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草地早熟禾及其矮化突变材料锈病病原菌鉴定及抗病机制初探

甘露 苏浩天 凌欣闻 尹淑霞

甘露, 苏浩天, 凌欣闻, 尹淑霞. 草地早熟禾及其矮化突变材料锈病病原菌鉴定及抗病机制初探[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(3): 87-92. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160315
引用本文: 甘露, 苏浩天, 凌欣闻, 尹淑霞. 草地早熟禾及其矮化突变材料锈病病原菌鉴定及抗病机制初探[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(3): 87-92. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160315
GAN Lu, SU Hao-tian, LING Xin-wen, YIN Shu-xia. Rust pathogen identification and mechanism of disease-resistance research on Kentucky bluegrass dwarf mutant[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(3): 87-92. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160315
Citation: GAN Lu, SU Hao-tian, LING Xin-wen, YIN Shu-xia. Rust pathogen identification and mechanism of disease-resistance research on Kentucky bluegrass dwarf mutant[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(3): 87-92. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160315

草地早熟禾及其矮化突变材料锈病病原菌鉴定及抗病机制初探

doi: 10.13332/j.1000-1522.20160315
基金项目: 

国家自然科学基金项目 31302016

深圳市科技计划项目 JSGG20160229155434792

详细信息
    作者简介:

    甘露,博士生。主要研究方向:草坪草分子生理。Email:ganlu2016@bjfu.edu.cn  地址:100083  北京市海淀区清华东路35号北京林业大学草坪研究所

    通讯作者:

    尹淑霞,教授,博士生导师。主要研究方向:草坪科学与管理。Email: yinsx369@bjfu.edu.cn  地址:同上

  • 中图分类号: S688.4

Rust pathogen identification and mechanism of disease-resistance research on Kentucky bluegrass dwarf mutant

  • 摘要: 锈病是草坪草的重要病害,且病原菌种类多,鉴定困难。本研究以草地早熟禾野生型和矮化突变材料中的感病株系为对象,通过观察锈菌的形态特征,并结合ITS和β-tubulin基因序列分析,其中ITS序列的同源比对分析和β-tubulin基因的分子进化分析结果表明,该菌种与小麦禾柄锈菌的同源关系接近,所以初步认定该菌株属于禾柄锈菌,这是国内对禾柄锈菌引起草地早熟禾锈病的首次报道。同时,我们对病原菌诱导后草地早熟禾PR1LNPR1L基因的表达变化和PRs蛋白表达进行了研究,发现PR1LNPR1L基因在病菌诱导12 h时的表达量达到了峰值,且在矮化突变植株(A16)中的相对表达量分别达到了8.8-fold、4.5-fold,均大于在对照植株(WT)中的表达量。另外植物的PRs蛋白在禾柄锈菌侵染植物第8天后的表达量明显高于未侵染的植株。初步对草地早熟禾锈病的防御机制进行了探讨,为今后开展草地早熟禾锈病的预防及抗病育种研究奠定基础。
  • 图  1  感病植株的发病症状和锈菌菌株夏孢子形态的光学显微镜观察

    Figure  1.  Symptoms of Kentucky bluegrass leaves infected by urediospore of rust and morphological investigation of the urediospore under optical microscope

    图  2  供试菌株及Puccinia相关菌株β-tubulin基因的系统发育树

    候选锈菌菌株为供试材料的锈病病原菌。进化树右端的字母和数字代表GenBank中的序列号,分支上的数字代表自举的可信度,0.02为序列分歧度。

    Figure  2.  Phylogenetic tree of isolate strain and their relatives in Puccinia

    Putative Puccinia is the isolate rust strain. Numbers in parentheses represent the sequences' accession number in Gen Bank. The number at each branch points is the percentage supported by bootstrap. Bar, 2% sequence divergence.

