Growth characteristics of fungi isolated from unearthed wooden cultural relics
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摘要:目的 为了解馆藏原位保存的出土木质文物上真菌病害特点,以针对性制定综合保护措施,本研究对南越国宫署遗址原位保存出土木质水槽上分离的11株真菌进行木材败坏测试和生物学特性观察。方法 将分离的真菌分别表面接种木材,观察对木材表面的影响;通过质量损失率测试各真菌对木材的生物降解程度;并通过对真菌在不同培养基上培养,观察其生长速率、产孢情况和显微特点等生物学特性;利用对峙生长试验研究其相互影响。结果 从木材表面接种测试观察到枝孢瓶霉菌、木霉菌、福氏拟青霉、篮状菌、黄暗青霉和镰孢菌在接种木材表面产生菌丝或孢子,使木材表面附着霉斑或者菌丝,聚壳座菌和节菱孢霉菌可使木材表面颜色发生显著变化。木材降解测试12周,担子菌纯黄白鬼伞使杨木的质量损失率接近10%,其他10株子囊菌基本未对杨木造成质量损失。PDA培养基上生长速率测试显示:木霉菌生长速度最快,每天生长近35 mm,其次是聚壳座菌、节菱孢霉菌、福氏拟青霉和镰孢菌,每天生长8 ~ 13 mm,较为缓慢是纯黄白鬼伞、聚多曲霉菌、黄暗青霉、篮状菌、枝顶孢霉菌和枝孢瓶霉菌,每天生长低于5 mm;除聚壳座菌、节菱孢霉菌和纯黄白鬼伞外,其余真菌均较易在不同培养基上产生孢子。对峙培养观察,木霉菌YN4-5对遗址中其他真菌生长都有一定的抑制作用,抑制率为11.0%~64.6%,对担子菌纯黄白鬼伞的抑制率最大。结论 分离的11种真菌中8种子囊菌可引起木质文物表面发霉或变色,担子菌纯黄白鬼伞有降解木质文物的风险;其中生长最快的木霉菌可通过竞争生长环境的方式抑制其他真菌生长,对有降解木材作用的纯黄白鬼伞的抑制作用最大,使木质文物降低了生物降解风险,从而分析认为目前该馆藏出土木质文物上的微生态相互作用已经达到一个平衡。Abstract:Objectives This research was carried out to observe and analyze the biological characteristics and the biodeterioration characteristics of 11 fungi strains isolated from the wooden water flume unearthed at the Nanyue National Palace site, to provide data on the designing of high-performance protection measures for the unearthed wooden cultural relics and the healthy environment in the museum.Method We inoculated the isolated fungi on the wood surface to observe the impact on the wood, tested the biodegradation degree of each fungus on the wood through the mass loss rate, and observed the biological characteristics such as growth rate, sporulation and microscopic characteristics by culture on different media, used the confrontation growth experiment to study their interaction.Result The wood surface inoculation test showed that Cladophialophora sp., Trichoderma sp., Paecilomyces formosus, Talaromyces sp., Penicillium citreonigrum, Fusarium sp., Eutypella sp. and Arthrinium