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红松松针精油抗氧化和抑菌活性研究

樊梓鸾 张艳东 张华 王振宇 包怡红

樊梓鸾, 张艳东, 张华, 王振宇, 包怡红. 红松松针精油抗氧化和抑菌活性研究[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(8): 98-103. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160265
引用本文: 樊梓鸾, 张艳东, 张华, 王振宇, 包怡红. 红松松针精油抗氧化和抑菌活性研究[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(8): 98-103. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160265
FAN Zi-luan, ZHANG Yan-dong, ZHANG Hua, WANG Zhen-yu, BAO Yi-hong. Antioxidant and antibacterial activity of essential oil from Pinus koraiensis needles[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(8): 98-103. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160265
Citation: FAN Zi-luan, ZHANG Yan-dong, ZHANG Hua, WANG Zhen-yu, BAO Yi-hong. Antioxidant and antibacterial activity of essential oil from Pinus koraiensis needles[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(8): 98-103. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160265

红松松针精油抗氧化和抑菌活性研究

doi: 10.13332/j.1000-1522.20160265
基金项目: 

黑龙江省科学自然基金项目 QC2016021

中央高校科学前沿与交叉学科创新基金项目 2572016CA06

中央高校基本科研业务费专项 2572014EA02-4

国家自然科学基金项目 31170510

详细信息
    作者简介:

    樊梓鸾,博士,讲师。主要研究方向:天然产物分离纯化及功能活性评价。Email:fzl_1122@163.com  地址:150040 黑龙江省哈尔滨市香坊区和兴路26号东北林业大学林学院

    通讯作者:

    包怡红,博士,教授。主要研究方向:天然产物化学。Email:baoyihong@163.com   地址:同上

  • 中图分类号: S791.247; S789.4; TQ654+.2

Antioxidant and antibacterial activity of essential oil from Pinus koraiensis needles

  • 摘要: 本文以红松松针精油为研究对象,主要研究了红松松针精油的抗氧化和抑菌活性。通过对DPPH自由基、ABTS自由基、超氧阴离子(O2)自由基的清除活性以及总还原力探讨红松松针精油的抗氧化活性;以大肠杆菌、枯草芽胞杆菌和金黄色葡萄球菌为供试菌种,测定抑菌圈和最低抑菌浓度来研究红松松针精油的抑菌活性。实验结果显示:该精油对DPPH自由基、ABTS自由基、超氧阴离子(O2)自由基的半数清除率IC50值分别为4.24、4.46、3.26 mg/mL;精油对大肠杆菌、枯草芽胞杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈分别为(15.2±0.12) mm、(13.3±0.15) mm、(9.5±0.21)mm,最低抑菌质量浓度分别为1.26、2.50、5.00 μL/mL。实验结果证明,红松松针精油作为天然抗氧化、抑菌剂具有巨大的开发潜质。
  • 图  1  红松松针精油对DPPH自由基的清除能力

    Figure  1.  DPPH free radical-scavenging capability of essential oil from Pinus koraiensis needles

    图  2  红松松针精油对ABTS自由基的清除能力

    Figure  2.  ABTS free radical-scavenging capability of essential oil from Pinus koraiensis needles

    图  3  红松松针精油对超氧阴离子自由基的清除能力

    Figure  3.  Super oxide anion free radical-scavenging capability of essential oil from Pinus koraiensis needles

    图  4  总还原力的测定

    Figure  4.  Total reducing ability of essential oil from Pinus koraiensis needles

    图  5  红松松针精油对食源性微生物抑菌圈的大小对比

    Figure  5.  Comparison in the size of the inhibition zone of Pinus koraiensis needle essential oil against food-borne microorganisms

    表  1  红松松针精油抑菌圈实验结果

    Table  1.   Inhibition zone of the essential oil from Pinus koraiensis needles

    大肠杆菌
    Escherichia colia
    枯草芽胞杆菌
    Bacillus subtilis b
    金黄色葡萄球菌
    Staphylococcus aureus b
    丙酮
    acetone
    精油
    essential oil
    丙酮
    acetone
    精油
    essential oil
    丙酮
    acetone
    精油
    essential oil
    抑菌圈直径
    Diameter of the inhibition zone (d)/mm
    6.20±0.10 15.20±0.12 6.20±0.32 13.30±0.15 6.10±0.18 9.50±0.21
    注:a表示革兰氏阴性菌;b表示革兰氏阳性菌。Notes: a represents Gram-negative bacteria; b represents Gram-positive bacteria.
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    , 王瑛, 王华芳, 于京民2, 刘玉军, 尹伟伦, 王建中, 王晓楠, 张志翔, 孙建华, 张兴杰, 沈应柏, 李镇宇, 陈卫平, 张庆, 王民中, 王玉春, 丁霞, 林善枝, 刘艳, 李凤兰, 刘玉军, 呼晓姝, 陶凤杰, 杨伟光, 汪植, 蒋平, 马建海, 付瑞海, 赵新丽.  苹果多酚的超声波提取及抗氧化作用研究 . 北京林业大学学报, 2007, 29(5): 137-141.
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出版历程
  • 收稿日期:  2016-09-28
  • 修回日期:  2017-03-20
  • 刊出日期:  2017-08-01

