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毛白杨杂种三倍体的2n雌配子形成途径鉴定

旻昱 康宁 索玉静 田菊 康向阳

旻昱, 康宁, 索玉静, 田菊, 康向阳. 毛白杨杂种三倍体的2n雌配子形成途径鉴定[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(5): 17-24. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170001
引用本文: 旻昱, 康宁, 索玉静, 田菊, 康向阳. 毛白杨杂种三倍体的2n雌配子形成途径鉴定[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(5): 17-24. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170001
MIN Yu, KANG Ning, SUO Yu-jing, TIAN Ju, KANG Xiang-yang. Origin identification of 2n female gamete of Populus tomentosa triploid hybrids[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(5): 17-24. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170001
Citation: MIN Yu, KANG Ning, SUO Yu-jing, TIAN Ju, KANG Xiang-yang. Origin identification of 2n female gamete of Populus tomentosa triploid hybrids[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(5): 17-24. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170001

毛白杨杂种三倍体的2n雌配子形成途径鉴定

doi: 10.13332/j.1000-1522.20170001
基金项目: 

国家自然科学基金项目 31470667

内蒙古自治区科技重大专项 2014

北京市共建项目专项 2016BLREEE00

详细信息
    作者简介:

    旻昱。主要研究方向:林木倍性育种。Email : minyu421@126.com  地址:100083 北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院

    通讯作者:

    康向阳,教授,博士生导师。主要研究方向:林木倍性育种与细胞遗传学。Email: kangxy@bjfu.edu.cn   地址:同上

  • 中图分类号: S718.46;S792.117

Origin identification of 2n female gamete of Populus tomentosa triploid hybrids

  • 摘要: 由于受杨树大孢子母细胞减数分裂不同步性影响,通过施加理化处理诱导杨树大孢子染色体加倍授粉杂交获得的三倍体,可能既包括来源于第一次减数分裂核复原形成的2n雌配子(FDR),也有来源于第二次减数分裂核复原形成的2n雌配子(SDR),难以进行表型鉴别,而通过分子标记分析可以实现不同类型2n雌配子的区分。本研究以通过高温诱导毛白杨大孢子染色体加倍所获得的87株三倍体及其亲本为材料,从母本杂合且与父本有差异的SSR多态性引物中,筛选出5对适宜于2n配子诱导途径来源鉴定的重组率较低的SSR分子标记。在此基础上,利用这5对低重组率SSR分子标记,开展毛白杨杂种三倍体的2n雌配子诱导途径来源分析。结果表明,不同毛白杨杂种三倍体的2n雌配子相应简单重复序列区域的等位基因配置不同,利用筛选出的5对低重组率SSR标记可以实现毛白杨杂种三倍体的2n雌配子诱导途径鉴定,其中35株三倍体来源于FDR型2n配子,另52株来源于SDR型2n配子。此外,选用5个位于高重组率位点的SSR引物进行检测分析,结果验证了随机挑选的SSR引物用于鉴别结果是不完全可靠的,只有挑选低重组率的SSR位点才可能准确鉴定2n配子来源。开展毛白杨杂种三倍体的2n配子诱导途径鉴定研究,对于FDR、SDR不同形成途径的2n配子传递亲本杂合性分析,以及毛白杨三倍体育种策略制定等具有重要意义。
  • 图  1  毛白杨杂种三倍体SSR毛细管电泳分析

    亲本及三倍体子代植株在5对SSR位点处检测到的毛细管电泳结果。母本‘3119’及父本‘YX1’在所有位点多态且父、母本间没有相同等位基因,a、b、c、d代表父、母本的SSR位点所检测到的不同等位基因。异源三倍体植株的等位基因配置分为F型与S型两种类型,在F型中,母本所有杂合等位基因全部传递至三倍体中;在S型中,母本杂合等位基因中的1个以2倍剂量传递至三倍体中。GCPM_1577、GCPM_1120、GCPM_1153、GCPM_1390-1、GCPM_1175为研究中所应用的5对低重组率SSR引物。

    Figure  1.  Allelic configurations of the triploid hybrids

    Results of capillary electrophoresis for the five SSR markers were detected in two parents and triploid hybrids. Both female parent '3119' and male parent 'YX1' were heterozygous and two distinct alleles were detected at all loci. 'a', 'b', 'c', 'd' present different alleles detected at SSR loci of parents.The allelic configurations of the triploid hybrids were divided into two types, which were previously named F type and S type. In the F type allelic configuration, both female parent 3119 alleles were transmited to the triploid hybrid, whereas only one of two female parent 3119 alleles was transmited to the triploid hybrid in the S type allelic configuration. GCPM_1577、GCPM_1120、GCPM_1153、GCPM_1390-1、GCPM_1175 were the SSR primers applied in this study with low recombination rate.

