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有斑百合多倍体诱导及鉴定

张锡庆 汪莲娟 曹钦政 贾桂霞

张锡庆, 汪莲娟, 曹钦政, 贾桂霞. 有斑百合多倍体诱导及鉴定[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(7): 96-102. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170028
引用本文: 张锡庆, 汪莲娟, 曹钦政, 贾桂霞. 有斑百合多倍体诱导及鉴定[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(7): 96-102. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170028
ZHANG Xi-qing, WANG Lian-juan, CAO Qin-zheng, JIA Gui-xia. Polyploidy induction and identification in Lilium concolor var. pulchellum[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(7): 96-102. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170028
Citation: ZHANG Xi-qing, WANG Lian-juan, CAO Qin-zheng, JIA Gui-xia. Polyploidy induction and identification in Lilium concolor var. pulchellum[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(7): 96-102. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170028

有斑百合多倍体诱导及鉴定

doi: 10.13332/j.1000-1522.20170028
基金项目: 

林业公益性行业科研专项 201204609

国家自然科学基金项目 31470106

详细信息
    作者简介:

    张锡庆,博士生。主要研究方向:园林植物种质资源与遗传育种。Email:zhangxiqing1983@126.com  地址:100083  北京市海淀区清华东路35号北京林业大学园林学院

    通讯作者:

    贾桂霞,教授,博士生导师。主要研究方向:园林植物种质资源与遗传育种。Email:gxjia@bjfu.edu.cn  地址:同上

  • 中图分类号: S682.2+9

Polyploidy induction and identification in Lilium concolor var. pulchellum

  • 摘要: 为了建立野生有斑百合多基因型种子离体多倍体诱导方法及快速、准确和高效的多倍体鉴定技术,本研究在离体培养条件下,以野生有斑百合预培养7 d的无菌萌动种子(2n=2x=24)为材料,用不同含量的秋水仙素溶液进行不同时间的诱变处理。以种子下胚轴明显膨大作为变异植株早期鉴定的标准,通过流式细胞仪检测细胞核DNA含量,并结合染色体计数法对诱导后的植株进行倍性鉴定,探讨在相同的种子萌动状态下,不同含量、不同浸泡时间的秋水仙素诱变效果,并初步建立了种子离体多倍体诱导和鉴定技术流程。结果表明:0.10%的秋水仙素溶液可有效地诱导野生有斑百合萌动种子的染色体加倍,其中以浸泡处理36 h的诱导效果最好,诱导率达44.43%;与二倍体植株相比,四倍体植株表现出叶片肥厚且增宽、叶色深绿、叶表面轻微褶皱、叶柄粗壮、生长缓慢等特征。研究还发现,植物外部形态变化不仅在二倍体和四倍体之间存在,而且在不同基因型的四倍体之间也存在差异。本研究利用下胚轴的膨大作为早期筛选多倍体的有效指标,同时结合直接测定细胞中DNA含量和计数染色体数可快速有效地培育出野生有斑百合同源四倍体植株。本研究建立的离体多倍体诱导流程除可应用于有斑百合种子多倍体的诱导外,也可为其他野生百合种子离体染色体加倍提供参考。
  • 图  1  二倍体和四倍体倍性鉴定

    x轴和y轴分别代表荧光强度和细胞核数。图a、b为流式细胞分析,二倍体(图a)作内标,图b为四倍体;图c、d为根尖染色体数, 二倍体2n=2x=24(图c),四倍体2n=4x=48(图d); 比例尺=10 μm。

    Figure  1.  Ploidy confirmation of diploid and tetraploid plants

    The x-and y-axes represent the relative signal intensity and number of nuclei, respectively.Figures a, b are flow cytometry analysis of the relative DNA amounts of PI-stained nuclei from fresh young leaves. The diploid (a) was used as a control standard to compare the ploidy levels of tetraploid (b) plants; c, d are chromosomes of a root tip cell from diploid 2n = 2x = 24 (c) and induced tetraploid 2n = 4x = 48 (d); bars = 10 μm.