    图  3  草地早熟禾及其矮化突变材料受禾柄锈菌侵染后PR1LNPR1L基因的表达变化情况

    Figure  3.  Expression pattern of PR1L, NPR1L induced by Puccinia graminis in Kentucky bluegrass wild type (WT) and its dwarf mutants (A16)

    图  4  草地早熟禾野生型(WT)及其矮化突变(A16)植株接种禾柄锈菌前后的病程相关蛋白电泳分析

    1.蛋白marker;2.未接种的WT样品;3.未接种的A16样品;4.接种后的A16样品;5.接种后的WT样品。

    Figure  4.  12% SDS-PAGE analysis of pathogenesis-related proteins extracted from leaves of WT and A16 inoculated with/without Puccinia graminis

    1, protein marker; 2, the A16 sample inoculated without Puccinia graminis; 3, the WT sample inoculated without Puccinia graminis; 4, the A16 sample inoculated with Puccinia graminis; 5, the WT sample inoculated with Puccinia graminis.

    表  1  实验所需引物的序列

    Table  1.   List of primer sequences used in this study

    引物名称
    Primer name
    引物序列
    Primer sequence(5′—3′)
    ITS1TCCGTAGGTGAACCTGCGG
    ITS4TCCTCCGCTTATTGATATGC
    Tubulin-FATGGAYTCGGTYCGATCTGGCG
    Tubulin-RCYTCTCCRGTGTACCAATGCAGG
    PR1L-qFCGCTACGCCCGCTCCC
    PR1L-qRGCCCCTCGTCCACCCA
    NPR1L-qFCAAGGAAGGGCAGACTAA
    NPR1L-qRGCAGCGATGTGAAGAACA
    Actin-qFTTGACTGAGAGGGGCT
    Actin-qRTCATACGGTCTGCGAT
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    表  2  草地早熟禾的抗病相关的候选基因筛选

    Table  2.   List of candidate disease-resistant gene studied in Kentucky bluegrass clones

    基因名称
    Gene ID
    候选基因注释
    Candidate gene annotation
    开放阅读框序列长度
    ORF length/bp
    同源基因编号
    GenBank accession of homologs
    同源物种
    Allied species
    PR1Lpathogenesis-related protein 1A-like552XM_004975168Setaria italica
    NPR1LNPR1-like 1 protein1 758JX424315硬粒小麦Triticum durum
    下载: 导出CSV
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出版历程
  • 收稿日期:  2016-09-29
  • 修回日期:  2016-11-19
  • 刊出日期:  2017-03-01

草地早熟禾及其矮化突变材料锈病病原菌鉴定及抗病机制初探

doi: 10.13332/j.1000-1522.20160315
    基金项目:

    国家自然科学基金项目 31302016

    深圳市科技计划项目 JSGG20160229155434792

    作者简介:

    甘露,博士生。主要研究方向:草坪草分子生理。Email:ganlu2016@bjfu.edu.cn  地址:100083  北京市海淀区清华东路35号北京林业大学草坪研究所

    通讯作者: 尹淑霞,教授,博士生导师。主要研究方向:草坪科学与管理。Email: yinsx369@bjfu.edu.cn  地址:同上
  • 中图分类号: S688.4

摘要: 锈病是草坪草的重要病害,且病原菌种类多,鉴定困难。本研究以草地早熟禾野生型和矮化突变材料中的感病株系为对象,通过观察锈菌的形态特征,并结合ITS和β-tubulin基因序列分析,其中ITS序列的同源比对分析和β-tubulin基因的分子进化分析结果表明,该菌种与小麦禾柄锈菌的同源关系接近,所以初步认定该菌株属于禾柄锈菌,这是国内对禾柄锈菌引起草地早熟禾锈病的首次报道。同时,我们对病原菌诱导后草地早熟禾PR1LNPR1L基因的表达变化和PRs蛋白表达进行了研究,发现PR1LNPR1L基因在病菌诱导12 h时的表达量达到了峰值,且在矮化突变植株(A16)中的相对表达量分别达到了8.8-fold、4.5-fold,均大于在对照植株(WT)中的表达量。另外植物的PRs蛋白在禾柄锈菌侵染植物第8天后的表达量明显高于未侵染的植株。初步对草地早熟禾锈病的防御机制进行了探讨,为今后开展草地早熟禾锈病的预防及抗病育种研究奠定基础。

