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春黄菊族部分植物CYC2d同源基因的分离与功能初步分析

黄笛 孙明 袁存权 程堂仁 王佳 张启翔

黄笛, 孙明, 袁存权, 程堂仁, 王佳, 张启翔. 春黄菊族部分植物CYC2d同源基因的分离与功能初步分析[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(4): 63-71. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170003
引用本文: 黄笛, 孙明, 袁存权, 程堂仁, 王佳, 张启翔. 春黄菊族部分植物CYC2d同源基因的分离与功能初步分析[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(4): 63-71. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170003
HUANG Di, SUN Ming, YUAN Cun-quan, CHENG Tang-ren, WANG Jia, ZHANG Qi-xiang. Isolation and functional analysis of CYC2d orthologous genes from several plants of the tribe Anthemideae[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(4): 63-71. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170003
Citation: HUANG Di, SUN Ming, YUAN Cun-quan, CHENG Tang-ren, WANG Jia, ZHANG Qi-xiang. Isolation and functional analysis of CYC2d orthologous genes from several plants of the tribe Anthemideae[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(4): 63-71. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170003

春黄菊族部分植物CYC2d同源基因的分离与功能初步分析

doi: 10.13332/j.1000-1522.20170003
基金项目: 

北京市共建项目 2016

“十二五”国家科技支撑计划项目 2013BAD01B07

详细信息
    作者简介:

    黄笛,博士生。主要研究方向:园林植物遗传育种。Email: huangdi@bjfu.edu.cn  地址:100083  北京市海淀区清华东路35号北京林业大学园林学院

    通讯作者:

    张启翔,教授,博士生导师。主要研究方向:园林植物资源与育种。Email: zqxbjfu@126.com  地址:同上

  • 中图分类号: S682.1+1

Isolation and functional analysis of CYC2d orthologous genes from several plants of the tribe Anthemideae

  • 摘要: CYC同源基因作为控制花瓣对称性形成的关键基因,在菊科头状花序中主要调控着舌状花(两侧对称)的生长发育。菊科植物中舌状花的有或无及其分子调控机制和演化过程一直备受关注。本研究从花型不同的川甘亚菊、戈壁短舌菊和神农香菊中分别同源克隆了转录因子基因CYC2d。3个序列与菊花CmCYC2d基因氨基酸序列的比对结果显示其同源性均超过90%,且均含有保守的TCP和R结构域。半定量RT-qPCR结果显示,CYC2d在地被菊品种‘毛香玉’幼嫩花序中的表达量最高,而在川甘亚菊和戈壁短舌菊中的表达量非常微弱。因此,进一步通过实时荧光定量检测了CmCYC2d在‘毛香玉’6个发育时期舌状花和管状花中的表达情况,结果表明, CmCYC2d各个时期管状花中的表达量均很低,而在相应时期舌状花中的表达均很丰富。在不同花型的杂交F1代优株中,CmCYC2d也主要在不同位置的舌状花中高表达。通过农杆菌转化重组质粒pSUPER1300-CmCYC2d-GFP在烟草表皮细胞瞬时表达,亚细胞定位结果显示其定位于表皮细胞核。分别在野生型拟南芥和tcp1突变体(SALK-022364)中过表达CmCYC2d基因的结果表明,转基因阳性株系的营养生长受到抑制,花期延迟,花瓣大小和排列均发生了变化,使原本辐射对称的花瓣呈现两侧对称的趋势。从研究结果可知, 转录因子基因CmCYC2d对菊花舌状花的发育有重要调控作用。本研究为菊科舌状花演化的分子调控机制研究奠定了基础。
  • 图  1  地被菊‘毛香玉’花序的6个生长阶段

    Figure  1.  Six inflorescence developing stages of the groundcover chrysanthemum 'Mao xiangyu'

    图  2  六倍体菊杂交F1代3个优株F1-1、F1-2和F1-3

    Figure  2.  Three F1 progenies of two hexaploid chrysanthemum: F1-1, F1-2 and F1-3

    图  3  CYC2d同源基因氨基酸序列比对

    *为川甘亚菊和戈壁短舌菊与菊花CYC2d基因在TCP和R结构域有差异的位点;黑圆点表示bHLH的核定位信号区。

    Figure  3.  Alignment of amino acid sequence of CYC2d homologues

    * indicates the different sites in TCP and R domain of CYC2d proteins among Ajania potaninii, Brachanthemum titovii and Chrysanthemum; The black circle indicates the nuclear localization signal site.

    图  4  半定量RT-PCR检测CYC2d在4种材料花芽中的表达

    MXY为‘毛香玉’,Ci为神农香菊,Ap为川甘亚菊,Bt为戈壁短舌菊。

    Figure  4.  Expression of CYC2d in floral buds of four plants detected by semi-quantitative RT-PCR

    MXY, 'Mao xiangyu'; Ci, C. indicum var. aromaticum; Ap, A. potaninii; Bt, B. titovii.

