Cryopreservation of embryogenic callus for Larix gmelinii var. principis-rupprechtii
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摘要:目的 超低温保存是植物优良种质长期保存的重要方法。本文为探究梯度预处理对超低温保存存活率的影响，以期有效保存华北落叶松胚性组织的发育潜能。方法 本研究以华北落叶松胚性组织为材料，对超低温冷冻保存程序中预培养、冷冻处理方式、解冻方式和恢复培养等关键环节开展研究。预培养和冷冻保护共设计成4种处理，以不经过预培养和冷冻保护直接冷冻保存为对照，每个处理重复3次。结果 结果表明：处理组合1、2、3之间虽无显著差异，但结合冷冻保护剂二甲基亚砜（ DMSO）对细胞具有一定毒害作用，高浓度的DMSO会影响后续胚性组织的恢复甚至造成细胞死亡，因此选出效果较好的超低温保存方法为： 0.2、0.4 mol/L山梨醇液体梯度预处理与0.4 mol/L山梨醇 + 5%DMSO为冷冻保护剂进行冷冻保护，最佳解冻方式为37 ℃水浴，解冻后的胚性愈伤组织细胞活性最高达78%；超低温保存后的胚性组织与正常增殖的胚性组织在外观及显微结构上无明显差异，且低温保存后的愈伤组织仍保持分化形成体细胞胚的能力。结论 研究结果为华北落叶松乃至其他针叶树胚性组织的超低温保存提供了参考。Abstract:Objective Cryopreservation is an important method for long-term preservation of plant germplasm. This paper aims to explore the effects of gradient preconditioning on the survival rate of cryopreservation to preserve the developmental potential of embryonic tissues of Larix gmelinii var. principis-rupprechtii.Method In this study, the embryonic tissues of Larix gmelinii var. principis-rupprechtii were used as materials to conduct research on the key links of pre-cultivation, freezing treatment methods, thawing methods and recovery culture in the cryopreservation procedure. The pre-cultivation and cryoprotection were designed into 4 treatments, and the direct cryopreservation without pre-cultivation and cryoprotection was used as the control, and each treatment was repeated 3 times.Result Although there was no significant difference between treatment combinations 1, 2, and 3, the combination of cryoprotectant DMSO had a certain toxic effect on cells. High concentration of DMSO will affect the recovery of subsequent embryonic callus and even cause cell death, so the effective cryopreservation method we selected was: the combination of 0.2 mol/L and 0.4 mol/L sorbitol gradient pretreatment and cryopreserve with 0.4 mol/L sorbitol and 5% DMSO as a cryoprotectant for cryoprotection; the best thawing method was 37 ℃ water bath, and the activity of embryonic callus was up to 78% after thawing. There was no significant difference in appearance and microstructure between the embryogenic tissue after cryopreservation and that of normal proliferation.Conclusion The results will establish good base for long-time cryopreservation for embryogenic cell lines in Larix gmelinii var. principis-rupprechtii and even some other conifers.
