Optimization of tissue culture system and establishment of high-efficiency adventitious bud regeneration system from leaf explants of tetraploid Ziziphus jujuba var. spinosa
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摘要:目的 以四倍体酸枣组培苗为材料，优化其组织培养体系并构建适宜的四倍体酸枣叶片离体再生体系，为该种质的保存、推广以及利用奠定基础。方法 本研究以秋水仙素加倍获得的酸枣同源四倍体种质为材料，设计试验，利用组织培养技术探索了不同植物生长调节剂的种类、浓度对于四倍体酸枣的增殖、生根、不定芽再生的影响情况；并利用石蜡切片法对叶片不定芽再生过程进行了细胞学观察。结果 （1）当四倍体酸枣以带顶芽的茎段作为外植体时，最佳增殖培养基为：1/2MS + 6-BA 0.5 mg/L + IBA 0.2 mg/L + TDZ 0.5 mg/L + 蔗糖30.0 g/L + 琼脂5.9 g/L，适宜生根培养基为：1/2MS + IBA 0.8 mg/L + 蔗糖30.0 g/L + 琼脂5.9 g/L。生根苗经炼苗后移栽至大田，成活率可达93.33%。（2）诱导四倍体酸枣叶片离体再生不定芽的最佳培养基为WPM + TDZ 1.0 mg/L + IBA 0.3 mg/L + 蔗糖30.0 g/L + 琼脂5.9 g/L，在该培养基上叶片可通过直接再生途径再生出不定芽。（3）再生不定芽主要起源于叶脉维管束周围的薄壁细胞，在预培养8 ~ 12 d时，分生细胞的分裂能力最强且未出现分化现象。结论 本研究优化了四倍体酸枣组培体系，并成功建立了四倍体酸枣叶片离体再生体系，同时对叶片不定芽的再生过程进行组织学研究，为酸枣多倍体培养体系完善以及后续多倍体种质的利用奠定了基础。Abstract:Objective A protocol for tissue culture system was optimized and an in vitro regeneration system suitable for tetraploid Ziziphus jujuba var. spinosa was constructed using same source as the starting material, so as to lay the foundation for the preservation, promotion and utilization of excellent germplasm.Method This study used Z. jujuba var. spinosa germplasm obtained by doubling colchicine as materials, designed experiments and explored the effects of different types and concentrations of plant growth regulators on the proliferation, rooting and adventitious bud regeneration of tetraploid Z. jujuba var. spinosa using tissue culture technology. Additionally, we explored the cytological observation of the process of leaf adventitious shoot regeneration using paraffin sectioning.Result (1) Tetraploid Z. jujuba var. spinosa was grown on stem segments with terminal buds as the explants. The best multiplication medium for tissue culture seedlings of tetraploid germplasm was: 1/2MS + 6-BA 0.5 mg/L + IBA 0.2 mg/L + TDZ 0.5 mg/L + sucrose 30.0 g/L + agar 5.9 g/L, the best rooting medium was 1/2MS + IBA 0.8 mg/L + sucrose 30.0 g/L + agar 5.9 g/L. The rooted seedlings were transplanted to the field after refining, and the survival rate could reach 93.33%. (2) The optimal medium for inducing the in vitro regeneration of adventitious shoots from tetraploid leaves was WPM + TDZ 1.0 mg/L + IBA 0.3 mg/L + sucrose 30.0 g/L + agar 5.9 g/L, in which the leaves could regenerate adventitious shoots by the direct regeneration pathway. (3) The cytological study of the regeneration process of autotetraploid jujube leaves in vitro showed that the regeneration of adventitious shoots originated mainly from thin-walled cells around the vascular bundles of leaf veins, and the meristematic cells were most divisive and undifferentiated at 8−12 d of preculture.Conclusion This study successfully established and optimized the system of tissue culture and in vitro regeneration of tetraploid sour jujube germplasm, and also conducted histological studies on the regeneration process of leaves adventitious bud regeneration, which lays the foundation for the perfection of jujube polyploid system and the subsequent utilization of its polyploid germplasm.
