Optimization of tissue culture system and establishment of high-efficiency adventitious bud regeneration system from leaf explants of tetraploid Ziziphus jujuba var. spinosa
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摘要:目的 以四倍体酸枣组培苗为材料，优化其组织培养体系并构建适宜的四倍体酸枣叶片离体再生体系，为该种质的保存、推广以及利用奠定基础。方法 本研究以秋水仙素加倍获得的酸枣同源四倍体种质为材料，设计试验，利用组织培养技术探索了不同植物生长调节剂的种类、浓度对于四倍体酸枣的增殖、生根、不定芽再生的影响情况；并利用石蜡切片法对叶片不定芽再生过程进行了细胞学观察。结果 （1）当四倍体酸枣以带顶芽的茎段作为外植体时，最佳增殖培养基为：1/2MS + 6-BA 0.5 mg/L + IBA 0.2 mg/L + TDZ 0.5 mg/L + 蔗糖30.0 g/L + 琼脂5.9 g/L，适宜生根培养基为：1/2MS + IBA 0.8 mg/L + 蔗糖30.0 g/L + 琼脂5.9 g/L。生根苗经炼苗后移栽至大田，成活率可达93.33%。（2）诱导四倍体酸枣叶片离体再生不定芽的最佳培养基为WPM + TDZ 1.0 mg/L + IBA 0.3 mg/L + 蔗糖30.0 g/L + 琼脂5.9 g/L，在该培养基上叶片可通过直接再生途径再生出不定芽。（3）再生不定芽主要起源于叶脉维管束周围的薄壁细胞，在预培养8 ~ 12 d时，分生细胞的分裂能力最强且未出现分化现象。结论 本研究优化了四倍体酸枣组培体系，并成功建立了四倍体酸枣叶片离体再生体系，同时对叶片不定芽的再生过程进行组织学研究，为酸枣多倍体培养体系完善以及后续多倍体种质的利用奠定了基础。Abstract:Objective A protocol for tissue culture system was optimized and an in vitro regeneration system suitable for tetraploid Ziziphus jujuba var. spinosa was constructed using same source as the starting material, so as to lay the foundation for the preservation, promotion and utilization of excellent germplasm.Method This study used Z. jujuba var. spinosa germplasm obtained by doubling colchicine as materials, designed experiments and explored the effects of different types and concentrations of plant growth regulators on the proliferation, rooting and adventitious bud regeneration of tetraploid Z. jujuba var. spinosa using tissue culture technology. Additionally, we explored the cytological observation of the process of leaf adventitious shoot regeneration using paraffin sectioning.Result (1) Tetraploid Z. jujuba var. spinosa was grown on stem segments with terminal buds as the explants. The best multiplication medium for tissue culture seedlings of tetraploid germplasm was: 1/2MS + 6-BA 0.5 mg/L + IBA 0.2 mg/L + TDZ 0.5 mg/L + sucrose 30.0 g/L + agar 5.9 g/L, the best rooting medium was 1/2MS + IBA 0.8 mg/L + sucrose 30.0 g/L + agar 5.9 g/L. The rooted seedlings were transplanted to the field after refining, and the survival rate could reach 93.33%. (2) The optimal medium for inducing the in vitro regeneration of adventitious shoots from tetraploid leaves was WPM + TDZ 1.0 mg/L + IBA 0.3 mg/L + sucrose 30.0 g/L + agar 5.9 g/L, in which the leaves could regenerate adventitious shoots by the direct regeneration pathway. (3) The cytological study of the regeneration process of autotetraploid jujube leaves in vitro showed that the regeneration of adventitious shoots originated mainly from thin-walled cells around the vascular bundles of leaf veins, and the meristematic cells were most divisive and undifferentiated at 8−12 d of preculture.Conclusion This study successfully established and optimized the system of tissue culture and in vitro regeneration of tetraploid sour jujube germplasm, and also conducted histological studies on the regeneration process of leaves adventitious bud regeneration, which lays the foundation for the perfection of jujube polyploid system and the subsequent utilization of its polyploid germplasm.