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华北落叶松（Larix gmelinii var. principis-rupprechtii）是我国北方重要的乡土针叶树种，生态价值高、生长迅速，在生态造林和经济用材中均发挥着重要作用[1]。体细胞胚胎发生（简称体胚发生）以单个或少数细胞为增殖单位，成熟稳定的体系具有繁殖效率最高、生产成本低、遗传稳定性强等特点[2]，是实现华北落叶松优良种质大规模无性快繁的重要途径；同时，体胚发生与合子胚胎发生具有相似性的发育过程，且体胚发生过程可控制性强、繁殖速度快、容易观察，已经成为植物胚胎发育研究的理想模型[3]；另外，体胚发生还是植物遗传转化中理想的受体系统[2]，因此无论是在理论研究还是实践应用中都具有重要应用价值。然而，在离体培养中，胚性愈伤组织可能会因长期继代而造成体细胞变异，或体胚发生潜力下降甚至彻底丧失[4]，严重影响系统的稳定性和高效利用，因此筛选可靠长久的低温保存方法至关重要。
超低温冷冻保存技术是目前应用十分广泛的种质长期保存方法[5]，它能够有效地遏制变异的发生，保存胚性材料的发育潜能，且以最少的量和最低的风险保存材料的完整性。国外采用体细胞胚胎发生快速繁殖已成为针叶树优质苗木规模化生产的重要途径[6]，而且体细胞胚胎发生技术可以和冷藏保存法结合起来[7]。将植物组织长期储存于液氮中，便于进行长期无性系试验[8]。自超低温保存技术第一次提出至今，随着科学技术的进步和发展，植物种质资源的超低温保存方法逐步得到完善。主要包括慢冻法、快冻法、包埋脱水法、玻璃化法、包埋玻璃化法和小滴玻璃化法等，其中慢冻法最常用来保存针叶树胚胎培养物。近年来，随着针叶树体胚发生研究取得巨大进展，该方法在冷杉（Abies fraseri）[9]、北美云杉（Picea sitchensis） [10]、柏树（Cupressus sempervirens）[11] 、巴西松（Araucaria angustifolia）[12]和湿加松（Pinus elliottii × Pinus canbaea）[13]等众多针叶树种中成功运用。目前，已经建立了稳定的华北落叶松体细胞胚胎发生体系，具备稳定的材料基础，因此对优良胚性细胞系的保存迫在眉睫，而对于华北落叶松胚性组织的超低温保存技术还未见报道。
本研究以华北落叶松液体增殖的胚性培养物为材料，本身组织分散性、均一性好，且组织长期在液体培养基中生长，适应性更强，从超低温保存过程的预培养、冷冻处理方式、胚性组织恢复、组织解冻方式等环节开展研究，旨在建立一套适合华北落叶松胚性细胞系超低温冷冻保存的方法，为长期稳定保存华北落叶松优良种质资源奠定重要基础。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料选用本实验室建立的稳定的华北落叶松胚性细胞系BL13-25a的继代3 ~ 4 d的胚性悬浮液进行超低温冷冻保存研究。
1.2 试验方法
1.2.1 预培养处理
本研究以添加高浓度的蔗糖或山梨醇进行梯度培养的方式进行。预培养的培养液采用液体增殖培养基，分别以0.2 mol/L和0.4 mol/L的浓度进行梯度预培养，每个浓度培养24 h。
第一阶段预培养处理。以继代培养3 ~ 4 d的胚性悬浮液为试验材料，采用60目和100目细胞筛过滤，滤除培养液后，在100 mL三角瓶中加入30 mL第一预培养基，进行第一阶段的预培养处理；其中：起始接种量为2%，即向培养基中添加0.6 g胚性愈伤组织；摇床转数105转/min， pH 5.8，（24±1）℃下暗培养，培养时间为24 h（通常为20 ~ 36 h）。
第二阶段预培养处理。在第一阶段预培养处理24 h（通常为20 ~ 36 h）后，采用60目和100目细胞筛过滤，滤除培养液后，置于第二预培养基中，进行第二阶段预培养处理； 摇床转数105转/min， pH 5.8，（24±1）℃下暗培养；第二阶段预培养处理的培养时间为24 h（通常为20 ~ 36 h）。
