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油松大孢子叶球发生发育的形态与解剖学观察

张敏 张唯 宫再欣 郑彩霞

张敏, 张唯, 宫再欣, 郑彩霞. 油松大孢子叶球发生发育的形态与解剖学观察[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(6): 1-12. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160411
引用本文: 张敏, 张唯, 宫再欣, 郑彩霞. 油松大孢子叶球发生发育的形态与解剖学观察[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(6): 1-12. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160411
ZHANG Min, ZHANG Wei, GONG Zai-xin, ZHENG Cai-xia. Morphologic and anatomical observations in the process of ovulate strobilus generation and development in Pinus tabuliformis[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(6): 1-12. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160411
Citation: ZHANG Min, ZHANG Wei, GONG Zai-xin, ZHENG Cai-xia. Morphologic and anatomical observations in the process of ovulate strobilus generation and development in Pinus tabuliformis[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(6): 1-12. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160411

油松大孢子叶球发生发育的形态与解剖学观察

doi: 10.13332/j.1000-1522.20160411
基金项目: 

国家自然科学基金项目 30671655

国家自然科学基金项目 31170563

国家自然科学基金项目 30371144

详细信息
    作者简介:

    张敏, 博士生.主要研究方向:树木生长发育及其调控.Email: zhangmin1990@bjfu.edu.cn   地址:100083 北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院

    通讯作者:

    郑彩霞, 教授, 博士生导师.主要研究方向:树木生长发育及其调控.Email: zhengcx@bjfu.edu.cn   地址:同上

  • 中图分类号: S718.47

Morphologic and anatomical observations in the process of ovulate strobilus generation and development in Pinus tabuliformis

  • 摘要: 为了准确掌握油松大孢子叶球发生发育过程的外部形态特征及内部胚珠生长的解剖学特征,建立其外部形态和内部组织发育的对应关系,本研究采用形态观测和石蜡切片法,在2013—2016年对北京地区油松大孢子叶球,从花芽分化到种子成熟的过程进行了形态学和解剖学观察。结果显示:北京地区油松的花芽在第1年8月初分化,9月底大孢子叶球原基形成。原基在冬季休眠,至第2年春季继续发育。大孢子叶球在4月初从形态学上可辨,到4月10日左右,胚珠进行细胞分化,此时,大孢子叶球纵径约为5.0 mm。大孢子母细胞在4月20日左右形成,随后进行减数分裂形成功能大孢子。至5月10日左右,大孢子叶球接受小孢子叶球的传粉,随后,珠鳞的颜色由红转绿再逐渐变为棕色。同时,球果缓慢长大,其胚珠内的功能大孢子进行几次分裂,在6月初形成16~32个核的雌配子体,胚珠发育进入游离核分裂期。球果在冬季转入休眠,此时,大孢子叶球纵径约为11.0 mm。至第3年春季,胚珠内部的雌配子体继续发育,4月20日左右含有几千个游离核,此时,大孢子叶球纵径约为21.0 mm。雌配子体在4月30日左右进入细胞化时期,5月初颈卵器开始发育,形成卵细胞,此时,大孢子叶球生长至37.0 mm。待卵细胞在5月10日左右发育成熟时,雌配子体细胞化过程也全部结束。在雌配子体发育、球果长大的同时,珠鳞的颜色逐渐复绿。受精于5月20日左右进行,此时,大孢子叶球纵径约为45.0 mm。受精后,胚胎不断发育。球果在7月10日长约58.0 mm,之后略有萎缩,珠磷逐渐木质化成为种磷。至10月底,球果开裂,长约53.0 mm,种子成熟并弹出。北京地区油松的大孢子叶球从花芽分化、原基形成、胚珠分化、大孢子母细胞产生与分裂、传粉、雌配子体与颈卵器发育、卵细胞成熟、受精、胚胎发育至大孢子叶球成熟形成种子,历时2年2个月。本研究为裸子植物大孢子叶球发生发育的相关研究提供了形态学和解剖学依据。
  • 图  1  油松花芽

    第1年7月20日(A)、9月20日(B)和11月20日(C), 以及第2年2月20日(D)、3月10日(E)、3月20日(F), 3月30日(G)和4月10日(H)的油松花芽。

    Figure  1.  Flower buds of P. tabuliformis

    The flower buds of P. tabuliformis in July 20 (A), September 20 (B) and November 20 (C) of the first year, and in February 20 (D), March 10 (E), March 20 (F), March 30 (G) and April 10 (H) of the second year.

