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水曲柳TCP4转录因子克隆及胁迫和激素下的表达分析

刘春浩 梁楠松 于磊 赵兴堂 刘颖 孙爽 王紫晴 詹亚光

刘春浩, 梁楠松, 于磊, 赵兴堂, 刘颖, 孙爽, 王紫晴, 詹亚光. 水曲柳TCP4转录因子克隆及胁迫和激素下的表达分析[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(6): 22-31. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160359
引用本文: 刘春浩, 梁楠松, 于磊, 赵兴堂, 刘颖, 孙爽, 王紫晴, 詹亚光. 水曲柳TCP4转录因子克隆及胁迫和激素下的表达分析[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(6): 22-31. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160359
LIU Chun-hao, LIANG Nan-song, YU Lei, ZHAO Xing-tang, LIU Ying, SUN Shuang, WANG Zi-qing, ZHAN Ya-guang. Cloning, analysing and homologous expression of TCP4 transcription factor under abiotic stress and hormone signal in Fraxinus mandschurica[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(6): 22-31. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160359
Citation: LIU Chun-hao, LIANG Nan-song, YU Lei, ZHAO Xing-tang, LIU Ying, SUN Shuang, WANG Zi-qing, ZHAN Ya-guang. Cloning, analysing and homologous expression of TCP4 transcription factor under abiotic stress and hormone signal in Fraxinus mandschurica[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(6): 22-31. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160359

水曲柳TCP4转录因子克隆及胁迫和激素下的表达分析

doi: 10.13332/j.1000-1522.20160359
基金项目: 

东北林业大学大学生创新创业训练计划项目 201610225233

“十二五”国家科技支撑计划项目 2012BAD21B020106

国家自然科学基金项目 31270697

详细信息
    作者简介:

    刘春浩。主要研究方向:植物基因工程。Email: DLliuchunhao@163.com  地址:150040  黑龙江省哈尔滨市香坊区和兴路26号东北林业大学生命科学学院

    通讯作者:

    詹亚光,博士,教授。主要研究方向:林木遗传育种。Emailyaguangzhan@126.com  地址:同上

  • 中图分类号: S718.46;S792.41;Q943.2

Cloning, analysing and homologous expression of TCP4 transcription factor under abiotic stress and hormone signal in Fraxinus mandschurica

  • 摘要: TCP转录因子家族是植物特异的一类调控生长发育和逆境胁迫的重要转录因子。本文揭示了水曲柳FmTCP4在非生物胁迫及激素信号诱导调控的表达特征,为该基因在水曲柳中调控生长发育以及逆境胁迫响应功能的研究奠定基础。通过前期研究克隆获得了水曲柳TCP4基因序列,并命名为FmTCP4,应用生物信息学软件对水曲柳FmTCP4基因的分子结构特征进行了分析,利用4 ℃低温、盐(NaCl)以及干旱(PEG6000)进行非生物胁迫处理,利用脱落酸(ABA)和赤霉素(GA3)进行激素信号诱导,分析FmTCP4基因的表达特征。生物信息学分析表明该基因全长1 251 bp,具有完整的开放阅读框,编码416个氨基酸。FmTCP4具有螺旋-环-螺旋结构,为亲水性的不稳定蛋白,不存在信号肽,具有跨膜能力,亚细胞定位预测存在于细胞核中,并在细胞质到细胞核的调控中起作用。同源序列比对结果表明,FmTCP4与芝麻、烟草等物种的同源蛋白序列相比具有很高的同源性。非生物胁迫处理后,FmTCP4的表达量随处理时间而改变,但其变化趋势不同,表明FmTCP4明显响应了这3种非生物胁迫。激素信号诱导结果表明,外源植物激素调控了FmTCP4基因的表达,基因表达量相对于对照组具有显著性差异。非生物胁迫和激素信号诱导下的基因表达分析表明,FmTCP4响应了寒冷、盐、干旱等非生物胁迫以及激素信号,说明其参与了植物的生长发育和逆境胁迫的平衡。
  • 图  1  FmTCP4基因PCR扩增片段(M:DL2 000)

    Figure  1.  PCR amplified fragments of FmTCP4 (M:DL2 000)

    图  2  FmTCP4基因编码区序列及推测的氨基酸序列

    Figure  2.  Gene coding region sequence and amino acid sequence of FmTCP4

    图  3  FmTCP4蛋白信号肽的预测和分析

    C.原始剪切位点的分值; S.信号肽的分值; Y.综合剪切位点的分值。

    Figure  3.  Prediction and analysis of signal peptides in FmTCP4 protein using the neural network algorithm

    C, the score of the original cut site; S, the score of signal peptide; Y, the score of the integrated cut site.