红松松针精油抗氧化和抑菌活性研究

doi: 10.13332/j.1000-1522.20160265
    基金项目:

    黑龙江省科学自然基金项目 QC2016021

    中央高校科学前沿与交叉学科创新基金项目 2572016CA06

    中央高校基本科研业务费专项 2572014EA02-4

    国家自然科学基金项目 31170510

    作者简介:

    樊梓鸾,博士,讲师。主要研究方向:天然产物分离纯化及功能活性评价。Email:fzl_1122@163.com  地址:150040 黑龙江省哈尔滨市香坊区和兴路26号东北林业大学林学院

    通讯作者: 包怡红,博士,教授。主要研究方向:天然产物化学。Email:baoyihong@163.com   地址:同上
  • 中图分类号: S791.247; S789.4; TQ654+.2

摘要: 本文以红松松针精油为研究对象,主要研究了红松松针精油的抗氧化和抑菌活性。通过对DPPH自由基、ABTS自由基、超氧阴离子(O2)自由基的清除活性以及总还原力探讨红松松针精油的抗氧化活性;以大肠杆菌、枯草芽胞杆菌和金黄色葡萄球菌为供试菌种,测定抑菌圈和最低抑菌浓度来研究红松松针精油的抑菌活性。实验结果显示:该精油对DPPH自由基、ABTS自由基、超氧阴离子(O2)自由基的半数清除率IC50值分别为4.24、4.46、3.26 mg/mL;精油对大肠杆菌、枯草芽胞杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈分别为(15.2±0.12) mm、(13.3±0.15) mm、(9.5±0.21)mm,最低抑菌质量浓度分别为1.26、2.50、5.00 μL/mL。实验结果证明,红松松针精油作为天然抗氧化、抑菌剂具有巨大的开发潜质。

English Abstract

樊梓鸾, 张艳东, 张华, 王振宇, 包怡红. 红松松针精油抗氧化和抑菌活性研究[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(8): 98-103. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160265
引用本文: 樊梓鸾, 张艳东, 张华, 王振宇, 包怡红. 红松松针精油抗氧化和抑菌活性研究[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(8): 98-103. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160265
FAN Zi-luan, ZHANG Yan-dong, ZHANG Hua, WANG Zhen-yu, BAO Yi-hong. Antioxidant and antibacterial activity of essential oil from Pinus koraiensis needles[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(8): 98-103. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160265
Citation: FAN Zi-luan, ZHANG Yan-dong, ZHANG Hua, WANG Zhen-yu, BAO Yi-hong. Antioxidant and antibacterial activity of essential oil from Pinus koraiensis needles[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(8): 98-103. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160265
  • 氧化是食品加工和贮存中产生的一种生化反应,其可缩短产品的保质期,并导致风味、质地、颜色发生改变[1]。此外,氧化还不利于人类健康,许多活性氧中间体可以诱发多种疾病,包括癌症,心脏疾病,以及衰老[2]。微生物污染是另一个促进食品变质和促进食源性疾病发病率的因素[3]。据报道,引起微生物污染和对环境污染的食源性疾病的发病率将在全球范围增加[4]。虽然许多合成的抗氧化剂和防腐剂已在食品工业中被广泛使用,但是其安全性和对健康的潜在影响正在受到越来越多人的关注。所以,近期的许多研究都指向寻找天然活性成分[5]。红松(Pinus koraiensis)为松科(Pinaceae)松属的常绿乔木,是国家Ⅱ级重点保护野生植物,分布广,是东北地区主要的森林树种之一。红松松针中含有挥发油类、黄酮类、树脂、纤维素、木质素、叶绿素、胡萝卜素、维生素、微量元素等成分,其中松叶挥发油类有祛痰、健胃、驱风、解热、利尿、镇痛、抗菌、抗病毒等作用,可以用来治疗上呼吸道慢性感染[6]。国外的研究认为,松针中含有能够溶解人体老化的物质,它通过调整和促进身体组织机能,进而增进人体健康,而且松针还具有增强免疫力,提高抗病能力的作用[7]。在食品方面,精油可以制成防腐剂或者制成天然色素添加到食品中。在药学应用方面,精油具有抗肿瘤、抗氧化、降血脂等功效。在生活日用方面,精油可以调配成各式香水,护肤品,美容美发香波等,在化妆品和洗涤用品方面应用巨大[8]