预培养后，向培养物中添加冷冻保护液。冷冻保护液以二甲基亚砜（DMSO）为基本保护剂，添加山梨醇或蔗糖配成不同的冷冻保护液，分别采用0.4 mol/L山梨醇或蔗糖与5%或10%二甲基亚砜的组合。上述预培养和冷冻保护共设计成4种处理，以不经过预培养和冷冻保护直接冷冻保存的胚性组织为对照，每个处理重复3次。
1.2.2 冷冻处理
预培养后的悬浮材料采用60目和100目细胞筛过滤，滤除培养液，将培养物分装至2 mL的冷冻管内，每支冷冻管内装入0.6 mL过滤后的培养物，然后再分别添加冷冻保护液，冷冻保护液的添加量为1.2 mL；冷冻保护液与培养物的体积之比为2∶1（通常为（1 ~ 4）∶1），每个处理均为3次生物学重复。将冷冻管放入程序降温盒（NalgeneTM Cryo 1℃ Freezing Container）进行程序降温，降温速度为−1 ℃/min，置于−40 ℃的冰箱中。程序降温至少4 h以后，直至温度降低至−40 ℃后，将冷冻管取出，迅速投入液氮生物容器中保存。
1.2.3 解冻处理
将存储在液氮生物容器内不同时间（1、7、14、28 d）的冷冻管取出，分别置于4 ℃冰箱内放置、室温下放置、37 ℃水浴、42 ℃水浴以及50 ℃水浴条件下进行解冻，每个处理均为3次生物学重复。待组织复融后，滤掉冷冻保护液，每个冷冻管中的复融后的愈伤组织分别用液体增殖培养基洗涤3 ~ 4次；用滤纸吸干组织表面液体培养基后，备用。解冻复融后的胚性培养物用于TTC（氯化三苯四氮唑）检测，检测冷冻愈伤组织复溶后的胚性细胞的活力，从而确定最佳解冻方式。
1.2.4 细胞存活及组织恢复生长
1.2.4.1 细胞存活率检测
采用氯化三苯四氮唑还原法（TTC法）测定冷冻后组织的细胞活力。由于（TTC）在脱氢酶的作用下被还原成一种不溶于水但易溶于酒精的红色复合物，因此可以利用95%乙醇对红色复合物进行抽提后，立即在分光光度计下定量测定。具体操作如下：将解冻并洗涤后的胚性材料，放入10 mL试管中，加入5 mL 0.5%TTC溶液，在25 ℃黑暗条件下培育24 h；TTC被脱氢酶还原成不溶于水的三苯基甲腙（TTF），吸去未被还原的TTC溶液，用蒸馏水冲洗3 ~ 4次；加入5 mL 95%乙醇，在65 ℃恒温水浴中培育30 min；抽提TTC被脱氢酶还原生成的红色TTF；冷却后取上清， 岛津UV2550分光光度计测定其在485 nm下的吸光度值，每个处理做3次重复。以正常继代增殖的胚性组织为对照，细胞相对存活率公式如下：
CV=ODfODc×100% 式中：CV为细胞相对存活率，ODf为冷冻处理后细胞的吸光度值，ODc为对照的吸光度值。
1.2.4.2 冷冻后组织恢复生长
冷冻保存1、7、14、28 d后，分别取出超低温保存的胚性组织。经过解冻洗涤后的胚性培养物立即转移到固体增殖培养基上，每皿接种6块胚性愈伤组织，5次重复。在25 ℃黑暗条件下，进行胚性愈伤组织超低温冷冻后的恢复培养。培养过程中，不断观察愈伤组织恢复生长情况，并在培养10 d后统计恢复生长率。以不经过冷冻保存的胚性愈伤组织的增殖培养为对照。
CRG=CRfFC×100% 式中：CRG为愈伤组织恢复生长率，CRf为冻存后恢复生长愈伤组织块数，FC为冻存愈伤组织块数。
1.2.5 体细胞胚的成熟处理
将经过超低温冷冻保存1、7、14、28 d后的材料进行解冻，恢复生长培养。将恢复生长的愈伤组织置于成熟培养基上进行分化培养，观察愈伤分化能力。
体胚的成熟过程设置过渡培养阶段和成熟培养阶段。将液体悬浮组织均匀分散于滤纸上，真空抽滤掉残存的液体培养基，置于过渡培养基上，过渡培养阶段条件为1/2 Litvay medium（LV）培养基 + 活性炭（AC）2 g/L + 蔗糖10 g/L，不添加植物生长调节剂，（24±1）℃暗培养7 d。
成熟阶段以1/2LV培养基为基本培养基，添加ABA 16 mg/L，蔗糖50 g/L，phytagel 7 g/L，PEG 75 g/L，附加水解酪蛋白400 mg/L，谷氨酰胺500 mg/L，pH调至5.8，（24±1）℃下暗培养8周左右。
1.2.6 数据分析
所有数据均采用Excel 2019处理，用SPSS 20.0 软件进行方差分析和差异显著性检验。
2. 结果与分析
2.1 预处理及冷冻保护对细胞存活率的影响