    图  4  FmTCP4蛋白跨膜结构域预测和分析

    箭头所示为预测的FmTCP4的跨膜结构域。

    Figure  4.  Prediction and analysis of trans-membrane domain in FmTCP4 protein

    Arrow means trans-membrane domain of predicted FmTCP4.

    图  5  FmTCP4蛋白三级结构预测(三视图)

    Figure  5.  Three-dimensional structure prediction of FmTCP4 protein(three views)

    图  6  FmTCP4蛋白质残基二面角预测

    Figure  6.  Prediction of residue dihedral alangles in FmTCP4 protein

    图  7  FmTCP4基因编码的氨基酸序列比对

    Figure  7.  Multiple alignment of amino acid sequence of FmTCP4

    图  8  FmTCP4蛋白质结构域预测

    Figure  8.  FmTCP4 protein domain prediction

    图  9  根据FmTCP4蛋白NCBI Blastp比对结果构建的系统进化树

    Figure  9.  Phylogenetic tree of FmTCP4 protein based on the Blastp results from NCBI

    图  10  FmTCP4基因在非生物胁迫下的相对表达量

    a, b, c, d表示处理下不同时间点的基因表达差异显著性(P<0.05), 下同。

    Figure  10.  Relative expression level of FmTCP4 under abiotic stress treatment

    a, b, c and d mean significant difference in gene expression at different time points under processing (P<0.05), same as below.

    图  11  FmTCP4在植物激素信号下的相对表达量

    Figure  11.  Relative expression level of FmTCP4 under hormone signal

    表  1  克隆FmTCP4基因编码区对应引物

    Table  1.   Primers used for cloning the coding regions in FmTCP4 gene

    引物名称
    Primer name
    引物序列
    Primer sequence
    FmTCP4-F 5ˊ-CCGCTCTACTCCACAACTCCC-3ˊ
    FmTCP4-R5ˊ-GCTACTAGCTCACCCAGACAATAAAC-3ˊ
    下载: 导出CSV

    表  2  实时荧光定量PCR采用的引物序列

    Table  2.   Primers for quantitative real-time PCR

    引物名称
    Primer name
    引物序列
    Primer sequence
    Tu-F 5′-AGGACGCTGCCAACAACTTT-3′
    Tu-R 5′-TTGAGGGGAAGGGTAAATAGTG-3′
    qFmTCP4-F 5′-CTTCGGCTGAGTCCAGTTCC-3′
    qFmTCP4-R 5′-TGCTGTGGCTGTTGTTGGTTAT-3′
    下载: 导出CSV
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    水曲柳大小孢子发生、雌雄配子体发育及其系统学意义 . 北京林业大学学报, 2005, 27(5): 42-47.
    [20] 马文辉, 张秋英, 张一平, 殷亚方, 王明枝, 詹亚光, 李景文, 
    王保平, 侯亚南, 黄国胜, 李慧, 杜华强, 杨海龙, 杨晓晖, 熊瑾, 符韵林, 刘震, 李景文, 李全发, 李梅, 饶良懿, 宋小双, 龙玲, 刘文耀, 李俊清, 王雪军, 赵敏, 陆熙娴, 耿晓东, 王洁瑛, 李吉跃, 张克斌, 窦军霞, 韩海荣, 朱金兆, 秦瑶, 尹立辉, 徐峰, 吕建雄, 李妮亚, 李发东, 朱金兆, 梁机, 李俊清, 陈晓阳, 范文义, 于贵瑞, 陈素文, 沈有信, 慈龙骏, 李凤兰, 倪春, 李黎, 赵宪文, 李云, 秦素玲, 齐实, 刘雪梅, 乔杰, 康峰峰, 毕华兴, 孙玉军, 刘桂丰, 唐黎明, 欧国强, 陈晓阳, 任海青, 李伟, 文瑞钧, 韦广绥, 马钦彦, 李伟, 黎昌琼, 张桂芹, 王玉成, 赵双菊, 宋献方, 刘伦辉, 王雪, 蒋建平, 魏建祥, 朱国平, 杨谦, 丁霞, 李慧, 周海江, , 孙涛, 张万军, 宋清海, 孙志强, 刘莹, 孙晓敏, 李宗然, 
    北方梭囊孔菌漆酶基因DNA片段的克隆与序列分析 . 北京林业大学学报, 2005, 27(5): 59-64.
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出版历程
  • 收稿日期:  2016-11-24
  • 修回日期:  2016-03-20
  • 刊出日期:  2017-06-01

水曲柳TCP4转录因子克隆及胁迫和激素下的表达分析

doi: 10.13332/j.1000-1522.20160359
    基金项目:

    东北林业大学大学生创新创业训练计划项目 201610225233

    “十二五”国家科技支撑计划项目 2012BAD21B020106

    国家自然科学基金项目 31270697

    作者简介:

    刘春浩。主要研究方向:植物基因工程。Email: DLliuchunhao@163.com  地址:150040  黑龙江省哈尔滨市香坊区和兴路26号东北林业大学生命科学学院

    通讯作者: 詹亚光,博士,教授。主要研究方向:林木遗传育种。Emailyaguangzhan@126.com  地址:同上
  • 中图分类号: S718.46;S792.41;Q943.2

摘要: TCP转录因子家族是植物特异的一类调控生长发育和逆境胁迫的重要转录因子。本文揭示了水曲柳FmTCP4在非生物胁迫及激素信号诱导调控的表达特征,为该基因在水曲柳中调控生长发育以及逆境胁迫响应功能的研究奠定基础。通过前期研究克隆获得了水曲柳TCP4基因序列,并命名为FmTCP4,应用生物信息学软件对水曲柳FmTCP4基因的分子结构特征进行了分析,利用4 ℃低温、盐(NaCl)以及干旱(PEG6000)进行非生物胁迫处理,利用脱落酸(ABA)和赤霉素(GA3)进行激素信号诱导,分析FmTCP4基因的表达特征。生物信息学分析表明该基因全长1 251 bp,具有完整的开放阅读框,编码416个氨基酸。FmTCP4具有螺旋-环-螺旋结构,为亲水性的不稳定蛋白,不存在信号肽,具有跨膜能力,亚细胞定位预测存在于细胞核中,并在细胞质到细胞核的调控中起作用。同源序列比对结果表明,FmTCP4与芝麻、烟草等物种的同源蛋白序列相比具有很高的同源性。非生物胁迫处理后,FmTCP4的表达量随处理时间而改变,但其变化趋势不同,表明FmTCP4明显响应了这3种非生物胁迫。激素信号诱导结果表明,外源植物激素调控了FmTCP4基因的表达,基因表达量相对于对照组具有显著性差异。非生物胁迫和激素信号诱导下的基因表达分析表明,FmTCP4响应了寒冷、盐、干旱等非生物胁迫以及激素信号,说明其参与了植物的生长发育和逆境胁迫的平衡。

English Abstract

刘春浩, 梁楠松, 于磊, 赵兴堂, 刘颖, 孙爽, 王紫晴, 詹亚光. 水曲柳TCP4转录因子克隆及胁迫和激素下的表达分析[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(6): 22-31. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160359
引用本文: 刘春浩, 梁楠松, 于磊, 赵兴堂, 刘颖, 孙爽, 王紫晴, 詹亚光. 水曲柳TCP4转录因子克隆及胁迫和激素下的表达分析[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(6): 22-31. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160359
LIU Chun-hao, LIANG Nan-song, YU Lei, ZHAO Xing-tang, LIU Ying, SUN Shuang, WANG Zi-qing, ZHAN Ya-guang. Cloning, analysing and homologous expression of TCP4 transcription factor under abiotic stress and hormone signal in Fraxinus mandschurica[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(6): 22-31. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160359
Citation: LIU Chun-hao, LIANG Nan-song, YU Lei, ZHAO Xing-tang, LIU Ying, SUN Shuang, WANG Zi-qing, ZHAN Ya-guang. Cloning, analysing and homologous expression of TCP4 transcription factor under abiotic stress and hormone signal in Fraxinus mandschurica[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(6): 22-31. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160359
  • 转录因子通过调节动物和植物基因的时空表达水平,在生物体的细胞增殖、正常生长发育以及免疫反应过程中起到重要的调控作用[1]。TCP转录因子家族是根据玉米(Zea mays)中的TEOSINTEBRANCHE1(TB1)、金鱼草(Antirrhinum majus)中的CYCLOIDEA(CYC)以及水稻(Oryza sativa)中的PROLIFERATING CELL FACTORS 1和2(PCF1和PCF2)的3个基因的首字母来命名的[2-3]。TCP转录因子是一类植物特有的转录因子,其主要特征是具有一个由60个氨基酸组成的TCP结构域,这个TCP结构域是一个非典型的碱性螺旋环螺旋(bHLH)结构,TCP转录因子通过该TCP结构域参与了与DNA的互作等功能。基于TCP结构域序列上的差别,TCP转录因子家族被分为2个亚家族:classⅠ(又名PCF或TCP-P)和classⅡ(又名TCP-C),主要是classⅠ和classⅡ相比,在TCP基本结构域上缺失了1个短的氨基酸的结构(4个氨基酸残基),此外classⅠ和classⅡ的蛋白识别位点也有所差别,分别为GGNCCCAC和G(T/C)GGNCCC[4-5]。TCP家族参与了植物发育中细胞增殖和细胞分化的调控,其中classⅠ类在调控植物的生长以及胁迫应答中,起到正调控的作用,而classⅡ则与Ⅰ类功能有所拮抗[4-6]。例如,AtTCP20对于细胞分裂和生长协调是必不可少的,AtTCP20的转录激活域(VP16)或抑制域(EAR)被修饰后,AtTCP20的表达量发生改变,影响植物的株高、叶片形态(卷曲)以及开花时间[7];拟南芥(Arabidopsis thaliana)的classⅡ的成员AtTCP2、AtTCP3、AtTCP4、AtTCP10和AtTCP24,及其在不同物种的同源基因,存在miR319的结合位点,miR319靶向TCP转录因子,影响叶片发育以及细胞分化。例如,miR319的过表达,降低了TCP转录因子的表达,突变型叶片与野生型相比,成熟缓慢,分化程度较低;相反,TCP转录因子过表达的植株具有成熟早、细胞分裂减缓的特点[8-9]OsTCP19在调节非生物胁迫中发挥了重要的作用,盐和干旱条件下水稻中OsTCP19基因的表达量上调了5~6倍,并且在拟南芥中过量表达的OsTCP19引起ABI3、ABI4、IAA3的上调表达和LOX2下调表达,导致植株的发育异常,例如侧根的减少等[10]。且目前针对TCP的研究集中于发育调控,在抗逆方面的研究少见报道。