    图  5  CmCYC2d在‘毛香玉’舌状花和管状花中的时空表达模式

    A:小花不同发育时期CmCYC2d基因的表达分析。B: CmCYC2d在3个F1优株不同位置小花中的表达分析,其中:RF-O为外轮舌状花;RF-I为内轮舌状花;DF-O为外轮管状花;DF-C为中心管状花。

    Figure  5.  Temporal and spatial expression patterns of CmCYC2d in ray and disc florets of 'Mao xiangyu'

    A: expression analysis of CmCYC2d during different stages of floret development. B: expression analysis of CmCYC2d at different floret locations of three F1 progenies. Tissues are outer ray florets (RF-O), inner ray florets (RF-I), outer disc florets (DF-O) and central disc florets (DF-C).

    图  6  CmCYC2d蛋白在烟草叶片表皮细胞中的亚细胞定位分析

    Figure  6.  Subcellular localization of CmCYC2d in tobacco epidermal cells

    图  7  转基因拟南芥的PCR鉴定(A)及表型分析(B)

    A: M,DNA Marker; 1和2分别为质粒和野生型对照; 3~10为转基因株系;B: CmCYC2d超表达影响了植株的营养、生殖生长及花瓣排列方式。标尺:1 mm。

    Figure  7.  PCR identification (A) and phenotype analysis (B) of CmCYC2d overexpressing Arabidopsis

    A: M, DNA marker; 1 and 2 for plasmid and wild-type controls; 3-10 for transgenic lines. B: ectopic expression of CmCYC2d in Arabidopsis affecting vegetative and reproductive growth, as well as the arrangement of petals. Scale bars: 1 mm.

    图  8  转基因拟南芥tcp1突变体的PCR鉴定及表型分析

    A:M,DNA Marker 2000; 1为转空载对照; 2~11为CmCYC2d基因超表达tcp1突变体株系。B:CmCYC2d超表达抑制了根系的生长。C:CmCYC2d超表达推迟了花期。D和E:CmCYC2d超表达和空载株系的花。

    Figure  8.  PCR identification and phenotype analysis of CmCYC2d overexpressing Arabidopsis of tcp1 mutant

    A: M, DNA marker; 1 for transgenic plants with empty vector; 2-11 for CmCYC2d overexpression tcp1 mutant lines. B: ectopic expression of CmCYC2d affecting growth of roots in positive transgenic lines; C: ectopic expression of CmCYC2d affecting flowering. D, E: flower types of the CmCYC2d overexpression lines and empty lines.

    表  1  本研究所用引物序列

    Table  1.   Primer sequences used in this study

    引物名称
    Primer name
    引物序列(5′-3′)
    Primer sequence (5′-3′)
    用途Use
    CYC2d -F1ATGTTTTCCTCGAACCCTTTTCAT同源克隆及半定量
    RT-PCRHomology-based cloning and semi-quantitative RT-PCR
    CYC2d-R1CTAGTGTAAATTTAGGAAACTTGTGTAC
    CnActin-F1CACCTCTAAATCCTAAGGCTAACAG半定量
    RT-PCRSemi-quantitative RT-PCR
    CnActin-R1GAACAATGGATGGGCCAGACTC
    CnActin-F2CTGACAGGATGAGCAAGGAAATCAC荧光定量
    PCRQuantitative RT-PCR
    CnActin-R2GAACAATGGATGGGCCAGACTC
    CmCYC2d-F1TCCTCGAACCCTTTTCATCAACAG
    CmCYC2d-R1GCTGCCTGTCCAAAATATTGCTGT
    CmCYC2d-F2CCAAATCGACTCTAGAATGTTTTCCTCGAACCCTTTTC亚细胞定位载体构建
    Construction of pSUPER1300-CmCYC2d-GFP
    CmCYC2d-R2TACCGGATCCACTAGTGTAGTGTAAATTTAGGAAACTTGTGTAC
    CmCYC2d-F3GGACTCTTGACCATGGCTATGTTTTCCTCGAACCCTTTTC转基因载体构建
    Construction of pCAMBIA1304-CmCYC2d
    CmCYC2d-R3CTTCTCCTTTACTAGTGTAGTGTAAATTTAGGAAACTTGTGTAC
    p1304-F1ACACGGGGGACTCTTGAC转基因植株鉴定
    PCR identification of transgenic insertion
    p1304-R1CAACAAGAATTGGGACAACTC
    p1300-F1TCATAACCAATCTCGATACACCA
    p1300-R1CTGAACTTGTGGCCGTTTACG
    注:下划线处为酶切位点。Note:underlines are enzyme recognition sites.
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出版历程
  • 收稿日期:  2017-01-04
  • 修回日期:  2017-03-01
  • 刊出日期:  2017-04-01