sp. stained or discolored the surface of wood. After 12-week wood degradation test, the mass loss of poplar wood was nearly 10% by Leucocoprinus birnbaumii. Among them, Trichoderma sp. grew fastest, nearly by 35 mm per day; Eutypella sp., Arthrinium sp., P. formosus and Fusarium sp., with a daily growth of 8−13 mm; L. birnbaumii, A. sydowii, P. citreonigrum, Talaromyces sp., Acremonium sp. and Cladophialophora sp., with a daily growth of less than 5 mm on PDA media. All the other fungi were easy to produce spores on different media, except for Eutypella sp., Arthrinium sp. and L. birnbaumii. Trichoderma YN4-5 had certain inhibitory effect on the growth of other fungi, with inhibition rate of 11.0% to 64.6% by confrontation growth test. YN4-5 had the highest inhibition rate to the basidiomycete L. birnbaumii.Conclusion Eight ascomycetes of fungi strains isolated could cause stain or discolored on the surface of wooden cultural relics, and L. birnbaumii had risk of degrade to wooden cultural relics. Among them, Trichoderma sp
. with the fastest growth can inhibit the growth of other fungi by competitive growth environment, and it has the greatest inhibitory effect on L. birnbaumii, which reduce the degradation risk of wooden cultural relics. Therefore, it is speculated that the microecological interaction on the unearthed wooden cultural relics in this museum has reached a balance. -
木质文物作为古代文明的一种重要载体,记录着人类文明的发展历程,是研究古代不同时期历史、艺术、科技和经济发展的宝贵实物资料[1]。对木质文物的保护也一直是文化遗产保护研究的重点。由于木材主要是由纤维素、半纤维素和木质素组成的天然生物质材料,因而木质文物在长期保存中易受到微生物的侵蚀和降解[2]。目前留存在世的古代木材一种是以古建筑形式被保存下来,一种是以出土、出水文物的形式被发掘或打捞出来。对古建筑木材影响较大的病害主要集中在腐朽和虫蛀[3-5]。而出土木质文物由于木材组成、结构及保存环境和保存形式的不同,与古建筑木材病害有所不同[6]。有研究表明埋藏于地下的木质文物微生物降解主要来自侵蚀细菌和软腐真菌[7-9];但当被发掘出来暴露于空气中后,环境因素发生剧烈变化,木质文物更易遭受一些腐生真菌侵蚀[10-11]。不同微生物对木质文物造成的病害不同,对文物的影响程度也不同。一般对木材影响较大的真菌主要可以分为3类,一类是可对木材主成分降解的腐朽菌,一类是可使木材颜色发生变化的变色菌,第三类是可使木材表面发霉的霉菌[12-13]。而在保存环境中,真菌之间的竞争与互作,对整个馆藏环境中的微生态也有影响,只有充分掌握病害微生物状况,才能使木质文物和馆藏环境保护措施达到预期效果[14]。因此,对原位保存出土木质文物上的病害真菌进行木材败坏测试和生物学特性观察,将有助于进一步了解病害真菌对木质文物和馆藏环境的危害特点,对有针对性地筛选合适的杀菌剂奠定基础。
