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为了保护木材并延长使用年限，通常对其进行防腐处理，以实现节约森林资源的目的。目前，国内外商业用木材防腐剂采用以铜为活性成分的铬酸铜砷酸盐、季铵铜等水载型防腐剂，其处理后的木材若不进行无害化处理，将会对环境造成不利影响，并容易造成铜的生物累计效应[1]。从植物中提取抑菌活性成分，具有毒性低、残留少等优点，逐渐成为木材防腐领域的研究热点。例如，白坚木(Schinopsis lorentzii)树皮、含羞草(Acacia mollissima)树皮[2]、樟树(Cinnamomum camphora)叶[3-4]、楝树(Melia azederach)叶和籽[5-6]等提取物均有较好的抑制木材腐朽菌能力，有望替代化学防腐剂。本研究中使用的牛蒡(Arctium lappa)，经药理研究和临床试验表明其具有抗炎作用和自由基清除活性，这归因于咖啡酰奎宁酸衍生物的存在[7]。另外，Duh[8]发现采用水溶液提取的牛蒡根中活性物质，具有较好的抗氧化、抗菌能力；并且其提取物对1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)的清除率达到80%[9]。而Ao等[10]认为植物源提取物的抗菌能力取决于许多不同的组分，包括醛和酚类化合物。这些天然化合物组合通常具有协同抑菌作用，导致粗提取物比纯的单一化合物具有更高的抗微生物活性[11]。目前，植物源活性物质的提取过程多为单体提取优化并进行单体抑菌研究，对于植物源活性物质的整体研究相对较少。另外，作为农业生产废弃物的牛蒡叶，对其在抑制木材腐朽菌方面的研究相对较少。因此，本研究以牛蒡叶为研究对象，采用响应曲面优化的方法，确定牛蒡叶中抑菌活性成分简便快捷的提取工艺，获得抑制木材腐朽菌活性成分，为生物源防腐剂在木材中的应用研究提供合理有效的抑菌成分及提取工艺。
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菌种为白腐菌—彩绒革盖菌(Coriolus versicolor, C.v)、褐腐菌—密粘褶菌(Gloceophyllum trabeum, G.t)，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，其中白腐菌为提取效果指示菌。
牛蒡叶，于2016年6月采自江苏省徐州市沛县栖山镇，室内阴干，磨粉后过20目筛子。
试剂：冰醋酸、乙醇等分析纯(天津天利化学试剂有限公司)。
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首先，确定溶剂的不同导致提取物抑菌能力差异。先将10 g牛蒡叶阴干粉末，以1:19的比例分别加入蒸馏水和酸性水溶液(pH值在2.0~3.0)，在50 ℃水浴搅拌提取1 h；过滤后，减压浓缩。将酸性水提取物，用乙醇进行二次处理，浓缩后分别获得提取剩余物和溶解于乙醇中的物质。将经蒸馏水、酸性水、乙醇提取的物质和提取剩余物，分别配置成10%的水药液，以白腐菌为抑菌效果指示菌，进行牛津杯抑菌实验，3 d后测量抑菌圈直径。基于阴干后粉末的质量计算提取率：
$$ Z = {m_1}/{m_0} \times 100\% $$ 式中：Z为提取率，%；m1为浓缩后药剂的质量，g；m0为牛蒡叶阴干后并过20目筛子粉末质量，g。
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进行单因素实验得到响应曲面各自变量提取范围。选取液料比、提取温度、提取时间以及溶剂pH值4个因素作为研究的自变量，分别测量各因素对牛蒡叶提取率的影响。
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在单因素实验的基础上，采用响应曲面Box-Behnken组合原理进行四因素三水平优化实验，并借助Design-Expert(V8.0.6)软件对实验进行设计和分析，以牛蒡叶提取率为响应值，液料比、提取温度、提取时间、溶剂pH值为自变量，进行响应曲面实验，水平设计见表 1。
表 1 响应曲面实验水平设计表
Table 1. Level design of response surface method
因素
Factor水平Level -1 0 1 A液料比Liquid-to-solid ratio/(mL·g-1) 10 20 30 B提取温度Extraction temperature/℃ 45 50 55 C提取时间Extraction time/min 30 60 90 D溶剂pH值pH of extraction solution 2.0 3.0 4.0 -
为了验证提取物的抑菌性能，将提取物分别配置成2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%的水溶液，并采用牛津杯法进行抑白腐菌、褐腐菌实验。另外所配置的药剂pH值在3.0~4.0，因此以pH值为3.0的乙酸溶液为对照，确定牛蒡叶提取物对白腐菌和褐腐菌的最低抑菌质量分数(MIC)。
-