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沙枣（Elaeagnus angustifolia）生活力强，能抗风沙、耐贫瘠、耐盐碱[1]，在中国主要作为半干旱地区和盐土地防护林带的绿化树种，起到防风固沙、造林绿化的作用，是西北地区主要造林树种之一[2]。近年来在北京、河北、河南等地均有引种，开发利用前景广阔[3]。
Zalesny 等[4]通过检测4年间不同盐浓度下沙枣、杨树（Populus spp.）的生长及其对金属离子的吸附情况，发现沙枣具备一定耐盐能力，且对土壤中钠、镉和铁离子吸附能力较强。我国研究人员在20世纪90年代就对沙枣耐盐性进行了初步研究。郑秀玲等[2]通过对同一种源地不同沙枣品种进行NaCl胁迫，发现沙枣的耐盐机理以拒盐为主，且同一种源地不同沙枣间耐盐阈值存在显著差异。陈春晓等[5]在对沙枣幼苗进行不同程度盐旱共胁迫试验后，发现盐分和干旱处理明显抑制沙枣幼苗的生长，轻度干旱和盐分共胁迫条件下，沙枣幼苗表现出一定的交叉适应现象，而重度干旱加重了盐害。Liu等[6]通过试验证明沙枣在盐分和涝渍的共同胁迫下，通过增加孔隙率，积累无机离子和有机溶质以及增加抗氧化酶活性来维持较高光合速率和膜稳定性。
不同地理位置的同一物种会形成特定的地理种源，杨升等[7-8]通过研究不同种源沙枣幼苗在NaCl胁迫下的生长差异表现发现，随胁迫时间延长，其根冠比会发生显著变化，地上部分生物量比例减少；而随盐浓度升高，幼苗株高生长量呈下降趋势，根冠比呈上升趋势。王利军等[9]对赤峰和包头两种源的沙枣研究发现，盐分胁迫对包头种源沙枣叶绿素含量和荧光参数的影响要大于赤峰种源。
混合盐（NaCl、Na2SO4）胁迫下不同种源地沙枣幼苗的耐盐性研究目前仍是空白。因此，本研究选择宁夏和甘肃种源沙枣幼苗为试材，通过监测不同浓度混合盐溶液及不同胁迫时间下沙枣的生长及生理特性变化，比较分析沙枣种源间耐盐能力差异，进一步研究沙枣耐盐生理机制，为优良耐盐沙枣种质的种植、推广与开发提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料为采购于宁夏银川、甘肃张掖两地的生长健壮、长势一致的沙枣二年生幼苗。
1.2 试验处理
2019年3月将沙枣苗单株栽植于塑料盆（上、下口径分别为30、20 cm，高30 cm）中，盆底放置托盘。选用5 kg V（草炭土）∶V（珍珠岩）∶V（沙子） = 2∶1∶1的混合基质进行培养。
采用体积比为1∶1的NaCl和Na2SO4混合盐溶液，设定0.0%、0.3%、0.6%、0.9%、1.2% 5个质量分数梯度，每组3个重复。试验前取样1次作为对照。盆土干燥后，将定量盐溶液浇入对应处理中，1 d 1次（0.5 L），4 d完成施加。之后每10 d取一次样，测一次光合参数。取样时将沙枣功能叶片速冻，存放于−80 ℃超低温冰箱中待测，叶片膜透性则需取鲜样后立即测定。在处理40 d时完成最后一次采样，并测定叶长、叶宽、新梢以及地径等生长指标。
1.3 指标的测定
1.3.1 沙枣幼苗叶长、叶宽，新梢及地径生长量测定
盐胁迫试验前后，分别测量各植株地径及其被标记的5枝新梢的长度；并选择植株中上部成熟叶片10枚，分别用游标卡尺测量其叶长、叶宽（精度为0.01 cm）；胁迫前后数据差值即为各指标生长量。
1.3.2 沙枣幼苗生理指标测定
叶片膜透性（membrane permeability，MP）测定采用相对电导率法[10]，丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量测定采用巴比妥酸法，游离脯氨酸（proline，Pro）含量测定采用酸性茚三酮比色法，可溶性糖（soluble sugar，SS）含量测定采用蒽酮比色法，过氧化物酶（peroxidase，POD）活性的测定采用愈创木酚法，可溶性蛋白（soluble protein，SP）含量的测定采用考马斯亮蓝G-250染色法，叶绿素（chlorophyll，Chl）含量的测定采用丙酮乙醇法[11]，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性的测定采用氮蓝四唑光化还原法[12]，净光合速率（net photosynthesis rate，Pn）、胞间CO2 浓度（intercellular CO2 concentration，Ci）、气孔导度（stomatal conductance，Gs）、蒸腾速率（transpiration rate，Tr）等光和参数由LI-6400便携式光合仪进行测定。
1.3.3 试验数据处理及分析
采用Microsoft Excel 2012、SPSS22.0进行数据统计分析，OriginPro 2018进行绘图。
2. 结果与分析
2.1 混合盐胁迫对沙枣苗生长特性的影响
不同质量分数的混合盐胁迫对宁夏、甘肃两种源沙枣幼苗叶长、叶宽、新梢及地径生长量等指标均存在影响（表1）。整体来看，混合盐质量分数越高，沙枣生长量越小，生长抑制作用越显著；在1.2%胁迫下，两种源沙枣叶长、叶宽、新梢及地径生长量最小。值得注意的是，在0.3%胁迫下宁夏种源叶长、叶宽生长量均高于对照组。