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枣树（Ziziphus jujuba）为鼠李科（Rhamnaceae）枣属（Ziziphus）植物，原产中国，是世界上最古老的栽培果树之一，广泛分布于我国干旱和半干旱的边缘地区[1]，栽培品种多达900余个。酸枣（Ziziphus jujuba var. spinosa）因其具有抗干旱、耐瘠薄特性，是绿化荒山的先锋树种[2]。枣树栽培中，酸枣由于根系发达、抗性好，常用作枣树砧木[3]。同时，酸枣果实含有丰富的五环三萜类物质[4]，种仁中黄酮类成分是其具有生物活性的主要物质成分[5]，极具营养和药用价值。倍性育种是林木、果树重要的育种方法[6]，多倍体植物通常表现为生长健壮、抗性增强、果实增大，生育期延长、维生素氨基酸等营养物质增加等[7-8]。本课题组前期研究中利用枣树秋水仙素离体加倍的技术体系成功获得了酸枣同源四倍体，初步观测发现与二倍体相比，四倍体的叶片变大变厚、颜色变深，生长速度更快[9]。但进一步培养过程中发现，原有的酸枣组培体系并不适用于其同源四倍体，且该四倍体酸枣组培过程中存在生根困难和移栽成活低的情况，严重影响其后续利用，需要通过试验研究进行优化。同时，采用离体再生途径诱导不定芽发育成完整植株的方式是林木优良品种保存和扩繁的重要手段[10-12]。研究发现，植株的再生效率受到多因素的影响，包括外植体类型、基本培养基种类、植物生长调节物质的种类和浓度、培养条件等[13]。枣树相关研究中，常以叶片为外植体直接诱导再生不定芽。灰枣（Ziziphus jujuba ‘Huizao’）叶片不定芽再生体系研究发现，最适合的外植体应选用中部平展、嫩绿、较厚的叶片，以叶片近轴端接触培养基的方式接种叶片，再生率高达82.25%[14]。近年来，已有多个枣品种建立了稳定、高效的不定芽再生体系，如冬枣（Ziziphus jujuba ‘Dongzao’）[15-16]、灰枣[17]等。枣树通常使用的基本培养基包括WPM、MS和1/2MS[18]。孙清荣等[19]研究不同基本培养基对茎段再生的影响发现，WPM培养基上的愈伤组织诱导率更高，最高可达100%。郭烨等[20]以茶壶枣（Ziziphus jujuba ‘Chahuzao’）无菌叶片为材料，将叶片接种至WPM 中培养，平均不定芽再生个数高达（5.7 ± 0.3）个。魏薇[21]以MS为基础培养基对月光枣（Ziziphus jujuba ‘Yueguangzao’）、冬枣和木枣（Ziziphus jujuba ‘Muzao’）离体叶片不定芽进行诱导，3个品种出芽率分别为93.30%、96.88%和66.63%。此外，王国平等[22]研究表明，基本培养基选用1/2MS可促进骏枣（Ziziphus jujuba ‘Junzao’）不定芽、不定根的再生。
植物生长调节物质是诱导不定芽再生和调控再生芽的生长发育的关键，研究认为较低的生长素和细胞分裂素配比有利于不定芽的形成[23-24]。孙清荣等[25]建立酸枣叶片再生体系时，在TDZ质量浓度2.0 mg/L和IAA0.5 mg/L的组合下再生率最高，为47.6%。在建立冬枣叶片再生体系时，最佳的诱导培养基为BA 1.0 mg/L + IBA 0.5 mg/L，不定芽诱导率高达97.3%。王妍[26]在建立泰山酸枣叶片再生体系时，最佳的诱导培养基TDZ高达1.0 mg/L，IAA质量浓度为0.5 mg/L，诱导培养基中长出不定芽后，将其转移至不定芽伸长培养基IAA 0.1 mg/L + GA 0.5 mg/L中，成功建立起高效的再生体系并获得完整植株。此外，影响枣树叶片离体再生效率的因素还包括温度、光照、暗培养时间等[27]，枣树叶片诱导的最适温度为23 ~ 27 ℃，光照强度为2 000 ~ 3 000 lx，每天的光照时长为10 ~ 12 h，其中温度过高或者过低都不利于组培苗的生长，会使组培苗出现玻璃化现象[28]。不定芽再生过程中预先对叶片进行3 ~ 4周的暗培养能大大提高不定芽的再生率[29]。
本研究以人工诱导染色体加倍获得的四倍体酸枣组培苗为材料，通过探究不同植物生长调节剂6-BA、IBA、TDZ质量浓度及配比对组培苗的影响，分别筛选了最佳的增殖、生根和不定芽再生培养基，优化其组培体系，探索四倍体酸枣离体叶片再生体系。在此基础上，通过切片技术探究不定芽再生过程中的组织学机制，为该四倍体种质的保存、利用和进一步深入研究奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
本试验以北京林业大学林木育种与生态修复国家工程研究中心保存的四倍体酸枣组培苗为研究材料，组培苗已连续继代20代以上。选择长势良好的幼嫩芽，置于继代培养基（MS + 6-BA 1.0 mg/L + IBA 0.4 mg/L + 蔗糖30.0 g/L + 琼脂5.9 g/L）中培养，30 d后选取长势粗壮、叶片嫩绿、生长状况一致的组培苗为植物材料进行试验。培养基pH值为5.8，培养温度保持在（25 ± 2） ℃，空气相对湿度为40% ~ 60%，光照周期设置为14 h光/10 h暗。
1.2 试验方法
1.2.1 增殖培养基的优化
将继代培养基上的组培苗截取上部1 cm左右转移至增殖培养基上，增殖培养基以MS为基本培养基，添加不同质量浓度的6-BA、IBA和TDZ，采用L9（34）正交试验设计，共9个处理（表1）。每个处理接种10个外植体，重复3次。培养30 d后观察组培苗的生长情况并统计增殖系数。
表 1 增殖培养正交试验方案L9（34）Table 1. Orthogonal experimental protocol for proliferation culture L9 (34)处理号
Treatment No.IBA/
（mg·L−1）6-BA/
（mg·L−1）TDZ/
（mg·L−1）空列
Blank column1 0 0 0.25 1 2 0 0.5 0.50 2 3 0 1.0 1.00 3 4 0.2 0 0.50 3 5 0.2 0.5 1.00 1 6 0.2 1.0 0.25 2 7 0.4 0 1.00 2 8 0.4 0.5 0.25 3 9 0.4 1.0 0.50 1 1.2.2 适宜生根培养基的筛选
以二倍体酸枣的生根培养基（1/2MS + IBA 0.4 mg/L）为基础对IBA的含量进行调整，设置单因素完全随机区组试验，IBA的质量浓度设置7个水平（表2）。将生长健壮的四倍体酸枣组培苗接种至生根培养基中，每个处理接种10瓶，每瓶4株外植体，重复3次。接种40 d后统计生根率、根数、根长、生根情况等。