English Abstract

甘露, 苏浩天, 凌欣闻, 尹淑霞. 草地早熟禾及其矮化突变材料锈病病原菌鉴定及抗病机制初探[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(3): 87-92. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160315
引用本文: 甘露, 苏浩天, 凌欣闻, 尹淑霞. 草地早熟禾及其矮化突变材料锈病病原菌鉴定及抗病机制初探[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(3): 87-92. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160315
GAN Lu, SU Hao-tian, LING Xin-wen, YIN Shu-xia. Rust pathogen identification and mechanism of disease-resistance research on Kentucky bluegrass dwarf mutant[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(3): 87-92. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160315
Citation: GAN Lu, SU Hao-tian, LING Xin-wen, YIN Shu-xia. Rust pathogen identification and mechanism of disease-resistance research on Kentucky bluegrass dwarf mutant[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(3): 87-92. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160315
  • 草坪草锈病种类很多,常发生的主要锈病有:条锈病、叶锈病、秆锈病和冠锈病以及一些其他禾草锈病。锈病分布广、危害重,其中以冷季型草中的多年生黑麦草(Lolium perenne)、高羊茅(Festuca arundinacea)和草地早熟禾(Poa pratensis),及暖季型草中的狗牙根(Cynodon dactylon)、结缕草(Zoysia japonica)受害最重[1]。锈菌主要危害叶片、叶鞘或茎秆,一旦环境适宜,传播较快,在感病部位生成鲜黄色至黄褐色的夏孢子堆,并在后期出现暗黑色至深褐色的冬孢子堆。草坪草感染锈病后光合作用降低、呼吸作用失调,叶片变黄枯死,草坪被破坏[2]

    冷季型草坪草锈病的主要病原物有:引起草地早熟禾、多年生黑麦草和高羊茅冠锈病[3-4]的病原物柄锈菌属的禾冠柄锈菌(Puccinia coronata),引起柄锈病[5]的病原物早熟禾柄锈菌(Puccinia poae-nemoralis);引起黑麦草锈病[5]的禾草叶褐锈病菌(Puccinia rubigo-vera);引起匍匐翦股颖锈病[6]的病原物翦股颖生柄锈菌(Puccinia agrostidicola);引起早熟禾、高羊茅、黑麦草和翦股颖叶锈病[7]的病原物小麦叶锈菌(Puccinia recondita);引起早熟禾、黑麦草和高羊茅条锈病[8-9]的病原物小麦条锈菌(Puccinia striiformis);引起早熟禾、黑麦草秆锈病[10]的病原物小麦禾柄锈菌(Puccinia graminis)。由此可见,不同草坪草的锈病病原物的种类不同,正确鉴定这些病原菌对草坪草的病害防治及抗病育种具有重要意义。

    目前,病原菌分类鉴定仍主要依据形态学和生理特征进行,但随着分子技术手段的快速发展,基于病原菌核酸水平上的系统进化分析也被广泛用于病原菌鉴定研究中。其中,以核糖体DNA转录间隔区(rDNA-ITS)[11]β-tubulin基因部分序列[12]为研究对象,同时结合形态学特征对真菌进行区分鉴定的手段其应用最为广泛。为明确草地早熟禾矮化突变材料锈病的病原物,本研究观察分析了锈病病原菌的形态特征,并结合ITS和β-tubulin基因序列分析对其鉴定。此外,为了解草地早熟禾抗该锈病病原菌的分子机理,本文对病原菌诱导后的PR1LNPR1L基因的表达变化情况和PRs蛋白表达进行了研究,为之后开展该病害的防治研究工作奠定基础。

    • 供试材料:自然环境生长条件下的草地早熟禾野生型(WT)及矮化突变材料(A16)的感病株系,并将其隔离以防止侵染其他植株。主要试剂和仪器:苯酚、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)等试剂均为分析纯;2×Taq Master Mix (Dye)、DL2000、2×SYBR Mix和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均为康为生物科技有限公司生产。Bio-Rad PCR仪、凝胶成像仪为美国伯乐公司生产;Olympus-HB光学显微镜,日本奥林巴斯株式会社。

