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芍药属组内组间杂交及部分后代核型分析与SSR鉴定

刘建鑫 杨柳慧 魏冬霞 于晓南

刘建鑫, 杨柳慧, 魏冬霞, 于晓南. 芍药属组内组间杂交及部分后代核型分析与SSR鉴定[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(4): 72-78. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160181
引用本文: 刘建鑫, 杨柳慧, 魏冬霞, 于晓南. 芍药属组内组间杂交及部分后代核型分析与SSR鉴定[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(4): 72-78. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160181
LIU Jian-xin, YANG Liu-hui, WEI Dong-xia, YU Xiao-nan. Intrasectional and intersectional cross breeding of Paeonia and karyotype analysis and SSR identification of some hybrids[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(4): 72-78. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160181
Citation: LIU Jian-xin, YANG Liu-hui, WEI Dong-xia, YU Xiao-nan. Intrasectional and intersectional cross breeding of Paeonia and karyotype analysis and SSR identification of some hybrids[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(4): 72-78. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160181

芍药属组内组间杂交及部分后代核型分析与SSR鉴定

doi: 10.13332/j.1000-1522.20160181
基金项目: 

国家自然科学基金项目 31400591

北京市教育委员会科学研究与研究生培养共建项目 BLCXY201629

详细信息
    作者简介:

    刘建鑫。主要研究方向:芍药资源与育种。Email:jianxinliu@hotmail.com  地址:100083  北京市海淀区清华东路35号北京林业大学园林学院

    通讯作者:

    于晓南,博士,教授。主要研究方向:园林植物资源与育种。Email:yuxiaonan626@126.com  地址:同上

  • 中图分类号: S682.1+2

Intrasectional and intersectional cross breeding of Paeonia and karyotype analysis and SSR identification of some hybrids

  • 摘要: 以芍药品种‘朱砂判’为母本,分别与6个芍药组品种和4个牡丹组品种进行杂交,并综合利用核型分析和SSR分子标记法对部分杂交后代进行杂种鉴定,筛选出亲和性较好的远缘杂交组合,并确定杂交后代早期鉴定方法,为芍药属新品种培育提供参考。结果表明:1)芍药组内近缘杂交亲和性好,平均结实率均在5粒/朵以上;芍药组内远缘杂交亲和性较差,但仍有一定结实;芍药组间远缘杂交表现出不亲和性,仅杂交组合‘朱砂判’בDao Da Chen’有较少结实。2)核型分析表明:组内远缘杂交后代ZC4、ZC5、ZC6、ZC7为三倍体(2n=3x=15);从50对芍药SSR引物中筛选出7对多态性引物进行扩增,结果显示杂交后代ZC4、ZC5、ZC6、ZC7含有父母本特异性条带,结合核型分析证明ZC4、ZC5、ZC6、ZC7为真杂种。以上结果表明:组内远缘杂交中‘朱砂判’与‘Garden Peace’、‘Pink Teacup’、‘Cream Delight’杂交均有一定结实,组间远缘杂交中‘朱砂判’בDao Da Chen’可打破杂交不亲和性;SSR分子标记技术可用于芍药属植物杂交后代的早期鉴定。
  • 图  1  ‘朱砂判’בCream Delight’杂种后代早期形态图

    Figure  1.  Early morphology of 'Zhu Sha Pan'× 'Cream Delight' hybrids

    图  2  亲本及杂交后代的染色体核型和模式图(‘朱砂判’בCream Delight’)

    Figure  2.  Chromosome karyotypes and idiograms of hybrids and their parents ('Zhu Sha Pan'× 'Cream Delight')