表 2 不同IBA水平对四倍体生根培养的处理Table 2. Treatment of different IBA levels on the rooting culture of tetraploids处理号
Treatment No.IBA/（mg·L−1） 1 0.4 2 0.5 3 0.6 4 0.7 5 0.8 6 0.9 7 1.0 1.2.3 炼苗与移栽
将生长健壮的四倍体生根组培苗分阶段炼苗，前1周随时间缓缓松开瓶盖，闭瓶培养，第8 ~ 10天开瓶炼苗。炼苗后，用自来水将根部冲洗干净，移栽至蛭石与营养土（3∶1）的基质中，放入人工气候室培养35 d，温度为（25 ± 2） ℃，空气相对湿度保持在50% ~ 60%，共处理30株。培养结束后将盆栽苗移栽至大田中，分别统计移栽了30、60 d植株的平均苗高生长量，并于移栽60 d时计算成活率。
1.2.4 叶片不定芽再生培养基的筛选
在WPM培养基上添加不同浓度的TDA和IBA，采用两因素三水平完全随机区组试验，共9个处理（表3）。每处理10个外植体，重复3次。选取长势良好的四倍体酸枣组培苗为材料，剪取形态学自上而下的第3 ~ 5枚叶片，沿叶片中脉垂直方向过中脉左右各横切1刀，之后以叶片近轴端接触培养基的方式接种。暗培养21 d后，转移光下正常培养14 d，观察生长情况，统计叶片再生率和叶片平均再生芽数。
表 3 不定芽再生培养基试验处理设计Table 3. Design of experimental treatment for adventitious bud regeneration culture medium处理号
Treatment No.TDZ/（mg·L−1） IBA/（mg·L−1） 1 0.5 0.2 2 0.5 0.3 3 0.5 0.4 4 1.0 0.2 5 1.0 0.3 6 1.0 0.4 7 1.5 0.2 8 1.5 0.3 9 1.5 0.4 1.2.5 叶片离体再生形态学和解剖学观察
沿叶片中脉的垂直方向横切2个伤口，切断主脉但不切断叶片，将切好的叶片以近轴端接触培养基的方式接种于1.2.4中筛选出的最适培养基中，接种后，暗培养21 d后转至光下继续进行培养，期间分别在第0、7、14、21、35、56天拍照观察叶片的生长状况和形态学变化。自叶片培养第7天起，每天取样，直至第14天为止，将每日取样的叶片置于FAA固定液（38%甲醛∶冰醋酸∶30%乙醇 = 1∶1∶8）中固定36 h以上，通过石蜡切片技术观察不定芽再生的细胞学过程，并在BX51型光学显微镜下拍照记录。
1.3 数据分析
采用Excel 2013录入和整理数据，并用SPSS 20.0软件进行数据统计分析，邓肯新复极差法进行数据的多重比较，确定数据间是否存在显著差异。文中涉及百分比数据需反正弦转换后再进行数据分析。试验涉及到的公式如下：外植体存活率 = 存活株数/处理株数 × 100%；增殖系数 = 每瓶可形成的带单芽茎段总数/每瓶接种的茎段数 × 100%；叶片再生率 = 再生不定芽叶片数/接种叶片数 × 100%；叶片平均再生芽数 = 叶片再生不定芽总数/萌发不定芽叶片数；生根率 = 生根株数/处理株数 × 100%；平均生根数 = 植株生根总数/生根植株数；平均根长 = 总根长度/总生根数量。
2. 结果与分析
2.1 不同生长调节物质种类和质量浓度对四倍体酸枣组培苗增殖影响
以MS为基本培养基，添加不同植物生长调节物质对四倍体酸枣的增殖效果有显著影响（表4），将带顶芽的四倍体酸枣组培苗置于增殖培养基中连续培养30 d，获取继代丛芽。在试验处理的9个处理中，处理1，即在只添加TDZ的情况下组培苗的增殖效果最差，并表现出再生苗细弱、生长缓慢的情况；在3种生长调节剂质量浓度均较高的处理9中，组培苗增殖分化系数也较低；总体看来，处理5，即添加IBA 0.2 mg/L、6-BA 0.5 mg/L和TDZ 0.5 mg/L的培养基上，四倍体组培苗的增殖系数最高，达到（6.41 ± 0.38），分生苗叶片深绿、生长健壮、发育速度快。
表 4 生长调节剂对四倍体组培苗增殖培养的影响Table 4. Effects of growth regulators on the proliferation culture of tetraploid tissue culture seedlings处理号
Treatment No.IBA/（mg·L−1） 6-BA/（mg·L−1） TDZ/（mg·L−1） 增殖系数
Multiplication factor生长情况
Growth condition1 0 0 0.25 1.91 ± 0.28e 叶绿、生长缓慢、增殖苗细弱
Green leaves, slow growth, and weak proliferating seedlings2 0 0.5 0.50 3.58 ± 0.38cd 叶绿、生长较慢、增殖苗细弱
Green leaves, slower growth, and weak proliferating seedlings3 0 1.0 1.00 4.66 ± 0.29b 叶深绿、生长较快、增殖苗健壮
Dark green leaves, faster growth, robust proliferating seedlings4 0.2 0 0.50 2.83 ± 0.14de 叶绿、生长较慢、增殖苗细弱
Green leaves, slower growth, weak proliferating seedlings5 0.2 0.5 1.00 6.41 ± 0.38a 叶深绿、生长较快、增殖苗健壮
Dark green leaves, faster growth, robust proliferating seedlings6 0.2 1.0 0.25 3.83 ± 0.38c 叶深绿、生长较快、增殖苗健壮
Dark green leaves, faster growth, robust proliferating seedlings7 0.4 0 1.00 3.66 ± 0.14cd 叶绿、生长较慢、增殖苗细弱
Green leaves, slower growth, weak proliferating seedlings8 0.4 0.5 0.25 3.25 ± 0.25de 叶嫩绿、生长较慢、增殖苗细弱
Tender green leaves, slower growth, weak proliferating seedlings9 0.4 1.0 0.50 2.08 ± 0.28e 叶绿、生长缓慢、增殖苗细弱