    表  1  PCR扩增反应体系配置表

    Table  1.   Configuration of PCR reaction system

    成分
    Configuration
    体积
    Volume/μL
    无菌ddH2O Sterile double distilled water 7.20
    模板DNA DNA mould 2.00
    5′端接有M13序列的上游引物Forward primer with an universal primer M13 tail at the 5′end 0.08
    下游引物Reverse primer 0.32
    荧光引物(ROX,FAM,TAMRA,HEX) Fluorescently labeled primer(ROX,FAM,TAMRA,HEX) 0.40
    PCR Mix 10.00
    总体系Total system 20.00
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    表  2  适合毛白杨2n配子诱导途径鉴定的低重组率多态性SSR位点信息

    Table  2.   Information of SSR loci with low recombination frequencies

    标记名称
    Marker
    所在染色体
    Chromosome
    No.
    重复单元
    Repeat
    motif
    引物序列(5′→3′)
    Primer sequence
    (5′→3′)
    检测等位基因
    Detected allele/bp
    位点距着丝粒距离与
    所在臂长之比
    Ratio of distance from
    centromere of loci to
    chromosome arm length/%
    母本
    Female
    parent
    父本
    Male
    parent
    GC_1153 11 CTT 上游Forward TTCCTTTCACACAATGACAA 178/181 172/175 10.79
    下游Reverse TTTAAAAACTGGGTCCGTAA
    GC_1175 14 CTT 上游Forward TCATCAACCTGACCTCTACC 191/210 194/197 10.80
    下游Reverse CAAAGCAAAAACAAACACAA
    GC_1577 18 TA 上游Forward GAGAACATGTCAGCAGTTCA 238/242 234/240 16.44
    下游Reverse GCTTAAACATTGAGAAAGCG
    GC_1120 10 TAA 上游Forward TGCAAATCCAAACACAGATA 237/261 228/231 25.41
    下游Reverse ACGAATCATCTTACGCACTT
    GC_1390-1 13 CA 上游Forward CAAGAACGGTAAAATGCTTC 244/276 239/253 30.78
    下游Reverse TCCATTTTCCAAATCCTAAA
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    表  3  大孢子染色体加倍来源的毛白杨三倍体SSR分子标记鉴定

    Table  3.   Genetic composition of the 87 Populus tomentosa triploids analyzed by 5 SSR markers with low hDNA frequencies

    2n配子类型2n gamete type 基因配置类型Gene configuration 三倍体数Number of triploids 株数Total number
    FDR 5F0S 1 35
    4F1S 9
    3F2S 25
    SDR 2F3S 24 52
    1F4S 18
    0F5S 10
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    表  4  高重组率多态性SSR位点具体信息

    Table  4.   Information of SSR loci with high recombination frequencies

    标记名称
    Marker
    所在染色体
    Chromosome No.
    重复单元
    Repeat motif
    引物序列(5′→3′)
    Primer sequence
    (5′→3′)
    检测等位基因
    Detected allele/bp
    位点距着丝粒距离与
    所在臂长之比
    Ratio of distance from
    centromere of loci to
    chromosome arm length/%
    母本
    Female
    parent
    父本
    Male
    parent
    GCPM_2615 6 CTTT 上游Forward ATGTCAACGTCACTGACAAA 230/238 228/235 99.07
    下游Reverse ATTAGGCAATGCAGAACACT
    GCPM_3310-1 8 GAG 上游Forward GCCTCATCATGCTTCTAAAC 222/228 231/237 86.41
    下游Reverse CATGAACCTTCCACCATTAT
    GCPM_1418-1 16 CT 上游Forward GTACACTCAGCTGTGGTCCT 204/216 230/238 95.50
    下游Reverse TGGGAGTCATGAAATCTACC
    ORPM_422 1 TAA 上游Forward TGCAAATCCAAACACAGATA 222/234 218/232 81.36
    下游Reverse ACGAATCATCTTACGCACTT
    GCPM_719 15 AG 上游Forward AAAGTTATGCTTCAAGCCAG 211/239 207/227 80.57
    下游Reverse AAGGGTTGCAACTTTTCATA
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    表  5  SDR型(1F5S)三倍体在高重组率SSR位点的等位基因组成

    Table  5.   Allelic configurations of SDR triploids at the SSR loci with high recombination frequencies

