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胡杨PeAPY1和PeAPY2调控拟南芥耐盐机制研究

邓佳音 张艳丽 张一南 赵瑞 李金克 周晓阳 刘香芬 陈少良

邓佳音, 张艳丽, 张一南, 赵瑞, 李金克, 周晓阳, 刘香芬, 陈少良. 胡杨PeAPY1和PeAPY2调控拟南芥耐盐机制研究[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(6): 13-21. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170034
引用本文: 邓佳音, 张艳丽, 张一南, 赵瑞, 李金克, 周晓阳, 刘香芬, 陈少良. 胡杨PeAPY1和PeAPY2调控拟南芥耐盐机制研究[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(6): 13-21. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170034
DENG Jia-yin, ZHANG Yan-li, ZHANG Yi-nan, ZHAO Rui, LI Jin-ke, ZHOU Xiao-yang, LIU Xiang-fen, CHEN Shao-liang. PeAPY1 and PeAPY2 of Populus euphratica regulating salt tolerance in Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(6): 13-21. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170034
Citation: DENG Jia-yin, ZHANG Yan-li, ZHANG Yi-nan, ZHAO Rui, LI Jin-ke, ZHOU Xiao-yang, LIU Xiang-fen, CHEN Shao-liang. PeAPY1 and PeAPY2 of Populus euphratica regulating salt tolerance in Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(6): 13-21. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170034

胡杨PeAPY1和PeAPY2调控拟南芥耐盐机制研究

doi: 10.13332/j.1000-1522.20170034
基金项目: 

北京市自然科学基金项目 6172024

教育部科学技术研究(科学技术类) 113013A

教育部创新团队发展计划项目 IRT13047

高等学校学科创新引智计划项目 111project

高等学校学科创新引智计划项目 B130007

国家自然科学基金项目 31270654

国家自然科学基金项目 31570587

详细信息
    作者简介:

    主要研究方向:树木逆境生理。Email:dengjiayin12345@163.com  地址: 100083 北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院

    通讯作者:

    陈少良,教授,博士生导师。主要研究方向:树木逆境生理。Email:lschen@bjfu.edu.cn  地址:同上

  • 中图分类号: S792.11;Q945

PeAPY1 and PeAPY2 of Populus euphratica regulating salt tolerance in Arabidopsis thaliana

  • 摘要: 本文研究了胡杨apyrase基因(PeAPY1和PeAPY2)对植物耐盐性的影响。以PeAPY1和PeAPY2过表达拟南芥、拟南芥Atapy1和Atapy2突变体、野生型(WT)拟南芥及空载体(VC)为实验材料,研究盐胁迫条件下的植物根长、相对电导率、细胞活力、H2O2水平、eATP浓度、抗氧化酶活性的变化。研究结果显示:低盐浓度(50 mmol/L NaCl)对拟南芥各基因型的生长和生理生化指标没有显著影响;而高盐浓度(100 mmol/L NaCl)抑制了各株系的根长生长、细胞活力和抗氧化酶(超氧化物歧化酶/SOD、抗坏血酸过氧化酶/APX、过氧化氢酶/CAT)活性,却提高了相对电导率、H2O2水平和eATP浓度。但与Atapy突变体株系相比较,PeAPY过表达株系受高盐胁迫的影响较小。主要是由于PeAPY1/2的过表达提高了apyrase酶活,下调了eATP浓度及其诱发的活性氧水平,同时,过表达株系还通过保持抗氧化酶活性来抑制H2O2的水平,从而降低活性氧及其对膜脂的过氧化,保持了膜的稳定性、细胞活力和生长,最终提高了植物耐盐性。
  • 图  1  NaCl对PeAPY过表达株系、Atapy突变体、空载体、野生型拟南芥生长的影响

    A. NaCl对PeAPY过表达株系(PeAPY1-OEPeAPY2-OE)、Atapy突变体(Atapy1、Atapy2)、空载体(VC)与野生型(WT)拟南芥根长生长的影响; B. PeAPY过表达株系、Atapy突变体、空载体与野生型拟南芥在盐胁迫下的根长平均值。每个数值均为3次重复实验的平均值, 每次实验统计25株, 误差线为标准误差(SE); 柱形图上标注的不同字母表示同一盐浓度下不同株系之间存在显著性差异(P<0.05);N. S表示同一处理条件下各基因型之间无显著差异。下同。

    Figure  1.  Effects of NaCl on root growth of PeAPY-transgenic plants, Atapy mutants, vector control and wild-type arabidopsis

    A, effects of NaCl on root growth of PeAPY-transgenic plants (PeAPY1-OE, PeAPY2-OE), Atapy mutants (Atapy1, Atapy2), vector control (VC) and wild-type (WT) arabidopsis; B, average root length of PeAPY-transgenic plants, arabidopsis Atapy mutants, VC and wild-type under salt stress. Each column shows the mean of three independent experiments. Bars represent the standard error of the mean. Columns labelled with different letters show significant differences (P <0.05) between the WT and PeAPY-transgenic lines; N. S, no significant difference. The same below.