    • 取叶片上的孢子制成临时切片,于Olympus-HB光学显微镜下观察并显微摄影。

    • 从自然感病植株WT和A16中取带有锈菌孢子的侵染叶片,参照文献[13]提取锈菌的DNA,-20 ℃储存备用。扩增片段1为核糖体DNA(rDNA)的ITS1, 5.8S和ITS2区域,扩增片段2为β-tubulin基因部分序列,引物(表 1)由天一辉远生物技术有限公司合成。扩增反应体系25 μL,依次加入下列试剂:2×Taq Master Mix 12.5 μL;上下游引物(10 μmol/L)各1 μL;模板DNA 1 μL;ddH2O 9.5 μL。反应程序:94 ℃预变性10 min;94 ℃变性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共进行35个循环;最后72 ℃延伸5 min。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物电泳检测后切胶回收,目的DNA片段和载体质粒pMD19-T连接,转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,PCR检测(反应程序同前),检测重组子,选择阳性克隆菌液,由天一辉远生物技术有限公司测序。DNA序列同源性通过NCBI BLAST server分析;采用Mega 5中的邻接法(Neighbor-joining, NJ)构建系统发育树,通过自举(bootstrap)对系统树进行检验,1 000次重复[14]

      表 1  实验所需引物的序列

      Table 1.  List of primer sequences used in this study

      引物名称
      Primer name
      引物序列
      Primer sequence(5′—3′)
      ITS1TCCGTAGGTGAACCTGCGG
      ITS4TCCTCCGCTTATTGATATGC
      Tubulin-FATGGAYTCGGTYCGATCTGGCG
      Tubulin-RCYTCTCCRGTGTACCAATGCAGG
      PR1L-qFCGCTACGCCCGCTCCC
      PR1L-qRGCCCCTCGTCCACCCA
      NPR1L-qFCAAGGAAGGGCAGACTAA
      NPR1L-qRGCAGCGATGTGAAGAACA
      Actin-qFTTGACTGAGAGGGGCT
      Actin-qRTCATACGGTCTGCGAT
    • 采用手涂摩擦接种法。取草地早熟禾感病植株中分离的已鉴定菌种的锈菌孢子,用灭菌水配置成悬浮液。然后先用手指沾取清水摩擦正常植株叶片,再沾取孢子悬浮液在叶片上轻轻涂匀。接种完成后,黑暗保湿24 h,之后于20 ℃、16 h光周期、50%湿度条件下培养。接种病原菌的草地早熟禾植株在0、6、12、24和48 h等时间点取样。

    • 本实验以二穗短柄草BdPR1、BdNPR1基因的cds序列为种子序列,采用本地Blast方法检索草地早熟禾转录组数据库(NCBI登录号:SRA315988),分别获取了草地早熟禾PR1LNPR1L候选基因电子序列,并对其进行ORF预测和BLAST比对分析,分析结果见表 2。根据候选基因PR1LNPR1L和内参基因Actin分别设计定量PCR引物(具体引物序列见表 1)。

      表 2  草地早熟禾的抗病相关的候选基因筛选

      Table 2.  List of candidate disease-resistant gene studied in Kentucky bluegrass clones

      基因名称
      Gene ID
      候选基因注释
      Candidate gene annotation
      开放阅读框序列长度
      ORF length/bp
      同源基因编号
      GenBank accession of homologs
      同源物种
      Allied species
      PR1Lpathogenesis-related protein 1A-like552XM_004975168Setaria italica
      NPR1LNPR1-like 1 protein1 758JX424315硬粒小麦Triticum durum

      采用Trizol法提取各个取样点的叶片总RNA,通过NanoDrop 2000检测其浓度,质量浓度范围约为300~600 ng/μL之间。然后按照First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR Kit (Transgene)说明书合成cDNA。然后以各个取样点cDNA为模板,按照如下PCR体系在Bio-Rad CFX96实时定量PCR仪进行反应:2×SYBR Mix 12.5 μL;上下游引物(10 μmol/L)各1 μL;模板cDNA 1 μL;ddH2O 9.5 μL。定量PCR反应程序:95 ℃预变性30 s;95 ℃变性10 s,57 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共进行40个循环。根据试验所得Ct值,按照Comparative 2-ΔΔCT方法计算相对表达量。