采用Accela U-HPLC高速液相色谱系统对提取物中的活性成分进行分离，洗脱程序见表 2。色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18 Column(1.7 μm，2.1×50 mm)(美国)。定性分析采用Thermo LTQ XL离子阱质谱仪(美国Thermo公司)，ESI电喷雾离子源。质谱条件：负离子电离方式，质谱扫描范围50~1 000，喷雾电压4.5 kV，金属毛细管温度250 ℃，鞘气(N2)流速40.5 L/h，辅助气(N2)流速90 L/h。碰撞气为He，碰撞能为25~40 eV，根据化合物不同进行优化。
表 2 U-HPLC流动相洗脱方式
Table 2. U-HPLC mobile phase elution method
序号
No.保留时间
Retention time/min乙腈
Acetonitrile/%0.1%甲酸溶液
0.1% formic acid/%流速
Flow velocity/(μL·min-1)0 0 10 90 400 1 5 13 87 400 2 15 20 80 400 3 21 20 80 400 4 30 75 25 400 5 35 90 10 400 6 37 100 0 400 -
表 3显示：以酸性水为溶剂得到的提取物抑菌效果最好，平均抑菌圈直径为13.17 mm，其提取率高于其他几种提取方式。这可能是由于在酸性条件下，溶剂的浓度远大于细胞内的浓度，形成浓度差，在加热和搅拌的作用下，促进了牛蒡叶细胞内活性成分的溶出和溶解。而酸性水提取物经二次处理后，乙醇提取物的抑菌能力(平均抑菌圈直径10.93 mm)低于酸性水提取物。乙醇能够溶解牛蒡中的易溶于有机溶剂的抑菌活性成分，但萃取剩余部分也有抑菌效果，这可能是由于乙醇萃取部分在二次浓缩过程中损失量较大导致的。水提取物的抑菌性能最低，但其也具有一定的抑菌能力，即水也能够溶解牛蒡叶中的活性成分。从牛蒡叶提取率和抑菌效果综合考虑，酸性水溶液比乙醇溶剂获取更多种类的抑菌物质，其抑菌效果最好，这也与Bandyopadhyay等[11]提到的粗提物的抑菌效果要比单一组分强的结论相一致。考虑到植物内部具有抑菌活性成分的含量是相对较低的，因此，本研究采用酸性水溶液为提取溶剂，进一步对其进行响应曲面优化分析。
表 3 牛蒡叶提取预实验结果
Table 3. Pre-test results of burdock leaf extraction
提取方式Extraction method 提取率
Extraction rate/%平均抑菌圈直径Average anti-fungal zone diameter/mm 初提取Initial extraction 二次处理Second processing 水提取Extraction with distilled water 30.74 8.70 酸性水Extraction with acid water 33.08 13.17 酸性水Extraction with acid water 萃取剩余Extraction remaining 20.38 9.91 乙醇萃取Ethanol extraction 5.21 10.93 -
以提取温度50 ℃，提取时间90 min，溶剂pH值3.0为基础条件，进行液料比对提取率的影响实验，结果如图 1所示。总体上，牛蒡提取率随液料比的增加而增加。在液料比小于30 mL/g时，提取率迅速提高；而当液料比大于30 mL/g，总体趋于平缓。这说明：随液料比增加，溶剂溶解的量就越多，可以促进牛蒡叶中活性成分的浸出和溶解；但液料比过大，虽然可以提高提取率，但由于浓缩功耗(时间、能源等)的增加，会造成活性成分的改变，并给浓缩增加了难度，降低提取率。所以从功耗、效率考虑，选择10~30 mL/g的液料比作为下一步实验指标。
图 1 液料比对提取率的影响
Figure 1. Effects of liquid-to-solid ratio on extraction rate
-
以液料比20 mL/g，提取时间90 min，溶剂pH值3.0为基础条件，进行温度对提取率的影响实验，结果如图 2所示。在35~50 ℃时，提取率随温度升高而增加，即加热能够增加分子运动速率，促进牛蒡叶成分的溶解；而50 ℃之后，提取率减少，这可能是由于植物活性成分、活性蛋白等多含有酯键、不饱和键等易受温度影响的基团，使提取率降低。因此为了减少温度对活性成分的影响，将温度控制在50 ℃左右，即在45~55 ℃进行提取。
图 2 提取温度对提取率的影响
Figure 2. Effects of extraction temperature on extraction rate
-
以液料比20 mL/g，提取温度50 ℃，溶剂pH值3.0为基础条件，进行提取时间对提取率的影响实验，结果如图 3所示。在提取时间30~60 min内，提取率随提取时间的延长而增加；但60 min之后，提取率缓慢降低。说明随提取时间的延长，牛蒡叶内部某些化学成分发生了降解、挥发等现象，因此提取时间设置为30~90 min为宜。
图 3 提取时间对提取率的影响
Figure 3. Effects of extraction time on extraction rate
-
以液料比20 mL/g，提取温度50 ℃，提取时间60 min为基础条件，进行pH值对提取率的影响实验，结果如图 4所示。总体上，提取率对pH值有很强的依赖性。在溶剂pH值为2.0~4.0，随着pH值的提高，牛蒡叶的提取率迅速降低，pH值为4.0时提取率达到最低。产生这样现象的原因可能是：当溶剂加入一定量乙酸后抑制了某些成分的溶出；但随着氢离子浓度的增加，使细胞内外溶液的浓度差增大，进而提高了牛蒡叶的提取率，使提取率在溶剂的pH值从4.0降到2.0范围内迅速提高。因此在后续实验中，选择pH值2.0~4.0进行优化实验。