    图  2  油松新枝及球果

    第2年4月20日(A)、4月30日(B)、5月10日(C)的油松新枝及球果。

    Figure  2.  Shoots and ovulate strobilus of P. tabuliformis

    The flower buds and cone of P. tabuliformis in April 20 (A), April 30 (B) and May 10 (C) of the second year.

    图  3  油松球果(第2年5月10日—11月30日)

    第2年5月10日(A)、5月20日(B)、5月30日(C)、6月20日(D)、7月30日(E)、9月10日(F)、10月20日(G)和11月30日(H)的油松球果。

    Figure  3.  Cones of P. tabuliformis (from May 10 to November 30 of the second year)

    The cones of P. tabuliformis in May 10 (A), May 20 (B), May 30 (C), June 20 (D), July 30 (E), September 10 (F), October 20 (G) and November 30 (H) of the second year.

    图  4  油松球果纵径(第2年5月10日—第3年5月10日)

    数值由3次生物学重复获得, 为平均值± SE, 小写字母表示多重比较分析结果(P<0.05), “Ⅱ和“ Ⅲ"分别表示大孢子叶球整个发育过程的第2年和第3年。

    Figure  4.  Longitudinal diameter of cones in P. tabuliformis (from May 10 of the second year to May 10 of the third year)

    Data are shown as means ± SE from three independent biological replicates. Letters indicate statistical differences (P<0.05)."Ⅱ and "Ⅲ" indicate the second and third year in the process of ovulate strobilus generation and development.

    图  5  油松球果(第3年1月10日—5月10日)

    第3年1月10日(A)、2月20日(B)、3月20日(C)、3月30日(D)、4月10日(E)、4月20日(F)、4月30日(G)和5月10日(H)的油松球果.

    Figure  5.  Cones of P.tabuliformis (from January 10 to May 10 of the third year)

    The cones of P. tabuliformis in January10(A),February20(B),March20(C),March30(D),April10(E),April20(F),April30(G) and May10(H) of the third year.

    图  6  油松球果(第3年5月20日—10月30日)

    第3年5月20日(A)、5月30日(B)、6月10日(C)、6月20日(D)、6月30日(E)、7月10日(F)、7月20日(G)、8月10日(H)、8月30日(I)、9月20日(J)、10月10日(K)和10月30日(L)的油松球果。

    Figure  6.  Cones of P. tabuliformis (from May 20 to October 30 of the third year)

    The cones of P. tabuliformis in May20(A),May30(B),June10(C),June20(D),June30(E),July10(F),July20(G),August10(H),August30(I),September20(J),October10(K) and October30(L) of the third year.

    图  7  油松球果纵径(第3年5月20日—10月10日)

    数值由3次生物学重复获得, 为平均值±SE, 小写字母表示多重比较分析结果(P<0.05), “ Ⅲ"表示大孢子叶球整个发育过程的第3年。

    Figure  7.  Longitudinal diameter of cones in P. tabuliformis (from May 20 to October 10 of the third year)

    Data are shown as means ± SE from three independent biological replicates. Letters indicate statistical differences (P<0.05). " Ⅲ" indicates the third year in the process of ovulate strobilus generation and development.

    图  8  油松新芽及胚珠的发育

    A.第1年8月20日油松新芽纵切面观; B、C.图A的局部放大; D.第2年4月10日油松胚珠的纵切面观; ABP.腋芽原基; BS.芽鳞; I.珠被; M.珠孔; N.珠心; TBP.顶芽原基。

    Figure  8.  Development of buds and ovules in P. tabuliformis

    Figure A shows the longitudinal section of P. tabuliformis bud in August 20 of the first year; Figure B and C are the partial enlargements of Figure A; Figure D shows the longitudinal section of P. tabuliformis ovules in April 10 of the second year; ABP, axillary bud primordium; BS, bud scale; I, integument; M, micropyle; N, nucellus; TBP, terminal bud primordium.

    图  9  油松胚珠纵切(第2年4月20日)

    A.油松胚珠纵切面观; B. A的局部放大; I.珠被; M.珠孔; MMC.大孢子母细胞; N.珠心。

    Figure  9.  Longitudinal section of ovule in P. tabuliformis (April 20 in the second year)

    Figure A shows the longitudinal section of ovule in P. tabuliformis; Figure B is the partial enlargement of figure A; I, integument; M, micropyle; MMC, megaspore mother cell; N, nucellus.