Green leaves, slower growth, weak proliferating seedlings注：不同字母表示处理间存在显著差异（P < 0.05）。下同。Notes: different letters indicate significant differences between treatments (P < 0.05). The same below. 对各处理的增殖系数进行极差分析，结果如图1所示。随着6-BA、IBA和TDZ质量浓度的升高，酸枣外植体增殖系数逐渐变大，在试验的3个水平范围内，过高或者过低质量浓度都不利于外植体分化；3种植物生长调节剂质量浓度为第2水平时，最适合四倍体增殖生长。
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图 1 植物生长调节剂浓度对四倍体增殖培养影响的极差分析各水平下的数字1、2、3分别对应不同激素质量浓度在试验中的水平值。其中，IBA 1、2、3水平的质量浓度分别为0、0.2、0.4 mg/L；6-BA 1、2、3水平的质量浓度分别为0、0.5、1.0 mg/L；TDZ 1、2、3水平的质量浓度分别为0.25、0.50、1.00 mg/L。The numbers 1, 2 and 3 under each level correspond to the level values of different hormone concentrations in the experiment. The concentrations of IBA 1, 2 and 3 levels are 0, 0.2 and 0.4 mg/L, respectively. The concentrations of 6-BA 1, 2 and 3 levels are 0, 0.5 and 1.0 mg/L, respectively. The concentrations of TDZ 1, 2 and 3 levels are 0.25, 0.50 and 1.00 mg/L, respectively.Figure 1. Extreme difference analysis of the effects of plant growth regulator concentration on tetraploid proliferation culture对增殖系数进行方差分析，结果如表5所示，不同浓度的6-BA、TDZ、IBA对四倍体酸枣组培苗的增殖具有极显著的影响（P < 0.01）。进一步多重比较结果表明，处理5的增殖系数最高，显著高于其他处理组合（表4）。因此，四倍体酸枣最佳增殖培养的培养基为：MS + IBA 0.2 mg/L + 6-BA 0.5 mg/L + TDZ 0.5 mg/L。
表 5 生长调节剂对四倍体增殖系数影响的方差分析Table 5. ANOVA of the effects of growth regulators on the multiplication factor of tetraploids变异来源
Source of variationdf SS MS F 区组 Block group 2 0.992 0.496 TDZ 2 24.124 12.062 133.615** 6-BA 2 11.722 5.861 64.923** IBA 2 8.848 4.424 49.000** 随机误差 Random error 18 1.620 0.090 总计 Total 26 47.306 注：*表示达到0.05水平差异；**表示达到0.01水平差异。下同。Notes: * indicates reaching 0.05 level difference; ** indicates reaching 0.01 level difference. The same below. 2.2 不同IBA质量浓度对生根培养的影响
试验结果表明：添加不同质量浓度的IBA对四倍体酸枣组培苗生根有不同程度的影响，发育出的根的生长状况也有明显差异（表6）。随着IBA质量浓度的增加，生根率呈上升趋势，添加0.7 mg/L IBA和0.8 mg/L IBA处理，生根率均在80%以上，且形成根系较为粗壮，可分化出许多主根和须根；而当浓度在0.8 mg/L以上时，生根率反而下降，且生出的根粗短。进一步对平均根数、平均根长、生根率这3项指标进行方差分析和多重比较。处理5的生根率（90.62%）、平均根数（5.80）和平均根长（2.72 cm）相对于其他处理都是最优的。综合3项指标多重比较的结果，筛选出四倍体酸枣生根最佳培养基为：1/2MS + IBA 0.8 mg/L + 蔗糖20.0 g/L + 琼脂5.9 g/L。
表 6 培养基对四倍体酸枣生根培养的影响Table 6. Effects of medium on the rooting culture of tetraploids处理号
Treatment No.IBA/（mg·L−1） 平均根数
Number of average root平均根长
Average root length/cm生根率
Rooting rate/%生根情况
Rooting condition1 0.4 1.50 ± 0.08f 1.52 ± 0.08cd 48.96 ± 4.96c 根细弱，无侧根
Thin weak roots, no lateral roots2 0.5 2.51 ± 0.09d 2.18 ± 0.12b 63.62 ± 2.82b 根细弱，少侧根
Thin weak roots, few lateral roots3 0.6 3.34 ± 0.12c 2.15 ± 0.08b 65.04 ± 1.42b 根粗短，少量须根
Stubby short roots, few fibrous roots4 0.7 5.30 ± 0.21b 2.28 ± 0.11b 80.87 ± 1.93a 根较粗壮，侧根数较少
Sturdier roots, fewer lateral roots5 0.8 5.80 ± 0.05a 2.72 ± 0.06a 90.62 ± 1.39a 根较粗壮，侧根数较少
Sturdier roots, fewer lateral roots6 0.9 3.18 ± 0.17c 1.80 ± 0.07c 42.60 ± 2.17cd 根粗短，少量须根
Stubby short roots, few fibrous roots7 1.0 2.05 ± 0.04e 1.39 ± 0.11d 35.75 ± 4.47d 根粗短，少量须根
Stubby short roots, few fibrous roots选择芽高不足1 cm的初始芽接入诱导培养基继续诱导培养，高度为1 cm以上的初始芽接入至继代培养基进行培养（图2c）；将继代苗基部修剪后接种到生根培养基中，培养45 d后可以明显观察到苗基部生长分化出粗细不一致的根（图2d）；选择生长健壮、根系发育较好的生根苗炼苗45 d后转移至大田（图2e）；组培苗移栽至大田后经过缓苗后能够迅速恢复生长，第30、60天时平均苗高生长量分别为（3.51 ± 0.21） cm和（8.47 ± 0.27） cm（图3）。移栽至第45天时，植株生长良好，叶深绿（图2f），移栽大田60 d后的成活率可达93.33%。