图 4 pH值对牛蒡叶提取率的影响
Figure 4. Effects of pH on extraction rate
-
建立提取率与各因素的回归模型，获得如表 4的分析数据。根据F值得到4个因素对牛蒡叶提取率的影响程度为：溶液pH值>液料比>提取温度>提取时间；模型的P值< 0.000 1，模型整体较好，但其失拟项显著(P < 0.029 8)，可能是非显著项的增加或者AB2等交互项的缺少造成的。因此采用逐步回归的方法进行分析，建立响应值提取率(y，%)和液料比(A，mL/g)、提取温度(B，℃)、提取时间(C，min)、pH值(D)的关系模型，如下：
$$ \begin{array}{l} y = - 35.44 - 2.44A + 3.85B + 1.25C - 21.27D + \\ \;0.18AB + 0.039AC - 0.091AD - 0.082BC - 0.13{A^2} - \\ \;\;\;\;\;\;0.024{B^2} + 0.005\;6{C^2} + 3.01{D^2} + 0.002{\rm{ }}9{A^2}B - \\ 0.000\;29{A^2}C - 0.003A{B^2} - 0.000\;2A{C^2} + 0.000\;81{B^2}C\\ \;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;({R^2} = 0.985) \end{array} $$ 由于响应曲面不仅能减少实验量，而且可以综合考虑各因素对响应值的影响，同时可以借助图形直观观察各因素间相互作用关系对响应值的影响程度[12]，因此绘制出响应曲面交互图(图 5)。液料比与pH值间相互作用较强，图 5c中的等高线较其他密集，即液料比的提高，增加了药粉与药剂的充分接触，促进提取过程的进行；但各个因素间的交互作用微弱，这也可从表 4中看出，交互项的P值(P >0.05)不显著。
图 5 交互作用对提取率的影响
Figure 5. Effects of interaction on extraction rate
表 4 响应曲面因子方差分析
Table 4. Anova for response surface method (RSM) quadratic model analysis
方差来源
Variance source平方和
Sum of squares自由度
df均方
Mean squaresF值
F-valueP值
P-value模型Model 426.13 14 30.44 22.87 < 0.000 1** A 23.35 1 23.35 17.54 0.000 9** B 3.53 1 3.53 2.656 0.126 0 C 0.29 1 0.292 0.22 0.647 0 D 306.62 1 306.62 230.41 < 0.000 1** AB 0.98 1 0.98 0.73 0.406 0 AC 3.94 1 3.94 2.96 0.107 0 AD 3.33 1 3.33 2.50 0.136 0 BC 0.18 1 0.18 0.13 0.721 0 BD 0.31 1 0.31 0.23 0.638 0 CD 0.085 1 0.085 0.064 0.805 0 A2 0.000 52 1 0.000 52 0.000 39 0.985 0 B2 5.32 1 5.32 4.00 0.065 3 C2 13.74 1 13.74 10.32 0.006 3** D2 58.60 1 58.60 44.04 < 0.000 1** 残差Residual 18.63 14 1.33 失拟项Lack of fit 17.75 10 1.77 8.02 0.029 8* 纯误差Pure error 0.89 4 0.22 总误差Total error 444.76 28 注：**表示差异极显著(P < 0.01)，*表示差异显著(P < 0.05)。Notes: ** means extremely significant difference(P < 0.01), * means significant difference(P < 0.05). -
通过对提取率回归模型的求解，得到牛蒡叶最佳提取条件：液料比30.00 mL/g、温度51.69 ℃、时间76.78 min和pH值2.0。此条件下，理论提取率为45.81%。从实验可行性出发，对最佳条件修正为：料液比30 mL/g、温度52 ℃、时间77 min、pH值2.0。在此修正条件下，多次实验的平均提取率为44.86%，与理论值相对差异率为-2.08%, 差异性较小，其抑制指示菌(白腐菌)的平均抑菌圈直径达到15.34 mm，较预实验提高了16.47%，因此采用此条件对牛蒡抑菌物质进行提取是最优的。
-
如表 5所示：牛蒡提取物对白腐菌和褐腐菌具有良好的抑菌性能，在14%时达到最高抑菌能力。另外，在一定范围内，抑菌能力随着质量分数的增加而加强；在2%时，无明显抑菌圈，所以其对两种菌的MIC应在2%~4%。考虑牛津杯法中质量分数的对数与抑菌圈直径的平方成线性关系，因此提取物对两种木腐菌的毒力回归方程如下：