    三倍体Triploid GCPM_2615 GCPM_3310 GCPM_1418-1 ORPM_422 GCPM_719
    SDR-1 Ho He He Ho Ho
    SDR-2 He He He Ho He
    SDR-3 He He He He He
    SDR-4 He He He He He
    SDR-5 He He He He He
    SDR-6 He He He He He
    SDR-7 He Ho Ho He Ho
    SDR-8 Ho He He He He
    SDR-9 He He Ho He He
    SDR-10 He He Ho He He
    注:He代表杂合型;Ho代表纯合型。Note: He, heterozygous; Ho, homozygous.
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    , 王晓楠, 刘玉军, 尹伟伦, 谢磊, 冯仲科, 严晓素, 高荣孚, 李凯, 郭晓萍, 冯晓峰, 温秀凤3, 于京民2, 吴坚, 赵兵, 王瑛, 王冬梅, 王玉兵, 邹坤, 骈瑞琪, 王华芳, 王建中, 李凤兰, 王民中, 丁霞, 陶凤杰, 张兴杰, 孙建华, 张庆, 刘玉军, 陈卫平, 杨伟光, 王玉春, 李镇宇, 刘艳, 林善枝, 呼晓姝, 沈应柏, 赵新丽, 付瑞海, 马建海, 蒋平, 汪植.  毛白杨叶片离体再生培养的基因型效应 . 北京林业大学学报, 2007, 29(5): 38-43.
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    , 严晓素, 赵兵, 高荣孚, 于京民2, 王建中, 尹伟伦, 王玉兵, 王晓楠, 李凯, 谢磊, 张志翔, 刘玉军, 冯仲科, 王民中, 杨伟光, 张兴杰, 林善枝, 丁霞, 刘玉军, 陈卫平, 孙建华, 沈应柏, 李凤兰, 刘艳, 李镇宇, 陶凤杰, 王玉春, 张庆, 呼晓姝, 蒋平, 赵新丽, 汪植, 马建海, 付瑞海.  诱导大孢子染色体加倍选育白杨杂种三倍体 . 北京林业大学学报, 2007, 29(5): 22-25.
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    ZHAOGuang-jie, 李雪萍, 赵燕东, 李雪峰, 温俊宝, 常德龙, 鲁绍伟, 郑凌凌, 徐文铎, 刘金福, 匡文慧, 程占红, 王玉杰, 温俊宝, 张建国, 白陈祥, 张树文, 何正权, 赵广杰, 李增元, 洪伟, 余新晓, 何友均, 韩士杰, 李吉跃, 翟洪波, LUOWen-sheng, 宋湛谦, 朱天辉, 韩烈保, 吴庆利, 何承忠, 何兴元, 张路平, 吴斌, 骆有庆, 梁小红, 姜伟, 刘凤芹, 郭忠玲, 陈尔学, 骆有庆, 李俊清, 林秦文, 匡秋明, ]魏晓霞, FurunoTakeshi, 张志毅, ]陈玮, 黄文豪, 何静, 张养贞, 童书振, 陈发菊, 许志春, 胡伟华, 张璧光, 庞勇, 曾会明, 赵桂玲, 梁宏伟, 郑兴波, 崔国发, RENQian, 许志春, 张军, 安新民, 张振明, 李颖, PaulWolfgang, 杨凯, 侯伟, 雷渊才, 郑杰, 李福海, 赵广亮, 曹川健, 刘君, 李凤兰, 宋国正, 张有慧, 姚永刚, 董建生, 张全来, 李考学, 田桂芳, 李永波, 赫万成, 李长明, 张世玺.  毛白杨幼林间作效应研究 . 北京林业大学学报, 2006, 28(3): 81-85.
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    ZHAOGuang-jie, 刘金福, 李吉跃, 刘常富, 邹大林, 常德龙, 郑凌凌, 鲁绍伟, 温俊宝, 徐文铎, 李雪萍, 白陈祥, 吴斌, 李增元, 李吉跃, 洪伟, 吴庆利, 韩烈保, 何兴元, 翟洪波, 赵广杰, 温俊宝, 何正权, 何友均, 王玉杰, 宋湛谦, 张树文, 余新晓, 何承忠, 韩士杰, 朱天辉, 张路平, 张建国, LUOWen-sheng, 刘凤芹, 李俊清, 骆有庆, 陈发菊, 骆有庆, 何静, 黄文豪, 匡秋明, 张养贞, 陈尔学, 张志毅, 姜伟, 郭忠玲, ]陈玮, FurunoTakeshi, 林秦文, ]魏晓霞, 童书振, 梁小红, 安新民, 庞勇, 张振明, 梁宏伟, 李颖, 许志春, 张军, 胡伟华, 崔国发, 张璧光, 郑兴波, 许志春, RENQian, 赵桂玲, 曾会明, PaulWolfgang, 刘君, 宋国正, 雷渊才, 曹川健, 侯伟, 李福海, 杨凯, 郑杰, 李凤兰, 赵广亮, 姚永刚, 董建生, 张全来, 张有慧, 李考学, 田桂芳, 李永波, 赫万成, 李长明, 张世玺.  毛白杨ISSR反应体系的建立及优化 . 北京林业大学学报, 2006, 28(3): 61-65.
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    王保平, 李全发, 王明枝, 杨晓晖, 张秋英, 李慧, 李景文, 熊瑾, 李梅, 杨海龙, 詹亚光, 李俊清, 张克斌, 韩海荣, 李吉跃, 范文义, 朱金兆, 朱金兆, 耿晓东, 赵敏, 徐峰, 梁机, 王洁瑛, 王雪军, 吕建雄, 窦军霞, 秦瑶, 刘文耀, 李发东, 李俊清, 李妮亚, 陆熙娴, 陈晓阳, 尹立辉, 秦素玲, 陈素文, 赵宪文, 倪春, 李凤兰, 孙玉军, 刘雪梅, 陈晓阳, 李云, 唐黎明, 毕华兴, 于贵瑞, 欧国强, 乔杰, 沈有信, 刘桂丰, 齐实, 康峰峰, 李黎, 慈龙骏, 赵双菊, 李伟, 魏建祥, 宋献方, 王玉成, 文瑞钧, 马钦彦, 张桂芹, 李伟, 韦广绥, 任海青, 王雪, 黎昌琼, 刘伦辉, 蒋建平, 朱国平, 张万军, 丁霞, 周海江, 杨谦, , 孙涛, 宋清海, 李慧, 孙晓敏, 刘莹, 孙志强, 李宗然, 
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出版历程
  • 收稿日期:  2016-12-28
  • 修回日期:  2017-03-03
  • 刊出日期:  2017-05-01