    图  3  引物S3、55、S16荧光检测图

    荧光检测图顺序对应表 5中的编号

    Figure  3.  Fluorescence detection figures by primer S3, 55, S16

    No. corresponding to the No. in Tab. 5

    表  1  父本基本信息

    Table  1.   Basic information of male parent

    杂交类型
    Hybrid type
    父本
    Male parent
    品种群
    Cultivar group
    花型
    Flower type
    花色
    Flower color
    组内近缘杂交
    Hybridization in Lactiflora group
    ‘Kansas’中国芍药品种群
    Lactiflora group
    皇冠型
    Crown type
    红色
    Red
    ‘Taff’中国芍药品种群Lactiflora group皇冠型
    Crown type
    粉色
    Pink
    ‘Karl Rosenfield’中国芍药品种群
    Lactiflora group
    菊花型
    Chrysanthemum type
    紫红色
    Purple
    组内远缘杂交Interspecific hybridization in sect. Paeonia‘Garden Peace’杂种芍药品种群Hybrid group单瓣型
    Single type
    白色
    White
    ‘Pink Teacup’杂种芍药品种群Hybrid group单瓣型
    Single type
    奶油粉
    Cream pink
    ‘Cream Delight’杂种芍药品种群Hybrid group单瓣型
    Single type
    奶油色
    Cream
    组间远缘杂交
    Intersectional hybridization
    ‘凤丹白’‘Feng Dan Bai’凤丹品种群
    Feng Dan cultivar group
    单瓣型
    Single type
    白色
    White
    ‘姚黄’ ‘Yao Huang’中原牡丹品种群
    Zhongyuan cultivar group
    皇冠型
    Crown type
    淡黄色
    Light yellow
    ‘High Noon’Lemoine系
    Lemoine strain
    荷花型
    Lotus type
    黄色
    Yellow
    ‘Dao Da Chen’日本牡丹品种群
    Japanese cultivar group
    菊花型
    Chrysanthemum type
    蓝紫色
    Blue-pruple
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    表  2  杂交结实统计

    Table  2.   Seed-set of different cross combinations

    杂交类型
    Hybrid type
    母本
    Female parent
    父本
    Male parent
    授粉花朵数
    Number of pollinated flower
    结籽数
    Total number of seed
    单花结籽数
    Seed number per flower
    组内近缘杂交
    Hybridization in Lactiflora group
    ‘朱砂判’‘Zhu Sha Pan’‘Kansas’301735.77
    ‘朱砂判’‘Zhu Sha Pan’‘Taff’362045.67
    ‘朱砂判’‘Zhu Sha Pan’‘Karl Rosenfield’271595.89
    组内远缘杂交Interspecific hybridization in sect. Paeonia‘朱砂判’‘Zhu Sha Pan’‘Garden Peace’21291.38
    ‘朱砂判’‘Zhu Sha Pan’‘Pink Teacup’22492.23
    ‘朱砂判’‘Zhu Sha Pan’‘Cream Delight’128790.62
    组间杂交
    Intersectional hybridization
    ‘朱砂判’‘Zhu Sha Pan’‘凤丹白’‘Feng Dan Bai’5000
    ‘朱砂判’‘Zhu Sha Pan’‘姚黄’‘Yao Huang’5000
    ‘朱砂判’‘Zhu Sha Pan’‘High Noon’5100
    ‘朱砂判’‘Zhu Sha Pan’‘Dao Da Chen’3390.27
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    表  3  亲本和杂交后代的核型参数(‘朱砂判’× ‘Cream Delight’)

    Table  3.   Chromosome parameters of parents and progenies ('Zhu Sha Pan'× 'Cream Delight')