$$ \begin{array}{l} d_1^2 = {\rm{ }}331.86{\rm{lg}}c + {\rm{ }}572.47\;\;\;\;\;\;\;({\mathit{R}^2} = 0.957)\\ d_2^2 = {\rm{ }}266.91{\rm{lg}}c + {\rm{ }}436.82\;\;\;\;\;\;\;({\mathit{R}^2} = 0.861) \end{array} $$ 式中：d1、d2分别白腐菌和褐腐菌抑菌圈直径，mm；c为药液质量分数。
表 5 不同质量分数下提取物对白腐菌和褐腐菌的抑制圈直径
Table 5. Inhibition zone diameter of extracts against Coriolusversicolor and Gloceophyllumtrabeum under different concentrations mm
菌种
Wood rot fungi药液质量分数Medicament concentration 对照Conrtol 2% 4% 6% 8% 10% 12% 14% 16% 白腐菌Coriolusversicolor - - 10.72 12.73 14.48 15.40 15.67 17.64 16.06 褐腐菌Gloceophyllumtrabeum - - 9.26 9.96 11.15 12.33 13.65 15.52 13.86 注：-表示无明显抑菌效果。Note: - means no obvious anti-fungal effects. 计算得出：白腐菌和褐腐菌的MIC(即抑菌圈直径等于0 mm时药液的质量分数)分别为1.88%、2.31%。此提取物对白腐菌的敏感性高。另外，将药液配置成不同质量分数后，药液的pH值在3.0~4.0，而对照组(pH值为3.0的乙酸溶液)无明显抑菌效果。邸向辉[6]对楝树种子粉末进行提取，获得对白腐菌和褐腐菌的MIC为2%和5%，以及张玲[13]对银杏(Ginkgo biloba)心材进行提取，其提取物MIC分别为6%和2%，说明本研究获得的提取物对两种菌具有良好的抑菌效果，且广谱性较好。
-
在负离子检出模式下，以相对丰度大于5%，且分离良好的色谱峰为对象，在不同的保留时间下牛蒡叶分离出16个特征峰(图 6)。经液相色谱质谱连用仪给出的多级质谱数据，结合文献中母离子、特征离子的变化以及质核比的相对强度对抑菌活性物质的定性分析，共确定出12个化学成分(见表 6)。其中奎宁酸、4, 5-二咖啡酰奎尼酸在许多植物组织中作为绿原酸等酚酸类的组成成分，并且相对于维生素E具有较好的抗氧化能力，即具有较好的稳定性[14]。绿原酸是一种重要的生物活性物质，具有抗菌、抗病毒等作用，芦丁、β-桉叶醇也具有一定的抗氧化稳定性作用[7-9, 15]。在总离子流图中未检测出乙酸离子峰，可能是大部分乙酸在浓缩过程中被剔除。预实验中以酸性水为溶剂获得的提取物的抑菌能力均高于乙醇提取物、提取剩余物和对照试剂(pH值为3.0的乙酸水溶液)的抑菌能力。从以上结果可以推断出：牛蒡叶提取物对木材腐朽菌的抑制作用不是由单一成分作用的，而是提取物中多种成分的协同作用，同时也排除了乙酸溶剂的抑菌性能。
图 6 牛蒡叶提取物成分总离子流图
Figure 6. Total ion flow diagram of burdock leaf extract
表 6 牛蒡叶提取物成分分析
Table 6. Analysis of active components from burdock leaves
序号
No.保留时间
Retention time/min母离子质荷比
Parent ion mass-to-charge ratio分子式
Molecular formula特征离子质荷比
Typical ion mass-to-charge ratio化合物
Compound1 6.31 191 C7H2O6 173、127、111 奎宁酸Quinic acid[16] 2 12.47 153 C7H7O4 109 原儿茶酸Protocatechuic acid[17] 3 12.80 515 C25H24O12 353、191、179 异绿原酸C Isochlorogenic acid C[18] 4 13.64 515 C25H24O12 353、191、179 异绿原酸A Isochlorogenic acid A[18] 5 13.89 515 C25H24O12 353、191、179 异绿原酸B Isochlorogenic acid B[18] 6 14.55、14.84、15.20、17.66 707 353 二聚绿原酸Dimer chlorogenic acid 7 21.02 353 C16H18O9 191、173、127 绿原酸Chlorogenic acid[16, 18] 8 24.77 221 C15H26O 177 β-桉叶醇β-eudesmol[19] 9 26.78 610 C27H30O16 301 芦丁Rutin[20] 10 29.14 701 335、683 11 29.67 449 431、269 12 30.28 594 C27H31O15 286 5′-propanediolmatairesinoside[21] 13 30.95 515 C25H24O12 353、191、179 4, 5-二咖啡酰奎尼酸4, 5-dicaffeoylquinic acid[18] 14 32.18 811 793、631 15 32.21 809 465、241 16 33.51 327 C17H18O2S2 291、269 牛蒡酮-a Arctinone-a[12] -