    水曲柳(Fraxinus mandschurica)系木犀科(Oleaceae)白蜡树属落叶乔木,是东北珍贵硬阔叶用材树种之一,与胡桃楸(Juglans mandshurica)、黄菠萝(Phellodendron amurense)合称为中国东北的“三大硬阔”。树干材质坚硬,纹理通直,被广泛地应用于建筑、仪器、家具、室内装饰、车辆中;水曲柳能耐-40℃低温且有一定的耐盐性,抗病虫性较强,含有丰富的优良基因资源。因此,水曲柳生长发育和抗逆相关基因资源的开发利用,对于林木遗传改良、生态建设具有重要的科学和实践意义[11-12]

    本研究中获得了水曲柳TCP classⅡ转录因子TCP4,命名为FmTCP4。FmTCP4与水稻中TCP转录因子OsPCF5基因具有很高的同源性,在水稻中,OsPCF5受到了miR319的调控,参与了水稻应对寒冷胁迫的调控。而FmTCP4在拟南芥中的同源基因AtTCP4参与了拟南芥的种子形成、细胞增殖与分化过程的调控。例如AtTCP4过量表达拟南芥的花粉不能产生可育的种子,并且miR396b激活编码的AtTCP4可以直接抑制细胞增殖分化[6-9]miR319调控的AtTCP4通过调控细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白(ICK1)和激酶抑制蛋白(KRP1)调控细胞周期[9]。本文对水曲柳TCP4的编码区进行了克隆,同时进行了详细的生物信息学分析,对其在不同非生物胁迫以及激素等信号调控下的基因表达进行了测定,为深入研究水曲柳FmTCP4的功能提供参考。

    • 水曲柳种子、叶片取自东北林业大学实验林场,将水曲柳幼苗置于恒温培养箱中培养,培养基质为V(营养土):V(蛭石)=3:1。并调整培养箱维持温度(23±2)℃以及湿度60%~80%,日照长度为16 h,保证植物正常生长。待水曲柳幼苗培养至20 d时,取长势均一的植株进行处理,所有处理均采用基质浇灌的方法。分别用4 ℃低温、200 mmol/L NaCl和w:v为20% PEG6000干旱进行胁迫处理;用100 μmol/L ABA和100 μmol/L GA3进行激素信号处理,对照组不做任何处理(NaCl、PEG600、ABA和GA3购自于sigma公司)。分别于处理后0、6、12、24、48和72 h取水曲柳幼苗,置于液氮中冷冻,并于-80 ℃下保存。

    • 以水曲柳叶片为实验材料,采用CTAB法提取材料的总RNA[13]。以反转录试剂盒将提取的RNA反转录成cDNA。应用本研究团队前期对水曲柳转录组测序所得的水曲柳转录组数据库,通过应用BioEdit软件Local blast中的blastx和blastn功能,比对分析确定TCP4基因序列并设计引物,克隆TCP4编码区全长序列(引物如表 1所示)。通过凝胶回收试剂盒回收纯化特异性扩增产物,采用pMD18-T载体连接纯化产物,转化克隆进入JM109感受态细胞,送生物公司测序。

