Effects of ethylene on the viability of cryopreserved Dendrobium protocorm-like bodies
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摘要:目的 为探究乙烯对PLBs超低温保存存活率的影响,以期为提高其存活率开拓思路。方法 以春石斛‘红梦幻’类原球茎(PLBs)为材料,分别在其玻璃化超低温保存的预培养和装载阶段添加外源乙烯供体乙烯利和乙烯合成抑制剂硝酸钴,测定PLBs超低温保存过程中内源乙烯前体1-氨基环丙烷羧酸(ACC)含量、ACC氧化酶(ACO)活性及PLBs液氮保存后细胞存活率。结果 结果显示:无论在预培养还是装载阶段,外源乙烯供体乙烯利处理后,超低温保存过程中PLBs内源ACC含量和ACO活性均显著提高,同时液氮保存后存活率也显著提高;在这两个阶段添加外源乙烯合成抑制剂硝酸钴后,超低温保存过程中PLBs内源ACC含量、ACO活性显著降低,液氮保存后存活率也显著降低。相关分析显示,PLBs液氮冻后存活率与其内源ACC含量和ACO活性呈极显著正相关。结论 本研究表明,外源乙烯调节剂乙烯利和硝酸钴通过调节内源乙烯含量而对玻璃化超低温保存的春石斛类原球茎存活率产生显著影响。Abstract:Objective This paper aims to explore the effects of ethylene on the survival rate of PLBs under cryopreservation to develop ideas for improving the survival rate of PLBs.Method The protocorm-like bodies (PLBs) of Dendrobium nobile ‘Hamana Lake Dream’ were used as materials, exogenous ethylene donor ethephon and ethylene synthesis inhibitor cobalt nitrate were added during the preculture and loading stages of its vitrification cryopreservation, respectively to study the effects of ethylene on cell survival rate, endogenous 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) content and ACC oxidase (ACO) activity of the cryopreserved PLBs.Result The addition of exogenous ethylene ethephon can significantly improve the endogenous ACC content, ACO activity and cell survival rate of Dendrobium PLBs after cryopreservation by vitrification. While, the addition of exogenous ethylene inhibitor cobalt nitrate significantly reduced the endogenous ACC content, ACO activity and the cell survival rate of PLBs after cryopreservation by vitrification. In addition, the survival rate of PLBs after cryopreservation was significantly positively correlated with endogenous ACC content and was extremely significantly positively correlated with endogenous ACO activity.Conclusion This study shows that the exogenous ethylene regulator ethephon and cobalt nitrate has a significant effect on the viability of Dendrobium PLBs after vitrification-cryopreservation by regulating endogenous ethylene.