采用酸性水为溶剂获得的牛蒡叶提取物的抑菌能力要高于乙醇萃取物以及萃取剩余，即植物源活性物质的抑菌能力是多种成分协同作用的结果。通过逐步回归，确定了牛蒡叶提取率与液料比、提取温度、提取时间和溶剂pH值的回归模型，经检验该模型预测效果较好。模型下的最佳工艺条件为：液料比30 mL/g、温度52 ℃、时间77 min和pH值2.0，平均提取率为44.86%，提取物的抑菌圈直径达到15.34 mm，比预实验(抑菌圈直径为13.17 mm)提高了16.47%。经质谱分析可知：此种方式下得到的牛蒡叶提取物主要含有有机酸类、黄酮类、苷类、萜类等抑菌活性物质，并且该提取物对木材腐朽菌的抑制作用主要来自于各种活性成分的协同作用。牛蒡叶提取物对白腐菌和褐腐菌的MIC为1.88%、2.31%，具有良好的广谱抑木腐菌效果，其中对白腐菌的敏感性更强。因此，采用酸性水为提取溶剂能够快速获取牛蒡叶中的抑菌活性成分，并为植物源木材防腐剂研究提供新的来源和获取方式。植物源木材防腐剂作为低毒、高效、新型木材防腐剂，具有深入研究的价值。
from Arctium lappa leaves and its anti-fungal properties of wood rot fungi
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摘要: 研究了牛蒡叶中抑制木腐菌活性成分的快速提取工艺及其提取物对木材腐朽菌的抑制性能。在以彩绒革盖菌为提取物抑菌效果指示菌的提取预实验以及以提取率为指标的单因素实验基础上，采用响应曲面法对牛蒡叶中活性成分进行优化提取，确定最优提取方式和对木材腐朽菌(彩绒革盖菌和密粘褶菌)的抑制能力，并通过Accela U-HPLC高速液相色谱系统分离和鉴定优化条件下提取物中的活性成分。结果表明：在预实验中，酸性水提取物的抑菌效果要优于其他方式；经过响应曲面四因素三水平优化后，在液料比30 mL/g、提取温度52 ℃、提取时间77 min和溶剂pH值2.0条件下，理论提取率达到45.81%，经验证此条件下的平均提取率为44.86%，与模型理论值差异为-2.08%；此条件下的提取物，比预实验中采用酸性水方式获得的提取物抑制白腐菌的效果提高了16.47%；在此条件下获取的提取物，经U-HPLC-MS分离并鉴定出12种具有抑菌活性的成分，分别为有机酸类(奎宁酸、原儿茶酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、二聚绿原酸、绿原酸、4, 5-二咖啡酰奎尼酸)、黄酮类(牛蒡酮-a)、苷类(芦丁、5′-Propanediolmatairesinoside)、萜类(β-桉叶醇)。经验证，响应曲面优化后得到的提取物对彩绒革盖菌和密粘褶菌均具有良好的广谱抑菌能力，其对两种菌的最低抑菌质量分数分别为1.88%和2.31%。Abstract: The purpose of this study was to determine the rapid extraction process of the active ingredient from burdock leaves and its inhibition performance of wood-rot fungus. On the basis of the preliminary experiment with the Coriolus versicolor as indicator fungi and the single factor experiments with the extraction rate as an indicator, the response surface method (RSM) was used to optimize the extraction of active constituents from the leaves of Arctium lappa, and the anti-fungal ability to wood rot fungi was determined. And the active constituents were separated and identified by U-HPLC-MS under the optimization condition of extraction. Experiment results showed that: the anti-fungi property with acidic water extraction was superior to other ways in the preliminary experiments. After four factors and three levels of response surface optimization, the extraction rate reached 45.81% under the following conditions: the ratio of liquid to material was 30 mL/g, the extraction temperature was 52 ℃, extraction time was 77 min, and the solvent pH was 2.0. The average extraction yield was 