广州南越国宫署遗址木质水槽、木暗渠等木质文物采取原位保存方式,渠体一半埋藏于地下,一半裸露展示供游客参观。与地面接触有木材腐朽菌侵染风险,高温高湿环境下有霉菌和变色菌侵染风险,因而方旋等[15]对疑似真菌生长的木质水槽取样,采用传统组织分离技术分离纯化得到真菌10株,根据子实体获得一株担子菌纯黄白鬼伞(Leucocoprinus birnbaumii);采用高通量测序技术对样本真菌组成和丰度进行测试,木质样本中担子菌平均含量不到20%,主要检测到的是纯黄白鬼伞,其他占比较高的子囊菌也基本分离到了。为弄清这些真菌是否对木质文物本体确实有败坏,以及造成什么类型的败坏,本研究进一步测试此分离鉴定的11株真菌对木材的败坏,并通过不同培养基生长和平板对峙培养试验,对真菌生长速率、产孢与否、营养物质吸收情况和互作方式等生物学特性进行研究,从而充分了解馆藏原位保存木质文物上的病害特点和微生态环境,为进一步研究木质文物本体保护和评价目前保护措施是否得当提供依据。
1. 材料与方法
1.1 材 料
1.1.1 培养基成分和制备
各培养基按照如下配方称量,加蒸馏水或去离子水定容,加热煮沸1 min以上使彻底溶解后,分装,121 ℃高压灭菌15 min,备用。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA): 马铃薯浸粉 3 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂15 g/L;麦芽汁琼脂培养基(MEA):麦芽抽提粉20 g/L、蛋白胨1 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂15 g/L;查氏酵母膏琼脂培养基(CYA):K2HPO4 1 g、查氏浓缩液(NaNO3 300 g/L、KCL 50 g/L、MgSO4·7H2O 50 g/L、FeSO4·7H2O 1 g/L、ZnSO4·7H2O 1 g/L、CuSO4·5H20 0.5 g/L)10 mL/L、酵母抽提物5 g/L、蔗糖30 g/L、琼脂15 g/L;25%甘油硝酸盐琼脂培养基(G25N):K2HPO4 0.75 g/L、查氏浓缩液7.5 mL/L、酵母抽提粉3.7 g/L、甘油(分析纯)250 g/L、琼脂15 g/L;肌酸琼脂培养基(CREA):肌氨酸 3 g/L、蔗糖30 g/L、KCL 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L、K2HPO4·3H2O或者K3PO4·7H2O 1.3 g/L、溴甲酚紫0.05 g/L、琼脂15 g/L。
1.1.2 菌株种类和编号
采用方旋等[15]从南越国宫署遗址原位保存的出土木质水槽上分离纯化的11株真菌,编号和菌株种类见表1。其中YN6-3为担子菌,其余皆为子囊菌。
表 1 真菌种类及编号Table 1. Fungus species and No.编号 No. 真菌种类 Fungus species YN1-1 黄暗青霉 Penicillium citreonigrum YN1-2 福氏拟青霉 Paecilomyces formosus YN3-2 聚壳座菌 Eutypella sp. YN4-5 木霉菌 Trichoderma sp. YN5-31 节菱孢霉菌 Arthrinium sp. YN5-4 镰孢菌 Fusarium sp. YN2-2 枝顶孢霉菌 Acremonium sp. YN4-2 聚多曲霉 Aspergillus sydowii YN4-3 篮状菌 Talaromyces sp. YN5-6 枝孢瓶霉菌 Cladophialophora sp. YN6-3 纯黄白鬼伞 Leucocoprinus birnbaumii 1.1.3 试 件