    表  1  不同秋水仙素含量和浸泡时间对有斑百合萌动种子的诱导结果

    Table  1.   Effects of colchicine concentrations and exposure times on tetraploid induction rate from germinating seeds of L. concolor var. pulchellum

    处理
    Treatment
    秋水仙素质量分数
    Colchicine mass fraction
    浸泡时间
    Exposure time/h
    处理种子粒数
    Number of seeds
    存活率
    Survival rate/%
    下胚轴膨大率
    Hypocotyl swollen rate/%
    四倍体诱导率
    Tetraploid induction rate/%
    T10.00%189097.77±2.23a0.00±0.00d0.00±0.00f
    T20.03%189094.43±1.13ab15.53±4.00c4.43±1.13ef
    T30.05%189094.47±4.00ab14.43±4.43c6.67±1.93ef
    T40.10%189091.10±4.02ab22.20±1.10c11.13±2.94e
    T50.00%249097.80±1.10a0.00±0.00d0.00± 0.00f
    T60.03%249084.43±6.78bc27.77±6.19c21.13±2.94d
    T70.05%249091.10±2.20ab43.33±1.93b35.53±2.23c
    T80.10%249087.80±1.10abc58.90±4.02a47.77±2.94ab
    T90.00%369092.20±1.10ab0.00±0.00d0.00±0.00f
    T100.03%369090.00±1.91abc67.77±2.94a55.53±2.23a
    T110.05%369091.10±4.85ab64.47±9.68a54.47±7.79ab
    T120.10%369080.00±1.91c65.57±4.43a44.43±5.57bc
    注:后3列数据为3个重复的均值±标准误。同列不同字母之间差异显著(P<0.05)。Notes: values represent means ±SE of three replicates. Different lowercase letters within a column indicate significant difference at P<0.05 level.
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    表  2  多变量方差分析主体间效应的检验

    Table  2.   Tests of among-subjects effects in multivariate


    Source
    因变量
    Dependent variable
    Ⅲ型平方和
    Sum of squares of type Ⅲ
    自由度
    df
    均方
    Mean square
    F
    F value
    显著性
    Sig.
    秋水仙素质量分数
    Colchicine mass fraction
    存活率Survival rate447.3833149.1284.7680.008
    下胚轴膨大率Hypocotyl swollen rate12 694.23634 231.41226.0600.000
    四倍体诱导率Tetraploid induction rate6 845.13032 281.71016.5980.000
    浸泡时间Exposure time存活率Survival rate234.1622117.0813.7430.035
    下胚轴膨大率Hypocotyl swollen rate7 965.98423 982.99224.5300.000
    四倍体诱导率Tetraploid induction rate6 683.42023 341.71024.3090.000
    误差Error存活率Survival rate938.3853031.279
    下胚轴膨大率Hypocotyl swollen rate4 871.24330162.375
    四倍体诱导率Tetraploid induction rate4 124.05830137.469
    总计Total存活率Survival rate299 845.14036
    下胚轴膨大率Hypocotyl swollen rate61 625.13036
    四倍体诱导率Tetraploid induction rate37 406.91036
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    表  3  多变量方差多重比较分析

    Table  3.   Multiple comparison analysis in ANOVA

    项目
    Item
    存活率
    Survival rate/%
    下胚轴膨大率
    Hypocotyl swollen rate/%
    四倍体诱导率
    Tetraploid induction rate/%
    秋水仙素Colchicine mass fraction0.00%95.92±1.22a0.00±0.00c0.00±0.00c
    0.03%89.62±2.52ab37.02±8.21ab27.03±7.60ab
    0.05%92.78±2.18ab28.88±6.81b21.10±6.59b
    0.10%87.50± 1.97b52.78±5.90a39.45±5.52a
    浸泡时间Exposure time18 h94.44±1.50a13.04±2.76b5.56±1.44b
    24 h90.28±2.15ab32.50±6.76a26.11±5.45a
    36 h88.32±1.90b49.45±8.93a38.61±7.16a
    注:同列不同字母之间差异显著(P<0.05)。Note :different lowercase letters within a column indicate significant difference at P<0.05.
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    表  4  下胚轴膨大植株数与四倍体植株数间相关分析