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Keywords:
- Dendrobium protocorm-like body /
- ethephon /
- cobalt nitrate /
- ACC /
- ACO /
- cryopreservation /
- survival rate
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林分密度是造林和抚育工作中常用以评定林分稀密程度的指标,它是人工林经营重要的可控因子,对提高林木产量具有很重要的作用和意义[1−2]。林分密度调节控制是人工林经营的关键技术,也是提高人工林生产力水平以及最大限度发挥森林功能的重要途径。合理的林分密度不仅有利于林分健康稳定的生长,而且能通过自我的调控,改善林下环境状况,充分的利用光照、水分、空间等条件,增加木材产量,最大程度的发挥林地多种效益[3−4]。然而,合理的密度区间需要考虑林种、经营目标以及立地条件等因素,致使林分最优密度限值很难确定。林分密度控制图能够准确了解林木生长动态,掌握林木生长与林分密度之间数量关系,得到不同立地条件以及经营目标下的林分采伐时间,充分发挥林木的生长优势,为制定合理的经营策略提高经营水平提供了参考,从而将林分控制在合理密度范围内[2,4−5]。
林分密度控制图是反映林分密度与各项调查因子之间数量关系的一种经营图表,其能够准确的反映出同龄林动态的图式模型[2,6]。根据林分密度控制图,制定适当的林业措施,促进林分快速地生长,并且不会发生互斥竞争,避免自然稀疏现象的发生。Luis等利用其研制的密度控制图实现了对辐射松(Pinus radiata)林分的收获预估[7],López-Sánchez等利用密度控制图对花旗松(Pseudotsuga menziesii)林分树冠火发生规律进行了有效预测[8]。为了增加木材产量,获得更大的经济效益,世界各国以本国重要的用材树种为依托,研制了许多不同树种的密度控制图,先后编制了湿地松(Pinus elliotti)、香脂冷杉(Abies balsamea)和短叶松(Pinus banksiana)[5]、橡树(Quercus palustris)[9]、西黄松(Pinus ponderosa)[10],欧洲赤松(Pinus sylvestris)[11]、地中海白松(Pinus helepensis)[12]等主要用材树种的林分密度控制图,主要用于抚育间伐、产木材增量的预估、资源调查和造林设计等经营管。19世纪80年代末尹泰龙等[13]将林分密度控制图概念引入国内,靳爱仙等[14]和向玉国等[15]分别编制了马尾松(Pinus massoniana)和杉木(Cunninghamia lanceolata)的碳储量密度控制图,其在产量预估、资源调查等方面应用方便,对于马尾松林的经营有很重要的意义,但是不能解决定间伐的问题。
本研究基于热林中心建立的238块固定样地调查数据,编制热林中心马尾松人工林的密度控制图,研制的密度控制图主要为马尾松人工林的密度调控提供数据支持,为热林中心地区的马尾松林的产量预估,资源调查以及造林设计提供理论依据。基于构建的马尾松密度控制图的最优密度上限和下限,将热林中心地区的马尾松人工林分为3类,高于最优密度上限的高密度林分、介于最优密度上下限的合理密度的林分以及低于最优密度下限的低密度林分。基于二类调查数据,根据密度控制图最优密度上下限确定每个小班的密度分布情况。基于地理信息系统技术,研建了广西壮族自治区热林中心马尾松林分密度预警图,明确了当前热林中心马尾松林密度分布,对于高密度林分实行间伐,低密度林分进行补植,使林分处于最优密度状态。
1. 研究区概况与数据获取
1.1 研究区概况
本研究的样地分布在广西壮族自治区的热带林业实验中心,热林中心主要由伏波试验场、青山试验场、白云试验场和哨平试验场组成。热林中心地处22°00′ ~ 22°30′N、106°39′ ~ 107°00′E,太阳辐射的热量非常多,离海较近,夏季风的影响非常大。热林中心得气候类型是亚热带季风气候,夏季高温冬季温和,雨量较充沛,雨季高温多雨,从4—10月,平均降雨量为1 346.2 mm,10月到次年3月降雨量较少。气候特点特别适合植物的生长,对喜温林木、亚热带果树具有得天独厚的气候条件,热林中心的植物类型多,物种的丰富度非常高。热林中心位于桂西南地区,其地形主要以丘陵为主,平均海拔一般在500 ~ 800 m之间,最高峰伏波山高840 m,土壤以红壤为主,土壤较厚,氮、磷、钾以及腐殖质含量较高,适宜杉木、马尾松等用材林和珍贵阔叶树的生长。物种资源非常丰富,有植物种类达1 000多种。