    图  10  油松胚珠纵切(第2年9月10日)

    A.油松胚珠纵切面观; B. A的局部放大; FG.雌配子体; FN.游离核; I.珠被; M.珠孔; N.珠心; V.中央大液泡。

    Figure  10.  Longitudinal section of ovule in P. tabuliformis (September 10 in the second year)

    Figure A shows the longitudinal section of ovule in P. tabuliformis; Figure B is the partial enlargement of figure A; FG, female gametophyte; FN, free nucleus; I, integument; M, micropyle; N, nucellus; V, vacuole.

    图  11  油松胚珠纵切(第3年4月20日)

    A.油松胚珠纵切面观; B. A的局部放大; FG.雌配子体; FN.游离核; I.珠被; N.珠心。

    Figure  11.  Longitudinal section of ovule in P. tabuliformis (April 20 in the third year)

    Figure A shows the longitudinal section of ovule in P. tabuliformis; Figure B is the partial enlargement of figure A; FG, female gametophyte; FN, free nucleus; I, integument; N, nucellus.

    图  12  油松胚珠纵切(第3年4月30日)

    A.油松胚珠纵切面观; B. A的局部放大; 图中箭头所示为雌配子体中正在建成的细胞壁; FG.雌配子体; I.珠被; M.珠孔; N.珠心。

    Figure  12.  Longitudinal section of ovule in P. tabuliformis (April 30 in the third year)

    Figure A shows the longitudinal section of ovule in P.tabuliformis; Figure B is the partial enlargement of figure A; arrowheads indicate the establishing cell wall; FG, female gametophyte; I, integument; M, micropyle; N, nucellus.

    图  13  油松胚珠纵切(第3年5月2日)

    A.油松胚珠纵切面观; B. A的局部放大; AIC.颈卵器原始细胞; FG.雌配子体; I.珠被; M.珠孔; N.珠心。

    Figure  13.  Longitudinal section of ovule in P. tabuliformis (May 2 in the third year)

    Figure A shows the longitudinal section of ovule in P. tabuliformis; Figure B is the partial enlargement of figure A; AIC, archegonial initial cell; FG, female gametophyte; I, integument; M, micropyle; N, nucellus.

    图  14  油松胚珠纵切(第3年5月9日)

    A.油松胚珠纵切面观; B、C. A的局部放大; D.同一张胚珠切片的雌配子体区域; 箭头所示为雌配子体中已经建成的细胞壁; EC.卵细胞; EN.卵核; FG.雌配子体; I.珠被; JC.套细胞; N.珠心; PV.蛋白泡。

    Figure  14.  Longitudinal section of ovule in P. tabuliformis (May 9 in the third year)

    Figure A shows the longitudinal section of ovule in P. tabuliformis; Figure B-C are the partial enlargements of figure A; Figure D shows the female gametophyte in the same ovule section; arrowheads indicate the established cell wall; EC, egg cell; EN, egg nucleus; FG, female gametophyte; I, integument; JC, jacket cell; N, nucellus; PV, proteid vacuole.

    图  15  油松胚珠纵切(第3年5月16日)

    A.油松胚珠纵切面观; B. A的局部放大; EC.卵细胞; EN.卵核; FG.雌配子体; I.珠被; N.珠心; S.精子。

    Figure  15.  Longitudinal section of ovule in P. tabuliformis (May 16 in the third year)

    Figure A shows the longitudinal section of ovule in P. tabuliformis;Figure B is the partial enlargement of figure A;EC, egg cell;EN, egg nucleus;FG, female gametophyte;I,integument;N, nucellus;S, sperm

    图  16  油松成熟胚纵切(第3年9月1日)

    A.油松成熟胚纵切面观; B ~ D. A的局部放大, B为苗端区, C为下胚轴区, D为根端区; Co.子叶; CT.柱状组织; EC.胚皮层; EE.胚表皮; FG.雌配子体; Pi.髓; Pr.原形成层; RA.根端; RC.根冠; RCT.环柱组织; RPC.根原始细胞; SA.苗端。

    Figure  16.  Longitudinal section of mature embryo in P. tabuliformis (September 1 in the third year)

    Figure A shows the longitudinal section of P. tabuliformis mature embryo; figure B, C and D are the partial enlargements of figure A, and show the regions of shoot apex, hypocotyl and root apex, respectively; Co, cotyledon; CT, columnar tissue; EC, embryonic cortex; EE, embryonic epidermis; FG, female gametophyte; Pi, pith; Pr, procambia; RA, root apex; RC, root cap; RCT, ring columnar tissue; RPC, root primary cell; SA, shoot apex.