针叶树种胚性愈伤组织的冷冻保存前的预处理通常使用高浓度的山梨醇或者蔗糖进行梯度预培养。本试验以未进行任何预培养与冷冻保护为对照，4个处理组见表1，利用0.2 mol/L和0.4 mol/L的山梨醇或蔗糖分别进行梯度预培养24 h，以5%或10%DMSO为基本冷冻保护剂，超低温冷冻保存1 d后，37 ℃恒温水浴解冻，进行细胞存活率检测。结果如表1所示，对照组不经过任何预处理，直接进行冷冻保存的组织细胞存活率显著低于处理组，平均为23.54%。低温冰冻会使细胞内水结冰，造成细胞结构不可逆的破坏。植物组织不经过预处理，会导致细胞死亡，因此细胞存活率较低。
表 1 华北落叶松胚性细胞系超低温保存处理方式Table 1. Treatments for cryopreservation of embryogenic lines in Larix gmelinii var. principis-rupprechtii处理
Treatment预培养
Preculture冷冻保护液
Cryopreservant细胞存活率
Survival rate of cell/%对照 Control 23.54 ± 1.95a 1 0.2 mol/L山梨醇Sorbitol 24 h + 0.4 mol/L山梨醇Sorbitol 24 h 0.4 mol/L山梨醇Sorbitol + 5% DMSO 74.13 ± 4.72c 2 0.2 mol/L山梨醇Sorbitol 24 h + 0.4 mol/L山梨醇Sorbitol 24 h 0.4 mol/L山梨醇Sorbitol + 10% DMSO 69.44 ± 3.41c 3 0.2 mol/L蔗糖Sucrose 24 h + 0.4 mol/L蔗糖Sucrose 24 h 0.4 mol/L蔗糖Sucrose + 5% DMSO 69.67 ± 1.75c 4 0.2 mol/L蔗糖Sucrose 24 h + 0.4 mol/L蔗糖Sucrose 24 h 0.4 mol/L蔗糖Sucrose + 10% DMSO 61.45 ± 3.06b 注：不同小写字母表示Duncan法多重比较结果差异显著 (P < 0.05)。Note: different lowercase letters indicate significant differences in the multiple comparison results of Duncan method (P < 0.05). 处理组中，获得细胞存活率最高的处理1，平均为74.13%；其次依次为处理3、处理2和处理4，但是处理1、2、3之间不存在显著差异。由于试验使用的冷冻保护剂DMSO对细胞具有一定毒害作用，高浓度的DMSO会造成细胞死亡，因此5%DMSO更适合华北落叶松胚性愈伤组织的冷冻保护。
综合考虑以上因素，0.2 mol/L、0.4 mol/L山梨醇分别预培养24 h，以0.4 mol/L山梨醇添加5%DMSO作为冷冻保护剂，更有利于华北落叶松胚性愈伤冷冻后的细胞存活。
2.2 解冻方式对细胞存活率的影响试验
植物材料的超低温保存过程中，冷冻和解冻都可能造成细胞的冰冻伤害，采用合适的解冻方式才可以避免解冻过程中水分吸收导致的渗透压剧烈变化对细胞膜系统造成破坏。以处理组1中超低温冷冻保存1 d后的植物材料进行解冻试验，将冷冻1 d后的冷冻管分别置于4 ℃冰箱、室温下放置；置于37、42、50 ℃水浴锅内，进行水浴解冻，以上述5种方式进行解冻，待组织复融后，滤掉冷冻保护液，每个冷冻管中的组织分别用液体增殖培养基洗涤3 ~ 4次。滤纸吸干组织表面液体培养基后，用于TTC检测，从而确定最佳解冻方式，测定结果如图1。