    图  2  NaCl对PeAPY过表达株系、Atapy突变体、空载体、野生型拟南芥生长的影响

    Figure  2.  Effects of NaCl on relative electrolyte leakage of PeAPY-transgenic plants (PeAPY1-OE, PeAPY2-OE), Atapy mutants (Atapy1, Atapy2), vector control (VC) and wild-type (WT) arabidopsis

    图  3  NaCl对PeAPY过表达株系、Atapy突变体、空载体、野生型拟南芥细胞活力的影响

    Figure  3.  Effects of NaCl on cell viability of PeAPY-transgenic plants (PeAPY1-OE, PeAPY2-OE), Atapy mutants (Atapy1, Atapy2), vector control (VC) and wild-type (WT) arabidopsis

    图  4  NaCl对PeAPY过表达株系、Atapy突变体、空载体、野生型拟南芥胞外ATP的影响

    Figure  4.  Effects of NaCl on extracellular ATP of PeAPY-transgenic plants (PeAPY1-OE, PeAPY2-OE), Atapy mutants (Atapy1, Atapy2), vector control (VC) and wild-type (WT) arabidopsis

    图  5  NaCl对PeAPY过表达、Atapy突变体、空载体、野生型拟南芥根细胞内源H2O2水平的影响

    Figure  5.  Effects of NaCl on endogenous H2O2 of PeAPY-transgenic plants (PeAPY1-OE, PeAPY2-OE), Atapy mutants (Atapy1, Atapy2), vector control (VC) and wild-type (WT) arabidopsis

    图  6  NaCl对PeAPY过表达株系、Atapy突变体、空载体、野生型拟南芥抗氧化酶APX、CAT和SOD酶活力的影响

    Figure  6.  Effects of NaCl on antioxidase APX (A), CAT (B) and SOD (C) of PeAPY-transgenic plants (PeAPY1-OE, PeAPY2-OE), Atapy mutants (Atapy1, Atapy2), vector control (VC) and wild-type (WT) arabidopsis

    图  7  胡杨apyrase (PeAPY1和PeAPY2)调控拟南芥耐盐性的信号通路

    Figure  7.  A schematic model showing the role of Populus euphratica apyrase (PeAPY1 and PeAPY2) in salt tolerance in Arabidopsis thaliana

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出版历程
  • 收稿日期:  2017-02-12
  • 修回日期:  2017-03-16
  • 刊出日期:  2017-06-01

胡杨PeAPY1和PeAPY2调控拟南芥耐盐机制研究

doi: 10.13332/j.1000-1522.20170034
    基金项目:

    北京市自然科学基金项目 6172024

    教育部科学技术研究(科学技术类) 113013A

    教育部创新团队发展计划项目 IRT13047

    高等学校学科创新引智计划项目 111project

    高等学校学科创新引智计划项目 B130007

    国家自然科学基金项目 31270654

    国家自然科学基金项目 31570587

    作者简介:

    主要研究方向:树木逆境生理。Email:dengjiayin12345@163.com  地址: 100083 北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院

    通讯作者: 陈少良,教授,博士生导师。主要研究方向:树木逆境生理。Email:lschen@bjfu.edu.cn  地址:同上
  • 中图分类号: S792.11;Q945