    图  17  油松大孢子叶球的形态及解剖学发生发育过程

    箭头所示为大孢子叶球; “Ⅰ”、“Ⅱ”和“Ⅲ”分别表示大孢子叶球整个发育过程的第1年、第2年和第3年。

    Figure  17.  Morphology and anatomy process of ovulate strobilus generation and development in P.tabuliformis

    Arrowheads indicate the ovulate strobilus; "Ⅰ", "Ⅱ" and "Ⅲ" indicate the first, second and third year in the process of ovulate strobilus generation and development, respectively

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出版历程
  • 收稿日期:  2016-12-21
  • 修回日期:  2017-05-15
  • 刊出日期:  2017-06-01

油松大孢子叶球发生发育的形态与解剖学观察

doi: 10.13332/j.1000-1522.20160411
    基金项目:

    国家自然科学基金项目 30671655

    国家自然科学基金项目 31170563

    国家自然科学基金项目 30371144

    作者简介:

    张敏, 博士生.主要研究方向:树木生长发育及其调控.Email: zhangmin1990@bjfu.edu.cn   地址:100083 北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院

    通讯作者: 郑彩霞, 教授, 博士生导师.主要研究方向:树木生长发育及其调控.Email: zhengcx@bjfu.edu.cn   地址:同上
  • 中图分类号: S718.47

摘要: 为了准确掌握油松大孢子叶球发生发育过程的外部形态特征及内部胚珠生长的解剖学特征,建立其外部形态和内部组织发育的对应关系,本研究采用形态观测和石蜡切片法,在2013—2016年对北京地区油松大孢子叶球,从花芽分化到种子成熟的过程进行了形态学和解剖学观察。结果显示:北京地区油松的花芽在第1年8月初分化,9月底大孢子叶球原基形成。原基在冬季休眠,至第2年春季继续发育。大孢子叶球在4月初从形态学上可辨,到4月10日左右,胚珠进行细胞分化,此时,大孢子叶球纵径约为5.0 mm。大孢子母细胞在4月20日左右形成,随后进行减数分裂形成功能大孢子。至5月10日左右,大孢子叶球接受小孢子叶球的传粉,随后,珠鳞的颜色由红转绿再逐渐变为棕色。同时,球果缓慢长大,其胚珠内的功能大孢子进行几次分裂,在6月初形成16~32个核的雌配子体,胚珠发育进入游离核分裂期。球果在冬季转入休眠,此时,大孢子叶球纵径约为11.0 mm。至第3年春季,胚珠内部的雌配子体继续发育,4月20日左右含有几千个游离核,此时,大孢子叶球纵径约为21.0 mm。雌配子体在4月30日左右进入细胞化时期,5月初颈卵器开始发育,形成卵细胞,此时,大孢子叶球生长至37.0 mm。待卵细胞在5月10日左右发育成熟时,雌配子体细胞化过程也全部结束。在雌配子体发育、球果长大的同时,珠鳞的颜色逐渐复绿。受精于5月20日左右进行,此时,大孢子叶球纵径约为45.0 mm。受精后,胚胎不断发育。球果在7月10日长约58.0 mm,之后略有萎缩,珠磷逐渐木质化成为种磷。至10月底,球果开裂,长约53.0 mm,种子成熟并弹出。北京地区油松的大孢子叶球从花芽分化、原基形成、胚珠分化、大孢子母细胞产生与分裂、传粉、雌配子体与颈卵器发育、卵细胞成熟、受精、胚胎发育至大孢子叶球成熟形成种子,历时2年2个月。本研究为裸子植物大孢子叶球发生发育的相关研究提供了形态学和解剖学依据。