    Table  4.   Correlation analysis between number of swollen-hypocotyls plants and number of tetraploid plants

    下胚轴膨大植株数
    Number of swollen-hypocotyl plants
    四倍体植株数
    Number of tetraploid plants
    下胚轴膨大植株数Number of swollen-hypocotyl plants10.981**
    0.000
    3636
    四倍体植株数
    Number of tetraploid plants
    0.981**1
    0.000
    3636
    注:**表示在P<0.01水平(双侧)上相关性极显著;n=36。Notes: ** represents extremely significant correlation at P<0.01 level (bilateral);n=36.
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    , 冯仲科, 尹伟伦, 孙建华, 张庆, 刘玉军, 呼晓姝, 林善枝, 李镇宇, 张兴杰, 王民中, 沈应柏, 陈卫平, 丁霞, 陶凤杰, 王玉春, 刘艳, 李凤兰, 杨伟光, 马建海, 付瑞海, 蒋平, 赵新丽, 汪植.  授粉后施加秋水仙碱处理诱导青杨派异源三倍体 . 北京林业大学学报, 2007, 29(5): 18-21.
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    , 吴坚, 郭晓萍, 高荣孚, 刘玉军, 冯晓峰, 骈瑞琪, 王建中, 王晓楠, 李凯, 严晓素, 王玉兵, 谢磊, 于京民2, 王冬梅, 张志翔, 王瑛, 呼晓姝, 王玉春, 刘玉军, 陶凤杰, 孙建华, 陈卫平, 王民中, 张兴杰, 李镇宇, 刘艳, 沈应柏, 李凤兰, 杨伟光, 张庆, 丁霞, 林善枝, 汪植, 付瑞海, 蒋平, 赵新丽, 马建海.  四倍体刺槐大小孢子发生和雌雄配子体发育 . 北京林业大学学报, 2007, 29(5): 12-17.
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出版历程
  • 收稿日期:  2017-02-04
  • 修回日期:  2017-04-07
  • 刊出日期:  2017-07-01

有斑百合多倍体诱导及鉴定

doi: 10.13332/j.1000-1522.20170028
    基金项目:

    林业公益性行业科研专项 201204609

    国家自然科学基金项目 31470106

    作者简介:

    张锡庆,博士生。主要研究方向:园林植物种质资源与遗传育种。Email:zhangxiqing1983@126.com  地址:100083  北京市海淀区清华东路35号北京林业大学园林学院

    通讯作者: 贾桂霞,教授,博士生导师。主要研究方向:园林植物种质资源与遗传育种。Email:gxjia@bjfu.edu.cn  地址:同上
  • 中图分类号: S682.2+9

摘要: 为了建立野生有斑百合多基因型种子离体多倍体诱导方法及快速、准确和高效的多倍体鉴定技术,本研究在离体培养条件下,以野生有斑百合预培养7 d的无菌萌动种子(2n=2x=24)为材料,用不同含量的秋水仙素溶液进行不同时间的诱变处理。以种子下胚轴明显膨大作为变异植株早期鉴定的标准,通过流式细胞仪检测细胞核DNA含量,并结合染色体计数法对诱导后的植株进行倍性鉴定,探讨在相同的种子萌动状态下,不同含量、不同浸泡时间的秋水仙素诱变效果,并初步建立了种子离体多倍体诱导和鉴定技术流程。结果表明:0.10%的秋水仙素溶液可有效地诱导野生有斑百合萌动种子的染色体加倍,其中以浸泡处理36 h的诱导效果最好,诱导率达44.43%;与二倍体植株相比,四倍体植株表现出叶片肥厚且增宽、叶色深绿、叶表面轻微褶皱、叶柄粗壮、生长缓慢等特征。研究还发现,植物外部形态变化不仅在二倍体和四倍体之间存在,而且在不同基因型的四倍体之间也存在差异。本研究利用下胚轴的膨大作为早期筛选多倍体的有效指标,同时结合直接测定细胞中DNA含量和计数染色体数可快速有效地培育出野生有斑百合同源四倍体植株。本研究建立的离体多倍体诱导流程除可应用于有斑百合种子多倍体的诱导外,也可为其他野生百合种子离体染色体加倍提供参考。