    品种
    Cultivar
    相对长度
    Relative length/%
    臂比值
    Arm ratio
    最长染色体/最短染色体
    The longest chromosome/The shortest chromosome
    核不对称系数
    Asymmetry index/%
    着丝粒指数
    Centromere/%
    核型分类
    Karyotype
    核型公式
    Formula of karyotype
    ‘朱砂判’‘Zhu Sha Pan’16.40~25.021.28~5.001.5363.7116.67~43.782A2n=2x=10=6m+2sm+2st
    ‘Cream Delight’15.23~23.611.17~3.661.5559.9821.48~46.012A2n=4x=20=12m+4sm+4st
    ZC115.22~26.111.10~3.001.7259.1925.00~49.462A2n=2x=10=6m+2sm+2st
    ZC216.03~24.391.42~4.641.5262.1817.72~46.562A2n=2x=10=6m+2sm+2st
    ZC315.96~24.201.34~3.981.5261.9720.09~44.942A2n=2x=10=6m+2sm+2st
    ZC417.68~23.811.23~4.231.3561.6119.11~44.932A2n=3x=15=9m+3sm+3st
    ZC514.87~25.681.35~4.741.7362.6117.42~45.692A2n=3x=15=9m+3sm+3st
    ZC616.24~24.801.22~3.601.5362.4121.73~45.052A2n=3x=15=9m+3sm+3st
    ZC712.38~27.331.33~3.332.2162.7223.12~42.912B2n=3x=15=9m+3sm+3st
    注:m代表染色体臂比值为1.01~1.70;sm代表染色体臂比值为1.71~3.00;st代表染色体臂比值为3.01~7.00。Notes:metacentric (m):the arm ratio of each chromosome is from 1.01 to 1.70; submetacentric (sm):the arm ratio of each chromosome is from 1.71 to 3.00; subtelocentric (st):the arm ratio of each chromosomes is from 3.01 to 7.00.
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    表  4  SSR多态性引物

    Table  4.   SSR primers of Paeonia lactiflora

    引物(序列符号)
    Primer sequence(No.)
    序列(5′-3′)
    Primer sequence (5′-3′)
    重复基序
    Repeat motif
    目的片段
    Target fragment/bp
    退火温度Annealing temperature/℃
    44F  CACAATCAAAGTTTAAAGTGGTGATGT
    R CGTAGATGAGCACTTGTATTCTTCCT
    (AG)13A29358
    45F  GGAAAGGAGAAAGAGGACACTCA
    R  CACATCGGGATTTGTTAGCG
    (AC)20(TA)929255
    55F  CCAGTTATGGCGTCGTCTACTCTT
    R  GGAAAGGAAGGCAAGCTGATG
    (CT)1321357
    S3 (CL1109Contig1)F  CCCTCCCTTTCTTCACTTCC
    R  TTGAAACCCTAAACCCACCA
    (CT)822755
    S8 (CL17410Contig1)F  GAATCCACGAAAAATACGCA
    R  AGCGGGATGTAACCCTTCTT
    (AG)1225453
    S16 (CL25347Contig1)F  TTGAACAGCATTTGCACCTC
    R  ATGCGCTCTCTCTGTTTGGT
    (AT)824554
    S30(CL9771Contig1)F  TGAAAGGTGCACCATCAAAA
    R  ACGATCCCTCCTTTTCCATT
    (AG)924352
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    表  5  亲本和杂交后代经7对SSR多态性引物扩增结果

    Table  5.   Amplified results of hybrids and their parents by 7 SSR primers

    品种
    Cultivar
    引物Primer
    444555S3S8S16S30
    ‘朱砂判’‘Zhu Sha Pan’282, 286270, 286220, 224228, 238208255, 275243
    ‘Cream Delight’282, 296262, 270, 272, 286224, 226228, 238156, 208245, 255, 273, 275243, 247
    ZC1282270224, 226232, 238208255, 275243
    ZC2282, 286286, 288214, 224228, 238208245243
    ZC3282, 286286214, 224228, 238208245243, 247
    ZC4282, 294270224, 226228156, 208273, 275243
    ZC5282, 286270224, 226228156, 208273, 275243
    ZC6282, 286286220, 224228208255243
    ZC7282, 286262, 286220, 224228, 238208273, 275243
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出版历程
  • 收稿日期:  2016-05-27
  • 修回日期:  2016-11-11
  • 刊出日期:  2017-04-01

芍药属组内组间杂交及部分后代核型分析与SSR鉴定

doi: 10.13332/j.1000-1522.20160181
    基金项目:

    国家自然科学基金项目 31400591

    北京市教育委员会科学研究与研究生培养共建项目 BLCXY201629

    作者简介:

    刘建鑫。主要研究方向:芍药资源与育种。Email:jianxinliu@hotmail.com  地址:100083  北京市海淀区清华东路35号北京林业大学园林学院

    通讯作者: 于晓南,博士,教授。主要研究方向:园林植物资源与育种。Email:yuxiaonan626@126.com  地址:同上
  • 中图分类号: S682.1+2

