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酵母双杂交筛选与小黑杨PsnWRKY70相互作用的蛋白质

赵慧 王遂 姜静 刘桂丰

赵慧, 王遂, 姜静, 刘桂丰. 酵母双杂交筛选与小黑杨PsnWRKY70相互作用的蛋白质[J]. 北京林业大学学报, 2016, 38(2): 44-51. doi: 10.13332/j.1000-1522.20150162
引用本文: 赵慧, 王遂, 姜静, 刘桂丰. 酵母双杂交筛选与小黑杨PsnWRKY70相互作用的蛋白质[J]. 北京林业大学学报, 2016, 38(2): 44-51. doi: 10.13332/j.1000-1522.20150162
ZHAO Hui, WANG Sui, JIANG Jing, LIU Gui-feng. Screening of Populus simonii×Populus nigra WRKY70-interactive proteins by the yeast two-hybrid system[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2016, 38(2): 44-51. doi: 10.13332/j.1000-1522.20150162
Citation: ZHAO Hui, WANG Sui, JIANG Jing, LIU Gui-feng. Screening of Populus simonii×Populus nigra WRKY70-interactive proteins by the yeast two-hybrid system[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2016, 38(2): 44-51. doi: 10.13332/j.1000-1522.20150162

酵母双杂交筛选与小黑杨PsnWRKY70相互作用的蛋白质

doi: 10.13332/j.1000-1522.20150162
基金项目: 

“863”国家高技术研究发展计划项目(2011AA100201)。

详细信息
    作者简介:

    赵慧,博士生。主要研究方向:小黑杨抗逆基因工程育种。Email:zhao_hui_zh@126.com 地址:150040黑龙江省哈尔滨市香坊区和兴路51号东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室。责任作者: 刘桂丰,教授,博士生导师。主要研究方向:林木遗传改良和林木抗逆基因工程育种。Email:liuguifeng@126.com 地址:同上。

    赵慧,博士生。主要研究方向:小黑杨抗逆基因工程育种。Email:zhao_hui_zh@126.com 地址:150040黑龙江省哈尔滨市香坊区和兴路51号东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室。责任作者: 刘桂丰,教授,博士生导师。主要研究方向:林木遗传改良和林木抗逆基因工程育种。Email:liuguifeng@126.com 地址:同上。

Screening of Populus simonii×Populus nigra WRKY70-interactive proteins by the yeast two-hybrid system

  • 摘要: 小黑杨PsnWRKY70是能够响应盐胁迫的转录因子。为了进一步探究该转录因子在参与盐胁迫应答途径中与哪些蛋白质之间存在相互作用关系,本研究以140 mmol/L NaCl溶液处理过的小黑杨叶片为材料,利用热稳定核酸酶(DSN)构建了均一化的pGADT7-DEST酵母双杂交cDNA文库,将PsnWRKY70基因亚克隆至pGBKT7载体,形成BD-WRKY重组质粒,并以之为诱饵蛋白表达载体筛选小黑杨酵母双杂交cDNA文库。经过2轮酵母双杂交筛选以及回转验证试验,初步选出了5种与PsnWRKY70相互作用的蛋白质。对所筛选出的5种蛋白质进行保守结构域分析发现:有2种预测蛋白(HP1和HP2,其中HP1包含ClpP结构域),1种环化酶相关蛋白(CAP1),1种包含RNA识别基序的蛋白(RRM)以及1种泛素样修饰蛋白酶(Ulp1);对CAP1、HP1、RRM、HP2和Ulp1的毛果杨同源基因编码区上游2 000 bp范围内的顺式作用元件进行分析发现:CAP1、HP1、RRM、HP2和Ulp1的毛果杨同源基因上游启动子区均富含能够特异性结合WRKY转录因子的W-box。采用GST-pull down技术验证CAP1、HP1、RRM、HP2、Ulp1蛋白全长与PsnWRKY70转录因子之间是否存在直接的相互作用关系,将等量的His-X(X:CAP1、HP1、RRM、HP2或Ulp1)融合蛋白分别上样于正常谷胱甘肽琼脂糖树脂以及结合了GST或GST-WRKY蛋白的谷胱甘肽琼脂糖树脂中,SDS-PAGE电泳分离互作蛋白,最终Western blot结果显示:在体外状态下,HP1、RRM和Ulp1蛋白能够直接与PsnWRKY70相互作用,而CAP1和HP2则不能直接与PsnWRKY70相互作用。
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出版历程
  • 收稿日期:  2015-05-11
  • 修回日期:  2015-06-06
  • 刊出日期:  2016-02-29