English Abstract

张敏, 张唯, 宫再欣, 郑彩霞. 油松大孢子叶球发生发育的形态与解剖学观察[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(6): 1-12. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160411
引用本文: 张敏, 张唯, 宫再欣, 郑彩霞. 油松大孢子叶球发生发育的形态与解剖学观察[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(6): 1-12. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160411
ZHANG Min, ZHANG Wei, GONG Zai-xin, ZHENG Cai-xia. Morphologic and anatomical observations in the process of ovulate strobilus generation and development in Pinus tabuliformis[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(6): 1-12. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160411
Citation: ZHANG Min, ZHANG Wei, GONG Zai-xin, ZHENG Cai-xia. Morphologic and anatomical observations in the process of ovulate strobilus generation and development in Pinus tabuliformis[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(6): 1-12. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160411
  • 孢子叶球(strobilus)是裸子植物的生殖器官,是由孢子叶按一定顺序着生在茎枝末端或叶腋所形成的球果状或穗状结构。由大孢子叶聚生形成的孢子叶球为大孢子叶球(ovulate strobilus),又称“雌球花”。松杉类植物成熟的大孢子叶球习称球果(cone)。球果成熟时,珠鳞(大孢子叶)发育成种鳞,球果内的胚珠(ovule)发育为种子。胚珠是植物有性生殖基本过程,如雌配子体形成、受精作用、胚胎发生以及种子发育等发生的场所[1]。它的形成及发育,在植物二倍体世代和单倍体世代交替进行的生活史中,占有核心地位[2]。胚珠发育的基本步骤包括原基的启动和特化、细胞的定向分裂和增长、不对称生长及分化等[3]。胚珠发育成熟后,其产生的卵细胞受精并发育为胚;珠被(integument)发育为种皮;雌配子体细胞发育为胚乳,为胚的发育提供营养物质。胚珠的发育过程伴随着显著的形态变化,且相关基因一旦发生突变,往往造成雌性不育,这些特点为遗传分析研究提供了极大的方便[4-12]。因此,作为胚珠发生和发育的载体,大孢子叶球的发生和发育过程是研究器官的形态发生和模式建成机制的理想系统。

    裸子植物的种子裸露,无果皮包被[13],与被子植物相比较原始。由于裸子植物既保留孢子植物的部分特征,如苏铁(Cycas revoluta)和银杏(Ginkgo biloba)可产生独特的多鞭毛精子[14],又具有被子植物的进化特征,如买麻藤科(Gnetaceae)具有双受精现象[15],所以裸子植物在植物系统演化中处于进化节点,具有重要的研究价值。油松(Pinus tabuliformis)是我国特有树种,属于裸子植物门(Gymnospermae)松科(Pinaceae)松属的常绿乔木。其从花芽分化到种子成熟需要的时间很长[16],是研究裸子植物胚珠发育分子调控机制的极好材料,而在形态学和解剖学水平上对大孢子叶球整个发育阶段的确定则是该项工作的基础和关键点之一。曹慧娟[17]在1981年对裸子植物雌配子体的发育阶段作出过简要介绍。张云中等[18]对北京地区8年生油松进行了顶端结构的解剖观察和组织化学研究,确定了大孢子叶球的生理发端期为8月24日。张华新等[19]对河南卢氏县油松大、小孢子的形成、受精及胚胎发育过程进行了比较系统的观察,指出雌球花在第1年7月中旬分化,种子于第3年9月底成熟。此后,吴鸿等[20]对西北大学校园内油松的雌球花从原基发生至胚珠分化的过程进行了解剖学描述。周丽红等[16]对北京地区油松胚珠从胚珠分化至受精前的发育过程进行了研究,表明油松大孢子叶球的整个发育进程确实比较缓慢,但是在第3年4月中旬至5月底,胚珠内将发生颈卵器发生至成熟、雌配子体细胞化完成、受精及原胚形成等生物过程,发育阶段连续而密集。Zhang等[21]对油松颈卵器的发生发育过程进行了描述,并就卵细胞中蛋白泡的变化和新细胞质传递的问题进行了讨论。先前的研究或仅对大孢子叶球发生发育过程中的一个或几个阶段,或仅对其内部解剖结构进行观察,而未对相应的花芽或球果外观的形态结构特点作出描述。由于油松大孢子叶球发生发育的过程历时长,外部形态学变化大,加之此进程因地域不同而不同,仅掌握其解剖学结构特点,而不清楚其外部形态结构与内部解剖结构的对应关系,仍旧不能满足在较长发育周期中,在1年生和2年生球果同时存在的情况下精准采样的需要,给样品采集及后续相关研究带来了困扰。所以,针对大孢子叶球外观发育的形态学特性与其内部胚珠发育的解剖学特征进行的相对应的观察和研究,亟需完整、详细的阐述。

    本研究于2013—2016年采用形态观测和石蜡切片法对北京地区油松大孢子叶球,从花芽分化到种子成熟的发育过程进行了形态学和解剖学观察,旨在准确掌握油松大孢子叶球发生发育过程的外部形态特征及内部胚珠生长的解剖学特征,建立其外部形态和内部组织发育的对应关系,为精确采集样品和进一步研究油松胚珠发育的分子调控机制奠定基础。