English Abstract

张锡庆, 汪莲娟, 曹钦政, 贾桂霞. 有斑百合多倍体诱导及鉴定[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(7): 96-102. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170028
引用本文: 张锡庆, 汪莲娟, 曹钦政, 贾桂霞. 有斑百合多倍体诱导及鉴定[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(7): 96-102. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170028
ZHANG Xi-qing, WANG Lian-juan, CAO Qin-zheng, JIA Gui-xia. Polyploidy induction and identification in Lilium concolor var. pulchellum[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(7): 96-102. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170028
Citation: ZHANG Xi-qing, WANG Lian-juan, CAO Qin-zheng, JIA Gui-xia. Polyploidy induction and identification in Lilium concolor var. pulchellum[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(7): 96-102. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170028
  • 有斑百合(Lilium concolor var. pulchellum)为百合科(Liliaceae)百合属渥丹(L. concolor)的变种。分布于中国大陆的内蒙古、山东、河北、黑龙江、辽宁、吉林等地,日本、韩国、俄罗斯也有分布[1]。有斑百合具有植株低矮(30~70 cm), 花朵数多(1~5朵),花色艳丽, 自然结实率和有胚率高,抗寒、抗旱、抗病、抗盐碱性较强的特点,是优良的百合属种质资源,具有潜在的开发利用价值[2-3]。但因近年来有斑百合种质资源原生境破坏严重,人工采挖及无意识的破坏,加速了其濒危速度。此外,有斑百合在野生状态下繁殖系数较低,而且茎杆纤细,易倒伏,很难直接进行人工栽培或用于园林绿化。因此,开展有斑百合的多倍体育种,对于资源的保护和持续利用具有重要的意义。目前关于有斑百合的研究主要集中在种质资源调查、收集、保存[4],以及离体培养[3]、花粉保存与萌发[5]、杂交育种[6]和引种栽培试验及繁育技术[7]等方面。而对于有斑百合多倍体育种的研究较少。

    近年来国内多个科研单位分别以淡黄花百合(L. sulphureum)的2年生种球的新芽[8]、兰州百合(L. davidii var. unicolor)的鳞片[9]、青岛百合(L. tsingtauense)的愈伤组织[10]、条叶百合(L. callosum)的不定芽[11]、湖北百合(L.henryi)的丛生芽[12],朝鲜百合(L.amabile)的小鳞茎[13]和细叶百合(L. pumilum)的种子[14]等作为野生百合离体多倍体诱导的材料,均取得了一定的结果。Aina等[15]比较了落花生(Arachis hypogaea)不同外植体对多倍体诱导效率的高低,结果表明种子诱导率显著高于愈伤组织和茎尖;何燕红[16]研究发现用秋水仙素等有丝分裂抑制剂直接处理种子,胚根容易受到毒害而难以成苗,并且容易出现嵌合体等现象;张虹等[17]研究表明,用秋水仙素可有效地诱导黑果枸杞(Lycium ruthenicum)萌动种子的染色体加倍。

    尽管目前已有文献采用秋水仙素或氨磺灵(Oryzalin)处理有斑百合愈伤组织的方法进行多倍体诱导,但并未获得多倍体材料[10],而用有斑百合萌动种子进行离体多倍体诱导尚未见报道。此外,在相关种子离体加倍文献中,经秋水仙素处理后变异苗早期均表现为下胚轴明显的膨大[14, 16-18]。而鲜有研究对下胚轴的膨大和多倍体的诱导率进行相关性分析[14]