      表 1  克隆FmTCP4基因编码区对应引物

      Table 1.  Primers used for cloning the coding regions in FmTCP4 gene

      引物名称
      Primer name
      引物序列
      Primer sequence
      FmTCP4-F 5ˊ-CCGCTCTACTCCACAACTCCC-3ˊ
      FmTCP4-R5ˊ-GCTACTAGCTCACCCAGACAATAAAC-3ˊ

      Primer star Taq酶、One Step SYBR®PrimeScriptTM RT-PCR Kit等购自于宝生物工程(大连)有限公司。由生工生物工程(上海)股份有限公司完成引物合成和测序。

    • 对获得的水曲柳FmTCP4基因的核苷酸序列利用DNAMAN软件进行分析,并推测其蛋白质编码氨基酸序列。FmTCP4蛋白的理化性质通过Protparam[14]在线分析软件分析。FmTCP4蛋白的亲水/疏水性使用ProtScale[14]在线分析软件中的Kyte and Doolittle算法进行预测。FmTCP4蛋白的信号肽应用SignalP[15]在线分析工具的神经网络算法进行预测和分析。利用在线工具TMPred[16]对FmTCP4蛋白的跨膜结构进行预测及分析。通过在线分析工具COILS[17]对FmTCP4蛋白的卷曲螺旋预测和分析。FmTCP4蛋白的亚细胞定位使用在线分析工具wolf psort[18]进行分析。FmTCP4蛋白的二级结构应用GOR4软件分析[19-20]。FmTCP4的保守结构域利用NCBI数据库Conserved Domain Search Service(CD Search)在线分析软件分析。FmTCP4氨基酸序列应用NCBI数据库Blast进行同源序列比对,以及搜索不同物种中的同源基因及蛋白。并先将氨基酸序列利用ClustalX进行多序列比对的分析,然后通过MEGA 5.0软件的Neighbor-Joining算法,1 000次自检举,构建系统发育进化树[21-22]

    • 以水曲柳微管蛋白基因Tu作为内参基因,引物见表 2。PCR反应体系如下:10 μL Master Mix,2 μL模板cDNA,10 μmol/L的正反向引物各1 μL,用ddH2O补足至20 μL的总体积。扩增反应利用Applied Biosystems7500荧光定量PCR仪进行,反应程序:95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s(共40个循环)、95 ℃15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s。每份样品进行3次重复。目标基因表达水平运用相对定量的2-ΔΔCt[23],式中:Ct是热循环仪检测到反应体系中荧光信号的强度值)计算。

      表 2  实时荧光定量PCR采用的引物序列

      Table 2.  Primers for quantitative real-time PCR

      引物名称
      Primer name
      引物序列
      Primer sequence
      Tu-F 5′-AGGACGCTGCCAACAACTTT-3′
      Tu-R 5′-TTGAGGGGAAGGGTAAATAGTG-3′
      qFmTCP4-F 5′-CTTCGGCTGAGTCCAGTTCC-3′
      qFmTCP4-R 5′-TGCTGTGGCTGTTGTTGGTTAT-3′
    • 以水曲柳叶片获得的cDNA为模板进行PCR反应扩增,扩增结果见图 1。测序后,通过NCBI数据库blastn比对,确定获得了水曲柳TCP4基因序列,并命名为FmTCP4,上传至Genbank数据库,登录号为:KX905155,FmTCP4基因编码区全长为1 251 bp。经过比对,与拟南芥AtTCP4基因核苷酸序列(AT3G15030.1)的一致性为55.91%;与芝麻(Sesamum indicum)TCP4基因核苷酸序列(XM_011084436.1)的一致性为77%;与烟草(Nicotiana sylvestris)TCP4基因核苷酸序列(XM_009786850.1)的一致性为71%。

      图  1  FmTCP4基因PCR扩增片段(M:DL2 000)

      Figure 1.  PCR amplified fragments of FmTCP4 (M:DL2 000)

      应用DNAMAN软件对获得的水曲柳FmTCP4基因编码区全长进行分析和预测,氨基酸序列长度推测为416个氨基酸(图 2所示)。

      图  2  FmTCP4基因编码区序列及推测的氨基酸序列

      Figure 2.  Gene coding region sequence and amino acid sequence of FmTCP4

    • FmTCP4基因的氨基酸序列的理化性质利用在线分析软件Protparam进行分析。FmTCP4蛋白相对分子质量为45 453.91;不稳定系数是58.77(不稳定系数大于40时,预测蛋白质不稳定,反之则稳定),为不稳定类蛋白;等电点(pI)为6.27;总平均疏水性为-0.733,说明该蛋白为亲水性蛋白。