毛白杨杂种三倍体的2n雌配子形成途径鉴定

doi: 10.13332/j.1000-1522.20170001
    基金项目:

    国家自然科学基金项目 31470667

    内蒙古自治区科技重大专项 2014

    北京市共建项目专项 2016BLREEE00

    作者简介:

    旻昱。主要研究方向:林木倍性育种。Email : minyu421@126.com  地址:100083 北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院

    通讯作者: 康向阳,教授,博士生导师。主要研究方向:林木倍性育种与细胞遗传学。Email: kangxy@bjfu.edu.cn   地址:同上
  • 中图分类号: S718.46;S792.117

摘要: 由于受杨树大孢子母细胞减数分裂不同步性影响,通过施加理化处理诱导杨树大孢子染色体加倍授粉杂交获得的三倍体,可能既包括来源于第一次减数分裂核复原形成的2n雌配子(FDR),也有来源于第二次减数分裂核复原形成的2n雌配子(SDR),难以进行表型鉴别,而通过分子标记分析可以实现不同类型2n雌配子的区分。本研究以通过高温诱导毛白杨大孢子染色体加倍所获得的87株三倍体及其亲本为材料,从母本杂合且与父本有差异的SSR多态性引物中,筛选出5对适宜于2n配子诱导途径来源鉴定的重组率较低的SSR分子标记。在此基础上,利用这5对低重组率SSR分子标记,开展毛白杨杂种三倍体的2n雌配子诱导途径来源分析。结果表明,不同毛白杨杂种三倍体的2n雌配子相应简单重复序列区域的等位基因配置不同,利用筛选出的5对低重组率SSR标记可以实现毛白杨杂种三倍体的2n雌配子诱导途径鉴定,其中35株三倍体来源于FDR型2n配子,另52株来源于SDR型2n配子。此外,选用5个位于高重组率位点的SSR引物进行检测分析,结果验证了随机挑选的SSR引物用于鉴别结果是不完全可靠的,只有挑选低重组率的SSR位点才可能准确鉴定2n配子来源。开展毛白杨杂种三倍体的2n配子诱导途径鉴定研究,对于FDR、SDR不同形成途径的2n配子传递亲本杂合性分析,以及毛白杨三倍体育种策略制定等具有重要意义。