以毛白杨(Populus tomentosa)作为试材,选取无明显节子和蓝变等缺陷的边材,锯解成尺寸为20 mm (径向) × 20 mm (弦向) × 2 mm (轴向)和20 mm (径向) × 20 mm (弦向) × 10 mm (轴向)的试件,20 mm (径向) × 20 mm (弦向) × 2 mm (轴向)尺寸的杨木方片用于木材表面败坏性能测试,20 mm (径向) × 20 mm (弦向) × 10 mm (轴向)尺寸的杨木方块用于木材降解性能测试,其中饲木选用尺寸为20 mm (径向) × 20 mm (弦向) × 3 mm (轴向)的毛白杨边材,各试件自然气干备用。
1.2 方 法
1.2.1 菌株生长速率和生长特性观察
菌株生长速率测量:将表1中的真菌分别在含有PDA培养基的培养皿中活化,培养3 ~ 7 d后,用直径为1 mm的打孔器沿菌落外沿打菌饼,分别接种一个菌饼在倒有适量PDA培养基的培养皿中央,每个菌接种3皿,放于28 ℃、湿度80%培养箱中培养。从第2天开始测量菌落直径,直至长满皿,计算每天菌落生长速率(菌落生长速率 = 总生长量/生长天数)。
菌株生长特性观察:将表1中的真菌分别在含有PDA培养基的培养皿中活化,培养3 ~ 7 d后,用直径为1 mm的打孔器沿菌落外沿打菌饼,分别接种到倒有适量CYA、MEA、G25N和CREA的直径为90 mm培养基平皿中,每一培养基接种3个菌饼,各菌饼相隔约40 mm,每种菌每种培养基设置3个重复,放于28 ℃、湿度80%培养箱中培养。每天观察各菌在不同培养基上的菌丝长势、菌落形态、菌丝和菌落颜色变化,量取并记录菌落直径,计算每天菌落生长速率。
显微观察:制作显微切片,显微镜下观察各菌株分生孢子和分生孢子梗的形态特征。
1.2.2 菌株对木材表面败坏性能测试
根据菌株在不同培养基上的产孢情况,选取各菌株易产孢的培养基进行产孢培养。然后挑取菌丝块放入无菌水中将孢子洗脱,用血球计数板计数测定孢子悬浮液浓度并调至约1 × 106个/mL备用;几种培养基上均不产孢的个别菌株,喷洒等量的菌丝体悬浮液。用无菌水和 75%酒精依次擦拭杨木方片3次。将制作好的孢子菌丝悬浮液,均匀喷洒到杨木方片上,每组3个重复,以同量无菌水喷洒杨木方片作对照组,然后将其一起放置于培养箱中,每隔2 d观察木材表面变化,记录对木材表面的影响。
1.2.3 菌株对木材降解性能测试
参照 GB/T 13942.1—2009《木材耐久性能第一部分:天然耐腐性实验室试验方法》[16]中的腐朽测试方法,将纯化保存的11株真菌分别进行杨木腐朽测试,接种前称量杨木试块绝干质量,接种培养12周后再次测量杨木绝干质量,按下式计算质量损失率。每菌接种杨木10 ~ 12块,结果取平均值。质量损失率计算公式如下:
L=(m0−m1)/m0×100% 式中:L 为试件质量损失率,%;m0为试件腐朽前的绝干质量,g;m1为试件腐朽后的绝干质量,g。
1.2.4 对峙培养测试
为研究馆藏环境下各菌相互影响情况,拟选择生长速率最快的木霉菌株YN4-5与其他真菌进行对峙培养试验。将纯化保存的11种真菌在PDA培养基中活化,培养3 ~ 7 d后,用直径为1 mm的打孔器沿菌落外沿打菌饼,将YN4-5菌饼与其他菌菌饼一起接种在直径为90 mm的PDA培养基平皿中,两菌株相隔约40 mm,距离培养基边缘约20 mm,对照组单独接菌饼在另外PDA培养基平皿中央,各重复3 皿,放置于培养箱中培养,从第2天开始每天观察生长情况并用十字交叉法测量菌落直径,计算抑制率(%)。抑制率 = (对照组菌落直径 – 处理组菌落直径)/对照组菌落直径 × 100%。
2. 结果与分析
2.1 菌株生长速率和生长特性
2.1.1 菌株生长速率
在PDA上测试的菌株生长速率见表2。表2显示:在PDA培养基上的真菌生长速率可以分成快速、中速和慢速这3类: YN4-5生长最快,每天生长近35 mm,一般2 d即长满皿,为快速生长菌;其次是YN3-2、YN5-31、YN1-2和YN5-4,每天生长8 ~ 13 mm,为中速生长菌;慢速生长的菌是YN6-3、YN4-2、YN1-1、YN4-3、YN2-2和YN5-6,每天不超过5 mm。