表 1 混合盐胁迫对沙枣生长特性的影响Table 1. Effects of mixed salt stress on the growth characteristics of Elaeagnus angustifolia质量分数
Mass fraction/%叶长生长量
Leaf length growth/cm叶宽生长量
Leaf width growth/cm新梢生长量
New shoot growth/cm地径生长量
Ground diameter growth/cm宁夏 Ningxia 甘肃 Gansu 宁夏 Ningxia 甘肃 Gansu 宁夏 Ningxia 甘肃 Gansu 宁夏 Ningxia 甘肃 Gansu 0.0 (CK) 1.07 ± 0.04a 1.12 ± 0.05a 0.58 ± 0.04ab 0.68 ± 0.05a 21.50 ± 0.50a 20.67 ± 0.94a 1.04 ± 0.05a 1.08 ± 0.06a 0.3 1.14 ± 0.05a 1.10 ± 0.06a 0.68 ± 0.06a 0.50 ± 0.04c 16.38 ± 0.46a 18.67 ± 0.38a 0.85 ± 0.03bc 1.02 ± 0.04ab 0.6 0.82 ± 0.02b 0.97 ± 0.04b 0.46 ± 0.06bc 0.61 ± 0.01ab 16.08 ± 0.71b 14.33 ± 0.87b 0.95 ± 0.07ab 0.86 ± 0.05bc 0.9 0.92 ± 0.03b 0.72 ± 0.06c 0.52 ± 0.04abc 0.52 ± 0.02bc 13.17 ± 0.80c 16.08 ± 0.72b 0.92 ± 0.05ab 0.64 ± 0.09d 1.2 0.57 ± 0.05c 0.64 ± 0.05c 0.40 ± 0.09c 0.39 ± 0.06d 9.22 ± 0.47d 7.91 ± 0.80c 0.78 ± 0.02c 0.75 ± 0.09cd 注：不同小写字母表示各指标在不同浓度处理组间存在显著差异(P < 0.05)。下同。Notes: different lowercase letters indicate there is a significant difference between the treatment groups with different concentrations of each index (P < 0.05). The same below. 2.2 混合盐胁迫对沙枣苗生理特性的影响
2.2.1 混合盐胁迫对沙枣叶片膜透性及丙二醛含量的影响
随盐质量分数增加和时间延长，两种源沙枣MP及MDA含量均呈增加趋势（图1）。胁迫持续到30 d时，宁夏、甘肃两种源沙枣MP随质量分数升高均显著增强；胁迫40 d时，两种源沙枣MP仍持续增加，较CK均差异显著（P < 0.05）。这表明两种源的膜脂在长期或高质量分数盐胁迫下均受到不同程度损伤，且宁夏种源沙枣受损更为严重。
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图 1 不同盐胁迫对沙枣MP及MDA含量的影响图中N、G分别代表宁夏种源和甘肃种源；不同小写字母表示各指标在不同浓度处理组间存在显著差异(P < 0.05)。下同。The capital letters N and G in the figure represent Ningxia provenance and Gansu provenance, respectively; different lowercase letters indicate there is a significant difference between treatment groups with different concentrations of each index (P < 0.05). The same below.Figure 1. Effects of different salt stress on MP and MDA contents of Elaeagnus angustifolia2.2.2 混合盐胁迫对沙枣叶片中有机渗透调节物质含量的影响
随盐质量分数增加，两个种源沙枣Pro、SS含量呈上升趋势，且宁夏种源Pro、SS含量整体高于甘肃种源；随胁迫时间延长，两种源Pro含量逐渐上升，SS含量先升高后降低，SP含量先升高后降低再升高（图2）。当胁迫至20 d时，两种源SP含量较10 d均有所下降；30 d时宁夏种源沙枣Pro含量随着盐质量分数升高而增加，较CK分别增加了44.45%、74.31%、94.00%、119.94%，甘肃种源分别增加了19.68%、40.09%、67.89%、107.87%。40 d时，宁夏、甘肃两种源沙枣叶片Pro含量均在质量分数为1.2%时达到最高，较CK分别增加了130.20%和108.90%；此时各种源SP含量再次呈上升趋势。