    • 本实验所取花芽及球果采集自北京林业大学校园内3株油松树冠的相同部位,从2013年7月至2016年10月连续观察采样。实验进行2周期,每周期的第1年7月初至第3年4月中旬采样间隔时间为10 d,第3年4月中旬至5月底采样间隔时间为1 d,6月至10月采样间隔时间为10 d[16, 19]

    • 从2013年初秋至2016年夏末,以上述采样周期对北京林业大学内油松大孢子叶球发育关键时期的外观形态进行观察记录,得到花芽及球果外观的形态学照片及纵径数据。

    • 将采回的雌球果中的胚珠即刻剥出,FAA固定,抽气0.5~1 h,4 ℃保存。采集到的花芽清洗后固定、抽气并保存。将材料用经典石蜡切片法制成永久切片。番红-固绿对染或苏木精-伊红染色,在Leica光学显微镜下观察并照相。

    • 北京地区油松大孢子叶球的发生及发育过程,在形态学水平分为如下阶段。

      1) 在第1年7月,新芽形成,冬季休眠。如图 1所示,在7月20日枝条顶端可见新芽(图 1A),数目为一至几个不等。随后,新芽缓慢伸长,至11月20日后停止生长,开始休眠(图 1B~1C)。

      图  1  油松花芽

      Figure 1.  Flower buds of P. tabuliformis

      2) 新芽在第2年春季继续发育,不断伸长(图 1D~1H)。

      3) 在第2年初夏前,小孢子叶球发育成熟,进行传粉。如图 2A所示,至第2年4月20日,由花芽发育而来的新枝明显伸长。大孢子叶球单个或几个着生于新枝的近顶端(图 2B箭头所示),由许多珠鳞螺旋排列在球花的轴上构成。在5月10日左右,大孢子叶球接受小孢子叶球的传粉,花粉粒借风力传播(图 2C)。

      图  2  油松新枝及球果

      Figure 2.  Shoots and ovulate strobilus of P. tabuliformis

      4) 从第2年5月中旬开始,球果缓慢长大,珠鳞的颜色由红转绿后变为棕色(图 3图 4)。此后,球果生长缓慢,冬季休眠(图 4图 5A~5B)。

      图  3  油松球果(第2年5月10日—11月30日)

      Figure 3.  Cones of P. tabuliformis (from May 10 to November 30 of the second year)

      图  4  油松球果纵径(第2年5月10日—第3年5月10日)

      Figure 4.  Longitudinal diameter of cones in P. tabuliformis (from May 10 of the second year to May 10 of the third year)

      图  5  油松球果(第3年1月10日—5月10日)

      Figure 5.  Cones of P.tabuliformis (from January 10 to May 10 of the third year)

      5) 从第3年3月到10月,球果及种子逐渐发育成熟。在3月20日球果仅长12.0 mm(图 4图 5C),随后每隔10 d长5.0 mm(图 4图 5D~5H),同时珠鳞的颜色逐渐复绿。球果在5月10日长达39.0 mm(图 4图 5H),至5月20日明显增长至约50.0 mm(图 6A图 7),之后缓慢增长(图 6B~6F图 7)。到7月10日球果长约60.0 mm(图 6F图 7),随后增长不明显,甚至略有萎缩(图 6G~6K图 7)。在球果不断长大、种子发育成熟的过程中,珠磷木质化成为种磷。至10月底,球果开裂,种子成熟并弹出(图 6L)。

      图  6  油松球果(第3年5月20日—10月30日)

      Figure 6.  Cones of P. tabuliformis (from May 20 to October 30 of the third year)

      图  7  油松球果纵径(第3年5月20日—10月10日)

      Figure 7.  Longitudinal diameter of cones in P. tabuliformis (from May 20 to October 10 of the third year)

    • 随着油松大孢子叶球外部形态的变化,其内部的组织也在不断发育,整个过程分为如下阶段。

      1) 原基发生。如图 8所示,在第1年8月20日新芽的芽鳞(bud scale)之间可见腋芽原基(axillarybud primordium),但尚未有形态上的差异(图 8A~8B)。位于新芽最顶端体积较大的腋芽原基(图 8C)随后将发生可辨的形态变化,形成雌球花原基。