English Abstract

旻昱, 康宁, 索玉静, 田菊, 康向阳. 毛白杨杂种三倍体的2n雌配子形成途径鉴定[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(5): 17-24. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170001
引用本文: 旻昱, 康宁, 索玉静, 田菊, 康向阳. 毛白杨杂种三倍体的2n雌配子形成途径鉴定[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(5): 17-24. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170001
MIN Yu, KANG Ning, SUO Yu-jing, TIAN Ju, KANG Xiang-yang. Origin identification of 2n female gamete of Populus tomentosa triploid hybrids[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(5): 17-24. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170001
Citation: MIN Yu, KANG Ning, SUO Yu-jing, TIAN Ju, KANG Xiang-yang. Origin identification of 2n female gamete of Populus tomentosa triploid hybrids[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(5): 17-24. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170001
  • 杨树多倍体育种实践表明,杨树异源三倍体在生长、材质和抗性等性状方面表现突出[1-7]。三倍体可以通过二倍体与四倍体杂交或者利用未减数配子杂交获得[8-9]。在植物大小孢子发生过程中,减数分裂第一阶段和第二阶段的异常和人工诱变都可能产生2n配子,它们分别被称作第一次减数分裂核复原(first-division restitution,FDR)和第二次减数分裂核复原(second-division restitution,SDR)[10]。据已有研究的结果显示,FDR型2n配子传递亲本杂合性的能力是SDR型2n配子的两倍[11-14]。其差异产生的原因是由于同源重组所致[15]。因此,FDR型2n配子和SDR型2n配子在育种应用和理论研究方面应有所不同,准确鉴别2n配子的诱导途径十分必要。

    共显性分子标记常被用于评估等位基因上的遗传组成,其中简单重复序列(Simple sequence repeat,SSR)是一种常用的共显性标记[16-17]。但是以往的研究多运用少数随机的SSR标记去评估2n配子来源[18-19],导致判别结果产生一定的误差。因为,在减数第一次分裂前期,DNA双链断裂(double-strand breaks,DSBs)触发同源重组,由于酶切方式不同,最终有可能形成交叉互换(crossing over,CO),也有可能未形成交叉互换(noncrossing over,NCO),但两条非姐妹染色单体都会产生异源双链DNA(heteroduplex DNA,hDNA)区域[20-22]。因此,如果同源重组发生并且在一个SSR位点上产生交换,那么本属于FDR型2n配子的三倍体,其的等位基因有50%的可能性显示为SDR型2n配子,而本属于SDR型2n配子的三倍体,其等位基因则100%显示为来源于FDR型2n配子[23]。所以,少量的随机SSR位点并不能用于准确判断杂种三倍体2n配子的来源,应该使用大量、随机SSR位点或选择少数低重组率SSR位点应用于检测。根据Dong等[15]研究可知,杨树hDNA频率与SSR位点距着丝粒位置呈正相关,即SSR位点距着丝粒距离越近,重组率越低,可根据SSR位点距着丝粒的位置,选择较低重组率的SSR位点进行鉴定。

    本研究主要针对前期高温诱导毛白杨大孢子染色体加倍获得的部分三倍体的2n配子诱导途径鉴定问题,探讨利用SSR分子标记准确判别2n配子形成途径的检测方法,包括如何选择低重组率SSR引物,以及大孢子染色体加倍获得的FDR型和SDR型2n雌配子来源的异源三倍体形成途径的准确鉴定等,为进一步开展毛白杨2n配子传递亲本杂合性分析,以及毛白杨多倍体育种策略制定等奠定基础。

    • 本实验室在前期以结实率较高的毛白杨(Populus tomentosa)无性系‘3119’作母本,银腺杨(Populus alba×P. glandulosa)无性系YX1作父本,在授粉前12 h选用39和42 ℃恒温箱中持续处理2和4 h,利用高温诱导大孢子染色体加倍,经过种内杂交获得了87株杂种三倍体。

    • 选取以毛白杨‘3119’为母本,银腺杨‘YX1’为父本,经大孢子染色体加倍并杂交获得的87株三倍体后代的嫩叶样本300 mg,采用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒,根据试剂盒具体操作步骤进行DNA的提取。

    • 根据荧光标记的TP-M13-SSR PCR的方法[24],PCR扩增体系里需要3种引物,包括5′尾端接有M13序列(5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′)的上游引物,普通的下游引物,通用的具有荧光标记(FAM、HEX、TAMRA、ROX等)的M13引物,具体PCR体系见表 1。PCR程序如下:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,60~50 ℃,每30 s降1 ℃,72 ℃ 30 s共11个循环;94 ℃ 30 s,50 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s共20个循环;94 ℃ 30 s,53 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s共8个循环;72 ℃ 7 min,4 ℃保存。