表 2 11株真菌在PDA培养基上的生长速率Table 2. Growth rate of 11 fungi on PDA medium项目 Item 快速生长 Fast growing 中速生长 Medium speed growing 慢速生长 Slow growing YN4-5 YN3-2 YN5-31 YN1-2 YN5-4 YN6-3 YN4-2 YN1-1 YN4-3 YN2-2 YN5-6 生长速率 Growth rate/(mm·d−1 ) 34.54 12.53 11.54 8.49 8.00 4.55 3.77 3.32 2.72 2.08 1.87 2.1.2 菌株生长特性
为进一步观察各菌株生长特性和孢子形态,将11株分离纯化的真菌分别接种在MEA、CYA、G25N和CREA这4种培养基上,观察其生长速率和产孢情况,显微镜下观察孢子形态、分生孢子梗等,结果见表3、图1和图2。
表 3 11株真菌在不同培养基上的生长速率和产孢情况Table 3. Growth rate and sporulation of 11 fungi on different media编号
No.MEA CYA G25N CREA 生长速率
Growth rate/
(mm·d−1 )产孢情况
Sporulation生长速率
Growth rate/
(mm·d−1 )产孢情况
Sporulation生长速率
Growth rate/
(mm·d−1 )产孢情况
Sporulation生长速率
Growth rate/
(mm·d−1 )产孢情况
SporulationYN1-1 3.84 + + + 4.78 + 3.03 + + 3.20 + + + YN1-2 14.13 + + + 14.22 + + 5.36 + + + 11.32 + + + YN3-2 4.56 − − − 13.86 − − − 2.40 − − − 5.77 − − − YN4-5 29.96 + + + 25.12 + + + 0 − − − 30.28 + + + YN5-31 11.76 − − − 15.12 − − − 5.81 − − − 9.33 − − − YN5-4 10.02 + + + 11.73 + + + 2.34 + + + 12.24 + + YN2-2 2.33 + + + 1.73 + + + 0.66 + + + 2.34 + + YN4-2 3.24 + + + 3.66 + + + 4.09 + + + 2.92 + + + YN4-3 2.28 + + + 2.26 + + + 1.44 + + + 2.02 + + + YN5-6 2.13 − − − 1.92 − − − 0 − − − 1.60 + + YN6-3 3.71 − − − 1.09 − − − 0 − − − 0.85 − − − 注: + + + 表示视野中分生孢子相对较多; + + 表示视野中分生孢子相对一般; + 表示视野中分生孢子相对较少;− − − 表示视野中不可见分生孢子。Notes: + + + means there are relatively more conidia in the field of view; + + means the conidia in the field of view is relatively ordinary; + means there are relatively few conidia in the field of view; − − − means no conidia is visible in the field of view. 表3显示:YN1-1、YN1-2、YN5-4、YN2-2、YN4-2和YN4-3在4种培养基上都可产生孢子,且在MEA培养基上产生孢子量稍大,YN5-6仅在CREA培养基上产生分生孢子,而YN3-2、YN5-31和YN6-3在4种培养基上都未能诱导产孢。