主要乔木有杉木、马尾松、香樟树(Cinnamomum camphora)、米老排(Mytilaria laosensis)、石梓(Gmelina chinensis)、红椎(Castanopsis hystrix)、八角(Illicium verum)、油桐(Vernicia fordii)、油茶(Camellia oleifera)、大叶栎(Quercus griffithii)、厚叶琼楠(Beilschmiedia percoriacea)、鸭脚木(Schefflera octophylla)等。林果类有柑果(Citrus reticulata)、红毛丹(Nephelium lappaceum)、梅(Prunus mume)、芭蕉(Musa basjoo)、龙眼(Dimocarpus longan)、荔枝(Litchi chinensis)、沙梨(Pyrus pyrifolia)、李果(Prunus salicina)、榄果(Canarium album)等;还有较多的芸香竹(Monocladus amplexicaulis)、黄毛草(Hedyotis chrysotricha)、鹧鸪草(Eriachne pallescens)、蜈蚣草(Eremochloa ciliaris)群丛、龙须草(Juncus effusus)等造纸原料。
1.2 样地布设与数据收集
本次研究的数据来源于广西热林中心,其采用系统抽样的样地布设方式,共布设了238个面积大小为400 m2系统抽样样地,238块样地如图1。2011年建立样地并进行第1次测量,每隔2年进行1次外业调查。本研究包括2011、2013和2015年3期调查数据。数据主要分为样地数据和样木数据,样木数据主要是树种、胸径以及林木的基本情况,样地数据有坡度、坡向、坡位、土壤厚度以及郁闭度等条件。
2. 研究方法
2.1 自然稀疏方程及拟合方法
选用Reneike自然稀疏模型[16],表达式如下所示:
lnN=aln(QMD)+b (1) 式中:N 为单位面积林木株数,QMD为平方平均直径,a 、b 为常数。
最小二乘法广泛的用于方程参数的估计,也是估计条件平均值最好的方法。但是,Kmenta发现最小二乘法参数估计存在缺陷[17]。Leduc通过对不同拟合方法的对比发现,reduced major axis回归能够减小参数值的偏差,结果表达更准确[18]。本研究侧重参数值的估计,为了降低参数估计产生的偏差,本文运用reduced major axis回归方法进行拟合。
2.2 模型的构建
马尾松人工林密度控制图的构建主要包括两个方面,一是计算求出马尾松人工林的自然稀疏线;二是计算马尾松人工林最优生长密度的上限和最优生长密度下限。当马尾松人工林处于完满立木度状态时,拟合得到Reneike方程,将方程平移到截距的95%置信区间的上限,即得到自然稀疏线。
本研究除了自然稀疏模型构建的最优密度的上下限、郁闭线以及自然稀疏线(2)外,还加入材积方程(3),优势木高方程(4),实现不同状态下林分年龄的预测。
lnN=a×ln(QMD)×N+b (2) V=a×N×(QMD−b)c (3) QMD=a×Nb×DHc (4) 式中:V为材积,DH为优势木平均高,a、b、c为模型参数。
2.3 马尾松人工林密度预警图研制
当马尾松林分在最优密度上下限内,林分既能充分利用林地又不会发生竞争死亡枯死现象。当低于最优密度下限,其不能充分利用林地资源,发挥林地的最大作用,造成资源的浪费;当高于最优密度上限,林木之间发生了互斥竞争,出现了枯死现象。因此,需要将最优密度限值外的小班进行预警,为森林经营提供数据支持。
马尾松人工林的密度控制图,一般将最大密度线整体向下平移到60%,得到热林中心马尾松人工林最优密度的上限,将最大密度线整体向下平移到30%,得到最优密度的下限。基于构建的马尾松最优密度上限和下限,将马尾松人工林分为3类,高于最优密度上限的高密度林分、介于最优密度上下限的合理密度的林分以及低于最优密度下限的低密度林分。
基于二类调查数据,以最优密度上下限为参照,根据小班密度情况将小班分为高密度林分、合理密度林分以及低密度林分,在地理信息系统的支持下中,将不同的密度的林分通过不同颜色表示出来,构建马尾松人工林密度分布预警图。
3. 结果与分析
3.1 收获预估密度控制图构建
基于2011年(90块)、2013年(89块)和2015年(71块)热林中心马尾松样地数据,采取Solomon等[19]提出的方法,从250块马尾松相对纯林样地筛选出 34 块相对密度(RD)大于等于0.70的完满立木度样地。通过RMA回归,拟合得到赖内克方程。其方程如公式(5),其中方程的均方根误差(RMSE)为0.096,R2为0.905。将方程的截距向上平移,使其到达95%置信区间的上限,即得到最大密度线,最大密度线如公式(6)。根据当地马尾松人工林经营的相关经验[20],在参考直径10 cm时,马尾松的最大密度是5 405株/hm2,构建马尾松人工林的密度控制图,一般将最大密度线整体向下平移到60%,得到热林中心马尾松人工林最优密度的上限,将最大密度线整体向下平移到30%,得到最优密度的下限,而最大密度线整体向下平移到20%,得到林分郁闭的限度值。这3条平行线分别为公式(7 ~ 9)此外,除了上述5条平行线外,密度控制图中还需要包括优势高模型(10)、材积模型[21](11)立地条件模型[22]以及地位指数模型(12)。