酵母双杂交筛选与小黑杨PsnWRKY70相互作用的蛋白质

doi: 10.13332/j.1000-1522.20150162
    基金项目:

    “863”国家高技术研究发展计划项目(2011AA100201)。

    作者简介:

    赵慧,博士生。主要研究方向:小黑杨抗逆基因工程育种。Email:zhao_hui_zh@126.com 地址:150040黑龙江省哈尔滨市香坊区和兴路51号东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室。责任作者: 刘桂丰,教授,博士生导师。主要研究方向:林木遗传改良和林木抗逆基因工程育种。Email:liuguifeng@126.com 地址:同上。

    赵慧,博士生。主要研究方向:小黑杨抗逆基因工程育种。Email:zhao_hui_zh@126.com 地址:150040黑龙江省哈尔滨市香坊区和兴路51号东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室。责任作者: 刘桂丰,教授,博士生导师。主要研究方向:林木遗传改良和林木抗逆基因工程育种。Email:liuguifeng@126.com 地址:同上。

摘要: 小黑杨PsnWRKY70是能够响应盐胁迫的转录因子。为了进一步探究该转录因子在参与盐胁迫应答途径中与哪些蛋白质之间存在相互作用关系,本研究以140 mmol/L NaCl溶液处理过的小黑杨叶片为材料,利用热稳定核酸酶(DSN)构建了均一化的pGADT7-DEST酵母双杂交cDNA文库,将PsnWRKY70基因亚克隆至pGBKT7载体,形成BD-WRKY重组质粒,并以之为诱饵蛋白表达载体筛选小黑杨酵母双杂交cDNA文库。经过2轮酵母双杂交筛选以及回转验证试验,初步选出了5种与PsnWRKY70相互作用的蛋白质。对所筛选出的5种蛋白质进行保守结构域分析发现:有2种预测蛋白(HP1和HP2,其中HP1包含ClpP结构域),1种环化酶相关蛋白(CAP1),1种包含RNA识别基序的蛋白(RRM)以及1种泛素样修饰蛋白酶(Ulp1);对CAP1、HP1、RRM、HP2和Ulp1的毛果杨同源基因编码区上游2 000 bp范围内的顺式作用元件进行分析发现:CAP1、HP1、RRM、HP2和Ulp1的毛果杨同源基因上游启动子区均富含能够特异性结合WRKY转录因子的W-box。采用GST-pull down技术验证CAP1、HP1、RRM、HP2、Ulp1蛋白全长与PsnWRKY70转录因子之间是否存在直接的相互作用关系,将等量的His-X(X:CAP1、HP1、RRM、HP2或Ulp1)融合蛋白分别上样于正常谷胱甘肽琼脂糖树脂以及结合了GST或GST-WRKY蛋白的谷胱甘肽琼脂糖树脂中,SDS-PAGE电泳分离互作蛋白,最终Western blot结果显示:在体外状态下,HP1、RRM和Ulp1蛋白能够直接与PsnWRKY70相互作用,而CAP1和HP2则不能直接与PsnWRKY70相互作用。

English Abstract

赵慧, 王遂, 姜静, 刘桂丰. 酵母双杂交筛选与小黑杨PsnWRKY70相互作用的蛋白质[J]. 北京林业大学学报, 2016, 38(2): 44-51. doi: 10.13332/j.1000-1522.20150162
引用本文: 赵慧, 王遂, 姜静, 刘桂丰. 酵母双杂交筛选与小黑杨PsnWRKY70相互作用的蛋白质[J]. 北京林业大学学报, 2016, 38(2): 44-51. doi: 10.13332/j.1000-1522.20150162
ZHAO Hui, WANG Sui, JIANG Jing, LIU Gui-feng. Screening of Populus simonii×Populus nigra WRKY70-interactive proteins by the yeast two-hybrid system[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2016, 38(2): 44-51. doi: 10.13332/j.1000-1522.20150162
Citation: ZHAO Hui, WANG Sui, JIANG Jing, LIU Gui-feng. Screening of Populus simonii×Populus nigra WRKY70-interactive proteins by the yeast two-hybrid system[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2016, 38(2): 44-51. doi: 10.13332/j.1000-1522.20150162
参考文献 (28)

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