    • 病程相关蛋白(PRs)是一类普遍存在的具有广谱抗性的诱导的可溶性蛋白质[15],会受到外源激素或病原菌侵染的调节[16],故而本试验中以从草地早熟禾感病植株中提取的已鉴定菌种为诱导因子刺激病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins, PRs)。取接种后8 d的0.1~0.2 g左右的植物叶片,在液氮中研磨充分后转入2 mL离心管中,加入2 mL提取缓冲液(0.5 M Tris-HCl,1%SDS,100%甘油,100%巯基乙醇),振荡摇匀并放在4 ℃条件下提取1 h,充分溶解蛋白。4 ℃12 000 r/min离心20 min,弃沉淀,上清液取200 μL中加入4倍体积的预冷丙酮-20 ℃条件下放置1 h,让蛋白充分沉淀。之后,4 ℃12 000 r/min离心20 min,弃上清,使丙酮完全挥发后加入1×上样缓冲液100 μL溶解沉淀,即为病程相关蛋白溶液。所提蛋白溶液经12%SDS-PAGE电泳后,采用考马斯亮蓝溶液染色,观察蛋白电泳条带。

    • 图 1所示,受害植株病叶上布满了大片的锈菌孢子堆,孢子堆成浅棕色且排列散乱。夏孢子圆形、卵形或椭圆形,黄色或浅黄色,表面光滑,而且有向冬孢子分化的趋势。

      图  1  感病植株的发病症状和锈菌菌株夏孢子形态的光学显微镜观察

      Figure 1.  Symptoms of Kentucky bluegrass leaves infected by urediospore of rust and morphological investigation of the urediospore under optical microscope

    • 用通用引物ITS1和ITS4对菌株的rDNA-ITS序列进行扩增,获得767 bp包含5.8SrRNA的ITS序列,序列已提交GenBank(登录号为KU163393)。将所得出的ITS区序列与NCBI中已有的序列进行比较,该ITS序列与小麦禾柄锈菌(Puccinia graminis)相似度为82%。

      利用简并引物对供试菌株的β-tubulin基因进行扩增,测序获得793 bp的β-tubulin基因部分序列,然后将所得到的β-tubulin基因部分序列与GenBank中Puccinia属下不同种的β-tubulin序列构建分子进化树。其中,A16中出现的锈菌病原物的β-tubulin与参比菌株小麦禾柄锈菌聚类在一起(图 2)。综上所述,基于ITS序列分析和β-tubulin基因部分序列的分子进化分析,可初步认定该菌株隶属于小麦禾柄锈菌。

      图  2  供试菌株及Puccinia相关菌株β-tubulin基因的系统发育树

      Figure 2.  Phylogenetic tree of isolate strain and their relatives in Puccinia

    • 以草地早熟禾野生型植株(WT)、矮化突变植株(A16)为试验材料,研究并比较两份材料中禾柄锈菌(Puccinia graminis)诱导及其不同诱导时间PR1LNPR1L基因表达变化情况。由图 3可知:草地早熟禾受禾柄锈菌诱导后,PR1LNPR1L基因的表达均显著提高,呈先上调、再下降、后上升的波荡表达模式,均于12 h时达到最高。但两个抗病相关基因在两份植株材料中的表达情况较为不同,PR1LNPR1L在草地早熟禾矮化突变植株中的表达变化较野生型植株中的更快,其中PR1LNPR1L基因在A16接种12 h后达到最大表达量的相对值分别为8.8、4.5,均大于在WT中的表达量(2.0、1.9)。因此推测,PR1LNPR1L基因可能参与了前期草地早熟禾抗禾柄锈菌的基础防卫反应并在抗病信号通路中起着一定的作用,而且在野生型和矮化突变植株表现出转录水平的不同可能与两份材料的诱导抗病性有关。