摘要: 以芍药品种‘朱砂判’为母本,分别与6个芍药组品种和4个牡丹组品种进行杂交,并综合利用核型分析和SSR分子标记法对部分杂交后代进行杂种鉴定,筛选出亲和性较好的远缘杂交组合,并确定杂交后代早期鉴定方法,为芍药属新品种培育提供参考。结果表明:1)芍药组内近缘杂交亲和性好,平均结实率均在5粒/朵以上;芍药组内远缘杂交亲和性较差,但仍有一定结实;芍药组间远缘杂交表现出不亲和性,仅杂交组合‘朱砂判’בDao Da Chen’有较少结实。2)核型分析表明:组内远缘杂交后代ZC4、ZC5、ZC6、ZC7为三倍体(2n=3x=15);从50对芍药SSR引物中筛选出7对多态性引物进行扩增,结果显示杂交后代ZC4、ZC5、ZC6、ZC7含有父母本特异性条带,结合核型分析证明ZC4、ZC5、ZC6、ZC7为真杂种。以上结果表明:组内远缘杂交中‘朱砂判’与‘Garden Peace’、‘Pink Teacup’、‘Cream Delight’杂交均有一定结实,组间远缘杂交中‘朱砂判’בDao Da Chen’可打破杂交不亲和性;SSR分子标记技术可用于芍药属植物杂交后代的早期鉴定。

English Abstract

刘建鑫, 杨柳慧, 魏冬霞, 于晓南. 芍药属组内组间杂交及部分后代核型分析与SSR鉴定[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(4): 72-78. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160181
引用本文: 刘建鑫, 杨柳慧, 魏冬霞, 于晓南. 芍药属组内组间杂交及部分后代核型分析与SSR鉴定[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(4): 72-78. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160181
LIU Jian-xin, YANG Liu-hui, WEI Dong-xia, YU Xiao-nan. Intrasectional and intersectional cross breeding of Paeonia and karyotype analysis and SSR identification of some hybrids[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(4): 72-78. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160181
Citation: LIU Jian-xin, YANG Liu-hui, WEI Dong-xia, YU Xiao-nan. Intrasectional and intersectional cross breeding of Paeonia and karyotype analysis and SSR identification of some hybrids[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(4): 72-78. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160181
  • 芍药科(Paeoniaceae)芍药属(Paeonia)分为3个组,即牡丹组(Sect. Moutan)、芍药组(Sect. Paeonia)和北美芍药组(Sect. Onaepia)[1]。我国是芍药属植物的重要分布中心,拥有大量的种质资源,但育种工作相对滞后,而且多数品种存在花头下垂、花期短而集中的问题[2]。杂交育种是实现园林植物种质创新的有效途径,尤其是远缘杂交,可以打破种、属间的杂交障碍以扩大遗传变异的范围,把不同种、属优良性状结合起来创造出新的变异类群或新的物种[3]。芍药组内由多种芍药共同参与杂交形成的杂种芍药品种群(Hybrid group),其花色和叶色鲜艳、花型丰富、花头直立,并且大部分品种单枝单花[4]。牡丹组与芍药组间远缘杂交形成的伊藤杂种(Itoh group),具有牡丹的形态特征和芍药的生长习性,被形象地比喻为牡丹的花开在了芍药的植株上。其植株形态优美、茎杆挺拔、花头直立、花色丰富,且多数含有一定的黄色,花期介于牡丹与芍药之间;抗性强——比牡丹和芍药都要耐寒,被认为是芍药属的未来[5]。目前,已登录的组间杂种主要是以‘Martha Washington’、‘Kakoden’为母本,以‘Golden Era’、‘Alice Harding’为父本的杂交后代[6]。因此,筛选优良父母本及亲和性较高的杂交组合进行远缘杂交,可产生丰富的变异,是培育新品种的良好途径。