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图 2 四倍体组培体系的优化a ~ b. 四倍体酸枣的增殖培养；c. 继代培养；d. 生根培养；e. 炼苗移栽；f. 大田生长45 d后。a−b, proliferation culture of tetraploid Z. jujuba var. spinosa; c, subculture; d, rooting culture; e, acclimatization and transplant; f, after 45 d of field growth.Figure 2. Optimization of tetraploid tissue culture system![]()
图 3 不同移栽天数对组培苗生长情况的影响Figure 3. Effects of different transplanting days on the growth of tissue culture seedlings2.3 四倍体酸枣不定芽再生培养基的筛选
筛选四倍体叶片不定芽再生培养基的结果如表7所示。在2种生长调节剂添加低浓度的处理1中，不定芽诱导率和再生数最低；在TDZ质量浓度为1 mg/L的几个处理中，平均再生不定芽数均在3个以上，且不定芽诱导率没有显著差异，在处理5中，叶片不定芽诱导率最高，达95.45%，并且在该培养基上平均每片叶的不定芽再生数最高，达到4.37个。
表 7 生长调节剂对四倍体叶片不定芽再生的影响Table 7. Effects of growth regulators on regeneration of adventitious shoots from leaves of tetraploid处理号
Treatment No.TDZ/（mg·L−1） IBA/（mg·L−1） 不定芽诱导率
Induction rate of adventitious bud /%再生不定芽数
Number of regenerated adventitious bud1 0.5 0.2 70.28 ± 1.96e 1.02 ± 0.17e 2 0.5 0.3 83.63 ± 0.86d 1.75 ± 0.10de 3 0.5 0.4 86.76 ± 1.84bcd 2.11 ± 0.16d 4 1.0 0.2 91.41 ± 1.05ab 3.61 ± 0.08ab 5 1.0 0.3 95.45 ± 2.05a 4.37 ± 0.16a 6 1.0 0.4 93.44 ± 0.89a 3.15 ± 0.12bc 7 1.5 0.2 91.15 ± 0.84ab 2.59 ± 0.24cd 8 1.5 0.3 88.62 ± 0.62bc 2.34 ± 0.31cd 9 1.5 0.4 84.32 ± 1.32cd 1.88 ± 0.24d 对叶片不定芽再生数据进行方差分析（表8）。F检验数据显示，IBA和TDZ以及两者之间的交互作用均对四倍体的不定芽诱导率、不定芽再生数有极显著的影响（P < 0.01）。结合表6的多重比较结果发现，在添加TDZ 1.0 mg/L和IBA 0.3 mg/L的培养基上，叶片不定芽诱导率和每片叶不定芽再生数显著高于其他处理。综合筛选出四倍体酸枣叶片再生培养基为：WPM + TDZ 1.0 mg/L + IBA 0.3 mg/L + 蔗糖30.0 g/L + 琼脂5.9 g/L。
表 8 生长调节剂对四倍体叶片不定芽再生影响的方差分析Table 8. ANOVA on the effects of growth regulators on the regeneration of adventitious shoots in tetraploid leaves变异来源
Source of variationdf 不定芽诱导率
Induction rate of adventitious bud每片叶不定芽再生数
Number of adventitious bud regeneration per leafMS F MS F 区组 Block group 2 2.985 0.044 IBA 2 40.788 10.496** 0.561 9.605** TDZ 2 264.652 68.106** 6.914 118.435** IBA × TDZ 4 72.169 18.572** 0.514 8.806** 随机误差 Random error 16 3.886 0.058 总计 Total 26 2.4 叶片离体再生不定芽的形态学以及解剖学观察
四倍体酸枣种质离体叶片不定芽再生过程的形态学观察如图4所示，暗培养之前叶片呈现翠绿色，叶面整齐且光滑（图4a）；将叶片置于最佳的诱导培养基7 d后，由于受暗培养环境的影响，从外部形态观察到叶片开始失绿变黄，叶肉切口处开始部分扭曲，膨大增厚，叶柄处出现明显的白色凸起（图4b）；暗培养至第14天，叶片主脉近切口处出现小凸起，（图4c）；暗培养至第21天后将叶片放置于光下培养，叶片局部变黄，切口处出现少量褐化，肉眼可见叶片背部切口处边缘长出白色膨大的颗粒状组织，并观察到芽的形态发生（图4d）；培养至第35天，白色颗粒逐渐变为绿色，并在顶部直接分化出小芽（图4e）；培养至第56天，整个叶片褐化干枯，但不定芽旺盛，最高可达1.5 cm（图4f）。在离体叶片直接再生不定芽的整个过程中，并无明显愈伤组织产生。
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图 4 四倍体叶片不定芽再生过程表型观察a. 叶片培养0 d；b. 叶片培养7 d；c. 叶片培养14 d；d. 叶片培养21 d；e. 叶片培养35 d；f. 叶片培养56 d。标尺为 1 cm。a, leaf culture 0 d; b, leaf culture after 7 d; c, leaf culture after 14 d; d, leaf culture after 21 d; e, leaf culture after 35 d; f, leaf culture after 56 d. Scale bar is 1 cm.Figure 4. Phenotypic observations on the regeneration process of adventitious shoots of tetraploid leaves四倍体酸枣种质叶片不定芽再生过程的解剖结构变化如图5所示，当叶片在不定芽再生培养基中暗培养至7 d时，表皮细胞和薄壁细胞明显变大，近上表皮的叶肉细胞排列紧密，下表皮细胞排列疏松，尚未进行细胞分裂（图5a）；暗培养至8 d时，上表皮栅栏组织细胞和薄壁细胞明显大于下表皮海绵组织细胞，近上表皮的叶肉细胞排列更为紧密，离体叶片栅栏组织的叶肉细胞呈松散排列并开始出现分化（图5b）；诱导培养9 d时，切口附近处的薄壁细胞继续进行旺盛分裂，上表皮细胞层数增加，细胞排列更加紧密，细胞分化面积明显扩张，下表皮海绵组织细胞排列变疏松（图5c）；诱导培养10 d时，切口处附近的细胞有一定的伸长趋势，而切口处较远的薄壁细胞的状态仍然呈细胞质稀疏的状态（图5d）；暗培养至11 d时，细胞体积变小，结构更为紧密，维管束周围的薄壁细胞持续发生分裂，此时与维管束距离较远的薄壁细胞也出现不同程度的细胞分裂（图5e）；暗培养至12 d时，分生组织细胞加速分裂，分生组织细胞与周围细胞存在明显差异，主要表现为具有明显细胞核、细胞较小且排列更为紧密（图5f）；暗培养至13 ~ 14 d时，薄壁细胞继续向多个方向不规则分裂，致使分化细胞体积压缩，在外层形成表面分化形成极点结构。叶片表皮细胞和叶肉细胞由于不具有分裂能力，逐渐破损脱落（图5g，h）。