      表 1  PCR扩增反应体系配置表

      Table 1.  Configuration of PCR reaction system

      成分
      Configuration
      体积
      Volume/μL
      无菌ddH2O Sterile double distilled water 7.20
      模板DNA DNA mould 2.00
      5′端接有M13序列的上游引物Forward primer with an universal primer M13 tail at the 5′end 0.08
      下游引物Reverse primer 0.32
      荧光引物(ROX,FAM,TAMRA,HEX) Fluorescently labeled primer(ROX,FAM,TAMRA,HEX) 0.40
      PCR Mix 10.00
      总体系Total system 20.00
    • 本研究使用的SSR引物信息来源于the Populus Molecular Genetics Cooperative (GCPM,PMGC引物)及the Oak Ridge National Laboratory (ORPM引物),所有引物(5′尾端接有M13序列的上游引物,下游引物及通用的M13磷荧光标记引物)由北京睿博兴科有限公司进行合成。PCR产物委托睿博新科生物科技(北京)有限公司在ABI-3730XL基因分析仪上进行测试,其结果应用GeneMarker V2.20软件进行读取及分析。

      应用以上引物,首先筛选出适宜毛白杨鉴定的多态性SSR标记,以母本毛白杨‘3119’与父本银腺杨‘YX1’的DNA为模板进行TP-M13-SSR PCR,筛选在母本中处于杂合状态且与父本有差异的SSR多态性引物。在此基础上,为准确鉴定大孢子染色体加倍获得的2n雌配子的形成途径,应用染色体着丝粒附近,具有低重组率的标记,进行三倍体遗传组成的分析,通过所获得杂种三倍体的等位基因配置信息,判别毛白杨杂种三倍体的2n配子诱导途径。

    • 采用筛选出的适于毛白杨2n配子来源鉴定的多态性SSR引物进行鉴定时,母本2n配子的SSR特异标记可显示为杂合的ab型或纯合的aa或bb型。其中将杂合的ab型记为F型等位基因配置,纯合的aa或bb型记为S型等位基因配置。由Dong等[25]研究可知,青杨(Populus pseudo-simmii)FDR型2n配子传递亲本平均杂合度为74.80%,而SDR型2n配子分别传递亲本平均杂合度为39.58%。该结果也与其他植物中不同类型2n配子传递亲本杂合度研究相似[13-14, 26-27]。以此为根据,筛选多态性符合要求且重组率低的5对SSR引物,分析每个引物位点的信息进行判定。若3个或3个以上的SSR位点显示母本杂合等位基因信息,则判定该异源三倍体植株源自FDR型2n雌配子;如3个或3个以上的SSR位点显示纯合母本等位基因信息,则判定该异源三倍体源自SDR型2n雌配子。

    • 采用SSR分子标记鉴定2n配子诱导途径,筛选的SSR多态性引物首先应满足母本毛白杨‘3119’杂合且与父本银腺杨‘YX1’有差异的基本条件。经毛细管电泳检测,于633对引物中筛选得到26对SSR多态性符合要求的引物,其多态性位点距着丝粒距离与所在臂长之比介于10.79%~99.07%之间。在此基础上,进一步筛选适宜于毛白杨2n配子诱导途径来源鉴定的重组率较低的SSR分子标记,以避免同源重组对2n配子形成途径判别的影响。为此,在初步筛选获得的26个多态性标记中,将每对SSR引物序列通过BLAST搜索与毛果杨基因组Populus trichocarpav3.0(Phytozome v8.0; http://www.phytozome.net)进行对比,确定SSR标记在所在染色体上的准确位置,并与着丝粒位置关联,以超高密度遗传图谱所确定的着丝粒区域为判别依据[28]。最终选取了多态性位点所在位置距着丝粒的距离与所在臂长比值最小的5对SSR引物,比值介于10.79%~30.78%之间,这5对SSR分子标记分别位于第10、11、13、14、18染色体上(表 2)。由于这5对SSR引物位于着丝粒附近,受同源重组影响较小,利于毛白杨大孢子染色体加倍的2n配子诱导途径的准确鉴定。