同一种菌在不同碳源和氮源培养基中培养,其菌落形状差异很大(图1),除了担子菌YN6-3在MEA培养基上生长速度较快,菌丝发育良好,其他子囊菌菌株都是在CYA培养基上生长发育更好,显示CYA培养基适合这些子囊菌生长,而担子菌YN6-3更适合在MEA上进行培养。MEA培养基是以有机氮(蛋白胨)为氮源的培养基,CYA以硝酸氮为氮素营养,说明YN6-3能更好地利用有机氮源蛋白胨,子囊菌在硝酸氮营养上可以很好生长,酵母提取物中含有的多种维生素也能促进这些子囊菌的生长发育[17];G25N培养基可以观察菌株对甘油的利用和耐受度。除了YN4-2能在G25N培养基上生长发育良好外(图1),其余菌株在G25N上菌丝生长发育都比较差,其中YN4-5、YN5-6和YN6-3不能存活,YN5-4和YN2-2可以存活,但几乎没有进一步生长,其他菌如YN4-3、YN5-31、YN1-1、YN1-2和YN4-5生长速度较在MEA和CYA培养基上明显变慢。说明甘油对于大多数真菌,都不是良好的碳源营养,甚至可完全抑制其生长。CREA以肌氨酸为氮源,所有菌在此培养基上基本都可以生长,对生长速率的影响不明显,明显的变化是影响真菌的气生菌丝发育,所以菌落形态与在其他培养基上差异较大(图1)。
另外,CREA培养基中溴甲酚紫为酸碱指示剂,其pH与培养基颜色范围5.2(黄色) ~ 6.8(紫色)。由图1可见:接种YN1-1和YN6-3的CREA培养基上菌落周围出现黄色,接种YN4-3的CREA培养基全部变为黄色。由此可知,菌株YN1-1和YN6-3在生长发育中分泌少量酸性物质, YN4-3在生长发育中相对会分泌更多的酸性物质。
这些真菌在除了甘油外的其他碳源上都可生长,也均可利用肌氨酸、硝酸和有机氮作为氮源。通过分析木材的化学组分研究[18]得出:出土木材与健康木材的变化主要是发生了碳氢化合物的降解和损失,木质素的量还接近原始状态,推测这些真菌在出土木材上的存活应该不会受到影响,但由于缺乏碳素营养,生长速率也许会减慢,产孢量也会受到影响。
在物镜40X显微镜下观察各菌分生孢子梗、分生孢子着生方式和分生孢子形态等特征(图2)。显微观察可知:YN1-1可见分生孢子小球形;YN1-2分生孢子小球形至椭圆形,分生孢子梗有隔且顶端不膨大,其顶端产生瓶状小梗,小梗顶端着生孢子;YN2-2分生孢子小球形至卵圆形;YN4-2分生孢子球形,分生孢子梗有隔且顶端膨大,其上产生瓶状,分生孢子聚集在顶端的小梗上呈头状;YN4-3分生孢小球形至卵圆形,分生孢子梗顶端多次分枝,形成扫帚状,分枝顶端产生瓶状小梗,小梗顶端孢子串生;YN4-5分生孢子球形,分生孢子梗有隔且多次分枝,顶端产生瓶状小梗,分生孢子着生于瓶状小梗上;YN5-4分生孢子椭圆至镰刀型,无隔或者单隔;YN5-6分生孢子椭圆形,无隔或者单隔。
2.2 菌株对木材表面败坏性能的影响
根据表3中各菌在不同培养基的产孢情况,MEA培养基上大多数菌(YN1-1、YN1-2、YN4-5、YN5-4、YN2-2、YN4-2和YN4-3)可产孢,且产孢量较大,因而将此7种真菌在MEA上进行培养。YN5-6在CREA培养基上培养产孢,YN3-2、YN5-31和YN6-3在这4种培养基上都未见产孢,但相比而言在CYA培养基上生长速度较快,所以这3种菌在CYA上培养。将收集的真菌孢子菌丝悬浮液5 mL均匀喷洒在杨木方片上,对照杨木均匀喷洒同量灭菌水,一起放于培养箱中培养,每天观察木片表面,7 d后取出,比较接种木材与对照材表面。结果显示:YN5-6接种木材表面第2天即出现灰黑色的菌丝绒团,后逐渐加剧;YN4-5接种木材表面第2天出现绿色菌丝绒团,后绒团颜色逐渐加剧变为墨绿色,用显微镜检查发现绒团实为孢子团;YN1-2接种木材表面第3天开始出现粉质状的土黄色菌丝物;YN4-3接种木材表面第3天出现鲜黄色菌丝绒团,而YN1-1接种木材表面第3天观察到粉质状的青绿色的菌丝物;YN5-4接种木材表面第3天开始长出白色菌丝;YN3-2接种木材表面第3天虽然未观察到菌丝,但木材表面变红,后颜色逐渐加剧且分布不均匀;接种YN5-31第4天木材表面开始变暗发红(图3)。YN2-2、YN4-2和YN6-3接种木材表面7 d取出后,没有出现明显的变化,镜检也未发现菌丝和孢子。
表面接种测试表明:枝孢瓶霉菌、木霉菌、福氏拟青霉、篮状菌、黄暗青霉、镰孢菌、聚壳座菌和节菱孢霉菌这8株真菌可使木材表面发霉或者变色,为木材表面败坏菌,对馆内的木质文物会带来外观的影响。表3显示除了聚壳座菌和节菱孢霉菌外,其余木材败坏菌均可产生孢子。枝顶孢霉菌和聚多曲霉虽然不能影响木材表面,但这两种菌在碳源和氮源比较差的培养基上也可大量产孢,孢子的弹射在馆内会对环境和人员健康造成直接或间接的危害,也需要进一步制定防护措施[15]。
2.3 菌株对木材降解性能的影响