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图 2 不同盐胁迫对沙枣Pro、SP、SS含量的影响SP. 可溶性蛋白；Pro. 游离脯氨酸；SS. 可溶性糖。SP, soluble protein; Pro, proline; SS, soluble sugar.Figure 2. Effects of different salt stress on the contents of Pro, SP, SS of E. angustifolia2.2.3 混合盐胁迫对沙枣叶片抗氧化酶活性的影响
随胁迫时间延长，宁夏、甘肃两种源沙枣叶片SOD活性整体呈先上升后下降的趋势，POD活性也呈相似变化趋势（图3）。胁迫至10 d时，两种源沙枣SOD活性显著上升，宁夏种源在质量分数为0.3%时SOD活性最高（333.45 U/g）；在质量分数为0.6%时叶片POD活性到达最高，为CK的2.09倍。甘肃种源在质量分数为0.6%时SOD活性最高（309.29 U/g），0.9%时POD活性达到最高值，为CK的1.97倍。20 d时宁夏种源SOD活性在各质量分数处理组均低于甘肃种源。自20 d后，两种源沙枣叶片POD活性均显著下降（P < 0.05）。40 d时宁夏种源SOD活性较30 d有所下降，甘肃种源活性较稳定，且均与CK存在显著差异。
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图 3 不同盐胁迫对沙枣SOD、POD活性的影响Figure 3. Effects of different salt stress on the activities of SOD and POD of E. angustifolia2.2.4 混合盐胁迫对沙枣叶片叶绿素含量的影响
随盐质量分数升高和胁迫时间延长，宁夏、甘肃两种源Chl含量整体呈下降趋势（图4）。10 d时，宁夏种源中Chl含量在质量分数为0.6%时高于CK；甘肃种源Chl含量在盐各质量分数下均低于CK。20 d后，两种源Chl含量较CK均有所下降，且甘肃种源下降幅度更大。40 d时两种源各处理组Chl含量较CK均显著下降（P < 0.05）。
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图 4 不同盐胁迫下沙枣Chl含量变化Figure 4. Changes in Chl content of E. angustifolia under different salt stress2.3 混合盐胁迫对不同种源沙枣苗叶片光合参数的影响
宁夏、甘肃两种源沙枣随胁迫时间延长，叶片Gs、Pn值整体先下降后上升再下降，Ci值整体先下降后上升，Tr值整体呈下降趋势。随盐质量分数增加，Gs、Pn、Tr值整体呈下降趋势，Ci值呈上升趋势（图5）。胁迫至10 d时，两种源沙枣叶片Gs、Ci、Pn、Tr值较对照组均有所降低。20 d时，两种源沙枣叶片Ci、Pn值开始上升。30 d时，两种源Gs、Ci值均上升；Pn、Tr值较20 d时再次降低，且宁夏种源Pn值降幅更大。40 d时，两种源Gs、Pn、Tr值降至最低。
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图 5 不同盐胁迫对沙枣叶片光合参数的影响Tr. 蒸腾速率；Ci. 胞间CO2浓度；Pn. 净光合速率；Gs. 气孔导度。下同。Tr, transpiration rate; Ci, intercellular CO2 concentration; Pn, net photosynthesis rate; Gs, stomatal conductance. The same below.Figure 5. Effects of different salt stress on photosynthetic parameters of E. angustifolia leaves2.4 不同种源地沙枣耐盐性综合评价
2.4.1 不同种源沙枣耐盐阈值的确定
植物生长量是衡量其耐盐能力的重要指标。耐盐阈值是指植物生长量或生物量下降50%时的盐浓度[13]。本试验中，以胁迫处理的新梢生长量为因变量（y）、以盐浓度为自变量（x）建立回归方程（表2）。以新梢生长量下降50%时的盐浓度作为耐盐阈值，得出宁夏、甘肃种源沙枣的耐盐阈值分别为1.088%和1.153%。由此可见，不同种源沙枣的耐盐性存在差异，甘肃种源沙枣强于宁夏种源沙枣。