    芍药属植物从获得杂交苗,至第一次开花至少需要3~5年时间;再至性状稳定申请新品种则需要更长的时间。因此,进行杂种苗的早期鉴定,尽早淘汰假杂种苗,减少人力、物力至关重要。目前,杂种鉴定方法主要有形态学鉴定、细胞学鉴定和分子标记等。形态学鉴定法比较直观、经济,但容易受到环境的影响[7]。对于亲本倍性不同的杂交组合,利用核型分析法可以快速区分真假杂种[8-10]。近年来,快速发展的分子标记技术逐渐应用于亲子代的鉴定,尤其是SSR分子标记,因其具有分布广泛、均匀,变异丰富、多态性好,共显性等优点,已被广泛应用于杂种鉴定中[11-16]

    本研究以1个芍药组的品种为母本,以6个芍药组的品种和4个牡丹组的品种为父本进行杂交育种。所涉及的组内近缘杂交组合包括中国芍药品种群不同品种间杂交;组内远缘杂交组合包括中国芍药品种群品种与杂种芍药品种群品种间杂交;组间远缘杂交组合是以中国芍药品种群品种为母本、以牡丹品种为父本进行杂交。其目的是以改良国内芍药的观赏性状,筛选出亲和性较高的远缘杂交组合,并综合利用核型分析和SSR分子标记技术对杂交组合杂交后代进行杂种鉴定。

    • 试验材料均保存于国家花卉工程技术研究中心北京市小汤山苗圃,母本均为‘朱砂判’,花型为皇冠型,花色为玫瑰紫,父本基本信息见表 1

      表 1  父本基本信息

      Table 1.  Basic information of male parent

      杂交类型
      Hybrid type
      父本
      Male parent
      品种群
      Cultivar group
      花型
      Flower type
      花色
      Flower color
      组内近缘杂交
      Hybridization in Lactiflora group
      ‘Kansas’中国芍药品种群
      Lactiflora group
      皇冠型
      Crown type
      红色
      Red
      ‘Taff’中国芍药品种群Lactiflora group皇冠型
      Crown type
      粉色
      Pink
      ‘Karl Rosenfield’中国芍药品种群
      Lactiflora group
      菊花型
      Chrysanthemum type
      紫红色
      Purple
      组内远缘杂交Interspecific hybridization in sect. Paeonia‘Garden Peace’杂种芍药品种群Hybrid group单瓣型
      Single type
      白色
      White
      ‘Pink Teacup’杂种芍药品种群Hybrid group单瓣型
      Single type
      奶油粉
      Cream pink
      ‘Cream Delight’杂种芍药品种群Hybrid group单瓣型
      Single type
      奶油色
      Cream
      组间远缘杂交
      Intersectional hybridization
      ‘凤丹白’‘Feng Dan Bai’凤丹品种群
      Feng Dan cultivar group
      单瓣型
      Single type
      白色
      White
      ‘姚黄’ ‘Yao Huang’中原牡丹品种群
      Zhongyuan cultivar group
      皇冠型
      Crown type
      淡黄色
      Light yellow
      ‘High Noon’Lemoine系
      Lemoine strain
      荷花型
      Lotus type
      黄色
      Yellow
      ‘Dao Da Chen’日本牡丹品种群
      Japanese cultivar group
      菊花型
      Chrysanthemum type
      蓝紫色
      Blue-pruple
    • 本试验于2015年4—6月在国家花卉工程技术研究中心北京市小汤山苗圃进行。当父本花蕾透色时采集花粉,在干燥、通风、避光环境下阴干24h,轻拍花药使花粉散出,然后装入干净的小瓶中,贴上标签置于-20 ℃冰箱中贮藏备用。选择生长健壮的植株作母本,在花蕾透色期去除雄蕊,用硫酸袋套袋,袋口用回形针扎紧。套袋3~4d柱头开始分泌黏液时,于晴天上午09:00—11:00进行授粉1次,连续重复授粉3 d。7—8月份,当蓇葖果变为蟹黄色且微裂时收集种子,计数并进行统计分析。

    • 核型分析材料的选取和处理参照马慧等[17]的方法。核型分析参照李懋学等[18]的标准;核型分类依据Stebbins[19]的标准;核不对称系数采用Arano[20]的方法计算;参照Guo[21]的方法计算染色体相对长度。