    • 红松松针,采购于黑龙江省方正林业局。无水乙醇、氯化钠、氢氧化钠、硫酸亚铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、邻苯三酚、过硫酸钾、盐酸、抗坏血酸、牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉分析纯,国产;DPPH、ABTS、TRIS分析纯,美国Sigma公司。

    • DS-T100高速多功能粉碎机,上海市顶帅工贸有限公司;LT502E电子天平,常熟市天量仪器有限责任公司;98-1-B电子控温电热套,天津市泰斯特仪器有限公司;DL-1万用电炉,北京市永光明医疗仪器有限公司;T6新世纪紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;DK-8D电热恒温水槽,上海一恒科技有限公司;HZQ-X100振荡培养箱,中国哈尔滨市东明医疗仪器厂;TDL-5-W台式低速离心机,湖南星科科学仪器有限公司;YXQ-LS-18SI手提式压力蒸汽灭菌器,上海博讯实业有限公司医疗设备厂;SW-CJ-2F超净工作台,苏净集团安泰公司;EL20实验室pH计,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

    • 将松针洗净晾干,用高速万能粉碎机粉碎,过20目筛,备用。准确称取50 g松针,加400 mL蒸馏水,2%的NaCl,采用高剪切分散乳化机进行辅助提取5 min,将处理后的混合液放入1 000 mL圆底烧瓶内,连好蒸馏装置,共水蒸馏3 h,收集提取器中的精油,将溜出来的精油用无水硫酸钠吸收水分,最终得到淡黄色透明的纯净精油[9]

    • 参考符群等人[10]的方法,略有改动。配制0.1 mmol/L的DPPH无水乙醇溶液,量取3 mL于试管中,加入1 mL不同浓度的精油样液,立即混匀,于室温条件下避光放置30 min,于517 nm波长下测定吸光值A;以无水乙醇代替精油样液,测定吸光值A0。用相同浓度的抗坏血酸水溶液作为阳性对照,每组平行3次。DPPH自由基清除率的计算公式如下:

      $$ 清除率 = \frac{{{A_0} - A}}{{{A_0}}} \times 100\% $$ (1)
    • 参考Fan等人[11]的方法,略有改动。称取一定量的ABTS和过硫酸钾试剂,分别配成浓度为7.4和2.6 mmol/L的溶液,按体积比1:1混合,室温下避光静置12 h,制得ABTS自由基储备液,于4 ℃冰箱储存备用。用前用无水乙醇将ABTS自由基储备液稀释至吸光值为0.7±0.02。取精油样液1 mL于试管中,加入4.5 mL的ABTS储备液,立即混匀,室温下避光6 min,于734 nm条件下测定吸光值A;以无水乙醇代替精油样夜,测定吸光值A0。用相同浓度的抗坏血酸水溶液作为阳性对照,每组平行3次。ABTS自由基清除率的计算用式(1)。

    • 参考Adsare等人[12]的方法,略有改动。将1 mL不同浓度的精油样液分别与3 mL Tris-Hcl(50 mmol/L,pH8.2)混合,25 ℃保温10 min,立即加入1 mL 25 ℃预热的6 mmol/L邻苯三酚,迅速将其摇匀,于320 nm波长下每隔30 s测定其吸光值A;以无水乙醇代替精油样夜,测定其吸光值A0。用相同浓度的抗坏血酸水溶液作为阳性对照,每组平行3次。超氧阴离子(O2)自由基清除率计算公式如下:

      $$ 清除率 = \frac{{\Delta {A_0} - \Delta A}}{{\Delta {A_0}}} \times 100\% $$ (2)

      式中:ΔA0为邻苯三酚的自氧化速率,即未加样液时每分钟增加的吸光值;ΔA为加入样液后每分钟增加的吸光值。

    • 参考符群等[10]的方法,略有改动。将不同浓度的样液1 mL置于试管中,加入2.5 mL磷酸缓冲溶液(0.2 mmol/L,pH 6.6)和2.5 mL 1%的铁氰化钾溶液,混合均匀后于50 ℃水浴20 min,立即加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液终止反应,于3 000 r/min离心10 min。取上清液2.5 mL,加入2.5 mL蒸馏水和1 mL 0.1%的氯化铁溶液,混合均匀后静置10 min,于700 nm波长下测定吸光值。每组平行3次。