春黄菊族部分植物CYC2d同源基因的分离与功能初步分析

doi: 10.13332/j.1000-1522.20170003
    基金项目:

    北京市共建项目 2016

    “十二五”国家科技支撑计划项目 2013BAD01B07

    作者简介:

    黄笛,博士生。主要研究方向:园林植物遗传育种。Email: huangdi@bjfu.edu.cn  地址:100083  北京市海淀区清华东路35号北京林业大学园林学院

    通讯作者: 张启翔,教授,博士生导师。主要研究方向:园林植物资源与育种。Email: zqxbjfu@126.com  地址:同上
  • 中图分类号: S682.1+1

摘要: CYC同源基因作为控制花瓣对称性形成的关键基因,在菊科头状花序中主要调控着舌状花(两侧对称)的生长发育。菊科植物中舌状花的有或无及其分子调控机制和演化过程一直备受关注。本研究从花型不同的川甘亚菊、戈壁短舌菊和神农香菊中分别同源克隆了转录因子基因CYC2d。3个序列与菊花CmCYC2d基因氨基酸序列的比对结果显示其同源性均超过90%,且均含有保守的TCP和R结构域。半定量RT-qPCR结果显示,CYC2d在地被菊品种‘毛香玉’幼嫩花序中的表达量最高,而在川甘亚菊和戈壁短舌菊中的表达量非常微弱。因此,进一步通过实时荧光定量检测了CmCYC2d在‘毛香玉’6个发育时期舌状花和管状花中的表达情况,结果表明, CmCYC2d各个时期管状花中的表达量均很低,而在相应时期舌状花中的表达均很丰富。在不同花型的杂交F1代优株中,CmCYC2d也主要在不同位置的舌状花中高表达。通过农杆菌转化重组质粒pSUPER1300-CmCYC2d-GFP在烟草表皮细胞瞬时表达,亚细胞定位结果显示其定位于表皮细胞核。分别在野生型拟南芥和tcp1突变体(SALK-022364)中过表达CmCYC2d基因的结果表明,转基因阳性株系的营养生长受到抑制,花期延迟,花瓣大小和排列均发生了变化,使原本辐射对称的花瓣呈现两侧对称的趋势。从研究结果可知, 转录因子基因CmCYC2d对菊花舌状花的发育有重要调控作用。本研究为菊科舌状花演化的分子调控机制研究奠定了基础。

English Abstract

黄笛, 孙明, 袁存权, 程堂仁, 王佳, 张启翔. 春黄菊族部分植物CYC2d同源基因的分离与功能初步分析[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(4): 63-71. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170003
引用本文: 黄笛, 孙明, 袁存权, 程堂仁, 王佳, 张启翔. 春黄菊族部分植物CYC2d同源基因的分离与功能初步分析[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(4): 63-71. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170003
HUANG Di, SUN Ming, YUAN Cun-quan, CHENG Tang-ren, WANG Jia, ZHANG Qi-xiang. Isolation and functional analysis of CYC2d orthologous genes from several plants of the tribe Anthemideae[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(4): 63-71. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170003
Citation: HUANG Di, SUN Ming, YUAN Cun-quan, CHENG Tang-ren, WANG Jia, ZHANG Qi-xiang. Isolation and functional analysis of CYC2d orthologous genes from several plants of the tribe Anthemideae[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(4): 63-71. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170003
  • 被子植物的花主要分为辐射对称(actinomorphy或radial symmetry)和两侧对称(zygomorphy或bilateral symmetry)。对于花对称性的研究最早由卡尔·林奈(Carl Linnaeus)提出。林奈观察柳穿鱼(Linaria vulgaris)的花时发现,绝大多数花为两侧对称,然而也存在少数辐射对称的自然变异个体。林奈对这种现象很不解,将其命名为“反常整齐花”(peloric)[1]。20世纪末,科学家们首先在模式植物金鱼草(Antirrhinum majus)中发现了花对称性发育的分子调控机理[2-3]。野生金鱼草有5枚花瓣,腹部花瓣为两侧对称,而背部和侧部花瓣不对称。在CYCLOIDEA(cyc)和DICHOTOMA (dich) 双突变体中,产生了6枚花瓣,且花瓣器官之间的差异消失,所有花瓣自身均变为两侧对称,而整朵花变为辐射对称。dich单突变则只引起侧部2个花瓣形状的改变。在柳穿鱼中,由于LvCYC基因的启动子和开放阅读框发生甲基化,导致了LvCYC基因的沉默,使其花朵由两侧对称突变为辐射对称[4]CYCDICH基因均属于TCP基因家族的CYC/TB1分支,二者均有保守的TCP和R结构域,其中TCP区内有一个可能的核定位信号[5]。近年来,在苦苣苔科(Gesneriaceae)、车前科(Plantaginaceae)和豆科(Leguminosae)等植物中也相继发现了CYC同源基因对花瓣对称性形成及雄蕊发育的调控[6-9]