lnN=11.741−1.596ln(QMD) (5) lnN=12.270−1.596ln(QMD) (6) lnN=11.759−1.596ln(QMD) (7) lnN=11.066−1.596ln(QMD) (8) lnN=10.660−1.596ln(QMD) (9) DH=0.147653384×N0.21475633×QMD1.106125692 (10) V=0.714265437×10−4×DBH1.867008×DH0.9014632 (11) DH=1.265×S×1.12{(1−exp[(−0.464−0.057/S)]×t)}[1/(1−0.055−0.011×S+0.000144×S×S)] (12) 式中:S是林地指数,t是林龄。
综上所述,方程(5 ~ 9)以及马尾松的优势高模型和材积模型构成广西热林中心马尾松林分密度控制图(图2)。
3.2 密度预警图构建
马尾松人工林的密度控制图,一般将最大密度线整体向下平移到60%,得到热林中心马尾松人工林最优密度的上限,将最大密度线整体向下平移到30%,得到最优密度的下限。我们通过确定的密度控制图的上限(或下限)以及二类调查的小班数据,构建广西热林中心的马尾松人工纯林的密度预警图。落入合理区间不采取任何与密度调控相关的经营措施,使林分按照原来的经营模式发展;对没有落入最优密度控制范围内的样地小班实施一定的森林经营措施,在最优密度下限实施补植,在最优密度上限时,实施择伐,促使林分达到一个稳定的状态。
图3为热林中心马尾松人工林密度预警图。灰色表示非马尾松林地,其余3个颜色是马尾松林地。其中,蓝色表示最优密度区间的马尾松人工林,即林分的密度在最优密度上下限之间;红色表示马尾松人工林的密度较大,高于最优密度上限;黄色表示马尾松人工林的密度较小,低于最优密度下限。从马尾松密度分布图可以看出,热林中心马尾松人工林经营较好,合理密度的马尾松人工林占的比例较大,但是有问题的林分出现的比率也较大,低于密度下限的马尾松人工林尤为明显。
4. 结论与讨论
基于热林中心建立的238个固定样地,构建了马尾松人工林的密度控制图,基于构建的密度控制图和二类调查样地数据,研建了热林中心马尾松人工林的密度预警图,通过预警图可以得出热林中心马尾松人工林的经营措施合理,大部分的人工林密度在最优密度区间内,林分密度在合理密度区间,林木不仅能够最大限度的利用光照、水分等林地资源,而且林木个体之间处于促进生长的竞争状态,林分处于一个相对稳定的状态。但是有一部分小班存在问题,高于最优密度上限,林木的生长受到限制,林分出现自然枯死现象严重;低于最优密度下限,林地的资源条件得不到充分的利用,造成林地资源的浪费。本研究针对马尾松人工林预警图中密度已处于最优状态下的林分、密度高林分以及密度低下林分,结合相应的经营目标、立地条件、经营设施,提出如下建议:
(1)最优密度上下限合理密度条件下的林分。对于立地质量较差,以生产中小径材的林地,其林分相对稳定,不采取任何与密度调控相关的经营措施,使林分按照原来的经营模式发展;当林地的立地条件较好以培育大径材为主,或者交通便利不利于采用各种经营措施的林地,可以对这部分林分近自然改造,将其改造为以生产大径材为培养目标的近自然森林。但是近自然改造需要对马尾松人工林进行疏伐,破坏了马尾松林的稳定状态,为了更好地生产木材,建议保留一部分合理密度条件下的马尾松林,作为参考林分。
(2)当林木密度超过最优密度上限的林分,建议采取间伐措施,对林分进行疏伐并将林分逐步向稳定密度方向指引。由于热林中心马尾松人工林的种植时间间隔较大,需要根据马尾松林的年龄采取不同的经营措施。种植时间较早,已成熟的林分,直接采取皆伐的作业方式收获即可;对于接近成熟的林分可不采取密度调控措施,但是,林分密度过高,林内竞争导致的枯死现象较严重时,应采取疏伐作业,调整林分密度;对于种植时间较晚,林木年龄较小的中幼林,根据林分密度制定适当的抚育采伐间隔和强度。同时,根据实际条件可以对中幼林进行近自然改造,将马尾松人工纯林改造成为密度合理、结构复杂稳定、物种丰富度较高的混交异龄林。
(3)对于低于最优密度下限的林分,由于热林中心的人工林结构简单,树种单一,可以考虑对低密度林分进行近自然化改造,将林分调整到合理密度。密度低于最优密度的马尾松人工林,根据不同的年龄采取不同的营林措施:对于种植较晚的马尾松人工林,采伐作业方式不变,可以通过林下补植不同的珍贵阔叶树,提高林分密度,使密度合理。种植较早、年龄较大的马尾松林采取渐伐的方式进行收获,但采伐的间隔期要充分考虑补植阔叶树的生长期。