      图  8  油松新芽及胚珠的发育

      Figure 8.  Development of buds and ovules in P. tabuliformis

      2) 胚珠细胞分化。在第2年春季4月10日左右,油松新枝顶端深处已经出现了幼嫩的胚珠,由图 8D可见其珠心(nucellus)组织表皮细胞排列整齐,深处为一团幼嫩的细胞群;珠被包围珠心,其顶端开口为珠孔(micropyle)。此时油松胚珠处于细胞分化期。

      3) 大孢子母细胞发育。至4月20日,油松1年生球果珠心组织的中央可见大孢子母细胞(megaspore mother cell),细胞及细胞核的体积比其他细胞大(图 9)。此后,大孢子母细胞将分裂产生功能大孢子。

      图  9  油松胚珠纵切(第2年4月20日)

      Figure 9.  Longitudinal section of ovule in P. tabuliformis (April 20 in the second year)

      4) 雌配子体游离核分裂。功能大孢子发育成熟后进行多次分裂,胚珠在6月初进入雌配子体游离核分裂期。由图 10可见,至9月10日,油松1年生球果的胚珠中有数十个游离核(free nucleus)围绕在中央大液泡(vacuole)周围,但不形成细胞壁。此后,游离核不再分裂,胚珠越冬休眠。

      图  10  油松胚珠纵切(第2年9月10日)

      Figure 10.  Longitudinal section of ovule in P. tabuliformis (September 10 in the second year)

      至第3年4月20日左右,在油松两年生球果的胚珠中,雌配子体增大,游离核继续分裂,数目达几千个(图 11A),但仍未形成细胞壁(图 11B)。

      图  11  油松胚珠纵切(第3年4月20日)

      Figure 11.  Longitudinal section of ovule in P. tabuliformis (April 20 in the third year)

      5) 雌配子体细胞化。由图 12可见,在4月30日以后,雌配子体进一步增大,游离核开始形成细胞壁(箭头所示)。胚珠发育进入雌配子体细胞化时期。

      图  12  油松胚珠纵切(第3年4月30日)

      Figure 12.  Longitudinal section of ovule in P. tabuliformis (April 30 in the third year)

      6) 颈卵器发育。在5月2日左右的油松2年生球果的胚珠中,雌配子体近珠孔端有细胞明显分化,形态异于周围细胞,形成颈卵器原始细胞(archegonial initial cell)(图 13)。

      图  13  油松胚珠纵切(第3年5月2日)

      Figure 13.  Longitudinal section of ovule in P. tabuliformis (May 2 in the third year)

      至5月9日,颈卵器原始细胞经一系列分裂形成卵细胞(egg cell)(图 14A)。卵细胞被套细胞(jacket cell)包围,体积大,内含很多蛋白泡(proteid vacuole)(图 14B)。卵核(egg nucleus)位于珠孔端,核质呈颗粒状(图 14C)。此时的卵细胞已经成熟,等待受精。随着卵细胞的发育成熟,雌配子体细胞化过程也完全结束(图 14D)。

      图  14  油松胚珠纵切(第3年5月9日)

      Figure 14.  Longitudinal section of ovule in P. tabuliformis (May 9 in the third year)

      7) 受精。如图 15所示,油松的2个精子大小不等,大的精子直径为45~50 μm,小精子为25~30 μm。受精时,花粉管内的2个精子都进入卵细胞。在5月16日的卵细胞中,可见卵核与2个精子(sperm)共存。随后,较大精子将向卵核移动,小精子留在细胞质中,终解体消失。

      图  15  油松胚珠纵切(第3年5月16日)

      Figure 15.  Longitudinal section of ovule in P. tabuliformis (May 16 in the third year)

      8) 种子成熟。受精作用完成后,合子不断分裂最终形成成熟胚。由图 16可见,在9月1日,胚体的较上部有1~2个横列的根原始细胞(root primary cell)。其侧面的细胞向上倾斜,越到周缘斜度越大,呈弧形(图 16A)。在弧之下为根冠(root cap)区域,细胞呈纵向行列,分为柱状组织(columnar tissue)和环柱组织(ring columnar tissue)。柱状组织位于根冠的中心,细胞排成长的纵行。环柱组织位于根冠的周缘,细胞呈径向伸长。被根冠包在内部的胚轴为根端(root apex)(图 16D)。胚轴包含中间的髓(pith)和周围的原形成层(procambia)。可见髓细胞比周围细胞着色淡,体积大;原形成层细胞染色较深,细胞伸长。胚轴外层的几层细胞是胚皮层(embryonic cortex),与根冠环柱组织细胞特征一致,两者没有明显界线,但细胞的行数从胚皮层到根冠环柱组织有所增加(图 16C)。胚的外面一层细胞是胚表皮(embryonic epidermis)。胚轴的另外一端为苗端(shoot apex)。如图 16B所示,油松成熟胚的苗端为圆锥形,高约200 μm,宽约370 μm,周围被子叶(cotyledon)包住。苗端细胞处于静止状态,没有分区现象。