    菊科的头状花序看似一朵花,其实每个花序由许多小花构成。小花分为舌状花和管状花。位于边缘的舌状花为雌花,其雄蕊败育,属于两侧对称;中央的管状花则为两性花,属于辐射对称。在菊科中,相继在千里光属(Senecio)、向日葵(Helianthus annuus)和非洲菊(Gerbera hybrida)中克隆得到了CYC同源基因[10-12]。然而,这些基因在菊科头状花序中调控小花(舌状花或管状花)的生长而非单朵花的对称性。在向日葵中由于CACTA转座子在HaCYC2c基因启动子区的插入,使该基因过表达,致使其花朵内部的管状花全部或部分变为舌状花(dbl或chry突变体);而若该转座子插入到TCP结构域区,则HaCYC2c基因的转录提前终止,致使花朵周围的舌状花转变为管状花(turf或tub)[13]。然而,进一步的研究表明这种调控途径并不稳定[14]。非洲菊中过表达CYC-like基因也促进了管状花花瓣的伸长[12, 15]。欧洲狗舌草(S. squalidus)有舌状花残缺和舌状花单轮两种生态型,因为从舌状花单轮的S. squalidus中渗入了基因RAY,使得原本无舌状花的生态型(S. vulgaris)产生了舌状花[10, 16]

    菊花素以其丰富多彩的花型而闻名于世。菊花舌状花和管状花的构成和分布差异形成了千差万别的品种类型,其演化过程和分子机制也一直备受科研学者的关注。川甘亚菊(Ajania potaninii)、戈壁短舌菊(Brachanthemum titovii)和神农香菊(Chrysanthemum indicum var. aromaticum)分别属于春黄菊族亚菊属、短舌菊属和菊属。3个种花序中管状花的形态和分布均相似,但川甘亚菊和戈壁短舌菊的舌状花与神农香菊相比数量更少且花瓣残缺。本研究分别从川甘亚菊、戈壁短舌菊和神农香菊中同源克隆得到TCP转录因子基因CYC2d,对比分析了其与地被菊品种‘毛香玉’(Chrysanthemum morifolium ‘Mao Xiangyu’)CmCYC2d基因的氨基酸序列。通过对‘毛香玉’CmCYC2d基因的亚细胞定位、时空表达分析和转化野生型拟南芥及tcp1突变体的研究,对该基因的功能进行了初步分析。本研究为CmCYC2d基因在菊花舌状花花发育过程中的分子调控机制研究奠定了基础。

    • 本研究所用植物材料:神农香菊、地被菊‘毛香玉’和‘国庆小六号’及其杂交F1代优株取自北京林业大学小汤山实验基地,戈壁短舌菊和川甘亚菊取自花卉工程中心沙河基地。

      RNA提取采用多糖多酚植物RNA提取试剂盒(ZH120)购自华越洋生物科技公司;大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞DH5α、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和普通质粒小提试剂盒购自天根生物公司;RQ1 RNase-free DNase和M-MLV反转录酶购自Promega公司;KOD-Plus-Neo高保真酶购自东洋纺生物科技有限公司;PrimeScriptTMRT去除基因组DNA反转录试剂盒、荧光定量SYBR premix、Premix TaqTM、克隆载体pMD-18T、In-Fusion HD Enzyme和各种限制性内切酶购自TaKaRa公司;植物表达载体pCAMBIA1304和pSUPER1300-GFP及根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)感受态细胞EH105由本实验室保存。

    • 分别以川甘亚菊、戈壁短舌菊、神农香菊和地被菊品种‘毛香玉’的幼嫩花芽为材料提取RNA,用M-MLV反转录酶反转录为cDNA。根据‘毛香玉’中CmCYC2d(GenBank:KU595426)的CDS序列,设计通用引物CYC2d-F1和CYC2d-R1(表 1)扩增川甘亚菊、戈壁短舌菊和神农香菊的CYC2d序列。对PCR产物经回收、连接和转化大肠杆菌DH5α后,将菌批鉴定为阳性的克隆送至公司测序。利用DNA MAN和BioEdit软件对所得的核苷酸序列进行拼接和比对分析,并用ExPASy在线工具(http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html)对其编码的蛋白质进行氨基酸基本特性分析。