    • DNA提取:采集亲本及子代的嫩叶,装入含硅胶的自封袋中,置于-20 ℃冰箱中贮藏备用。采用TIANGEN新型植物基因组DNA提取试剂盒(DP320)提取基因组DNA。

      PCR扩增:用50对芍药SSR引物对亲本进行PCR扩增(部分引物来自文献[22],部分来自转录组),筛选出7对多态性SSR引物。对7对多态性SSR引物进行荧光标记,以亲本及子代基因组DNA为模板,进行PCR扩增。PCR反应体系及扩增条件参照张建军等[23]的方法。扩增产物在ABI3730全自动DNA遗传分析仪上检测。荧光引物合成及PCR扩增产物的检测均由北京睿博兴科生物技术有限公司完成。利用GeneMarker软件进行数据分析与数据采集。

    • 在组内近缘杂交组合中,由于亲缘关系较近,表现出较高的亲和性。‘Kansas’、‘Taff’和‘Karl Rosenfield’作父本时,平均结实率均达到了5粒/朵以上(表 2)。组内远缘杂交组合中,则表现出较低的亲和性。‘Pink Teacup’作父本时,平均结实率为2.23粒/朵;而‘Cream Delight’作父本时,平均结实率仅为0.62粒/朵,说明与‘朱砂判’的亲缘关系较远。在组间远缘杂交组合中,仅有‘Dao Da Chen’作父本时有结实,平均结实率为0.27粒/朵;其他组合均未结实,表现出远缘杂交不亲和性。

      表 2  杂交结实统计

      Table 2.  Seed-set of different cross combinations

      杂交类型
      Hybrid type
      母本
      Female parent
      父本
      Male parent
      授粉花朵数
      Number of pollinated flower
      结籽数
      Total number of seed
      单花结籽数
      Seed number per flower
      组内近缘杂交
      Hybridization in Lactiflora group
      ‘朱砂判’‘Zhu Sha Pan’‘Kansas’301735.77
      ‘朱砂判’‘Zhu Sha Pan’‘Taff’362045.67
      ‘朱砂判’‘Zhu Sha Pan’‘Karl Rosenfield’271595.89
      组内远缘杂交Interspecific hybridization in sect. Paeonia‘朱砂判’‘Zhu Sha Pan’‘Garden Peace’21291.38
      ‘朱砂判’‘Zhu Sha Pan’‘Pink Teacup’22492.23
      ‘朱砂判’‘Zhu Sha Pan’‘Cream Delight’128790.62
      组间杂交
      Intersectional hybridization
      ‘朱砂判’‘Zhu Sha Pan’‘凤丹白’‘Feng Dan Bai’5000
      ‘朱砂判’‘Zhu Sha Pan’‘姚黄’‘Yao Huang’5000
      ‘朱砂判’‘Zhu Sha Pan’‘High Noon’5100
      ‘朱砂判’‘Zhu Sha Pan’‘Dao Da Chen’3390.27
    • 杂交组合父母本倍性不同,可以通过核型鉴定的方法对杂种后代进行倍性鉴定,判断其倍性是否发生变化[8]。‘朱砂判’体细胞染色体数2n=2x=10,为二倍体,‘Cream Delight’体细胞染色体数2n=4x=20,为四倍体。本文对‘朱砂判’בCream delight’杂交组合的7株杂交小苗(见图 1)进行核型分析(以下简称ZC,并从1~7进行编号)。

      图  1  ‘朱砂判’בCream Delight’杂种后代早期形态图

      Figure 1.  Early morphology of 'Zhu Sha Pan'× 'Cream Delight' hybrids

      ‘朱砂判’בCream delight’杂交组合父母本及杂交后代核型分析结果见表 3,核型和核型模式图见图 2。由表 3可以看出:杂交后代ZC1、ZC2、ZC3为二倍体(2n=2x=10),ZC4、ZC5、ZC6、ZC7为三倍体(2n=3x=15);初步确定ZC4、ZC5、ZC6、ZC7为真杂种,ZC1、ZC2、ZC3为假杂种。ZC4、ZC5、ZC6、ZC7的染色体相对长度、臂比值、核不对称系数和着丝粒指数均介于父母本之间。ZC4、ZC5、ZC6的核型均为2A型,与父母本相同,而ZC7为2B型。