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图 1 不同解冻方式对细胞存活率的影响不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。下同。Different lowercase letters indicate significant difference (P < 0.05). The same below.Figure 1. Effects of different melting methods on cell survival rates由图1可以看出：随着解冻温度逐渐升高，细胞存活率呈现先升高后降低的趋势，解冻效果为37 ℃水浴 > 42 ℃水浴 > 室温 > 50 ℃水浴 > 4 ℃冰箱，其中以37 ℃水浴解冻效果最好，细胞存活率平均为78.22%，可能由于该温度造成的解冻速度适中，一方面降低了细胞吸水和去质壁分离的损伤，另一方面又很大程度避免解冻速度慢引起细胞内发生再结晶而造成细胞破裂和细胞死亡。4 ℃冰箱中进行的解冻，就是解冻速度过于缓慢，引起细胞内的再结晶，从而造成细胞存活率较低。
2.3 冷冻后组织恢复生长检测
以上试验得到的最有效超低温冷冻保存程序为：培养基中附加0.2 mol/L、0.4 mol/L山梨醇分别预培养24 h；以0.4 mol/L山梨醇和5%DMSO作为冷冻保护剂，程序性降温后，液氮冷冻保存；以处理组1中超低温冷冻保存7 d后的植物材料进行解冻试验，将冷冻7 d后的冷冻管置于37 ℃水浴锅内，进行水浴解冻后用液体培养基冲洗3次。
经过以上程序，解冻后的胚性组织表面较光滑，无丝状结构（如图2A），将其置于固体增殖培养基上25 ℃黑暗条件下进行恢复培养；恢复培养7 d后，在胚性组织的某个部分最先长出白色半透明的丝状胚性愈伤组织（如图2B）；恢复培养14 d后，在冷冻的愈伤组织各个部分陆续有胚性愈伤组织长出，并且不断增大（如图2C）；至恢复培养28 d，已在冷冻的胚性组织表面包裹了一层重新生长的胚性愈伤组织（如图2D）。
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图 2 华北落叶松胚性愈伤组织超低温保存后的恢复生长A. 0 d；B. 7 d；C. 14 d；D. 28 dFigure 2. Regrowth after cryopreservation of embryogenic callus of Larix gmelinii var. principis-rupprechtii2.4 冷冻保存时间对组织恢复生长率的影响试验
超低温保存的目标是长期、安全、稳定的保存优良种质。因此，本试验研究了超低温保存时间对解冻后组织的恢复生长的影响。由图3可见，未经过超低温保存的胚性组织的生长率为100%；胚性组织冷冻保存1、7、14、28 d后，进行解冻恢复培养，发现4个保存时间后的恢复生长率之间并无显著差异，与未经超低温保存的对照组相比，本方法处理的胚性组织恢复生长率下降，降低至66.67% ~ 70.00%。试验结果初步表明液氮保存时间对华北落叶松胚性愈伤组织的恢复生长无显著影响，所得到的最优超低温保存条件可以达到长期保存的目的。
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图 3 不同液氮保存时间条件下胚性愈伤组织的恢复生长率Figure 3. Recovery growth rate of embryogenic callus under different storage time in liquid nitrogen2.5 体细胞胚的成熟试验
试验结果表明，经超低温冷冻保存而恢复生长的胚性组织，置于成熟培养基上进行分化培养，观察愈伤分化能力，8周后能够诱导出结构正常的体细胞胚（图4A），具备体胚再生能力的胚性组织为100%；与之相比，直接经液氮保存后存活的组织则失去了正常体胚的形成能力（图4B）。因此，经冷冻保护处理的超低温保存不但维持了胚性组织的增殖生长能力，而且没有降低胚性组织的分化潜能。
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图 4 华北落叶松胚性愈伤组织的成熟培养Figure 4. Mature culture of embryogenic callus of Larix gmelinii var. principis-rupprechtii3. 讨 论
在超低温冷冻过程中，对材料的伤害主要来自冰晶形成和冷冻保护剂毒性两个方面。因此冷冻前的预培养和冷冻保护剂的添加是超低温冷冻保存的关键步骤。