      表 1  本研究所用引物序列

      Table 1.  Primer sequences used in this study

      引物名称
      Primer name
      引物序列(5′-3′)
      Primer sequence (5′-3′)
      用途Use
      CYC2d -F1ATGTTTTCCTCGAACCCTTTTCAT同源克隆及半定量
      RT-PCRHomology-based cloning and semi-quantitative RT-PCR
      CYC2d-R1CTAGTGTAAATTTAGGAAACTTGTGTAC
      CnActin-F1CACCTCTAAATCCTAAGGCTAACAG半定量
      RT-PCRSemi-quantitative RT-PCR
      CnActin-R1GAACAATGGATGGGCCAGACTC
      CnActin-F2CTGACAGGATGAGCAAGGAAATCAC荧光定量
      PCRQuantitative RT-PCR
      CnActin-R2GAACAATGGATGGGCCAGACTC
      CmCYC2d-F1TCCTCGAACCCTTTTCATCAACAG
      CmCYC2d-R1GCTGCCTGTCCAAAATATTGCTGT
      CmCYC2d-F2CCAAATCGACTCTAGAATGTTTTCCTCGAACCCTTTTC亚细胞定位载体构建
      Construction of pSUPER1300-CmCYC2d-GFP
      CmCYC2d-R2TACCGGATCCACTAGTGTAGTGTAAATTTAGGAAACTTGTGTAC
      CmCYC2d-F3GGACTCTTGACCATGGCTATGTTTTCCTCGAACCCTTTTC转基因载体构建
      Construction of pCAMBIA1304-CmCYC2d
      CmCYC2d-R3CTTCTCCTTTACTAGTGTAGTGTAAATTTAGGAAACTTGTGTAC
      p1304-F1ACACGGGGGACTCTTGAC转基因植株鉴定
      PCR identification of transgenic insertion
      p1304-R1CAACAAGAATTGGGACAACTC
      p1300-F1TCATAACCAATCTCGATACACCA
      p1300-R1CTGAACTTGTGGCCGTTTACG
      注:下划线处为酶切位点。Note:underlines are enzyme recognition sites.
    • 以川甘亚菊、戈壁短舌菊、神农香菊和地被菊‘毛香玉’的嫩芽为材料提取RNA。先用RQ1 RNase-free DNase(Promega)去除基因组DNA,并用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法检测RNA质量,然后分别取2 μg RNA反转录为cDNA。以CnActin(GenBank:KF305683.1)为内参基因,设计通用引物对CYC2d在4种材料花芽中的表达进行半定量RT-PCR分析,引物序列见表 1。反应总体积为20 μL,包括反转录产物1 μL,Premix Taq 12.5 μL,ddH20 5.3 μL,上下游特异引物各0.6 μL。PCR扩增程序:98 ℃、10 s,56 ℃、30 s,72 ℃、1 min,共30个循环。电泳检测PCR产物的条带强弱。

    • 以地被菊‘毛香玉’6个生长时期的各轮舌状花和管状花为材料(图 1),检测CmCYC2d在其小花不同发育阶段的表达情况。‘毛香玉’花序不同时期的界定参考非洲菊花序发育后期不同阶段的界定方法[17]。同时选取六倍体地被菊品种‘毛香玉’(2~3轮舌状花)和‘国庆小六号’(11~12轮舌状花)的杂交F1代优株F1-1、F1-2和F1-3为材料(图 2),分别取其不同时期的外轮(F1-1、F1-2、F1-3)和内轮舌状花(F1-2、F1-3)及外轮(F1-1、F1-2)和中心管状花(F1-1、F1-2、F1-3),检测CmCYC2d在不同位置小花中的表达情况。每份舌状花和管状花样品均取自4棵生长势正常的植株,每棵植株上选取6个花芽,混合后分3份速冻于液氮中。RNA的提取和检测同上所述。然后分别取1 μg RNA进行反转录,反转录按照Takara的PrimeScriptTM RT reagent kit(with gDNA eraser)试剂盒的方法进行。qRT-PCR反应使用ABI7500系统。反应体系为:SYBR premix (Takara, RR820A) 10 μL,上下游引物(10 μmol)各0.5 μL,稀释10倍的cDNA 2 μL,ddH2O 7 μL。反应程序为:95 ℃、30 s;95 ℃、5 s,58 ℃、30 s,72 ℃、30 s,40个循环。所有试验均设置3次生物学重复和3次技术重复。采用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。内参和CmCYC2d基因的特异扩增引物序列见表 1(扩增效率为98%~100%)。

      图  1  地被菊‘毛香玉’花序的6个生长阶段

      Figure 1.  Six inflorescence developing stages of the groundcover chrysanthemum 'Mao xiangyu'

      图  2  六倍体菊杂交F1代3个优株F1-1、F1-2和F1-3

      Figure 2.  Three F1 progenies of two hexaploid chrysanthemum: F1-1, F1-2 and F1-3