摘要: 本文研究了胡杨apyrase基因(PeAPY1和PeAPY2)对植物耐盐性的影响。以PeAPY1和PeAPY2过表达拟南芥、拟南芥Atapy1和Atapy2突变体、野生型(WT)拟南芥及空载体(VC)为实验材料,研究盐胁迫条件下的植物根长、相对电导率、细胞活力、H2O2水平、eATP浓度、抗氧化酶活性的变化。研究结果显示:低盐浓度(50 mmol/L NaCl)对拟南芥各基因型的生长和生理生化指标没有显著影响;而高盐浓度(100 mmol/L NaCl)抑制了各株系的根长生长、细胞活力和抗氧化酶(超氧化物歧化酶/SOD、抗坏血酸过氧化酶/APX、过氧化氢酶/CAT)活性,却提高了相对电导率、H2O2水平和eATP浓度。但与Atapy突变体株系相比较,PeAPY过表达株系受高盐胁迫的影响较小。主要是由于PeAPY1/2的过表达提高了apyrase酶活,下调了eATP浓度及其诱发的活性氧水平,同时,过表达株系还通过保持抗氧化酶活性来抑制H2O2的水平,从而降低活性氧及其对膜脂的过氧化,保持了膜的稳定性、细胞活力和生长,最终提高了植物耐盐性。

English Abstract

邓佳音, 张艳丽, 张一南, 赵瑞, 李金克, 周晓阳, 刘香芬, 陈少良. 胡杨PeAPY1和PeAPY2调控拟南芥耐盐机制研究[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(6): 13-21. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170034
引用本文: 邓佳音, 张艳丽, 张一南, 赵瑞, 李金克, 周晓阳, 刘香芬, 陈少良. 胡杨PeAPY1和PeAPY2调控拟南芥耐盐机制研究[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(6): 13-21. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170034
DENG Jia-yin, ZHANG Yan-li, ZHANG Yi-nan, ZHAO Rui, LI Jin-ke, ZHOU Xiao-yang, LIU Xiang-fen, CHEN Shao-liang. PeAPY1 and PeAPY2 of Populus euphratica regulating salt tolerance in Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(6): 13-21. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170034
Citation: DENG Jia-yin, ZHANG Yan-li, ZHANG Yi-nan, ZHAO Rui, LI Jin-ke, ZHOU Xiao-yang, LIU Xiang-fen, CHEN Shao-liang. PeAPY1 and PeAPY2 of Populus euphratica regulating salt tolerance in Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(6): 13-21. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170034
  • 胞内ATP(三磷酸腺苷又称腺苷三磷酸,adenosine triphosphate)是高能磷酸化合物的典型代表,为细胞内特殊的自由能载体。生物体代谢所发生的化学反应多有ATP参与[1-3],ATP同时也为机体生命活动提供能量。在胞外发现的ATP对细胞的生命活动同样具有重要作用[4-5]。最早在动物细胞外基质中发现了胞外ATP(extracellular ATP,eATP)[6],随后证实,eATP来源于细胞的正常分泌而非由细胞凋亡质膜破裂所引起的胞内ATP外泄[7]。同样,在植物细胞中也证实了eATP的存在。人们发现eATP可以参与植物生长发育和生理活动的调节,例如外源ATP可以促进捕蝇草叶片闭合[8],并且,eATP在调控植物生长发育过程中表现出两相性[9]。更为重要的是,eATP可以作为信号分子调控植物的生长和发育[10-11],如参与调控棉花(Gossypium hirsutum)纤维的生长[12]与生物胁迫的抗逆调节等生理过程。

    在渗透胁迫条件下,eATP会诱发活性氧水平的提高,高浓度的eATP还会诱发植物细胞的程序化死亡(PCD)[13]。因此,在胁迫条件下,控制eATP的水平对植物适应胁迫环境至关重要。Sun等[13]发现胡杨细胞能够调控ATP水平,避免高浓度的eATP诱发的PCD,从而提高了细胞的耐盐性。研究者推测,盐处理的胡杨细胞很可能是利用apyrase(三磷酸腺苷双磷酸酶)水解胞外ATP,维持细胞的活力[14]。最近,Deng等[15]研究发现,胡杨apyrase 2能够调控eATP水平,提高植物的低温耐受性。

    Apyrase能将eATP的高能磷酸键水解形成核苷酸和磷酸。通过对胡杨PeAPY2纯化蛋白酶学特性分析,发现PeAPY2虽能水解多种嘌呤和嘧啶核苷酸,但还是对ATP的亲和力最高[15]。近几年,apyrase蛋白成为抗逆胁迫研究领域的新热点。目前人们已经在马铃薯(Solanum tuberosum)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、大豆(Glycine soja)、胡杨(Populus euphratica)等植物中发现了apyrase的存在,同时对apyrase的功能进行了分析与研究。拟南芥中共有7个apyrase蛋白,其中AtAPY1与AtAPY2相似度较高,达到87%[16-17]。Apyrase通过调节eATP浓度来调节植物的生长、发育及抗逆胁迫[16, 18],如APY1、APY2和eATP在生物胁迫、植物防御反应和生长变化中发挥重要作用[19-20]