表 2 盐碱胁迫下沙枣苗的回归方程及其耐盐阈值Table 2. Regression equation of E. angustifolia seedlings under salt-alkali stress and its salt tolerance threshold种源 Provenance 回归方程 Regression equation R2 阈值 Threshold/% 宁夏 Ningxia y = 20.824 − 9.257x 0.944 1.088 甘肃 Gansu y = 21.154 − 9.370x 0.822 1.153 2.4.2 沙枣耐盐性综合评价
利用综合生长量（叶长、叶宽、新梢、地径生长量），以及MP、Chl、MDA、SS、Pro、SP、SOD、POD、Pn、Gs、Ci、Tr等16项指标，通过主成分分析，以沙枣耐盐指标主成分系数为权重构建评分模型，再以归一化处理后的主成分方差贡献率为权重（表3、表4），构建综合评分模型，对宁夏、甘肃两种源地沙枣的耐盐性进行评价。
表 3 两种源沙枣耐盐指标主成分载荷表Table 3. Principal component loading table of salt tolerance index of E. angustifolia from two sources主成分
Main
ingredient指标 Index Chl Ci MDA Tr MP Pro Pn Gs SP SS SOD POD 新梢
New
shoot叶长
Leaf
length叶宽
Leaf
width地径
Ground
diameter1 −0.917 0.878 0.945 −0.945 0.937 0.918 −0.937 −0.951 0.934 0.876 0.876 −0.612 0.716 0.777 0.807 0.824 2 0.321 −0.374 −0.249 0.247 −0.255 −0.259 0.215 0.184 −0.092 0.084 0.158 0.081 0.678 0.624 0.566 0.533 表 4 两种源沙枣耐盐指标主成分系数及贡献率Table 4. Principal component coefficients and contribution rates of salt tolerance indexes of two sources主成分
Main
ingredient指标 Index Chl Ci MDA Tr MP Pro Pn Gs SP SS SOD POD 新梢
New
shoot叶长
Leaf
length叶宽
Leaf
width地径
Ground
diameter特征值
Eigenvalue贡献率
Contribution
rate/%累计贡献率
Cumulative
contribution
rate/%1 −0.938 0.937 0.921 −0.920 0.918 0.904 −0.895 −0.890 0.823 0.676 0.635 −0.551 0.210 0.291 0.349 0.381 12.131 75.818 75.818 2 −0.252 0.185 0.326 −0.328 0.317 0.303 −0.350 −0.384 0.450 0.563 0.624 −0.278 0.963 0.953 0.922 0.904 2.007 12.979 88.796 主成分分析共提取出2个主成分。第一主成分中的Chl、Ci、MDA、Tr、MP、Pro 6项指标和第二主成分中的生长量（叶长、叶宽、新梢、地径生长量）等指标，相关系数均在0.9以上。两主成分特征值分别为12.131和2.007，贡献率分别为75.818%和12.979%。两主成分累积贡献率达到88.796%，可代表变量的绝大多数信息。根据主成分分析结果，Chl、Ci、MDA、Tr、MP、Pro等6个指标可作为评价沙枣耐盐性的重要指标，生长量（叶长、叶宽、新梢、地径生长量）等指标可作为辅助评价参考指标。经计算，宁夏、甘肃种源沙枣的综合数值分别为−0.135和0.120，进一步证明甘肃种源沙枣耐盐能力强于宁夏种源。
3. 讨论与结论
植物受高浓度盐胁迫后，直接的表现就是各部分生物量受到不同程度的抑制[14]。当浓度过高时，沙枣会通过降低叶面积来减少叶面水分损失，从而维持植物的水分收支平衡，这是植物自我保护机制的体现[15]。试验表明，混合盐质量分数越高，沙枣生长量越小，生长抑制作用越显著，整体表现出“低促高抑”的现象，这与赵海燕[16]、魏秀君[17]的研究结论一致。本试验中，在质量分数为0.3%的盐胁迫下宁夏种源叶长、叶宽生长量均高于对照组。
植物的膜系统是在盐胁迫下最先感应到伤害的部位。细胞膜系统受到损伤，引起膜脂氧化反应，导致MP增大；而MDA是植物膜脂过氧化的产物之一，因此MP和MDA含量常用来反映细胞膜的受损程度[18-20]。本研究中宁夏、甘肃两种源沙枣叶片MP、MDA含量随盐质量分数增加和胁迫时间延长总体呈上升趋势。40 d时两种源沙枣叶片MP在盐质量分数为1.2%时达到最大值；宁夏种源较CK上升42.55%，甘肃种源较CK上升40.58%；这表明宁夏种源的细胞膜透性受损程度高于甘肃种源。