    本研究根据有斑百合种子发芽特性,有针对性地对其进行多倍体诱导,以期建立一套高效的多基因型种子离体多倍体诱导方法及快速、准确的倍性鉴定方法,从而为有斑百合野生种质资源利用和百合新品种培育提供参考。

    • 本试验以有斑百合自然授粉获得的种子作为供试材料。

    • 将种子在蒸馏水中室温浸泡1 h,取出用滤纸拭干,之后选取胚明显的种子用于进一步处理。将种子置入无菌容器并移至超净工作台中,浸入75%的乙醇振荡处理30 s后,再用添加有0.1%吐温-20的2%次氯酸钠溶液振荡处理20 min,无菌水漂洗3~4次。将消毒完毕的种子用无菌滤纸吸干水分。将其接种到MS+0.01 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L琼脂的培养基(pH为5.8)中进行种子萌发培养。培养所需光照和温度条件均参照杨利平等[19]的方法。

    • 选取培养7 d、开始萌动的无菌种子加以处理;萌动以种皮破裂,刚露白为标准。萌动种子分别放入质量分数为0.03%、0.05%和0.10%的秋水仙素溶液中浸泡,秋水仙素用2%的二甲基亚砜(DMSO)溶解,高压灭菌,以无菌蒸馏水为对照。静置于组培室分别处理18、24和36 h,无菌水漂洗3~4次,灭菌滤纸吸干水分,然后接种到新配制的上述种子萌发培养基中培养。共12个处理,各设3次重复,每次处理30粒种子。组培室温度为(22±2) ℃, 每天光照时间16 h,光照强度35 μmol/(m2·s),光源为日光灯。

    • 形态变异的鉴定:以萌动种子诱导处理后培养生长30 d后、下胚轴明显膨大为形态变异指标,初步筛选不同处理的变异株系,统计下胚轴膨大率。下胚轴膨大率=下胚轴明显膨大的种子数/处理的种子数×100%。

      流式细胞仪鉴定:以幼嫩的组培叶片为材料。流式细胞仪鉴定在北京市农林科学院蔬菜研究中心完成,统计四倍体诱导率。诱导率=四倍体植株数/处理的种子数×100%。

      染色体鉴定:用常规染色体计数法对流式细胞仪鉴定为四倍体的植株进行检测验证。染色体制片具体操作参照王忠轩等[20]的步骤。

    • 将二倍体对照和鉴定为四倍体的植株分割成不同部分转接至培养基配方为MS+1 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L琼脂的培养基(pH为5.8)中进行增殖和生长培养,90 d后得到生长健壮的试管苗,再转接到MS+0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L琼脂的培养基(pH为5.8)上培养30 d获得生根植株。炼苗移栽成活后60 d观察植株形态变化。

    • 采用SPSS 19.0软件对数据进行方差分析及相关性分析,若处理间差异显著(P<0.05), 则利用邓肯法(Duncan)比较各处理平均值之间的差异。

    • 萌动种子浸泡处理30 d后观察发现,用蒸馏水对照处理时萌动种子生长快,下胚轴和胚根细长,而秋水仙素处理后,萌动种子生长缓慢,胚根伸长受到抑制,且下胚轴明显膨大,粗短,根毛较多。下胚轴膨大种子在种子萌发培养中部分停止生长,将其转接到MS+2 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L琼脂的诱导分化培养基(pH为5.8)中能重新长出真叶或分化出愈伤组织。但也出现种子在培养过程中逐渐坏死的情况。

    • 用4种不同含量的秋水仙素溶液浸泡处理有斑百合培养7 d的萌动种子不同时间后,诱导结果见表 1。诱导处理的1 080粒种子中,共得到983株再生植株,其中342株来源于下胚轴明显膨大的种子,经流式细胞仪检测倍性,共获得253株四倍体植株。由图 1ab可知,四倍体细胞核DNA含量为二倍植株的2倍。经根尖染色体计数法观察,二倍体植株的染色体数为2n=2x=24 (图 1c),四倍体植株的染色体数为2n=4x=48(图 1d)。除此之外,还检测到1株八倍体植株,但未检测出嵌合体。