      表 3  亲本和杂交后代的核型参数(‘朱砂判’× ‘Cream Delight’)

      Table 3.  Chromosome parameters of parents and progenies ('Zhu Sha Pan'× 'Cream Delight')

      品种
      Cultivar
      相对长度
      Relative length/%
      臂比值
      Arm ratio
      最长染色体/最短染色体
      The longest chromosome/The shortest chromosome
      核不对称系数
      Asymmetry index/%
      着丝粒指数
      Centromere/%
      核型分类
      Karyotype
      核型公式
      Formula of karyotype
      ‘朱砂判’‘Zhu Sha Pan’16.40~25.021.28~5.001.5363.7116.67~43.782A2n=2x=10=6m+2sm+2st
      ‘Cream Delight’15.23~23.611.17~3.661.5559.9821.48~46.012A2n=4x=20=12m+4sm+4st
      ZC115.22~26.111.10~3.001.7259.1925.00~49.462A2n=2x=10=6m+2sm+2st
      ZC216.03~24.391.42~4.641.5262.1817.72~46.562A2n=2x=10=6m+2sm+2st
      ZC315.96~24.201.34~3.981.5261.9720.09~44.942A2n=2x=10=6m+2sm+2st
      ZC417.68~23.811.23~4.231.3561.6119.11~44.932A2n=3x=15=9m+3sm+3st
      ZC514.87~25.681.35~4.741.7362.6117.42~45.692A2n=3x=15=9m+3sm+3st
      ZC616.24~24.801.22~3.601.5362.4121.73~45.052A2n=3x=15=9m+3sm+3st
      ZC712.38~27.331.33~3.332.2162.7223.12~42.912B2n=3x=15=9m+3sm+3st
      注:m代表染色体臂比值为1.01~1.70;sm代表染色体臂比值为1.71~3.00;st代表染色体臂比值为3.01~7.00。Notes:metacentric (m):the arm ratio of each chromosome is from 1.01 to 1.70; submetacentric (sm):the arm ratio of each chromosome is from 1.71 to 3.00; subtelocentric (st):the arm ratio of each chromosomes is from 3.01 to 7.00.

      图  2  亲本及杂交后代的染色体核型和模式图(‘朱砂判’בCream Delight’)

      Figure 2.  Chromosome karyotypes and idiograms of hybrids and their parents ('Zhu Sha Pan'× 'Cream Delight')

    • 利用聚丙烯酰氨凝胶电泳对芍药50对引物进行筛选,选出7对具有多态性条带的引物(表 4)。

      表 4  SSR多态性引物

      Table 4.  SSR primers of Paeonia lactiflora

      引物(序列符号)
      Primer sequence(No.)
      序列(5′-3′)
      Primer sequence (5′-3′)
      重复基序
      Repeat motif
      目的片段
      Target fragment/bp
      退火温度Annealing temperature/℃
      44F  CACAATCAAAGTTTAAAGTGGTGATGT
      R CGTAGATGAGCACTTGTATTCTTCCT
      (AG)13A29358
      45F  GGAAAGGAGAAAGAGGACACTCA
      R  CACATCGGGATTTGTTAGCG
      (AC)20(TA)929255
      55F  CCAGTTATGGCGTCGTCTACTCTT
      R  GGAAAGGAAGGCAAGCTGATG
      (CT)1321357
      S3 (CL1109Contig1)F  CCCTCCCTTTCTTCACTTCC
      R  TTGAAACCCTAAACCCACCA
      (CT)822755
      S8 (CL17410Contig1)F  GAATCCACGAAAAATACGCA
      R  AGCGGGATGTAACCCTTCTT
      (AG)1225453
      S16 (CL25347Contig1)F  TTGAACAGCATTTGCACCTC
      R  ATGCGCTCTCTCTGTTTGGT
      (AT)824554
      S30(CL9771Contig1)F  TGAAAGGTGCACCATCAAAA
      R  ACGATCCCTCCTTTTCCATT
      (AG)924352