    • 液体培养基:称取牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g于1 000 mL蒸馏水中,加热溶解,用氢氧化钠溶液调节pH至7.4~7.6,分装于三角瓶中于121 ℃,20 min条件下高压灭菌。

      固体培养基:称取牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g于1 000 mL蒸馏水中,加热溶解,用氢氧化钠溶液调节pH至7.4~7.6,加入15 g琼脂粉,用万用电炉将其煮沸溶解,分装于三角瓶中于121 ℃高压灭菌20 min。

    • 取1 mL含菌种的甘油,无菌条件下接于150 mL液体培养基(已灭菌)中,于37 ℃恒温培养箱中培养24 h。将活化后的菌种在固体培养基中划线培养,37 ℃培养24 h,挑取单菌落接于250 mL已灭菌的液体培养基中,37 ℃培养24 h,制得实验用菌悬液。

    • 采用滤纸片法[13]。先在灭菌平皿中加入10 mL灭菌的琼脂培养基,待固体培养基灭菌后冷却到45 ℃左右,于无菌条件下将1 mL供试菌液加入其中,混合均匀,用已灭菌的移液管移取15 mL含供试菌种的培养基于已冷却的琼脂培养基上,使其均匀的平铺于培养皿中,待培养基冷却后,用无菌镊子夹取直径为6 mm的滤纸片(3片)于培养基上,用微量进样器吸取10 μL/mL的样液5 μL于滤纸片上,每个菌种作3组平行。对照组以5 μL丙酮代替样液。37 ℃培养24 h,测量抑菌圈的直径,求平均值。

    • 采用二倍稀释法[14]。取27支试管,每支试管中均加入4.5 mL液体培养基,平均分为3组,分别编号1~9,121 ℃高压灭菌20 min。在无菌条件下,向1~8号试管中各加入0.5 mL菌悬液,用微量进样器分别移取50、25、12.5、6.3、3.2、1.6、0.8、0 μL的精油加入1~8号试管中,9号试管作为空白对照于冰箱中冷藏,其余24支试管在37 ℃恒温振荡培养箱中培养24 h。根据试管内液体的浑浊度判定精油的MIC值(无细菌生长,液体澄清)。

    • DPPH自由基是一种稳定的自由基,在517 nm有强烈吸收峰,当接受电子或自由基时,由紫色变为黄色,吸光度降低,由于DPPH自由基能在较短时间内与很多样品融合并且对较低浓度样品也很敏感,因此广泛应用于水果和蔬菜汁或其提取物清除自由基能力的检测。

      图 1,红松松针精油对DPPH自由基的清除率随着精油质量浓度的增大而增大,具有明显的量效关系。当精油质量浓度为12 mg/mL时,对DPPH自由基的清除率可达到88.89%,而相同条件下,同等质量浓度的Vc对DPPH自由基的清除率可达93.6%。经过CalcuSyn Demo2.0分析,红松松针精油对DPPH自由基的半数清除率IC50为4.24 mg/mL,而相同条件下Vc的IC50为1.04 mg/mL。郑立辉等[15]对白芷(Angelica dahurica)精油的抗氧化活性进行了研究,结果表明白芷精油能明显地清除DPPH自由基,在精油质量浓度为32.93 mg/mL时清除率最大为95.09%。

      图  1  红松松针精油对DPPH自由基的清除能力

      Figure 1.  DPPH free radical-scavenging capability of essential oil from Pinus koraiensis needles

    • ABTS二铵盐与过硫酸钾反应生成蓝绿色ABTS+·,在734 nm处有强吸收。当加入自由基清除剂时,溶液颜色变浅,最大吸收波长处的吸收减弱,因此可根据吸光值的大小计算自由基的清除率。

      图 2,红松松针精油对ABTS自由基的清除率随着精油质量浓度的增大而增大,具有明显的量效关系。当精油质量浓度为12 mg/mL时,对ABTS自由基的清除率可达到86.89%,而相同条件下,同等质量浓度的Vc对ABTS自由基的清除率可达94.67%。经过CalcuSyn Demo2.0分析,红松松针精油对ABTS自由基的半数清除率IC50为4.46 mg/mL,而相同条件下Vc的IC50为0.59 mg/mL。

      图  2  红松松针精油对ABTS自由基的清除能力

      Figure 2.  ABTS free radical-scavenging capability of essential oil from Pinus koraiensis needles