44.86% verified under the optimization condition, and the theoretical value difference of the model was -2.08%. The effect of the extract on inhibiting white rot fungi was 16.47% higher than that of the pre-experiment with the acidic water. Twelve kinds of anti-fungi active compounds were isolated and identified by U-HPLC-MS, i.e. organic acids (quinic acid, protocatechuic acid, isochlorogenic acid A, isochlorogenic acid B, isochlorogenic acid C, dimer chlorogenic acid, chlorogenic acid, 4, 5-dicaffeoylquinic acid), flavonoids (arctinone-a), glycosides (rutin, 5′-propanediolmatairesinoside), terpenes (β-eudesmol). The minimum inhibitory concentrations of the extracts obtained by this method were 1.88% and 2.31% for white rot fungi (Coriolus versicolor) and brown rot fungi (Gloceophyllum trabeum), respectively.
-
Key words:
- burdock leaf /
- anti-fungal /
- white-rot fungi /
- response surface method
-
图 5 交互作用对提取率的影响
a.时间与液料比Time and liquid-to-solid ratio; b.温度与液料比Temperature and liquid-to-solid ratio; c.液料比与pH Liquid-to-solid ratio and pH; d.时间与温度Time and temperature
Figure 5. Effects of interaction on extraction rate
表 1 响应曲面实验水平设计表
Table 1. Level design of response surface method
因素
Factor水平Level -1 0 1 A液料比Liquid-to-solid ratio/(mL·g-1) 10 20 30 B提取温度Extraction temperature/℃ 45 50 55 C提取时间Extraction time/min 30 60 90 D溶剂pH值pH of extraction solution 2.0 3.0 4.0 
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表 2 U-HPLC流动相洗脱方式
Table 2. U-HPLC mobile phase elution method
序号
No.保留时间
Retention time/min乙腈
Acetonitrile/%0.1%甲酸溶液
0.1% formic acid/%流速
Flow velocity/(μL·min-1)0 0 10 90 400 1 5 13 87 400 2 15 20 80 400 3 21 20 80 400 4 30 75 25 400 5 35 90 10 400 6 37 100 0 400
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表 3 牛蒡叶提取预实验结果
Table 3. Pre-test results of burdock leaf extraction
提取方式Extraction method 提取率
Extraction rate/%平均抑菌圈直径Average anti-fungal zone diameter/mm 初提取Initial extraction 二次处理Second processing 水提取Extraction with distilled water 30.74 8.70 酸性水Extraction with acid water 33.08 13.17 酸性水Extraction with acid water 萃取剩余Extraction remaining 20.38 9.91 乙醇萃取Ethanol extraction 5.21 10.93
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表 4 响应曲面因子方差分析
Table 4. Anova for response surface method (RSM) quadratic model analysis
方差来源
Variance source平方和
Sum of squares自由度
df均方
Mean squaresF值