      表 2  适合毛白杨2n配子诱导途径鉴定的低重组率多态性SSR位点信息

      Table 2.  Information of SSR loci with low recombination frequencies

      标记名称
      Marker
      所在染色体
      Chromosome
      No.
      重复单元
      Repeat
      motif
      引物序列(5′→3′)
      Primer sequence
      (5′→3′)
      检测等位基因
      Detected allele/bp
      位点距着丝粒距离与
      所在臂长之比
      Ratio of distance from
      centromere of loci to
      chromosome arm length/%
      母本
      Female
      parent
      父本
      Male
      parent
      GC_1153 11 CTT 上游Forward TTCCTTTCACACAATGACAA 178/181 172/175 10.79
      下游Reverse TTTAAAAACTGGGTCCGTAA
      GC_1175 14 CTT 上游Forward TCATCAACCTGACCTCTACC 191/210 194/197 10.80
      下游Reverse CAAAGCAAAAACAAACACAA
      GC_1577 18 TA 上游Forward GAGAACATGTCAGCAGTTCA 238/242 234/240 16.44
      下游Reverse GCTTAAACATTGAGAAAGCG
      GC_1120 10 TAA 上游Forward TGCAAATCCAAACACAGATA 237/261 228/231 25.41
      下游Reverse ACGAATCATCTTACGCACTT
      GC_1390-1 13 CA 上游Forward CAAGAACGGTAAAATGCTTC 244/276 239/253 30.78
      下游Reverse TCCATTTTCCAAATCCTAAA
    • 应用筛选出的5对SSR引物对大孢子染色体加倍来源的毛白杨杂种三倍体形成途径进行鉴定。发现每对SSR引物在三倍体子代植株中均可检测到F或S两种基因配置类型,其中在F型基因配置中,所有在该位点的母本杂合信息均保留在三倍体子代中;而在S型基因配置中,母本在该位点的杂合信息中只有1个基因通过复制后保留至三倍体子代中(图 1)。

      图  1  毛白杨杂种三倍体SSR毛细管电泳分析

      Figure 1.  Allelic configurations of the triploid hybrids

      对于大孢子染色体加倍获得的87株毛白杨杂种三倍体而言,一些植株在5个低重组率SSR位点的等位基因配置类型并不一致。根据其在5个SSR位点处F和S型基因配置的个数,将所有毛白杨三倍体植株分为6类,分别命名为5F0S、4F1S、3F2S、2F3S、1F4S和0F5S型三倍体。5F0S类型为5个位点中有5个显示为F型等位基因配置、0个显示为S型等位基因配置的三倍体,4F1S类型为5个位点中,4个显示为F型等位基因配置、1个显示为S型等位基因配置的三倍体,剩余4类依此类推。由于我们选用的5对SSR标记具有较低的重组率,即SSR位点发生等位基因遗传配置改变的可能性很低,5个SSR标记位点上多个位点同时发生基因转换的可能性更低,因此发生FDR及SDR类型转换的情况更少,2n配子来源鉴定更准确。故我们认为,5F0S、4F1S、3F2S型三倍体均源于FDR型2n配子,而2F3S、1F4S和0F5S型三倍体均源于SDR型2n配子。

      最终经统计,在87株以下异源三倍体中,35株三倍体来自FDR型2n配子,其余52株源自SDR型2n配子。

      表 3  大孢子染色体加倍来源的毛白杨三倍体SSR分子标记鉴定

      Table 3.  Genetic composition of the 87 Populus tomentosa triploids analyzed by 5 SSR markers with low hDNA frequencies

      2n配子类型2n gamete type 基因配置类型Gene configuration 三倍体数Number of triploids 株数Total number
      FDR 5F0S 1 35
      4F1S 9
      3F2S 25
      SDR 2F3S 24 52
      1F4S 18
      0F5S 10
    • 为了验证同源重组对毛白杨2n配子诱导途径鉴定的影响,以采用5个低重组率SSR引物鉴定确认的10个1F5S型的毛白杨杂种三倍体为材料,选用5个位于高重组率位点的SSR引物(表 4)进行验证性检测分析。研究结果表明,对于10株通过低重组率SSR引物确定源自SDR型2n配子的1F5S型毛白杨三倍体,在检测的SSR分子标记位点处均只有1个位点显示为F型等位基因配置;但采用5个高重组率SSR引物鉴定,则显示在检测的SSR分子标记位点处分别有2~5个位点显示为F型等位基因配置,其中只有2株毛白杨三倍仍源自SDR型2n配子(表 5)。该结果验证了随机挑选的SSR引物用于鉴别结果是不完全可靠的,只有挑选低重组率的SSR位点才可能用于相对准确分析三倍体等位基因的遗传组成,进而准确鉴定2n配子来源。