    • 信号肽是由16~26个氨基酸残基组成的氨基酸序列,在新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移,位于蛋白质的N端,包括信号肽的C端和N端以及疏水核心区3部分[24]。FmTCP4蛋白采用SignalP在线分析工具的神经网络算法进行预测。结果如图 3所示,FmTCP4蛋白可能不存在信号肽。

      图  3  FmTCP4蛋白信号肽的预测和分析

      Figure 3.  Prediction and analysis of signal peptides in FmTCP4 protein using the neural network algorithm

    • 跨膜结构是存在于蛋白质上的并主要形成α-螺旋的由20个左右的疏水性氨基酸残基组成的与膜结合的一段氨基酸片段[25]。对FmTCP4蛋白利用TMPred在线工具进行跨膜结构分析,结果表明,FmTCP4蛋白有2个位置如图 4中箭头所示的跨膜结构域。其中,由内到外(i→o)的跨膜结构域有2个,分别位于283~304位和364~389位,分数分别为743和403;由外到内(o→i)的跨膜结构域有2个分别位于283~304位和363~390位,分数分别为167和667(分数>500为显著跨膜结构),其由内到外的跨膜结构域与由外到内的跨膜结构域基本重合。经N-terminus outside模型分析表明,其中i→o的283~304位,和o→i的363~390位具有强烈的跨膜螺旋结构。由此可见,FmTCP4蛋白(如图 4)既有由外到内的跨膜能力,又有由内到外的跨膜能力。

      图  4  FmTCP4蛋白跨膜结构域预测和分析

      Figure 4.  Prediction and analysis of trans-membrane domain in FmTCP4 protein

    • 分析蛋白在细胞内的分布是研究蛋白质功能的重要环节。通过生物信息学方法对蛋白进行亚细胞定位,并结合蛋白质可能存在的信号肽以及跨膜结构的分析,有利于更高效的揭示蛋白的功能[26]。为了解FmTCP4蛋白的亚细胞定位,利用在线工具WoLF PSORT对FmTCP4蛋白进行亚细胞定位预测,预测结果以及预测分值软件可直接给出,预测分值越高表明预测结果准确性越大。FmTCP4蛋白在细胞核得分为13,说明FmTCP4蛋白可能主要存在于细胞核中,并在细胞质到细胞核的调控中起作用。

    • FmTCP4蛋白的三级结构同源建模应用Swiss-Model在线分析工具分析,并对建模结果采用分析软件Swiss-PdbViewer进行处理[27-29]。FmTCP4蛋白的三级结构同源建模结果表明其为螺旋-环-螺旋结构,如图 5所示(FmTCP4蛋白同源建模三视图)。同时,通过软件的α-碳与酰胺平面交角图功能在FmTCP4蛋白中找到了二面角(1个残基与1个特定平面的构象角),往往可以通过二面角的分析对一个模型的质量进行判断。FmTCP4二面角分析结果如图 6所示,蛋白质残基存在于核心区域表明了其空间结构稳定,同时也证明了对FmTCP4蛋白的氨基酸序列进行的同源建模方法可行且结果可靠。

      图  5  FmTCP4蛋白三级结构预测(三视图)

      Figure 5.  Three-dimensional structure prediction of FmTCP4 protein(three views)

      图  6  FmTCP4蛋白质残基二面角预测

      Figure 6.  Prediction of residue dihedral alangles in FmTCP4 protein

    • FmTCP4基因序列以及推测的编码蛋白利用NCBI数据库中的Blast功能进行同源序列比对,比对结果表明,FmTCP4蛋白与芝麻(Sesamum indicum XP_011098249.1)、烟草(Nicotiana sylvestris XP_009785152.1)、金鱼草(Antirrhinum majus AAO43102.1)、马铃薯(Solanum tuberosum XP_006348284.1)、番茄(Solanum lycopersicum NP_001234335.2)、辣椒(Capsicum annuum XP_016541752.1)、莲(Nelumbo nucifera XP_010277724.1)、葡萄(Vitis vinifera XP_003634670.2)、毛果杨(Populus trichocarpa XP_006370036.1)、蓖麻(Ricinus communis XP_015574905.1)、可可(Theobroma cacao XP_017980250.1)、陆地棉(Gossypium hirsutum XP_016702532.1)、黄瓜(Cucumis sativus XP_004146031)、巨桉(Eucalyptus grandis XP_010060659.1)、拟南芥(Arabidopsis thaliana AT3G15030.1)和水稻(Oryza sativa XP_015634268.1)同源性较高,一致性分别为68%、64%、64%、62%、61%、59%、56%、56%、54%、53%、53%、51%、50%、50%、45%和39%。并对FmTCP4蛋白以及上述物种中的同源蛋白应用ClustlW在多序列比对软件进行同源序列比对分析,结果如图 7所示。我们获得的FmTCP4蛋白序列,与芝麻、烟草、金鱼草、马铃薯、番茄、辣椒、莲、葡萄、毛果杨、蓖麻、可可、陆地棉、黄瓜、巨桉、拟南芥和水稻等物种中的同源蛋白的相似性较高,具有很强的保守性,尤其表现在靠近N端的TCP保守结构域(如黑框所示)。