F-valueP值
P-value模型Model 426.13 14 30.44 22.87 < 0.000 1** A 23.35 1 23.35 17.54 0.000 9** B 3.53 1 3.53 2.656 0.126 0 C 0.29 1 0.292 0.22 0.647 0 D 306.62 1 306.62 230.41 < 0.000 1** AB 0.98 1 0.98 0.73 0.406 0 AC 3.94 1 3.94 2.96 0.107 0 AD 3.33 1 3.33 2.50 0.136 0 BC 0.18 1 0.18 0.13 0.721 0 BD 0.31 1 0.31 0.23 0.638 0 CD 0.085 1 0.085 0.064 0.805 0 A2 0.000 52 1 0.000 52 0.000 39 0.985 0 B2 5.32 1 5.32 4.00 0.065 3 C2 13.74 1 13.74 10.32 0.006 3** D2 58.60 1 58.60 44.04 < 0.000 1** 残差Residual 18.63 14 1.33 失拟项Lack of fit 17.75 10 1.77 8.02 0.029 8* 纯误差Pure error 0.89 4 0.22 总误差Total error 444.76 28 注：**表示差异极显著(P < 0.01)，*表示差异显著(P < 0.05)。Notes: ** means extremely significant difference(P < 0.01), * means significant difference(P < 0.05).
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表 5 不同质量分数下提取物对白腐菌和褐腐菌的抑制圈直径
Table 5. Inhibition zone diameter of extracts against Coriolusversicolor and Gloceophyllumtrabeum under different concentrations mm
菌种
Wood rot fungi药液质量分数Medicament concentration 对照Conrtol 2% 4% 6% 8% 10% 12% 14% 16% 白腐菌Coriolusversicolor - - 10.72 12.73 14.48 15.40 15.67 17.64 16.06 褐腐菌Gloceophyllumtrabeum - - 9.26 9.96 11.15 12.33 13.65 15.52 13.86 注：-表示无明显抑菌效果。Note: - means no obvious anti-fungal effects.
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表 6 牛蒡叶提取物成分分析
Table 6. Analysis of active components from burdock leaves
序号
No.保留时间
Retention time/min母离子质荷比
Parent ion mass-to-charge ratio分子式
Molecular formula特征离子质荷比
Typical ion mass-to-charge ratio化合物
Compound1 6.31 191 C7H2O6 173、127、111 奎宁酸Quinic acid[16] 2 12.47 153 C7H7O4 109 原儿茶酸Protocatechuic acid[17] 3 12.80 515 C25H24O12 353、191、179 异绿原酸C Isochlorogenic acid C[18] 4 13.64 515 C25H24O12 353、191、179 异绿原酸A Isochlorogenic acid A[18] 5 13.89 515 C25H24O12 353、191、179 异绿原酸B Isochlorogenic acid B[18] 6 14.55、14.84、15.20、17.66 707 353 二聚绿原酸Dimer chlorogenic acid 7 21.02 353 C16H18O9 191、173、127 绿原酸Chlorogenic acid[16, 18] 8 24.77 221 C15H26O 177 β-桉叶醇β-eudesmol[19] 9 26.78 610 C27H30O16 301 芦丁Rutin[20] 10 29.14 701 335、683 11 29.67 449 431、269 12 30.28 594 C27H31O15 286 5′-propanediolmatairesinoside[21] 13 30.95 515 C25H24O12 353、191、179 4, 5-二咖啡酰奎尼酸4, 5-dicaffeoylquinic acid[18] 14 32.18 811 793、631 15 32.21 809 465、241 16 33.51 327 C17H18O2S2 291、269 牛蒡酮-a Arctinone-a[12]
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