代谢活力的重要指标。测定结果表明,盐胁迫下,转基因株系Tr-2、Tr-3的叶绿素、脯氨酸、可溶性蛋白的含量均显著高于野生型(图11),说明LpNAC6基因的过表达能够增强烟草的代谢活力,从而提高烟草的耐盐性。

      图  11  盐胁迫下转基因株系和野生型烟草叶绿素、脯氨酸和可溶性蛋白质的含量变化

      Figure 11.  Changes of chlorophyll,proline and soluble protein content of transgenic lines and wild-type tobacco under salt stress

    • NAC转录因子是植物特有的一类转录因子,广泛参与植物的生长发育、生物及非生物胁迫应答[20]。它们已经在拟南芥和水稻中得到了充分的研究,但在细叶百合中有关NAC转录因子的研究报道却很少。本研究从细叶百合中克隆得到LpNAC6基因,与大多数NAC转录因子一样,在其N末端含有一个高度保守的NAM结构域,符合NAC转录因子的重要识别特征[21],说明LpNAC6属于NAC家族中的NAM亚家族。蛋白质翻译后修饰会影响蛋白质的功能、定位、稳定性以及与其他分子的相互作用,如糖基化与磷酸化[22]。LpNAC6蛋白含有5个糖基化位点和20个磷酸化位点,推测其具有多种表达调控方式。LpNAC6与芹菜(Apium graveolens)AgNAC1[23]、番茄(Solanum lycopersicum)SlNAC71[24]、胡杨(Populus euphratica)PeNAC045[25]等NAC转录因子一样定位在细胞核中,在细胞核中发挥其功能。

      诸多研究表明,NAC转录因子参与非生物胁迫应答,但不同的基因受逆境胁迫诱导表达量不同,各个基因的表达又具有组织特异性。青杄(Picea wilsoniiPwNAC42在根、茎、针叶、球果中对NaCl、干旱、4 ℃以及ABA均有响应,在球果中表达量最高[26];中间锦鸡儿(Caragana intermediaCiATAF1能响应干旱、盐、冷和ABA胁迫,并且在叶中的表达量高于根和茎[27];水稻 ONAC045在根和叶中被干旱、盐、冷和ABA高度诱导表达,但在叶和根之间的表达模式不同[28]。本研究发现,LpNAC6基因受盐、干旱、低温以及ABA胁迫诱导表达,在根、茎、叶中的表达量不同,在根中的表达更明显,这与日本结缕草(Zoysia japonica)中ZjNAC2[29]的研究结果较为一致。表明LpNAC6可以响应非生物胁迫应答,且在不同组织中的表达模式不同。

      在植物不同的发育时期,转录因子对胁迫的反应可能不同,例如,水稻HDA705过表达降低了转基因水稻在ABA和盐胁迫下种子的发芽率,而在苗期,却增强了转基因水稻幼苗的渗透胁迫耐受性[30]。因此,本研究将LpNAC6基因转入烟草中并对其种子、幼苗、成苗进行盐胁迫处理,进一步研究LpNAC6基因的功能。结果发现,与野生型植株相比,LpNAC6转基因烟草在盐胁迫下其种子发芽率和幼苗根长受抑制程度较低,这一结果与Yong等[31]对卷丹(Lilium lancifolium)的LlNAC2基因研究结果类似。由此初步推测LpNAC6基因在盐胁迫下起正调控作用。有研究表明,在盐胁迫下,活性氧的过度积累会对植物细胞造成损伤,抗氧化酶SOD、POD和CAT是清除植物中活性氧的三种主要的酶[32];另外,植物细胞渗透调节和积累有机溶质的能力是耐盐机制的一个主要因素,如脯氨酸、可溶性糖和蛋白质等关键渗透物质的积累可以维持渗透平衡[33],而叶绿素的含量则直接影响到光合效率。本研究发现,在盐胁迫下,SOD、POD和CAT 3种抗氧化酶的活性在转LpNAC6烟草中显著增加,叶绿素、脯氨酸、可溶性蛋白的含量也均显著高于野生型,这与Zhao等[34]对南荻( Miscanthus lutarioriparius )中的MlNAC9基因研究结果类似。说明 LpNAC6 在盐胁迫下提高了抗氧化酶的活性,有效地清除了过量积累的活性氧,减轻了对膜系统的伤害,积累大量的渗透调节物质来提高细胞渗透势防止失水过度,减轻对叶绿素生物合成的影响从而提高光合速率。本实验发现,不同的转基因烟草株系对盐胁迫的耐受性不同,Tr-2株系比Tr-3株系的耐盐性强,这与Ma等[35]的研究结果类似。这些结果表明,LpNAC6基因是与盐胁迫相关的转录因子,其过表达提高了转基因烟草的耐盐性。这为细叶百合NAC转录因子的功能研究奠定基础,为百合的抗逆育种提供基因源。

      在植物对盐胁迫的响应中,植物形态、生理和生化的变化往往需要大量基因的表达才能实现,而功能基因的调控在很大程度上是由特异性转录因子诱导的。一些研究表明,NAC基因的表达会直接或间接诱导一系列非生物胁迫相关基因的表达[36]LpNAC6基因启动了下游哪些基因的表达,它们是如何互作的,这些问题需要进一步研究。

参考文献 (36)

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