超低温保存前对组织进行预培养适当脱水，降低细胞内含水量，使细胞的分裂与分化同步，从而增强材料在面对低温保存过程中剧烈的温度变化和高度脱水时的抗逆境能力。针叶树胚性组织的超低温保存预培养的常见方法是预培养时培养基中添加高浓度蔗糖、山梨醇等，提高渗透压，使细胞逐步脱水，以达到增加抗寒能力的作用。在国外针叶树胚性组织的冷冻保存研究中，多采用高浓度蔗糖或山梨醇进行梯度培养，如塞尔维亚云杉（Picea omorika）胚性组织冷冻保存研究中，利用1周的预培养时间，培养基中添加0.25、0.5、0.75、1 mol/L蔗糖，依次培养24 h、24 h、2 d、3 d，使组织含水量缓慢降到约20%[14]；Gupta等[15]发表的适用于多种针叶树体胚冷冻保存的专利中采用液体培养基中添加0.2和0.4 mol/L山梨醇分别悬浮培养24 h。国内的针叶树胚性组织冷冻保存研究则多采用单一浓度蔗糖或山梨醇进行预培养，如刘伟东等[16]对湿加松（Pinus elliottii × Pinus canbaea）胚性愈伤组织的超低温冷冻保存研究中发现，0.5 mol/L山梨醇预培养4 d更有利于胚性愈伤组织的冻后存活率和复苏后愈伤组织的生长，沈李元等[17]在抗松材线虫病马尾松（Pinus massoniana）胚性愈伤组织冷存前的预培养中，利用0.5 mol/L蔗糖预培养36 ~ 48 h，解冻后的细胞存活率相对较高。由于胚性愈伤组织的含水量较高（> 90%），控制组织失水速度和失水量是影响预培养效果的关键，作者认为渗透剂浓度由低到高梯度预培养，可以有效控制组织失水速率，使组织可以适应失水环境，避免细胞失水过快受到损伤，因此本研究中采用的是0.2、0.4 mol/L渗透剂梯度预培养的方式。渗透剂的类型同样影响预培养的效果。Salaj等[18]研究了蔗糖、麦芽糖和山梨醇对黑松（Pinus nigra）胚性愈伤组织冷冻保存前预培养效果的影响，发现三者对预培养的多数胚性细胞系的恢复生长影响差异不显著，但在细胞系E247中，麦芽糖效果则明显优于其他两种渗透剂。本研究中选用针叶树冷冻保存中最常用的山梨醇和蔗糖作为预培养中的渗透剂，结果发现二者的预培养效果存在显著差异，山梨醇更适合于华北落叶松胚性组织冻存前的预培养。
针叶树冷冻保护通常采用复合型冷冻保护剂，以DMSO基本冷冻保护剂，附加其他高浓度渗透剂。DMSO的浓度是影响冷冻保护效果的关键。由于DMSO对细胞具有一定毒害作用，因此浓度过大会对细胞产生毒害作用，表现出材料发生褐化甚至死亡；反之，DMSO浓度过低，会使细胞脱水不好，细胞质达不到一定的浓度，导致抗冻能力下降[19]。本研究发现，DMSO浓度5%冷冻保护效果要优于10%。其他超低温保存研究中，DMSO的浓度也大多控制在10%以下，说明DMSO浓度超过10%对细胞毒害作用较大，不利于冷冻后细胞的存活。
据研究报道，大量落叶松属和云杉属树种的胚性愈伤组织经过超低温冻存，原胚团（PEMs）的液泡化的胚柄细胞会遭到不可逆的损伤，但是胚性区域却不受影响[20]。因此，适当的超低温冻存程序会避免破坏胚性细胞的结构，保持细胞的胚性能力。本试验中华北落叶松胚性组织冻存后，细胞团表面光滑，不存在丝状的原胚团的胚柄结构。然而，恢复培养7 d后，存活的组织会从胚性区域重新长出白色半透明丝状的原胚团组织；而死亡的组织则表面仍然光滑，无任何新生组织的生长迹象。但是，与未经过冻存的胚性组织的生长相比，冻存后的胚性组织恢复生长较慢，需经过1周左右时间才可能从冻存条件下恢复，有胚性组织再生。
在超低温冻存生物材料后，通常采用氯化三苯四氮唑还原法（TTC法）或二醋酸酯荧光素染色法（FDA法）来测定细胞活力，其检测的是细胞内某种酶的活性，试验周期短，不需要等待组织生长，便可进行初步判断。但是保存材料的损伤程度不能仅以此为标准，最直接准确的鉴定植物材料生活力的方法是经冻存后的组织或细胞的恢复生长，但是恢复生长培养时间较长。因此，研究中综合二者优势，利用前者进行初步鉴定筛选，再利用后者进行最终验证。