      表 5可知:经7对SSR引物扩增,杂交后代ZC4、ZC5、ZC6、ZC7含有父母本特异性条带,确定为真杂种,并且ZC4、ZC5、ZC6、ZC7所获得的父母本条带存在差异,具有丰富的遗传多样性;杂交后代ZC1在引物S3中出现了父母本都没有的特异性条带(232 bp);ZC2、ZC3在引物55中出现了父母本都没有的特异性条带(214 bp),在引物S16中则只遗传了父本中的一条特异性条带(245 bp)。所以,判定ZC1、ZC2、ZC3为假杂种,与核型分析结果一致。图 3为扩增电泳照片。

      表 5  亲本和杂交后代经7对SSR多态性引物扩增结果

      Table 5.  Amplified results of hybrids and their parents by 7 SSR primers

      品种
      Cultivar
      引物Primer
      444555S3S8S16S30
      ‘朱砂判’‘Zhu Sha Pan’282, 286270, 286220, 224228, 238208255, 275243
      ‘Cream Delight’282, 296262, 270, 272, 286224, 226228, 238156, 208245, 255, 273, 275243, 247
      ZC1282270224, 226232, 238208255, 275243
      ZC2282, 286286, 288214, 224228, 238208245243
      ZC3282, 286286214, 224228, 238208245243, 247
      ZC4282, 294270224, 226228156, 208273, 275243
      ZC5282, 286270224, 226228156, 208273, 275243
      ZC6282, 286286220, 224228208255243
      ZC7282, 286262, 286220, 224228, 238208273, 275243

      图  3  引物S3、55、S16荧光检测图

      Figure 3.  Fluorescence detection figures by primer S3, 55, S16

    • 国内芍药品种主要是芍药(Paeonia lactiflora)种源下不同品种间长期反复杂交形成的,遗传变异相对较少,无法产生更多新颖的变异。远缘杂交可以将不同种的优良性状结合起来,创造更丰富的变异类型。由多种芍药共同参与杂交形成的杂种芍药品种群(Hybrid Group)花色鲜艳,花型丰富,对环境适应性强,观赏价值高,表现出较强的杂种优势。杂种芍药品种群中‘Age of Victoria’、‘Early Glow’就是以‘Cream Delight’为父本杂交培育而成,‘Arctic Moon’则是以‘Cream Delight’为母本培育而成。牡丹组与芍药组间杂交获得的伊藤杂种(Itoh Group),被认为是芍药属的未来。但并不是所有杂交组合都有亲和性。本试验芍药组间远缘杂交组合中的‘朱砂判’、‘凤丹白’、‘High Noon’和‘姚黄’均未结实。张栋[24]以芍药品种‘Martha Washington’为母本,与‘凤丹白’杂交时有少量结实,与‘High Noon’杂交时基本无结实。王越岚[25]以芍药(P. lactiflora)为母本,与‘凤丹白’杂交时没有结实,与‘姚黄’、‘High Noon’杂交时有一定结实。说明母本不同,亲和性不同,从而导致结实上的差异。‘High Noon’是远缘杂交种,有性生殖败育是其作为亲本进行杂交育种的最大障碍。本试验中‘朱砂判’与‘Garden Peace’、‘Pink Teacup’、‘Cream Delight’、‘Dao Da Chen’均有一定结实,可以在以后杂交中推广。

      通过形态学标记、细胞学标记和SSR分子标记等可以对杂种进行鉴定,不同的鉴定方法存在各自的优缺点。形态学标记由于受到生长周期以及形态指标选取主观性的影响,无法在短时间内进行准确的鉴定。细胞学标记虽然可以快速精准地对杂交苗的细胞核染色体数目进行鉴定,但是只能用于父母本倍性不同的品种,具有一定的局限性。随着分子生物学的发展,从DNA水平直接进行杂种的鉴定具有越来越广阔的前景,特别适用于在苗期及早确定杂种的真实性,可以极大地提高育种效率。

参考文献 (25)

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