林分密度控制图是模拟林分平准整体的模型,反映林分密度与各项调查因子之间数量关系的一种经营图表,它能够准确的反映出同龄林动态的图式模型,从林分层面上为森林经营者提供森林经营的决策信息。但是,现有的林分密度控制图基本是人工纯林,如何适应时代潮流,营造多树种混交的人工改造林的密度控制图将是以后研究的一个热点。随着林业经营目标由木材生产向着森林多功能的转变,林分密度控制图的作用由木材生产为主朝着经济、生态和社会效益方向转变。研制密度控制图时,考虑到木材生产为主体的同时,最大程度的发挥森林的生态效益和社会效益。构建收获预估密度控制图、水源涵养密度控制图以及防风防火等自然灾害的密度控制图,通过适当的森林经营措施,使林分的密度既有利于防风倒又利于防火灾发生。
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图 1 预培养阶段添加外源乙烯调节剂乙烯利和硝酸钴对超低温保存后春石斛‘红梦幻’PLBs存活率的影响
图中数据用3个重复的平均值 ± 标准误表示,同阶段下不同小写字母表示各处理间差异显著(P < 0.05)。下同。Each bar represents mean ± SE over four repetitions. Columns with different letters are significantly different (P < 0.05). The same below.
Figure 1. Effects of adding exogenous ethylene regulator ETH and Co at the preculture stage on the survival rate of Dendrobiumnobile ‘Hamana Lake Dream’ PLBs after cryopreservation
图 3 外源乙烯调节剂乙烯利和硝酸钴的添加对玻璃化超低温保存中PLBs中内源ACC含量的影响
A、B分别表示在预培养阶段和装载阶段添加外源乙烯调节剂(乙烯利和硝酸钴)对玻璃化超低温保存下PLBs内源ACC含量的影响。Pr. 预培养阶段;L. 装载阶段;UNL. 去装载阶段;CK. 常规玻璃化程序;Pr+Eth和Pr+Co分别指预培养阶段添加乙烯利和硝酸钴的玻璃化程序;L+Eth和L+Co分别指装载阶段添加乙烯利和硝酸钴的玻璃化程序。下同。A, B are the effects of exogenous ethylene added in preculture medium or loading stage on endogenous ACC in PLBs under cryopreservation. Pr, preculture stage; L, loading stage; UNL, unloading stage; CK, common vitrification procedure; Pr+ETH and Pr+Co refer to vitrification procedure with ETH or Co addition at the preculture stage, respectively; L+ETH and L+Co refer to vitrification procedure with ETH or Co addition at the loading stage, respectively. The same below.
Figure 3. Effects of the addition of exogenous ethylene regulators ETH and Co on the content of endogenous ACC in PLBs during vitrification cryopreservation
表 1 存活率和内源ACC、ACO的简单相关系数矩阵
Table 1 Correlation coefficient matrix analysis of survival rate, endogenous ACC content and ACO activity
指标 Index 存活率 Survival rate ACC ACO 存活率 Survival rate 1.000 0.741* 0.956** ACC 1.000 0.732* ACO 1.000 注:**表示差异极显著(P < 0.01),*表示差异显著(P < 0.05)。
Notes: ** indicates that the difference is extremely significant (P < 0.01), and * indicates that the difference is significant (P < 0.05). -
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