      表 4  高重组率多态性SSR位点具体信息

      Table 4.  Information of SSR loci with high recombination frequencies

      标记名称
      Marker
      所在染色体
      Chromosome No.
      重复单元
      Repeat motif
      引物序列(5′→3′)
      Primer sequence
      (5′→3′)
      检测等位基因
      Detected allele/bp
      位点距着丝粒距离与
      所在臂长之比
      Ratio of distance from
      centromere of loci to
      chromosome arm length/%
      母本
      Female
      parent
      父本
      Male
      parent
      GCPM_2615 6 CTTT 上游Forward ATGTCAACGTCACTGACAAA 230/238 228/235 99.07
      下游Reverse ATTAGGCAATGCAGAACACT
      GCPM_3310-1 8 GAG 上游Forward GCCTCATCATGCTTCTAAAC 222/228 231/237 86.41
      下游Reverse CATGAACCTTCCACCATTAT
      GCPM_1418-1 16 CT 上游Forward GTACACTCAGCTGTGGTCCT 204/216 230/238 95.50
      下游Reverse TGGGAGTCATGAAATCTACC
      ORPM_422 1 TAA 上游Forward TGCAAATCCAAACACAGATA 222/234 218/232 81.36
      下游Reverse ACGAATCATCTTACGCACTT
      GCPM_719 15 AG 上游Forward AAAGTTATGCTTCAAGCCAG 211/239 207/227 80.57
      下游Reverse AAGGGTTGCAACTTTTCATA

      表 5  SDR型(1F5S)三倍体在高重组率SSR位点的等位基因组成

      Table 5.  Allelic configurations of SDR triploids at the SSR loci with high recombination frequencies

      三倍体Triploid GCPM_2615 GCPM_3310 GCPM_1418-1 ORPM_422 GCPM_719
      SDR-1 Ho He He Ho Ho
      SDR-2 He He He Ho He
      SDR-3 He He He He He
      SDR-4 He He He He He
      SDR-5 He He He He He
      SDR-6 He He He He He
      SDR-7 He Ho Ho He Ho
      SDR-8 Ho He He He He
      SDR-9 He He Ho He He
      SDR-10 He He Ho He He
      注:He代表杂合型;Ho代表纯合型。Note: He, heterozygous; Ho, homozygous.
    • Ferrante等[18]研究证明了基于SSR位点的共显性表达是测定等位基因组成及多倍体植株来源的可靠方法。实际这种方法并不能解决重组带来的影响。如果一个随机选择的SSR分子标记被用于评估杂种三倍体的遗传组成,并且这个SSR位点发生了同源重组,则将获得相反的结果。例如,在本研究中采用5个低重组率SSR引物鉴定确认的10个1F5S型的毛白杨杂种三倍体,在采用5个高重组率SSR引物鉴定时,其中有8株毛白杨三倍被判定为源自FDR型2n配子,只有2株毛白杨三倍仍判定为源自SDR型2n配子。对于一些杂种三倍体,由于同源重组的影响,2n配子在不同位点上等位基因组成与亲本并不一致,这个结果与Dong等[23]有关青杨杂种三倍体2n配子来源鉴定的研究结果相同。为了减少同源重组对检测杂种多倍体中染色体组来源的影响,保证鉴定结果的准确性,需应用大量随机SSR引物或少量低重组率SSR引物用于检测。Xi等[29]利用了来自19个连锁群的21对SSR随机引物检测美洲黑杨(Peuramericana)杂种三倍体2n雌配子的形成机制,来源于不同连锁群的随机引物并不能减小同源重组对鉴定结果的影响。相对于选择利用大量随机SSR引物进行分析,采用低重组率的SSR分子标记来评估杂种多倍体的遗传组成会更加准确,并且可节省人力、物力。在本研究中,作为研究对象的87株三倍体是施加高温处理诱导毛白杨大孢子染色体加倍得到的,鉴定结果显示在毛白杨无性系‘3119’与银腺杨无性系‘YX1’杂交后所得的杂种三倍体来源于FDR型和SDR型2n雌配子,说明在毛白杨的减数第一次分裂和减数第二次分裂过程中,高温处理都能够有效诱导2n雌配子。但在本研究中所获得的87株杂种三倍体中,有52株三倍体来源于SDR型2n配子,多于源自FDR型2n配子的35株三倍体,推测可能是由于毛白杨‘3119’的雌花芽在施加高温处理时处于较晚发育阶段,处于减数第二次分裂时期比减数第一次分裂时期的花芽数量更多的缘故。

      杨树杂种三倍体营养生长表现突出[2-3, 6-7, 30]。鉴于杨树三倍体在材积生长等遗传改良方面的优势,人工诱导多倍体技术研究进展迅速,在白杨派(Sect. Populus)、青杨派(Sect. Tacamahaca)杨树中已经成功地建立了一套人工诱导配子染色体加倍的有性多倍化途径选育三倍体技术体系[31-36]。由于FDR和SDR型2n配子传递亲本杂合性的差异,其应用应该有所不同,准确鉴定育种中获得的杂种三倍体的基因组成及2n配子形成机制十分重要。本研究所利用的低重组率引物的检测方法,也可用于检测其他树种的遗传组成及2n配子形成机制。

参考文献 (36)

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