      图  7  FmTCP4基因编码的氨基酸序列比对

      Figure 7.  Multiple alignment of amino acid sequence of FmTCP4

      蛋白质结构域是位于蛋白质序列和(三级)结构中的以独立于蛋白质链的其余部分而存在、进化以及发挥功能的保守部分。蛋白质结构域通常会形成紧凑的三维结构以独立的稳定折叠。许多蛋白质由几个结构域组成并且相同的结构域也可能存在于不同种蛋白中。目前,蛋白质功能的预测广泛应用了蛋白质结构域分析。蛋白质结构域通常有25个氨基酸到500个氨基酸组成。结构域通常会形成功能元件。利用NCBI数据库Conserved Domain Search Service(CD Search)[30]在线分析软件,根据其催化残基、辅酶结合位点、底物结合位点、抑制剂结合位点、四聚体接口对水曲柳FmTCP4蛋白的保守结构域进行预测,判断该编码蛋白包含有1个TCP结构域,位于近N端位置,属于TCP超家族(图 8),与前面的多序列比对结果一致。

      图  8  FmTCP4蛋白质结构域预测

      Figure 8.  FmTCP4 protein domain prediction

    • 系统进化树是用来描述物种之间进化关系的亲缘分支分类方法,即其进化史[31]。首先对NCBI比对的氨基酸序列利用ClustalX进行比对结果的分析,然后再利用MEGA 5.0软件中的Neighbor-Joining算法构建系统进化树(见图 9)。结果表明,13个物种的13条蛋白序列与拟南芥AtTCP4一致性都比较高,包括拟南芥AtTCP4在内,大致分为7类:其中水曲柳FmTCP4蛋白与芝麻和金鱼草聚为一类,马铃薯、辣椒和烟草聚为一类,莲和葡萄聚为一类,陆地棉、可可、毛果杨和蓖麻聚为一类,而拟南芥、黄瓜分别单独聚为一类,巨桉与水稻与其他物种FmTCP4同源蛋白关系更远,也分别单独聚为一类。

      图  9  根据FmTCP4蛋白NCBI Blastp比对结果构建的系统进化树

      Figure 9.  Phylogenetic tree of FmTCP4 protein based on the Blastp results from NCBI

    • 水曲柳FmTCP4基因的表达量随着非生物胁迫处理时间的延长发生明显变化(图 10)。在寒冷(4 ℃)处理后,FmTCP4基因的表达呈现出先下调后上调的表达趋势,在12 h达到下调表达峰值,为对照的0.56倍,并在24 h相对于对照组出现显著上调,表达量达到对照的26.45倍。在NaCl处理后,FmTCP4基因的表达呈现先上调后下调的趋势,在6 h出现显著上调,达到峰值,为对照的70.69倍。在干旱(PEG6000)处理下,FmTCP4基因表达呈现先上调后下调再上调后下调的趋势,处理组的表达量均高于对照组,并于24 h显著上调达到峰值,为对照的206.26倍。结果表明,FmTCP4明显响应了这3种非生物胁迫,并且其响应模式并不相同。

      图  10  FmTCP4基因在非生物胁迫下的相对表达量

      Figure 10.  Relative expression level of FmTCP4 under abiotic stress treatment

    • 水曲柳FmTCP4在激素信号处理下,随时间的变化,发生了明显的表达变化(图 11)。其中,在ABA处理后,FmTCP的表达呈现出先上调表达,后下调表达的趋势;其中,在6 h时显著上调达到峰值,为对照的1.91倍,而在12 h后,表达受到抑制,显著下调,表达量最低,为对照的0.38倍。在赤霉素处理后,FmTCP4的表达量先上升后下降,且处理组的表达量均高于对照组,其中在24 h显著上调达到峰值,为对照组的151.49倍。结果表明,FmTCP4响应了ABA和GA3的信号刺激。