随盐质量分数增加，两个种源沙枣Pro、SS含量呈上升趋势，且宁夏种源Pro、SS含量整体高于甘肃种源。随胁迫时间延长，两种源Pro含量逐渐上升，SS含量先升高后降低，SP含量先升高后降低再升高。沙枣体内Pro积累主要有两个原因：催化Pro合成的关键酶受到胁迫诱导因子激活以及氧化降解Pro的关键酶受到抑制[21]。由于试验中宁夏种源Pro含量整体高于甘肃种源，说明不同种源沙枣Pro合成酶或者降解酶活性存在差异。SS具有降低水势、稳定细胞膜和原生质胶体的功能，同时，还可为有机物合成提供碳架和能量[22-23]。在胁迫前期，SS作为渗透调节物质大量积累以维持细胞渗透压，此时表现为SS含量上升，且在高浓度胁迫下SS含量越高；随胁迫时间延长，细胞体受到严重损伤，SS作为细胞修复原料被大量消耗，导致植物体内SS含量降低。10 d时，由于沙枣的应激性反应，两种源沙枣SP含量均显著上升；随胁迫持续，部分SP分解形成包括Pro在内的多种氨基酸，导致其含量有所下降；但随着植物体渗透调节系统持续发挥作用，更多SP不断被产生，即表现为在胁迫后期SP含量出现不同程度的上升。Pro、SS及SP的积累和转化是沙枣渗透调节系统在不同程度、不同时期盐胁迫下发挥作用的途径和表现。
植物自身的抗氧化系统[24]，能清除盐胁迫产生的过量自由基，而清除O2−和H2O2的关键酶分别是SOD和POD[25]。两种源沙枣SOD、POD活性随胁迫时间延长均表现出先上升后下降的趋势。胁迫前期，宁夏种源沙枣的保护酶活性高于甘肃种源，说明宁夏种源沙枣抗氧化胁迫机制对盐胁迫环境的响应更为强烈。随时间延长，高浓度处理下SOD、POD活性显著降低，抗氧化系统受到破坏，自由基反应持续发生，最终导致细胞膜系统受损。
本研究发现随盐质量分数升高和胁迫时间延长，两种源沙枣内Chl含量整体均呈下降趋势。Chl作为植物叶绿体中重要的光合色素，随盐浓度升高发生降解，使其含量减少[26-28]，这可能是由于盐胁迫降低了卟啉的形成速率，或减少了Chl结合蛋白的形成[29]。
叶片光合参数方面，随胁迫时间延长，两种源沙枣叶片Pn、Gs总体呈先下降后上升再下降的趋势，Ci呈先下降后上升的趋势。随胁迫浓度的加深，Pn、Gs呈下降趋势，Ci呈上升趋势。Pn的降低是气孔因素和非气孔因素共同作用的结果[30]：气孔关闭阻碍了CO2进入细胞，导致Pn下降，此为气孔因素作用。由于气孔导度Gs降低，胞间CO2浓度Ci升高而引起的Pn下降则为非气孔因素作用[31-32]。盐浓度增加和胁迫时间延长均会造成植物Tr降低，进而减少根系吸水从而限制有毒离子的吸收。蒸腾速率随盐胁迫增加而降低，是植物适应盐胁迫的一种响应机制[15]。胁迫初期，沙枣叶片的Pn、Gs、Tr、Ci均随盐质量分数增加而降低，说明对沙枣光合作用的抑制主要是由气孔限制引起。胁迫后期，沙枣叶片的Pn、Gs、Tr值随盐浓度增加而降低，Ci值随盐浓度增加而升高，说明两种源沙枣光合作用受到显著抑制主要是由非气孔限制所引起的。沙枣受到盐碱胁迫后，其光合作用下降是气孔因素和非气孔因素共同作用的结果，且气孔和非气孔因素之间随胁迫浓度和时间的变化而发生动态变化。
植物的耐盐性是一个综合体现，单一指标评价体系中评价的时期、方法和指标等存在差异，结果会出现偏差。因此，选用多个指标能更全面、准确地评价植物间耐盐性差异[33-34]。试验过程中，两种源沙枣幼苗在有机渗透调节及抗氧化系统等方面表现差异，说明不同种源对沙枣幼苗耐盐能力影响不同。本研究选择了涵盖植物生长、生理的16项指标构建沙枣耐盐性综合评分模型，最终证明甘肃种源沙枣耐盐能力强于宁夏种源。因此，在中、重度盐渍土中进行沙枣引种栽培时，选种甘肃种源的沙枣能更有效地发挥其生态和经济效益。
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图 1 植物生长调节剂浓度对四倍体增殖培养影响的极差分析
各水平下的数字1、2、3分别对应不同激素质量浓度在试验中的水平值。其中，IBA 1、2、3水平的质量浓度分别为0、0.2、0.4 mg/L；6-BA 1、2、3水平的质量浓度分别为0、0.5、1.0 mg/L；TDZ 1、2、3水平的质量浓度分别为0.25、0.50、1.00 mg/L。The numbers 1, 2 and 3 under each level correspond to the level values of different hormone concentrations in the experiment. The concentrations of IBA 1, 2 and 3 levels are 0, 0.2 and 0.4 mg/L, respectively. The concentrations of 6-BA 1, 2 and 3 levels are 0, 0.5 and 1.0 mg/L, respectively. The concentrations of TDZ 1, 2 and 3 levels are 0.25, 0.50 and 1.00 mg/L, respectively.