    • 邻苯三酚在碱性条件下发生氧化链式反应,释放大量的O2,O2又进一步加速了邻苯三酚的氧化,生成一系列在可见光范围内有特征吸收的中间产物。自由基清除剂的加入可以清除产生的O2,抑制中间产物的生成,降低反应液在320 nm处的吸光值。

      图 3,红松松针精油对超氧阴离子(O2)自由基的清除率随着精油质量浓度的增大而增大,具有明显的量效关系。当精油质量浓度为12 mg/mL时,对超氧阴离子(O2)自由基的清除率可达到91.40%,而相同条件下,同等质量浓度的Vc对超氧阴离子(O2)自由基的清除率可达95.12%。经过CalcuSyn Demo2.0分析,红松松针精油对超氧阴离子(O2)自由基的半数清除率IC50为3.26 mg/mL,而相同条件下抗坏血酸的IC50为1.37 mg/mL。

      图  3  红松松针精油对超氧阴离子自由基的清除能力

      Figure 3.  Super oxide anion free radical-scavenging capability of essential oil from Pinus koraiensis needles

    • 当体系中存在还原性物质时,铁氰化钾被还原成亚铁氰化钾,亚铁氰化钾在酸性条件下与三氯化铁反应,生成普鲁士蓝,在700 nm处有最大吸收峰。故吸光值越大,反映样液的还原能力越强。

      图 4,随着精油浓度的增大,样液吸光值也越来越大,呈现良好的剂量关系,说明在一定范围内,精油的浓度越大总还原力越强。

      图  4  总还原力的测定

      Figure 4.  Total reducing ability of essential oil from Pinus koraiensis needles

    • 表 1所示,红松松针精油对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌均有良好的抑制作用,其中对大肠杆菌的抑菌圈直径为(15.2±0.12)mm,抑制作用最强,对枯草芽胞杆菌的抑菌圈直径为(13.3±0.15)mm,对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为(9.5±0.21)mm,抑制作用最弱。如图 5所示,可以直观看出红松松针精油和丙酮(空白对照)对3种供试菌种的抑菌效果。

      表 1  红松松针精油抑菌圈实验结果

      Table 1.  Inhibition zone of the essential oil from Pinus koraiensis needles

      大肠杆菌
      Escherichia colia
      枯草芽胞杆菌
      Bacillus subtilis b
      金黄色葡萄球菌
      Staphylococcus aureus b
      丙酮
      acetone
      精油
      essential oil
      丙酮
      acetone
      精油
      essential oil
      丙酮
      acetone
      精油
      essential oil
      抑菌圈直径
      Diameter of the inhibition zone (d)/mm
      6.20±0.10 15.20±0.12 6.20±0.32 13.30±0.15 6.10±0.18 9.50±0.21
      注:a表示革兰氏阴性菌;b表示革兰氏阳性菌。Notes: a represents Gram-negative bacteria; b represents Gram-positive bacteria.

      图  5  红松松针精油对食源性微生物抑菌圈的大小对比

      Figure 5.  Comparison in the size of the inhibition zone of Pinus koraiensis needle essential oil against food-borne microorganisms

    • MIC值是测定抗菌物质抗菌活性大小的一个指标。经实验测定,红松松针精油对大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌这3种供试菌种的最低抑菌质量浓度(MIC)分别为1.26、2.50、5.00 μL/mL。由此可见,红松松针精油对革兰氏阴性菌(大肠杆菌)的抑制效果要明显优于对革兰氏阳性菌(枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌)的抑制效果。

    • 本实验通过红松松针精油对DPPH自由基、ABTS自由基、超氧阴离子自由基的清除以及总还原力的测定,确定通过水蒸气蒸馏得到的红松松针精油确实具有一定的抗氧化活性,而且精油的浓度与自由基的清除率之间存在明显的量效关系,其半数清除率IC50值分别为4.24、4.46、3.26 mg/mL,略低于抗氧化剂Vc;通过精油对大肠杆菌、枯草芽胞杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈大小(15.20±0.12)、(13.30±0.15)、(9.50±0.21)mm,和最低抑菌质量浓度1.26、2.50、5.00 μL/mL可以看出,红松松针精油对3种供试菌种均具有一定的抑制作用,精油对大肠杆菌的抑制作用明显强于金黄色葡萄球菌。通过本实验证实,红松松针精油具有一定的抗氧化、抑菌活性,作为天然抗氧化、抑菌剂具有巨大的开发潜质。

参考文献 (15)

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