    • 利用PCR在CmCYC2d基因编码区的5’和3’端分别引入限制性酶切位点XbaI和SpeI (见表 1),然后采用In-fusion HD连接法将其连接至pSUPER1300-GFP载体,经测序和酶切鉴定无误后,提取质粒备用。使用冻融法将构建好的重组质粒pSUPER1300-CmCYC2d-GFP和空载(正对照)质粒分别转入农杆菌EH105感受态细胞,并涂板培养。将阳性单菌落在含抗生素的LB液体培养基中培养至OD600 nm为0.8~1.0,离心收集菌体后重悬于缓冲液(10 mM MES,100 μM AS,10 mM MgCl2)中。室温避光静置3~4 h后,注射到4~6叶期的本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶片背面。注射的烟草在光照培养箱中培养2~3 d后,取约1 cm2的注射叶片在激光共聚焦显微镜(Leica,SP8)下观察,并拍照记录。

    • 设计带有酶切位点NcoI和SpeI的特异引物(表 1)扩增CmCYC2d的ORF区,参照上述方法构建植物表达载体pCAMBIA1304-CmCYC2d,并将其转入农杆菌感受态细胞。使用花序侵染法转化野生型拟南芥。收获的T0代种子经10%次氯酸钠消毒并洗净后,播于含50 mg/L潮霉素的MS平板上。生长2周后,将根系伸长且真叶正常生长的8棵抗性苗和野生型对照移栽到营养土:蛭石=1:1(体积比)的花盆中,于16 h光照8 h黑暗的光照培养箱中养护。然后分别剪取抗性苗和对照的叶片提取DNA进行PCR鉴定,引物序列见表 1。单株收取PCR鉴定为阳性的超表达株系的T1代种子,继续按以上方法筛选,直至获得T2代植株。将T2代CmCYC2d过表达和野生型拟南芥株系栽植于上述环境条件一致的光照培养箱中,观察并记录其生长情况。

    • 将1.4中含有重组质粒pSUPER1300-CmCYC2d和pSUPER1300-empty的农杆菌菌液侵染拟南芥tcp1突变体(SALK-022364)的花序。并参照上述方法筛选转基因株系。将鉴定为阳性的10个突变体株系与空载株系分别栽植于环境条件一致的光照培养箱中,定时观察并记录其生长情况。

    • 以地被菊品种‘毛香玉’CmCYC2d基因序列为参考设计通用引物,分别以川甘亚菊、戈壁短舌菊和神农香菊的cDNA为模板扩增测序,获得3个CmCYC2d同源序列,依次分别为ApCYC2dBtCYC2dCiCYC2d。3个序列与菊花CmCYC2d基因氨基酸序列的同源性分别为91.0%, 97.5%和99.1%。说明同为菊属的神农香菊与‘毛香玉’CmCYC2d基因氨基酸同源性较高,而不同属的川甘亚菊和戈壁短舌菊与其同源性相对较低。另外,将这些CYC2d同源蛋白序列和金鱼草、非洲菊及向日葵等已验证功能的cyc-like蛋白序列进行多重比对,结果显示4个序列均含有保守的TCP结构域和R结构域(图 3)。其中川甘亚菊和戈壁短舌菊在这2个结构域区分别有1~2个氨基酸突变。利用ExPASy在线工具分析‘毛香玉’、川甘亚菊、戈壁短舌菊和神农香菊的CYC2d蛋白序列,结果显示其分子量约为37.3,理论等电点依次为9.15、9.26、8.82和9.15。

      图  3  CYC2d同源基因氨基酸序列比对

      Figure 3.  Alignment of amino acid sequence of CYC2d homologues

    • 依据上述4个CYC2d序列设计通用引物对4种材料的花芽进行半定量RT-PCR分析,结果如图 4所示。由图 4可知:CYC2d基因在‘毛香玉’花芽中的表达量最高,在神农香菊和川甘亚菊中的表达依次降低,在戈壁短舌菊中表达量非常微弱(图 4)。

      图  4  半定量RT-PCR检测CYC2d在4种材料花芽中的表达

      Figure 4.  Expression of CYC2d in floral buds of four plants detected by semi-quantitative RT-PCR

      因此,为进一步确定CmCYC2d在‘毛香玉’花序中的表达模式,我们选取了6个发育时期的舌状花和管状花进行了CmCYC2d的表达分析。如图 5A所示,CmCYC2d在6个时期管状花中的表达量都很微弱,且明显比相应时期的舌状花低。相反CmCYC2d在各个时期舌状花中的表达量均较高,尤其在S1和S7时期。整体而言,CmCYC2d在舌状花生长初期的表达量最高,然后逐步降低,在S7时期表达量有所回升。