Figure 1. Extreme difference analysis of the effects of plant growth regulator concentration on tetraploid proliferation culture
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图 2 四倍体组培体系的优化
a ~ b. 四倍体酸枣的增殖培养；c. 继代培养；d. 生根培养；e. 炼苗移栽；f. 大田生长45 d后。a−b, proliferation culture of tetraploid Z. jujuba var. spinosa; c, subculture; d, rooting culture; e, acclimatization and transplant; f, after 45 d of field growth.
Figure 2. Optimization of tetraploid tissue culture system
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图 3 不同移栽天数对组培苗生长情况的影响
Figure 3. Effects of different transplanting days on the growth of tissue culture seedlings
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图 4 四倍体叶片不定芽再生过程表型观察
a. 叶片培养0 d；b. 叶片培养7 d；c. 叶片培养14 d；d. 叶片培养21 d；e. 叶片培养35 d；f. 叶片培养56 d。标尺为 1 cm。a, leaf culture 0 d; b, leaf culture after 7 d; c, leaf culture after 14 d; d, leaf culture after 21 d; e, leaf culture after 35 d; f, leaf culture after 56 d. Scale bar is 1 cm.
Figure 4. Phenotypic observations on the regeneration process of adventitious shoots of tetraploid leaves
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图 5 四倍体叶片不定芽再生过程解剖学观察
a ~ h分别为叶片培养7 ~ 14 d；ue. 上表皮细胞；le. 下表皮细胞；pa. 栅栏组织；sp. 海绵组织；vb. 维管束；ps. 极点结构。其中a、b、c、f、h标尺为100 μm，d、e、g标尺为50 μm。a−h, leaf culture for 7−14 d; ue, supra-epidermis; le, lower-epidermis; pa, palisade tissue; sp, spongy tissue; vb, vascular bundle; ps, pole structure. a, b, c, f, h scale is 100 μm; d, e, g scale is 50 μm.
Figure 5. Anatomical observation of the regeneration process of adventitious buds of tetraploid leaves
表 1 增殖培养正交试验方案L9（34）
Table 1 Orthogonal experimental protocol for proliferation culture L9 (34)
处理号
Treatment No.IBA/
（mg·L−1）6-BA/
（mg·L−1）TDZ/
（mg·L−1）空列
Blank column1 0 0 0.25 1 2 0 0.5 0.50 2 3 0 1.0 1.00 3 4 0.2 0 0.50 3 5 0.2 0.5 1.00 1 6 0.2 1.0 0.25 2 7 0.4 0 1.00 2 8 0.4 0.5 0.25 3 9 0.4 1.0 0.50 1 
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表 2 不同IBA水平对四倍体生根培养的处理
Table 2 Treatment of different IBA levels on the rooting culture of tetraploids
处理号
Treatment No.IBA/（mg·L−1） 1 0.4 2 0.5 3 0.6 4 0.7 5 0.8 6 0.9 7 1.0
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表 3 不定芽再生培养基试验处理设计
Table 3 Design of experimental treatment for adventitious bud regeneration culture medium
处理号
Treatment No.TDZ/（mg·L−1） IBA/（mg·L−1） 1 0.5 0.2 2 0.5 0.3 3 0.5 0.4 4 1.0 0.2 5 1.0 0.3 6 1.0 0.4 7 1.5 0.2 8 1.5 0.3 9 1.5 0.4
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表 4 生长调节剂对四倍体组培苗增殖培养的影响
Table 4 Effects of growth regulators on the proliferation culture of tetraploid tissue culture seedlings
处理号
Treatment No.IBA/（mg·L−1） 6-BA/（mg·L−1） TDZ/（mg·L−1） 增殖系数
Multiplication factor生长情况
Growth condition1 0 0 0.25 1.91 ± 0.28e 叶绿、生长缓慢、增殖苗细弱
Green leaves, slow growth, and weak proliferating seedlings2 0 0.5 0.50 3.58 ± 0.38cd 叶绿、生长较慢、增殖苗细弱
Green leaves, slower growth, and weak proliferating seedlings3 0 1.0 1.00 4.66 ± 0.29b 叶深绿、生长较快、增殖苗健壮
Dark green leaves, faster growth, robust proliferating seedlings4 0.2 0 0.50 2.83 ± 0.14de 叶绿、生长较慢、增殖苗细弱
Green leaves, slower growth, weak proliferating seedlings5 0.2 0.5 1.00 6.41 ± 0.38a 叶深绿、生长较快、增殖苗健壮
Dark green leaves, faster growth, robust proliferating seedlings6 0.2 1.0 0.25 3.83 ± 0.38c 叶深绿、生长较快、增殖苗健壮
Dark green leaves, faster growth, robust proliferating seedlings7 0.4 0 1.00 3.66 ± 0.14cd 叶绿、生长较慢、增殖苗细弱
Green leaves, slower growth, weak proliferating seedlings8 0.4 0.5 0.25 3.25 ± 0.25de 叶嫩绿、生长较慢、增殖苗细弱
Tender green leaves, slower growth, weak proliferating seedlings9 0.4 1.0 0.50 2.08 ± 0.28e 叶绿、生长缓慢、增殖苗细弱
Green leaves, slower growth, weak proliferating seedlings注：不同字母表示处理间存在显著差异（P < 0.05）。下同。Notes: different letters indicate significant differences between treatments (P < 0.05). The same below.