为进一步确定这些分离的真菌对木材的败坏作用,将11株真菌分别按照腐朽测试方法接种杨木试材12周,检查可否对木材造成质量损失,结果显示:10株子囊菌基本未对杨木造成质量损失,说明这些真菌不能降解木材成分;担子菌YN6-3接种杨木,引起杨木试材变软、表面浆化,去掉菌丝后,木材表面发黄,质量损失率近10%。这说明YN6-3可以降解木材成分,对木质文物有潜在降解风险,其降解机理有待进一步研究和分析。
2.4 对峙培养测试
木霉菌在大多数环境或基质上生长迅速,易于分离和培养,可产生多种拮抗物质,其抑制病原真菌的作用早已被人们认识并逐渐利用[19]。诸多研究表明,木霉菌在病害生物防治中可通过与病原菌重寄生、竞争营养和空间、产生抗生素抑菌、分泌细胞壁降解酶降解病原菌细胞壁组分以及重寄生病菌等抑制病原菌的生长[20-22]。生长速率测试试验显示:在馆内分离的木霉菌YN4-5在所有分离的真菌中生长最快,每天生长速率可达25 mm以上,远远超过其他分离的真菌,具备了作为拮抗真菌的生长快速的特点。因而本研究将木霉菌YN4-5与其他10株菌对峙培养,观察是否有抑制作用,以第3天的生长数据计算YN4-5对其他真菌生长的影响,结果见表4。
表 4 YN4-5对其他真菌的抑制作用Table 4. Inhibitory effect of YN4-5 on other fungi编号 No. 抑制率 Inhibition rate/% YN6-3 64.6 YN4-2 60.1 YN1-1 57.1 YN2-2 53.7 YN4-3 44.1 YN5-6 40.2 YN1-2 39.4 YN5-31 27.2 YN3-2 24.9 YN5-4 11.0 由表4数据可知,木霉YN4-5对其他真菌的生长都有一定的抑制作用。其中YN4-5对YN6-3的抑制效果最明显,达到64.6%,对YN5-4抑制效果最弱,为11.0%。在YN4-5作拮抗菌株的对峙培养中, YN4-5最终会和其他真菌生长形成两种情况:一种是两菌株各自形成一定的菌落,分界线基本不变(图4a),这些菌有YN1-2、YN5-31、YN3-2 和YN5-4,基本为中速生长菌;另一种则显示木霉YN4-5将这些菌完全覆盖(图4b),有YN6-3、YN4-2、YN1-1、YN2-2、 YN4-3和 YN5-6,这些基本都是慢速生长菌。分析得到木霉菌YN4-5是通过竞争生长空间来抑制其他真菌的生长。
通过木质文物上所有真菌的高通量测序分析发现其占优势的是子囊菌,担子菌很少,除了酵母外就是纯黄白鬼伞YN6-3[15]。本研究发现纯黄白鬼伞虽然可以降解木材(近10%的木材质量损失率),但共同生活的YN4-5菌对纯黄白鬼伞高度抑制,分析得到目前原位保存的木质文物发生生物降解的风险还是非常低的。
3. 结 论
本研究对南越国宫署遗址原位保存出土木质水槽上分离鉴定的11株真菌进行了生长特性观察、木材表面败坏性能测试、木材降解性能测试和对峙培养测试,来研究土木质文物原位保存环境下的病害真菌生物学特性及其对木质文物的具体危害,得出以下结论:
(1) 在馆内木质文物上分离的11株真菌,9株真菌对出土木质文物会带来直接的危害。其中枝孢瓶霉菌、木霉菌、福氏拟青霉、篮状菌、黄暗青霉和镰孢菌可使杨木表面发霉,聚壳座菌和节菱孢霉菌使杨木表面颜色发生显著变化,担子菌纯黄白鬼伞可使杨木发生近10%的质量损失率,对木质文物带来降解的风险。
(2) 枝顶孢霉菌和聚多曲霉菌虽然不能影响木材表面或降解木材,但这两种菌在碳源和氮源比较差的培养基上皆可大量产孢,分析认为这两种菌在实际生长中非常容易产孢,为馆内环境带来风险。
(3) 分离的11株真菌中木霉菌生长速度最快,每天生长近35 mm,其次是聚壳座菌、节菱孢霉菌、福氏拟青霉和镰孢菌,每天生长8 ~ 13 mm,较为缓慢的是纯黄白鬼伞、聚多曲霉菌、黄暗青霉、篮状菌、枝顶孢霉菌和枝孢瓶霉菌,每天生长低于5 mm。除聚多曲霉菌外,这些真菌在以甘油为碳源的G25N培养基中生长发育较差甚至受到完全抑制。
(4) 分离的木霉菌YN4-5通过竞争生长环境抑制其他真菌的生长,对能引起木材降解的纯黄白鬼伞的抑制效果最明显,达到64.6%。也许由于该木霉菌的存在反而保护了降解菌对木质水槽的进一步作用,使木质文物损害的风险降低,这也预示目前馆藏出土木质文物上的微生态相互作用已经达到一个平衡,在制定综合保护措施上这一点应得到关注。
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表 1 真菌种类及编号
Table 1 Fungus species and No.