本研究对华北落叶松胚性组织的超低温保存方法进行了探究，筛选出适宜的超低温保存方案，建立了华北落叶松胚性组织的超低温保存体系，为华北落叶松胚性组织胚性的长期维持提供了技术参考，但冻后细胞的长期评估工作需进一步加强研究。
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图 1 不同解冻方式对细胞存活率的影响
不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。下同。Different lowercase letters indicate significant difference (P < 0.05). The same below.
Figure 1. Effects of different melting methods on cell survival rates
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图 2 华北落叶松胚性愈伤组织超低温保存后的恢复生长
A. 0 d；B. 7 d；C. 14 d；D. 28 d
Figure 2. Regrowth after cryopreservation of embryogenic callus of Larix gmelinii var. principis-rupprechtii
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图 3 不同液氮保存时间条件下胚性愈伤组织的恢复生长率
Figure 3. Recovery growth rate of embryogenic callus under different storage time in liquid nitrogen
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图 4 华北落叶松胚性愈伤组织的成熟培养
Figure 4. Mature culture of embryogenic callus of Larix gmelinii var. principis-rupprechtii
表 1 华北落叶松胚性细胞系超低温保存处理方式
Table 1 Treatments for cryopreservation of embryogenic lines in Larix gmelinii var. principis-rupprechtii
处理
Treatment预培养
Preculture冷冻保护液
Cryopreservant细胞存活率
Survival rate of cell/%对照 Control 23.54 ± 1.95a 1 0.2 mol/L山梨醇Sorbitol 24 h + 0.4 mol/L山梨醇Sorbitol 24 h 0.4 mol/L山梨醇Sorbitol + 5% DMSO 74.13 ± 4.72c 2 0.2 mol/L山梨醇Sorbitol 24 h + 0.4 mol/L山梨醇Sorbitol 24 h 0.4 mol/L山梨醇Sorbitol + 10% DMSO 69.44 ± 3.41c 3 0.2 mol/L蔗糖Sucrose 24 h + 0.4 mol/L蔗糖Sucrose 24 h 0.4 mol/L蔗糖Sucrose + 5% DMSO 69.67 ± 1.75c 4 0.2 mol/L蔗糖Sucrose 24 h + 0.4 mol/L蔗糖Sucrose 24 h 0.4 mol/L蔗糖Sucrose + 10% DMSO 61.45 ± 3.06b 注：不同小写字母表示Duncan法多重比较结果差异显著 (P < 0.05)。Note: different lowercase letters indicate significant differences in the multiple comparison results of Duncan method (P < 0.05). 
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