      图  5  CmCYC2d在‘毛香玉’舌状花和管状花中的时空表达模式

      Figure 5.  Temporal and spatial expression patterns of CmCYC2d in ray and disc florets of 'Mao xiangyu'

      本研究进一步分析了CmCYC2d在地被菊F1代优株(图 2)舌状花和管状花中的表达情况。如图 5B所示,在只有2~3轮舌状花的优株F1-1中,CmCYC2d在外轮(DF-O)和中心(DF-C)管状花中的表达量均很低,而仅在外轮舌状花(RF-O)中高表达。相应的在舌状花轮数逐渐增多的F1-2(半重瓣)和F1-3(重瓣)优株中,CmCYC2d依然仅在外轮和内轮舌状花(RF-O和RF-I)中高表达,在外轮和中心管状花(DF-O和DF-C)中的表达量均很低。因此,CmCYC2d的表达量高低仅与舌状花和管状花的类型有关,而与这两种小花的分布位置无关。

    • 激光共聚焦观察结果如图 6所示,空载质粒的荧光分布于整个细胞,而CmCYC2d-GFP融合蛋白的荧光信号仅在烟草表皮细胞核中清晰可见,说明CmCYC2d是一个核定位蛋白。这与转录因子是核定位的特征一致。

      图  6  CmCYC2d蛋白在烟草叶片表皮细胞中的亚细胞定位分析

      Figure 6.  Subcellular localization of CmCYC2d in tobacco epidermal cells

    • 为进一步分析CmCYC2d基因的功能,本研究构建了CmCYC2d超表达载体并分别转化拟南芥野生型和tcp1突变体,分别得到8个和10个CmCYC2d超表达株系。

      对转野生型拟南芥的RT-PCR检测结果表明,在所有转基因株系和重组质粒中均检测到目的基因的表达,而在野生型对照中没有扩增出条带(图 7A)。对转基因株系和与野生型株系的表型进行观察可知,相对于野生型拟南芥,CmCYC2d基因过表达减缓了拟南芥的营养生长和生殖生长(图 7B),使植株莲座叶片变小,果荚长度变短,花期也推迟。进一步观察发现过表达植株的花瓣排列方式也发生了变化,原本辐射对称的花瓣排列规律性变弱,2个花瓣靠拢且部分重叠,似乎有呈左右对称发展的趋势(图 7B)。

      图  7  转基因拟南芥的PCR鉴定(A)及表型分析(B)

      Figure 7.  PCR identification (A) and phenotype analysis (B) of CmCYC2d overexpressing Arabidopsis

      对转基因tcp1突变体株系的PCR检测结果表明,在10个CmCYC2d超表达株系中均扩增获得约1 150 bp的目的条带,而在空载中仅扩增出约180 bp的载序列(图 8A)。相对于空载株系的表型,CmCYC2d超表达tcp1突变体株系的营养生长和生殖生长均延迟。在筛选培养基上播种14 d后,空载株系的根系明显比超表达株系长,且空载株系的真叶生长速度也比超表达株系快(图 8B)。播种后49 d,空载株系抽出了高约15 cm的花序,而超表达株系刚刚开始抽薹开花(图 8C)。从花型图中可看出,空载株系的4枚花瓣大小相当,排列均衡,呈辐射对称(图 8D)。而超表达株系中有2枚花瓣(箭头)向外延伸,长度明显比另外2枚增加(图 8E)。此外,超表达株系的4枚花瓣似乎沿着一条轴线呈两侧对称排列。

      图  8  转基因拟南芥tcp1突变体的PCR鉴定及表型分析

      Figure 8.  PCR identification and phenotype analysis of CmCYC2d overexpressing Arabidopsis of tcp1 mutant

    • 本研究采用同源克隆法,分别从川甘亚菊、戈壁短舌菊和神农香菊中克隆得到3个CYC2d同源基因。氨基酸序列同源比对发现3个序列均含有完整的ORF区域及保守的TCP和R结构域,且与菊花CmCYC2d基因的同源性均达到90%以上。TCP结构域的二级结构预测形成一个类似bHLH(basic-Helix-Loop-Helix)的结构,其中约由21个氨基酸残基组长的碱性区域(basic region)中含有一个核定位NLS(nuclear localization signal)信号区[5, 18]。本研究中4个CYC2d同源序列在该核定位区域高度保守(图 3)。瞬时表达试验证明CmCYC2d定位于烟草表皮细胞核,暗示其作为一个转录因子在细胞核中发挥转录调控功能(图 6)。