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图 5 四倍体叶片不定芽再生过程解剖学观察a ~ h分别为叶片培养7 ~ 14 d；ue. 上表皮细胞；le. 下表皮细胞；pa. 栅栏组织；sp. 海绵组织；vb. 维管束；ps. 极点结构。其中a、b、c、f、h标尺为100 μm，d、e、g标尺为50 μm。a−h, leaf culture for 7−14 d; ue, supra-epidermis; le, lower-epidermis; pa, palisade tissue; sp, spongy tissue; vb, vascular bundle; ps, pole structure. a, b, c, f, h scale is 100 μm; d, e, g scale is 50 μm.Figure 5. Anatomical observation of the regeneration process of adventitious buds of tetraploid leaves3. 结论与讨论
3.1 植物生长调节剂的种类及浓度对四倍体酸枣增殖、生根培养的影响
植物生长调节剂可以有效调控细胞生长、组织和器官的分化、形态建成和植株生长发育。在枣树的组织培养研究中，常用的植物生长调节剂中，生长素有IBA、IAA、NAA、2,4-D，质量浓度范围在0.1 ~ 0.5 mg/L之间；细胞分裂素多选用6-BA、TDZ和KT，质量浓度一般在1.0 ~ 2.0 mg/L之间[30]。同种植物在不同途径的诱导中所采用的植物生长调节剂的种类及浓度均有所不同。通过试验发现，枣树的增殖培养一般选用MS培养基作为基本培养基，而1/2MS比MS更适合冬枣不定芽的诱导以及花药的愈伤诱导[31]。除MS和1/2MS培养基外，罗晓芳等[32]发现WPM培养基更适合金丝小枣的增殖培养。同时，适宜的细胞分裂素和生长素的配比能够促进外植体的正常生长发育，研究发现枣树茎段增殖培养采用低细胞分裂素和生长素配比，一旦比例过高会导致植株叶片卷曲，长势细长，死亡率高；比值过低则会减缓生长速度[33]。Liu[34]发现，当马牙枣（Ziziphus jujuba ‘Maya’）及其三倍体种质的最佳培养基生长激素质量浓度组合为6-BA 1.5 mg/L + IBA 0.2 mg/L，即细胞分裂素/生长素的比值为7.5时，腋芽萌发率高达87.67%和82.22%。在枣树增殖生长中采用的植物生长调节剂种类和浓度差异明显，骏枣的最佳增殖培养基为MS + BA 3.0 mg/L + IBA 0.2 mg/L，影响的因素从主到次为：基本培养基 > BA > IBA[35]。Kadota等[36]研究发现，在培养基中添加适量质量浓度的IBA、TDZ有利于促进不定芽的再生。本研究所得的四倍体酸枣最佳增殖培养培养基为：MS + IBA 0.2 mg/L + 6-BA 0.5 mg/L + TDZ 0.5 mg/L，是在继代培养基的基础上添加不同质量浓度TDZ，结果可知，增殖培养基中生长素和细胞分裂素的配比相较于启动培养中的配比更低。而在此基础上添加适量TDZ的情况下，增殖效果最佳且分生苗生长旺盛。
IBA作为生根诱导常用植物生长调节剂能显著提高生根效果，但不同品种所采用的诱导浓度不尽相同。当IBA质量浓度为0.4 mg/L时，二倍体酸枣不定芽生根诱导效果最佳[37]。金琪[38]使用相同培养基对茶壶枣生根培养，不仅生根率达100%，而且根愈伤组织量很少。然而，可能是由于多倍化使植株本身的生根机理发生改变的原因，该培养基不适用于同源四倍体酸枣的生根培养。内源激素水平受到不同的外源激素的调节，对不定根形成及根系的形成和发育产生间接影响，研究发现，当IAA的含量积累到一定程度之后，诱导根原基分化形成根[39]。对四倍体酸枣的激素水平研究发现：生根过程中四倍体比二倍体IAA的含量下降快，对IAA的需求量比二倍体大，而外源IBA对内源IAA的合成有促进作用，因而生根培养基中添加更多的IBA，有利于促进植株合成IAA，从而保证根的正常生长[40]。
因此，通过提高IBA质量浓度，能够有效提高四倍体酸枣的生根率，显著促进不定根的形态建成（根条数、根长），本试验中筛选出的四倍体酸枣的最适生根培养基IBA质量浓度为其同源二倍体的2倍。
3.2 四倍体酸枣不定芽再生体系的主要影响因素
构建离体叶片不定芽再生体系中，基本培养基种类、植物生长调节剂的种类、浓度和配比都是主要的影响因素。培养基包含着植物组织培养的物质基础，不同枣树品种、不同类型外植体在不同发育阶段对培养基的需求不同，因此必须根据不同材料选择合适的培养基。诱导茎段不定芽再生通常以MS为基本培养基，以马牙枣 [34]、鲁枣一号（Ziziphus jujuba ‘Lu zao 1’）[41]带腋芽幼嫩茎段为外植体直接接种MS培养基中时，不定芽再生率高。而离体叶片不定芽再生以WPM为基本培养基时诱导效率高[16]，例如灰枣[42]、蜂蜜罐枣（Ziziphus jujuba ‘Fengmiguan zao’）[43]等。
在诱导枣树离体再生的培养基中，一般添加较高配比的分裂素和生长素能更有效促进植物发生分化。罗在柒[44]在狗头枣叶片再生体系的建立过程中发现，TDZ 1.0 mg/L + IBA 0.2 mg/L时，诱导率接近94%。酸枣叶片的最佳诱导培养基为WPM + TDZ 1.0 mg/L + IAA 0.5 mg/L，不定芽诱导率可达61%[45]。在本研究中，四倍体酸枣叶片诱导不定芽的最适合培养基和条件为WPM + TDZ 1.0 mg/L + IBA 0.3 mg/L，暗培养3周后移至光下培养，诱导率高达95.45%。因此，在枣树不同种质再生体系建立过程中，探究适宜的生长素和细胞分裂素的质量浓度及配比是提高不定芽诱导率的关键。
3.3 四倍体酸枣离体再生的组织学观察