      表 1  不同秋水仙素含量和浸泡时间对有斑百合萌动种子的诱导结果

      Table 1.  Effects of colchicine concentrations and exposure times on tetraploid induction rate from germinating seeds of L. concolor var. pulchellum

      处理
      Treatment
      秋水仙素质量分数
      Colchicine mass fraction
      浸泡时间
      Exposure time/h
      处理种子粒数
      Number of seeds
      存活率
      Survival rate/%
      下胚轴膨大率
      Hypocotyl swollen rate/%
      四倍体诱导率
      Tetraploid induction rate/%
      T10.00%189097.77±2.23a0.00±0.00d0.00±0.00f
      T20.03%189094.43±1.13ab15.53±4.00c4.43±1.13ef
      T30.05%189094.47±4.00ab14.43±4.43c6.67±1.93ef
      T40.10%189091.10±4.02ab22.20±1.10c11.13±2.94e
      T50.00%249097.80±1.10a0.00±0.00d0.00± 0.00f
      T60.03%249084.43±6.78bc27.77±6.19c21.13±2.94d
      T70.05%249091.10±2.20ab43.33±1.93b35.53±2.23c
      T80.10%249087.80±1.10abc58.90±4.02a47.77±2.94ab
      T90.00%369092.20±1.10ab0.00±0.00d0.00±0.00f
      T100.03%369090.00±1.91abc67.77±2.94a55.53±2.23a
      T110.05%369091.10±4.85ab64.47±9.68a54.47±7.79ab
      T120.10%369080.00±1.91c65.57±4.43a44.43±5.57bc
      注:后3列数据为3个重复的均值±标准误。同列不同字母之间差异显著(P<0.05)。Notes: values represent means ±SE of three replicates. Different lowercase letters within a column indicate significant difference at P<0.05 level.

      图  1  二倍体和四倍体倍性鉴定

      Figure 1.  Ploidy confirmation of diploid and tetraploid plants

      为比较各因素对存活率、下胚轴膨大率和四倍体诱导率的影响程度,对统计结果进行多变量多因素方差分析,结果如表 2所示。由表 2可知:秋水仙素含量对存活率、下胚轴膨大率和四倍体诱导率的影响均具有极显著差异(P<0.01);浸泡时间对存活率的影响具有显著差异(P<0.05),而对下胚轴膨大率和四倍体诱导率的影响均具有极显著差异(P<0.01)。

      表 2  多变量方差分析主体间效应的检验

      Table 2.  Tests of among-subjects effects in multivariate


      Source
      因变量
      Dependent variable
      Ⅲ型平方和
      Sum of squares of type Ⅲ
      自由度
      df
      均方
      Mean square
      F
      F value
      显著性
      Sig.
      秋水仙素质量分数
      Colchicine mass fraction
      存活率Survival rate447.3833149.1284.7680.008
      下胚轴膨大率Hypocotyl swollen rate12 694.23634 231.41226.0600.000
      四倍体诱导率Tetraploid induction rate6 845.13032 281.71016.5980.000
      浸泡时间Exposure time存活率Survival rate234.1622117.0813.7430.035
      下胚轴膨大率Hypocotyl swollen rate7 965.98423 982.99224.5300.000
      四倍体诱导率Tetraploid induction rate6 683.42023 341.71024.3090.000
      误差Error存活率Survival rate938.3853031.279
      下胚轴膨大率Hypocotyl swollen rate4 871.24330162.375
      四倍体诱导率Tetraploid induction rate4 124.05830137.469
      总计Total存活率Survival rate299 845.14036
      下胚轴膨大率Hypocotyl swollen rate61 625.13036
      四倍体诱导率Tetraploid induction rate37 406.91036