      图  11  FmTCP4在植物激素信号下的相对表达量

      Figure 11.  Relative expression level of FmTCP4 under hormone signal

    • 本研究通过生物软件,对FmTCP4蛋白进行了预测和生物信息学分析。经预测分析,结果表明FmTCP4蛋白为亲水性蛋白质,可能不存在信号肽,既有由内到外的跨膜能力,又有由外到内的跨膜能力。FmTCP4蛋白亚细胞定位预测表明,其可能主要存在于细胞核中。结合亚细胞定位的预测与跨膜结构的预测,说明FmTCP4蛋白可能在细胞质到细胞核的调控中起作用。通过对FmTCP4蛋白进行的三级结构同源建模,绘制出了FmTCP4蛋白的三维结构模型(见图 78),表明了FmTCP4蛋白具有bHLH(basic helix-1oop-helix)结构。与之前De Paolo等人[4]的研究结果类似,TCP基因编码植物特有的bHLH类转录因子,通过与其他靶基因的结合或者蛋白之间的互作而发挥着重要的调控的功能。例如,在拟南芥中,AtTCP4转录因子通过影响miR319调控了细胞增殖和分化的平衡[6, 8],并且在水稻中研究发现miR319调控的OsPCF5(AtTCP4同源基因)在应对寒冷胁迫中也发挥了重要的作用[32]。TCP蛋白的结构分析和亚细胞定位预测都符合转录因子的特征和功能范围。

      将FmTCP4的氨基酸序列应用NCBI网站的Blastp进行比对,比对结果表明,FmTCP4蛋白与芝麻、烟草、金鱼草、马铃薯、番茄、辣椒、莲、葡萄、毛果杨、蓖麻、可可、陆地棉、黄瓜、巨桉、拟南芥和水稻等物种的对应蛋白的同源性较高。同时应用比对结果构建了系统进化树(见图 9)。进化树表明,水曲柳FmTCP4蛋白与芝麻和金鱼草中的同源蛋白聚为一类,说明它们在进化上亲缘关系较近。如水稻、拟南芥中TCP基因同源性较高,且在靠近N端的TCP保守结构域一致性较高,如AtTCP4、OsPCF5等[2-5]

      本研究同时对FmTCP4基因在非生物胁迫和激素信号下的表达进行了分析。低温胁迫限制了许多野生植物和作物的地理分布,是影响生产率的一个重要因素[33]。不同植物由于分子机制的不同,其对于寒冷胁迫的耐受性也各不相同。研究抗寒基因及其响应机制在生产中也越来越具有实际意义。本实验中,寒冷处理下FmTCP4基因的表达呈现出先下调后上调的表达趋势,并且在寒冷处理前期,FmTCP4基因的表达量低于对照组,这与之前Yang等人[32]关于水稻OsPCF5(FmTCP4同源基因)研究结果类似,水稻中过表达miR319通过对靶基因OsPCF5产物的下调调控,从而增强了水稻的抗寒性,表明OsPCF5是耐寒性的负调控基因。进而推测FmTCP4可能在调控水曲柳寒冷耐受性方面发挥了一定的作用,其具体表达模式有待进一步研究。此外,在NaCl和干旱分别处理下,FmTCP4基因均上调表达,这与之前Mukhopadhyay等人[10]关于水稻TCP转录因子OsTCP19基因的研究相似,盐、干旱胁迫下,OsTCP19基因明显上调表达。在植物激素信号的调控下,ABA处理后,FmTCP的表达呈现出先上调表达后下调表达的趋势,且在之前研究也发现OsTCP19(FmTCP4同源基因)能够调控ABA信号网络,通过与转录因子ABI4的直接互作,在多个信号通路中调控ABI3的表达,进而对ABA进行调控[10],而FmTCP4也响应了ABA信号,在应答方式上推测其与OsTCP19可能具有一定的相似性。Davière [34]报道拟南芥TCP-DELLA的表达模式下,TCP转录因子能直接结合在调控细胞周期基因的启动子上影响生长发育,而DELLAs通过结合到TCP DNA的识别域上而阻遏TCP的表达,GAS则能通过促进DELLAs的降解诱导TCP的表达。本研究发现赤霉素处理后FmTCP4的表达量先上升后下降,也明显响应了赤霉素信号,可能在植物生长发育的调控上发挥了一定的作用。

      综上所述,水曲柳FmTCP4基因同时参与非生物胁迫(寒冷、盐、干旱)的和植物激素ABA以及GA3的响应,在水曲柳中,FmTCP4可能作为调控植物正常生长发育以及逆境胁迫响应的节点而发挥作用,然而水曲柳TCP转录因子调控网络及分子机制仍有待进一步研究。

参考文献 (34)

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