目前枣树的不定芽诱导途径主要以直接产生分生组织形成器官原基，从而发育成完整植株的途径进行，该方法具有效率高、遗传稳定等优点[24]。Yalcin-Mendi等[46]通过组织学的方式对离体培养的子叶进行观察发现，其表皮和皮层细胞逐渐恢复分裂形成分生组织，后不经过愈伤分化直接产生芽原基和叶原基，最终发育成不定芽。马春华[47]研究发现，灰枣叶片在接种第3天，靠近维管束的少量细胞已开始分裂，培养第14天时，细胞团分化形成芽原基，培养20 d后发育成为具有完整结构的不定芽点。在本研究中，四倍体叶片培养8 ~ 10 d，切口处周围已经开始初步分化，当分生细胞达到一定规模后逐渐向薄壁细胞方向延伸；到11 ~ 12 d时，一部分已经有开始分化形成分生组织的趋势，且尚未分化形成芽原基；到13 ~ 14 d时，分生细胞表现很强的脱分化能力，不断分裂的分生组织细胞团突破外植体。整个过程发生部位多位于距离维管束较近的表皮细胞处，原因可能是维管束是外源物质的主要运输通道，其外部细胞更容易吸收外源物质而促使该部位细胞分化。不定芽的诱导再生来源于主脉附近部位的薄壁细胞分裂形成的分生组织，再生方式与Ma等[48]的研究结果相同。
4. 结 论
本研究以四倍体酸枣组培苗为材料，通过研究不同质量浓度的6-BA、IBA和TDZ对四倍体酸枣组织培养的影响，筛选出最佳增殖培养基为：MS + IBA 0.2 mg/L + 6-BA 0.5 mg/L + TDZ 0.5 mg/L + 蔗糖30.0 g/L + 琼脂5.9 g/L；适宜生根培养基为：1/2MS + IBA 0.8 mg/L + 蔗糖30.0 g/L + 琼脂5.9 g/L，并结合方差分析和多重比较综合筛选出适宜四倍体酸枣叶片不定芽再生的培养基为WPM + TDZ 1.0 mg/L + IBA 0.3 mg/L + 蔗糖30.0 g/L + 琼脂5.9 g/L。通过对叶片不定芽再生过程进行组织学研究，发现该过程属于直接再生途径获得不定芽，再生不定芽主要来自于叶脉维管束周围的薄壁细胞。本研究为该种质的高效再生以及进一步利用提供科学依据。
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图 1 植物生长调节剂浓度对四倍体增殖培养影响的极差分析
各水平下的数字1、2、3分别对应不同激素质量浓度在试验中的水平值。其中，IBA 1、2、3水平的质量浓度分别为0、0.2、0.4 mg/L；6-BA 1、2、3水平的质量浓度分别为0、0.5、1.0 mg/L；TDZ 1、2、3水平的质量浓度分别为0.25、0.50、1.00 mg/L。The numbers 1, 2 and 3 under each level correspond to the level values of different hormone concentrations in the experiment. The concentrations of IBA 1, 2 and 3 levels are 0, 0.2 and 0.4 mg/L, respectively. The concentrations of 6-BA 1, 2 and 3 levels are 0, 0.5 and 1.0 mg/L, respectively. The concentrations of TDZ 1, 2 and 3 levels are 0.25, 0.50 and 1.00 mg/L, respectively.
Figure 1. Extreme difference analysis of the effects of plant growth regulator concentration on tetraploid proliferation culture
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图 2 四倍体组培体系的优化
a ~ b. 四倍体酸枣的增殖培养；c. 继代培养；d. 生根培养；e. 炼苗移栽；f. 大田生长45 d后。a−b, proliferation culture of tetraploid Z. jujuba var. spinosa; c, subculture; d, rooting culture; e, acclimatization and transplant; f, after 45 d of field growth.
Figure 2. Optimization of tetraploid tissue culture system
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图 3 不同移栽天数对组培苗生长情况的影响
Figure 3. Effects of different transplanting days on the growth of tissue culture seedlings
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图 4 四倍体叶片不定芽再生过程表型观察
a. 叶片培养0 d；b. 叶片培养7 d；c. 叶片培养14 d；d. 叶片培养21 d；e. 叶片培养35 d；f. 叶片培养56 d。标尺为 1 cm。a, leaf culture 0 d; b, leaf culture after 7 d; c, leaf culture after 14 d; d, leaf culture after 21 d; e, leaf culture after 35 d; f, leaf culture after 56 d. Scale bar is 1 cm.
Figure 4. Phenotypic observations on the regeneration process of adventitious shoots of tetraploid leaves
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图 5 四倍体叶片不定芽再生过程解剖学观察
a ~ h分别为叶片培养7 ~ 14 d；ue. 上表皮细胞；le. 下表皮细胞；pa. 栅栏组织；sp. 海绵组织；vb. 维管束；ps. 极点结构。其中a、b、c、f、h标尺为100 μm，d、e、g标尺为50 μm。a−h, leaf culture for 7−14 d; ue, supra-epidermis; le, lower-epidermis; pa, palisade tissue; sp, spongy tissue; vb, vascular bundle; ps, pole structure. a, b, c, f, h scale is 100 μm; d, e, g scale is 50 μm.