      图  16  油松成熟胚纵切(第3年9月1日)

      Figure 16.  Longitudinal section of mature embryo in P. tabuliformis (September 1 in the third year)

    • 将油松大孢子叶球发生发育过程中的形态与解剖学观察结果进行比对可知:油松在第1年秋季新芽纵径约为7.0 mm时,内部芽鳞间的腋芽原基正在发育。至第2年春季初生大孢子叶球纵径约为5.0 mm时,内部出现幼嫩的胚珠,胚珠细胞正在分化。到大孢子叶球纵径约为6.0 mm时,胚珠中央可见大孢子母细胞。在第2年秋季大孢子叶球纵径约为11.0 mm时,胚珠的中央大液泡周围存在数十个游离核,细胞壁未形成。到第3年春季大孢子叶球纵径约为21.0 mm时,胚珠中游离核的数目达几千个,细胞壁未形成。至大孢子叶球纵径约为31.0 mm时,胚珠中的雌配子体开始形成细胞壁;约为37.0 mm时,颈卵器原始细胞分化;约为43.0 mm时,颈卵器、卵细胞发育成熟,雌配子体细胞化完成。至胚珠内进行受精作用时,大孢子叶球纵径约为45.0 mm。在第3年秋季大孢子叶球纵径约为53.0 mm时,球果内可见成熟胚(见图 17)。

      图  17  油松大孢子叶球的形态及解剖学发生发育过程

      Figure 17.  Morphology and anatomy process of ovulate strobilus generation and development in P.tabuliformis

    • 油松大孢子叶球的生长期经历2次冬季休眠,本研究是对其整个过程的外部形态和内部组织发育的完整观察。北京地区油松的大孢子叶球从花芽分化、原基形成、胚珠分化、大孢子母细胞产生与分裂、传粉、雌配子体与颈卵器发育、卵细胞成熟、受精、胚胎发育至大孢子叶球成熟形成种子,共历时2年2个月。与前人所观察到的北京地区油松颈卵器的发育过程不同的是,本研究表明从颈卵器原始细胞分化至卵细胞发育成熟一般仅需1周左右的时间,即颈卵器原始细胞在5月2日左右产生,至5月9日左右可在胚珠中观察到成熟的卵细胞。此外,多数松科植物大孢子叶球的发育过程持续时间较长,如,云南松(Pinus yunnanensis)的大孢子叶球从胚珠细胞分化至受精作用发生历时1年3个月[26],白皮松(Pinus bungeana)的大孢子叶球从传粉至受精持续1年1个月[28],分别与油松大孢子叶球发育的相应过程相似。不过也存在例外,如,金钱松(Pseudolarix amabilis)的大孢子叶球从胚珠原基发生到卵细胞成熟历时5个月,持续时间较短[32]

      在油松等松杉类植物大孢子叶球的发育过程中,卵细胞的内含物一直是研究热点。油松成熟的卵细胞具有2种大小不同的细胞质内含物,即“蛋白泡(proteid vacuole)”。研究者在多种松杉类植物的卵细胞内也观察到了蛋白泡的存在[22-26]。大蛋白泡邻近细胞壁,被双层膜包围,呈圆形或椭圆形,由改变了原有结构和形状的质体形成;小蛋白泡紧邻卵核,被单层膜包围,呈斑粒状,由胞质封闭区域的内质网小泡形成[27]。蛋白泡在成熟的卵细胞中数量最多,受精后开始减少,当原胚柄伸长时基本消失[28]。因此认为蛋白泡的出现和消亡与受精作用有一定的相关性,并推测蛋白泡为卵细胞的受精过程提供营养[29-33]。但在松杉类植物中,对蛋白泡作用的上述推论仍待进一步确定。

      总之,本研究对油松大孢子叶球的发生发育过程进行形态学和解剖学观测,建立其外部形态和内部组织发育的对应关系,为样品的精确采集提供了理论依据。此后,应继续对油松胚珠进行相关的生理生化指标测定,在分子水平进行蛋白质组学及转录组学的分析,为研究油松胚珠发育的分子调控机制奠定基础,拓展木本植物发育生物学的研究领域。

参考文献 (33)

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