      半定量RT-PCR分析可知CmCYC2d基因在无或少舌状花的戈壁短舌菊和川甘亚菊中表达微弱,而在舌状花发育正常的‘毛香玉’和神农香菊中表达量丰富(图 4)。因此尽管在本研究中4个CYC2d同源基因核苷酸序列差异不大,但在花序中的表达量差异显著,这可能是4种材料舌状花发育差异的原因之一。类似的研究在欧洲狗蛇草和向日葵中也有报道。RAY1和RAY2在辐射对称(舌状花畸形)的生态型中表达量很低,在非辐射对称(舌状花正常)的生态型中表达量高,而正是因为这两个基因的渗入使原本无舌状花的生态型(S.vulgaris N/N)获得了舌状花[10]。向日葵中HaCYC2c的无表达或少量表达导致正常发育的舌状花变为辐射对称的管状花[13]

      荧光定量结果表明CmCYC2d基因在‘毛香玉’6个时期管状花中的表达量均很低,而在不同时期的舌状花中表达量显著升高(图 5A)。在向日葵中,CYC2类基因也在不同时期的舌状花中高表达[19]。Huang等[20]的聚类分析结果表明非洲菊GhCYC3与菊花CmCYC2d亲缘关系较近。而GhCYC3在非洲菊舌状花的不同发育时期表达量均很丰富,且随着舌状花花瓣的伸长,该基因的表达量逐步降低[15]。在本研究中,CmCYC2d在S1时期的表达量最高,在之后的3个时期表达量逐渐降低,到S7时期表达量又回升。在S7期,舌状花花瓣由半开过渡到完全打开,花瓣裂片有一个明显的伸长过程,因此CmCYC2d在此期的高表达可能与花瓣裂片的伸长生长有关。在舌状花轮数不同的3个F1优株中,CmCYC2d在所有舌状花中的表达量均显著高于管状花(图 5B),尤其在内轮舌状花(F1-3和F1-2,RF-I)的表达量显著高于外轮管状花(F1-1,DF-O)。菊花的舌状花为左右对称,而管状花为辐射对称,而上述基因均在多轮舌状花中高表达,实现从管状花向舌状花的转变。向日葵HaCYC2e的表达模式与此相似。在野生型单轮舌状花的向日葵中,HaCYC2e仅在边缘舌状花中高表达,而在重瓣和半重瓣的突变体中,HaCYC2e在由管状花突变而来的内轮舌状花中也高表达[13]。在野生型金鱼草中,CYC仅在背部花器官中表达。由于cyc的突变,背部和两侧花瓣及其雄蕊均变为类似腹部花器官的形态,整朵花由左右对称变为辐射对称[3]。在豆科中,LegCYC1B在辐射对称的Cadia purpurea的所有花瓣中均有表达,而在两侧对称的Lotus nanus中仅在远轴侧花瓣表达,从而实现对花瓣对称性的调控[21]

      本研究中,CmCYC2d超表达抑制了拟南芥的营养生长和生殖生长(图 7)。在CmCYC2d超表达的TCP1突变体株系中,根系长度变短,花期推迟,且花瓣的大小和排列方式也发生了改变,使原本为辐射对称的花呈现两侧对称的趋势(图 8)。TCP类转录因子主要调控植物的生长和发育,比如茎的分枝和叶片生长[22-23]。CYC/TB1则主要在被子植物中控制花器官的生长从而改变花部的对称性[3, 18]。在非洲菊中,CYC2类基因的过表达抑制了拟南芥的根系和植株生长,但却能促进非洲菊花器官的生长[15]。Huang等[20]的研究表明在甘菊中过表达CmCYC2c促进了舌状花的生长,但也延缓了其早期的营养生长。将金鱼草的CYC转化拟南芥后,由于促进了细胞伸长使拟南芥的花瓣变大,因而改变了其对称性[24]。而苦苣苔PhCYC1C转化拟南芥后则因为抑制细胞生长而使花瓣变小[7]。因此,尽管在进化过程中,CYC-like在调控植物花器官的生长发育方面发生了功能分化,但在抑制拟南芥营养生长的方面其功能是保守的。

      本研究结果表明CmCYC2d基因仅在各种花型的舌状花中高表达,在管状花中几乎不表达。CmCYC2d在野生型和突变体拟南芥中超表达主要影响了其营养生长、花期和花瓣的生长及排列,因而改变了其对称性。由前人的研究可知花器官对称性的改变往往是若干基因互作或者上下游调控共同作用的结果。在苦苣苔中,CYC1CCYC1D通过形成双正向自调控反馈环,从而进行自我调控和相互调控,以维持其在花发育过程中的持续表达[7]。除CYCDICH外,MYB家族的DIVRAD基因也参与了对金鱼草花对称性的调控[25-26]。我们前期的研究表明菊花中有6条菊花CYC2类同源基因[20]CmCYC2d作为其中一个,其对菊花舌状花发育的具体调控模式和调控机理还有待更深入的研究。

参考文献 (26)

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