Figure 5. Anatomical observation of the regeneration process of adventitious buds of tetraploid leaves
表 1 增殖培养正交试验方案L9（34）
Table 1 Orthogonal experimental protocol for proliferation culture L9 (34)
处理号
Treatment No.IBA/
（mg·L−1）6-BA/
（mg·L−1）TDZ/
（mg·L−1）空列
Blank column1 0 0 0.25 1 2 0 0.5 0.50 2 3 0 1.0 1.00 3 4 0.2 0 0.50 3 5 0.2 0.5 1.00 1 6 0.2 1.0 0.25 2 7 0.4 0 1.00 2 8 0.4 0.5 0.25 3 9 0.4 1.0 0.50 1 
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表 2 不同IBA水平对四倍体生根培养的处理
Table 2 Treatment of different IBA levels on the rooting culture of tetraploids
处理号
Treatment No.IBA/（mg·L−1） 1 0.4 2 0.5 3 0.6 4 0.7 5 0.8 6 0.9 7 1.0
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表 3 不定芽再生培养基试验处理设计
Table 3 Design of experimental treatment for adventitious bud regeneration culture medium
处理号
Treatment No.TDZ/（mg·L−1） IBA/（mg·L−1） 1 0.5 0.2 2 0.5 0.3 3 0.5 0.4 4 1.0 0.2 5 1.0 0.3 6 1.0 0.4 7 1.5 0.2 8 1.5 0.3 9 1.5 0.4
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表 4 生长调节剂对四倍体组培苗增殖培养的影响
Table 4 Effects of growth regulators on the proliferation culture of tetraploid tissue culture seedlings
处理号
Treatment No.IBA/（mg·L−1） 6-BA/（mg·L−1） TDZ/（mg·L−1） 增殖系数
Multiplication factor生长情况
Growth condition1 0 0 0.25 1.91 ± 0.28e 叶绿、生长缓慢、增殖苗细弱
Green leaves, slow growth, and weak proliferating seedlings2 0 0.5 0.50 3.58 ± 0.38cd 叶绿、生长较慢、增殖苗细弱
Green leaves, slower growth, and weak proliferating seedlings3 0 1.0 1.00 4.66 ± 0.29b 叶深绿、生长较快、增殖苗健壮
Dark green leaves, faster growth, robust proliferating seedlings4 0.2 0 0.50 2.83 ± 0.14de 叶绿、生长较慢、增殖苗细弱
Green leaves, slower growth, weak proliferating seedlings5 0.2 0.5 1.00 6.41 ± 0.38a 叶深绿、生长较快、增殖苗健壮
Dark green leaves, faster growth, robust proliferating seedlings6 0.2 1.0 0.25 3.83 ± 0.38c 叶深绿、生长较快、增殖苗健壮
Dark green leaves, faster growth, robust proliferating seedlings7 0.4 0 1.00 3.66 ± 0.14cd 叶绿、生长较慢、增殖苗细弱
Green leaves, slower growth, weak proliferating seedlings8 0.4 0.5 0.25 3.25 ± 0.25de 叶嫩绿、生长较慢、增殖苗细弱
Tender green leaves, slower growth, weak proliferating seedlings9 0.4 1.0 0.50 2.08 ± 0.28e 叶绿、生长缓慢、增殖苗细弱
Green leaves, slower growth, weak proliferating seedlings注：不同字母表示处理间存在显著差异（P < 0.05）。下同。Notes: different letters indicate significant differences between treatments (P < 0.05). The same below.
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表 5 生长调节剂对四倍体增殖系数影响的方差分析
Table 5 ANOVA of the effects of growth regulators on the multiplication factor of tetraploids
变异来源
Source of variationdf SS MS F 区组 Block group 2 0.992 0.496 TDZ 2 24.124 12.062 133.615** 6-BA 2 11.722 5.861 64.923** IBA 2 8.848 4.424 49.000** 随机误差 Random error 18 1.620 0.090 总计 Total 26 47.306 注：*表示达到0.05水平差异；**表示达到0.01水平差异。下同。Notes: * indicates reaching 0.05 level difference; ** indicates reaching 0.01 level difference. The same below.
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表 6 培养基对四倍体酸枣生根培养的影响
Table 6 Effects of medium on the rooting culture of tetraploids
处理号
Treatment No.IBA/（mg·L−1） 平均根数
Number of average root平均根长
Average root length/cm生根率
Rooting rate/%生根情况
Rooting condition1 0.4 1.50 ± 0.08f 1.52 ± 0.08cd 48.96 ± 4.96c 根细弱，无侧根
Thin weak roots, no lateral roots2 0.5 2.51 ± 0.09d 2.18 ± 0.12b 63.62 ± 2.82b 根细弱，少侧根
Thin weak roots, few lateral roots3 0.6 3.34 ± 0.12c 2.15 ± 0.08b 65.04 ± 1.42b 根粗短，少量须根
Stubby short roots, few fibrous roots4 0.7 5.30 ± 0.21b 2.28 ± 0.11b 80.87 ± 1.93a 根较粗壮，侧根数较少
Sturdier roots, fewer lateral roots5 0.8 5.80 ± 0.05a 2.72 ± 0.06a 90.62 ± 1.39a 根较粗壮，侧根数较少
Sturdier roots, fewer lateral roots6 0.9 3.18 ± 0.17c 1.80 ± 0.07c 42.60 ± 2.17cd 根粗短，少量须根
Stubby short roots, few fibrous roots7 1.0 2.05 ± 0.04e 1.39 ± 0.11d 35.75 ± 4.47d 根粗短，少量须根
Stubby short roots, few fibrous roots
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表 7 生长调节剂对四倍体叶片不定芽再生的影响
Table 7 Effects of growth regulators on regeneration of adventitious shoots from leaves of tetraploid
处理号
Treatment No.TDZ/（mg·L−1） IBA/（mg·L−1） 不定芽诱导率
Induction rate of adventitious bud /%再生不定芽数
Number of regenerated adventitious bud1 0.5 0.2 70.28 ± 1.96e 1.02 ± 0.17e 2 0.5 0.3 83.63 ± 0.86d 1.75 ± 0.10de 3 0.5 0.4 86.76 ± 1.84bcd 2.11 ± 0.16d 4 1.0 0.2 91.41 ± 1.05ab 3.61 ± 0.08ab 5 1.0 0.3 95.45 ± 2.05a 4.37 ± 0.16a 6 1.0 0.4 93.44 ± 0.89a 3.15 ± 0.12bc 7 1.5 0.2 91.15 ± 0.84ab 2.59 ± 0.24cd 8 1.5 0.3 88.62 ± 0.62bc 2.34 ± 0.31cd 9 1.5 0.4 84.32 ± 1.32cd 1.88 ± 0.24d
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表 8 生长调节剂对四倍体叶片不定芽再生影响的方差分析
Table 8 ANOVA on the effects of growth regulators on the regeneration of adventitious shoots in tetraploid leaves
变异来源
Source of variationdf 不定芽诱导率
Induction rate of adventitious bud每片叶不定芽再生数
Number of adventitious bud regeneration per leafMS F MS F 区组 Block group 2 2.985 0.044 IBA 2 40.788 10.496** 0.561 9.605** TDZ 2 264.652 68.106** 6.914 118.435** IBA × TDZ 4 72.169 18.572** 0.514 8.806** 随机误差 Random error 16 3.886 0.058 总计 Total 26
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