      图  3  草地早熟禾及其矮化突变材料受禾柄锈菌侵染后PR1LNPR1L基因的表达变化情况

      Figure 3.  Expression pattern of PR1L, NPR1L induced by Puccinia graminis in Kentucky bluegrass wild type (WT) and its dwarf mutants (A16)

    • 禾柄锈菌侵染8 d后,肉眼观察到草地早熟禾叶片上有锈孢子堆,取此时发病的野生型(WT)和矮化突变(A16)植株为处理样品,另以未侵染的WT和A16植株为对照样品,提取可溶性病程相关蛋白,采用12% SDS-PAGE分析的结果显示(图 4),诱导前后均出现了2条较为明显的蛋白条带,其分子质量为33和50 kDa,而分子质量为33 kDa的蛋白表达量较低。另外,这两条蛋白带在禾柄锈菌侵染后的表达量明显高于未侵染的植株,而且在A16中的表达量高于在WT中,说明该蛋白的表达可能与草地早熟禾抗锈病的病程相关。此外,在A16被禾柄锈菌侵染后的蛋白样品中,还发现了一条分子质量约为40 kDa新蛋白条带,推测为草地早熟禾抗锈病过程的病程相关蛋白(PR蛋白)。而诱导出的是哪种PR蛋白还有待进一步证实。

      图  4  草地早熟禾野生型(WT)及其矮化突变(A16)植株接种禾柄锈菌前后的病程相关蛋白电泳分析

      Figure 4.  12% SDS-PAGE analysis of pathogenesis-related proteins extracted from leaves of WT and A16 inoculated with/without Puccinia graminis

    • 本研究采用形态学结合rDNA-ITS序列和β-butulin基因序列分析的方法,对草地早熟禾发生锈病的病原菌进行了鉴定。形态学和分子鉴定的结果表明,该病原菌可初步认定为禾柄锈菌(Puccinia graminis),这是国内对禾柄锈菌引起草地早熟禾锈病的首次报道。

      孢子的形态学特征是区分不同锈菌的重要手段,但对于Puccinia属下的锈菌仅凭孢子形态难以对引起锈病发生的病原菌进行准确鉴定。而对于此类在形态学上很难区分的锈病病原菌,ITS序列和β-tubulin基因序列分析已成功运用于真菌种类的鉴别,因为这些DNA特征是具有高度的变异性,因此为了确定研究中引起病害发生的病原菌,除采用形态学鉴别方法外,分子进化分析也是必不可少的手段之一[17]

      本研究还对草地早熟禾及其矮化突变材料的抗病机理进行了初步探索。植物抗病反应主要有植物过敏性反应(Hypersensitive response, HR)[18]和系统获得性抗病反应(Systemic acquired disease resistance, SAR),当植物被病原物侵染后,SAR系统会被激活,并伴随着一系列抗病相关基因的表达,譬如病程相关蛋白基因(pathogenesis related genes, PRs)和NPR1(nonexpressor of PR gene 1)。PR1和NPR1基因是调控植物抗病性的关键基因,其表达量的变化会直接影响植物对病原物的抵抗能力[19],且对于调控下游基因的表达起着关键作用[20][21]。如图 3所示,PR1LNPR1L基因的表达量在病原菌诱导前均处于较低水平(且在A16中略低),但在病原菌诱导12 h后,PR1和NPR1L基因的转录水平显著提高,尤其是在A16中分别提高约为8.8-fold和4.5-fold,且都比WT在12 h的相对表达量要高,这说明了矮化突变植株对禾柄锈菌的敏感性更强。此外,对用病原物处理的植物叶片可溶性PRs蛋白进行SDS-PAGE电泳,结果表明,PRs蛋白在未被侵染的植物样本中的表达量较低,而经过8 d侵染后的表达量显著提高,且在A16中诱导出一条新的蛋白条带,这也侧面说明了这些病程相关蛋白能被系统诱导。总而言之,禾柄锈菌的侵染引发了PR1LNPR1L基因的转录水平的提高以及PRs蛋白表达情况的变化。但这些基因和蛋白的表达及其在病原菌-植物互作关系中所扮演的角色还需要更深入的研究。进而为之后研究WT和A16抗病性差异的具体原因奠定基础。

参考文献 (21)

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