      进一步对各因素加以多重比较分析,结果如表 3所示。4种含量的秋水仙素溶液浸泡处理对存活率的影响为:0.00%与0.03%或0.05%之间差异不显著,而0.00%与0.10%之间差异显著;0.03%、0.05%、0.10%之间差异不显著,但以0.05%的存活率最高,为(92.78±2.18)%(表 3)。4种含量的秋水仙素溶液对下胚轴膨大率和四倍体诱导率的影响为:0.03%与0.05%或0.10%之间差异不显著,而0.05%与0.10%之间差异显著(表 3)。综合比较存活率、下胚轴膨大率和四倍体诱导率3个变量可知,0.10%的秋水仙素诱导效果最好。秋水仙素浸泡24 h与18 h或36 h对存活率的影响差异不显著,而浸泡18 h与36 h之间差异显著,浸泡18 h的存活率最高,为(94.44±1.50)%;秋水仙素浸泡18 h与24 h或36 h对下胚轴膨大率的影响存在显著性差异,并且随着浸泡时间延长,下胚轴膨大率逐渐增高。浸泡24 h和36 h之间对四倍体诱导率差异不显著,而与18 h差异显著,其中以浸泡36 h诱导率最高,达(38.61±7.16)%(表 3)。综合比较存活率、下胚轴膨大率和四倍体诱导率3个变量可知,以处理36 h效果最好。综上所述,野生有斑百合多倍体诱导的最佳处理为种子萌动培养7 d、0.10%的秋水仙素处理36 h,四倍体诱导率达44.43%。

      表 3  多变量方差多重比较分析

      Table 3.  Multiple comparison analysis in ANOVA

      项目
      Item
      存活率
      Survival rate/%
      下胚轴膨大率
      Hypocotyl swollen rate/%
      四倍体诱导率
      Tetraploid induction rate/%
      秋水仙素Colchicine mass fraction0.00%95.92±1.22a0.00±0.00c0.00±0.00c
      0.03%89.62±2.52ab37.02±8.21ab27.03±7.60ab
      0.05%92.78±2.18ab28.88±6.81b21.10±6.59b
      0.10%87.50± 1.97b52.78±5.90a39.45±5.52a
      浸泡时间Exposure time18 h94.44±1.50a13.04±2.76b5.56±1.44b
      24 h90.28±2.15ab32.50±6.76a26.11±5.45a
      36 h88.32±1.90b49.45±8.93a38.61±7.16a
      注:同列不同字母之间差异显著(P<0.05)。Note :different lowercase letters within a column indicate significant difference at P<0.05.
    • 表 4相关系数及其检验结果可知,经秋水仙素浸泡处理后获得的下胚轴膨大植株与四倍体植株间的相关系数r=0.981,P=0.000<0.01, 差异极显著,表明两个变量间存在着极显著的正相关关系,即四倍体植株数随下胚轴膨大植株数的增加而增加。

      表 4  下胚轴膨大植株数与四倍体植株数间相关分析

      Table 4.  Correlation analysis between number of swollen-hypocotyls plants and number of tetraploid plants

      下胚轴膨大植株数
      Number of swollen-hypocotyl plants
      四倍体植株数
      Number of tetraploid plants
      下胚轴膨大植株数Number of swollen-hypocotyl plants10.981**
      0.000
      3636
      四倍体植株数
      Number of tetraploid plants
      0.981**1
      0.000
      3636
      注:**表示在P<0.01水平(双侧)上相关性极显著;n=36。Notes: ** represents extremely significant correlation at P<0.01 level (bilateral);n=36.
    • 在相同生长条件下(组培或栽培),二倍体和四倍体植株的外部形态特征不同。但同一倍性植株在组培和栽培条件下基本保持一致。与二倍体对照相比,四倍体植株均表现为生长缓慢、叶柄粗壮、叶色深绿、叶片肥厚且增宽,叶表面轻微褶皱。观察还发现不同基因型的二倍体之间差异不显著,而四倍体之间存在明显差异。