编号 No. 真菌种类 Fungus species YN1-1 黄暗青霉 Penicillium citreonigrum YN1-2 福氏拟青霉 Paecilomyces formosus YN3-2 聚壳座菌 Eutypella sp. YN4-5 木霉菌 Trichoderma sp. YN5-31 节菱孢霉菌 Arthrinium sp. YN5-4 镰孢菌 Fusarium sp. YN2-2 枝顶孢霉菌 Acremonium sp. YN4-2 聚多曲霉 Aspergillus sydowii YN4-3 篮状菌 Talaromyces sp. YN5-6 枝孢瓶霉菌 Cladophialophora sp. YN6-3 纯黄白鬼伞 Leucocoprinus birnbaumii 表 2 11株真菌在PDA培养基上的生长速率
Table 2 Growth rate of 11 fungi on PDA medium
项目 Item 快速生长 Fast growing 中速生长 Medium speed growing 慢速生长 Slow growing YN4-5 YN3-2 YN5-31 YN1-2 YN5-4 YN6-3 YN4-2 YN1-1 YN4-3 YN2-2 YN5-6 生长速率 Growth rate/(mm·d−1 ) 34.54 12.53 11.54 8.49 8.00 4.55 3.77 3.32 2.72 2.08 1.87 表 3 11株真菌在不同培养基上的生长速率和产孢情况
Table 3 Growth rate and sporulation of 11 fungi on different media
编号
No.MEA CYA G25N CREA 生长速率
Growth rate/
(mm·d−1 )产孢情况
Sporulation生长速率
Growth rate/
(mm·d−1 )产孢情况
Sporulation生长速率
Growth rate/
(mm·d−1 )产孢情况
Sporulation生长速率
Growth rate/
(mm·d−1 )产孢情况
SporulationYN1-1 3.84 + + + 4.78 + 3.03 + + 3.20 + + + YN1-2 14.13 + + + 14.22 + + 5.36 + + + 11.32 + + + YN3-2 4.56 − − − 13.86 − − − 2.40 − − − 5.77 − − − YN4-5 29.96 + + + 25.12 + + + 0 − − − 30.28 + + + YN5-31 11.76 − − − 15.12 − − − 5.81 − − − 9.33 − − − YN5-4 10.02 + + + 11.73 + + + 2.34 + + + 12.24 + + YN2-2 2.33 + + + 1.73 + + + 0.66 + + + 2.34 + + YN4-2 3.24 + + + 3.66 + + + 4.09 + + + 2.92 + + + YN4-3 2.28 + + + 2.26 + + + 1.44 + + + 2.02 + + + YN5-6 2.13 − − − 1.92 − − − 0 − − − 1.60 + + YN6-3 3.71 − − − 1.09 − − − 0 − − − 0.85 − − − 注: + + + 表示视野中分生孢子相对较多; + + 表示视野中分生孢子相对一般; + 表示视野中分生孢子相对较少;− − − 表示视野中不可见分生孢子。Notes: + + + means there are relatively more conidia in the field of view; + + means the conidia in the field of view is relatively ordinary; + means there are relatively few conidia in the field of view; − − − means no conidia is visible in the field of view. 表 4 YN4-5对其他真菌的抑制作用
Table 4 Inhibitory effect of YN4-5 on other fungi
编号 No. 抑制率 Inhibition rate/% YN6-3 64.6 YN4-2 60.1 YN1-1 57.1 YN2-2 53.7 YN4-3 44.1 YN5-6 40.2 YN1-2 39.4 YN5-31 27.2 YN3-2 24.9 YN5-4 11.0 -
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