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表 5 生长调节剂对四倍体增殖系数影响的方差分析
Table 5 ANOVA of the effects of growth regulators on the multiplication factor of tetraploids
变异来源
Source of variationdf SS MS F 区组 Block group 2 0.992 0.496 TDZ 2 24.124 12.062 133.615** 6-BA 2 11.722 5.861 64.923** IBA 2 8.848 4.424 49.000** 随机误差 Random error 18 1.620 0.090 总计 Total 26 47.306 注：*表示达到0.05水平差异；**表示达到0.01水平差异。下同。Notes: * indicates reaching 0.05 level difference; ** indicates reaching 0.01 level difference. The same below.
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表 6 培养基对四倍体酸枣生根培养的影响
Table 6 Effects of medium on the rooting culture of tetraploids
处理号
Treatment No.IBA/（mg·L−1） 平均根数
Number of average root平均根长
Average root length/cm生根率
Rooting rate/%生根情况
Rooting condition1 0.4 1.50 ± 0.08f 1.52 ± 0.08cd 48.96 ± 4.96c 根细弱，无侧根
Thin weak roots, no lateral roots2 0.5 2.51 ± 0.09d 2.18 ± 0.12b 63.62 ± 2.82b 根细弱，少侧根
Thin weak roots, few lateral roots3 0.6 3.34 ± 0.12c 2.15 ± 0.08b 65.04 ± 1.42b 根粗短，少量须根
Stubby short roots, few fibrous roots4 0.7 5.30 ± 0.21b 2.28 ± 0.11b 80.87 ± 1.93a 根较粗壮，侧根数较少
Sturdier roots, fewer lateral roots5 0.8 5.80 ± 0.05a 2.72 ± 0.06a 90.62 ± 1.39a 根较粗壮，侧根数较少
Sturdier roots, fewer lateral roots6 0.9 3.18 ± 0.17c 1.80 ± 0.07c 42.60 ± 2.17cd 根粗短，少量须根
Stubby short roots, few fibrous roots7 1.0 2.05 ± 0.04e 1.39 ± 0.11d 35.75 ± 4.47d 根粗短，少量须根
Stubby short roots, few fibrous roots
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表 7 生长调节剂对四倍体叶片不定芽再生的影响
Table 7 Effects of growth regulators on regeneration of adventitious shoots from leaves of tetraploid
处理号
Treatment No.TDZ/（mg·L−1） IBA/（mg·L−1） 不定芽诱导率
Induction rate of adventitious bud /%再生不定芽数
Number of regenerated adventitious bud1 0.5 0.2 70.28 ± 1.96e 1.02 ± 0.17e 2 0.5 0.3 83.63 ± 0.86d 1.75 ± 0.10de 3 0.5 0.4 86.76 ± 1.84bcd 2.11 ± 0.16d 4 1.0 0.2 91.41 ± 1.05ab 3.61 ± 0.08ab 5 1.0 0.3 95.45 ± 2.05a 4.37 ± 0.16a 6 1.0 0.4 93.44 ± 0.89a 3.15 ± 0.12bc 7 1.5 0.2 91.15 ± 0.84ab 2.59 ± 0.24cd 8 1.5 0.3 88.62 ± 0.62bc 2.34 ± 0.31cd 9 1.5 0.4 84.32 ± 1.32cd 1.88 ± 0.24d
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表 8 生长调节剂对四倍体叶片不定芽再生影响的方差分析
Table 8 ANOVA on the effects of growth regulators on the regeneration of adventitious shoots in tetraploid leaves
变异来源
Source of variationdf 不定芽诱导率
Induction rate of adventitious bud每片叶不定芽再生数
Number of adventitious bud regeneration per leafMS F MS F 区组 Block group 2 2.985 0.044 IBA 2 40.788 10.496** 0.561 9.605** TDZ 2 264.652 68.106** 6.914 118.435** IBA × TDZ 4 72.169 18.572** 0.514 8.806** 随机误差 Random error 16 3.886 0.058 总计 Total 26
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