    • 秋水仙素诱导在植物多倍体育种中应用广泛,效果较显著[21],但它对植物有一定的毒害作用,常表现为对植株的生长有抑制作用。本研究表明秋水仙素对萌动种子下胚轴和胚根生长亦有抑制作用,但除少量下胚轴膨大植株在继代过程中逐渐死亡外,大部分的种子均能分化成苗并正常生根及生长,此结果表明刚露白的种子浸泡法对种子的损伤较小[16]。其次,用秋水仙素浸泡有斑百合萌动种子,效果较明显,共获得253株四倍体植株,诱导率达44.43%。其原因可能是种子萌动阶段的细胞处于代谢及合成的旺盛时期,体细胞易于突变[22]

      流式细胞仪检测法结合常规染色体计数法是最为可靠的多倍体鉴定方法[21], 但因流式细胞仪昂贵,测定费用较高,而染色体计数法工作量大等原因,常常用其他方法对诱导材料进行初步鉴定。常用的种子离体加倍初筛方法为形态学鉴定,主要包括早形态变化,如种子发芽慢、粗短, 且下胚轴明显膨大[14, 17-18],以及叶片下表皮单位面积的气孔密度和气孔大小的比较[17-18, 23]。用秋水仙素处理种子诱导多倍体的研究中,部分研究者认为由于秋水仙素处理后会引起生长初期的表型畸变,所以在早期用形态特征指标来鉴定多倍体是不可靠的[23]。而另一部分研究者发现大部分早期外部形态变异植株经染色体数目和流式细胞仪检测为多倍体,认为可将外部形态的变化作为初步鉴定多倍体的一个依据,从而减少了倍性鉴定的工作量[14, 17]。Zhang等[24]用流式细胞仪检测经形态学(茎粗、叶宽比、气孔大小和气孔保卫细胞内叶绿体数)初步筛选出的拟四倍体植株,结果表明50%的植株经流式细胞仪鉴定为四倍体。本研究用流式细胞仪检测经下胚轴膨大初步筛选出的变异株系,结果表明73.98%的变异株经流式细胞仪鉴定为四倍体。该方法易于操作和简单便捷,能大大地减少工作量和提高育种的速度,可为离体种子多倍体鉴定提供参考。

      随着生物技术的发展,利用组织培养技术人工诱导多倍体,是获得新品种的重要途径之一,该方法处理植株量大,实验条件容易控制,重复性好,减少嵌合体,提高诱导率,繁殖快,具有较大的发展潜力,目前已逐渐得到广泛的应用[25]。秋水仙素在诱发种子染色体加倍时,会对细胞产生毒副作用,进而影响其生长发育[26]。在本研究中,部分秋水仙素处理的萌动种子,在种子萌发培养基中停止生长而不能成苗,但转接到分化培养基后又能分化出小苗和愈伤组织,从而提高了诱导率。此外,通过染色体加倍获得的变异株,通过组织培养能迅速稳定住变异,并进行快速繁殖,可以迅速筛选出稳定的四倍体植株。

      多倍体植物常常表现出器官巨大, 生长迅速等优点。杨英杰等[14]在秋水仙素诱导细叶百合种子染色体加倍的研究中,通过比较不同生长阶段二倍体与四倍体植株生长势和形态差异,结果表明,与二倍体植株相比,四倍体植株前期生长缓慢,叶片短缩增宽,叶色加深;后期植株生长加速,叶片增大明显。本研究通过浸泡有斑百合萌动种子获得的四倍体植株,与二倍体植株相比,在组培和早期栽培环境下也同样表现出叶片肥厚、浓绿、增宽的特征,但植株生长缓慢,有待于继续观察比较。

    • 综合比较3个变量(存活率,下胚轴膨大率和四倍体诱导率),野生有斑百合种子离体多倍体诱导的最佳处理为:种子萌动培养7 d、经0.10%的秋水仙素处理36 h,诱导率为44.43%。由于种子下胚轴形态发生变异植株经鉴定大部分都发生倍性变化。所以利用秋水仙素诱导有斑百合种子时下胚轴的形态变异可作为多倍体植株的初步鉴定指标。

参考文献 (26)

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