    我国的胡杨主要分布于内蒙古西部、甘肃、青海、新疆等地区[21]。胡杨因其对生态环境的重要性受到人们广泛关注,探究其在干旱盐渍条件下的抗逆机制成为研究热点,研究人员从光合作用[22]、离子区隔化[23]、抗氧化能力[24]、植物激素[25]等角度探讨了胡杨的耐盐机理。但胡杨Apyrase如何调控植物的耐盐性,至今研究较少[18, 20]

    本文利用胡杨PeAPY1和PeAPY2过表达株系、拟南芥Atapy1和Atapy2突变体、空载体(VC)、野生型(WT)拟南芥株系,通过测定不同盐浓度胁迫条件下各株系生长和生理生化指标的变化,以探究胡杨apyrase提高植物耐盐性的机理,为后续apyrase的抗逆机制研究提供参考。

    • 本实验所用PeAPY1与PeAPY2过表达株系、Atapy1与Atapy2突变体拟南芥种子均来源于Deng等[15]转基因材料。培养方法:将不同基因型的拟南芥种子春化3 d后播种于1/2 MS培养基中,光照培养。培养条件:光照强度约为100 μmol/(m2·s)、16 h光照/d,生长温度为22 ℃,湿度为60%。每个实验重复3次,且每个基因型种子不少于25粒。

    • PeAPY1-OE与PeAPY2-OE过表达株系、Atapy1突变体、Atapy2突变体、野生型拟南芥WT(Arabidopsis thaliana, Columbia ecotype)和空载体(VC) 6种基因型拟南芥种子春化后播种于正常1/2 MS培养基中,光照培养,垂直放置,使种子萌发。3 d后,将萌发的种子分别转移至含有0、50、100 mmol/L NaCl的1/2 MS培养基中进行盐胁迫处理。

    • 将已萌发的种子转移至含不同盐浓度的培养基中进行胁迫处理7 d后,拍照,并使用ImageJ软件测量幼苗根长长度,分析不同基因型幼苗根长在盐胁迫下的长度变化。

    • 不同基因型的拟南芥种子点种于正常培养基中,生长7 d后,将幼苗转移至含不同盐浓度的液体培养基中处理12 h后,使用浓度为10 μmol/L的荧光素二乙酸酯(Fluorescein diacetate, FDA)对其进行染色,染色10 min后置于Leica SP5激光共聚焦显微镜下观察拟南芥根尖荧光强度,激发光波长为488 nm,接收光波长为505~525 nm,并用ImageJ软件计算荧光强度值。

    • 萌发的拟南芥种子在含盐培养基中胁迫处理7 d后,参照陈爱葵等[26]的方法测定膜透性:取胁迫后拟南芥幼苗,去离子水冲洗3次后将全株拟南芥切成约1 mm长小段,放入10 mL试管中,加入5 mL去离子水,静止12 h后使用雷磁DDS-307电导率仪测定电导率值C1,而后将试管置于100 ℃沸水中加热0.5 h后取出,待溶液冷却至室温后,再次测定此试管中溶液的电导值C2。其中,相对电导率值=C1/C2。

    • 将生长于正常培养基中的拟南芥植株,置于含盐液体培养基中胁迫处理12 h后,用H2O2特异性荧光探针—H2DCFDA对幼苗进行染色,时间为10 min。染色后置于Leica SP5激光共聚焦显微镜(Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany)下观察拟南芥根尖荧光强度,激发光波长为488 nm,接收光波长为510~530 nm,并用ImageJ软件计算荧光强度值。

    • 萌发的拟南芥种子在含盐培养基中胁迫处理7 d后,收集幼苗,迅速放于研钵中用液氮研磨,称量约0.1 g粉末于1.5 mL离心管中且置于液氮中以防止样品冻融。随后在样品中加入1 mL酶提取液,12 000 r/min,4 ℃,离心10 min。取上清溶液,并放在冰上保持酶活力。

      抗坏血酸过氧化酶(Ascorbate peroxidase, APX)活性的测定参考Nakano等[27]和荆晓姝等[28]的方法。

      过氧化氢酶(Catalase, CAT)活性的测定参考Aebi[29]的方法。

      超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase, SOD)活性的测定参考Wang等[30]和Giannopolitis等[31]的方法。

      蛋白定量测定:使用质量浓度为0.5 mg/mL的BSA标准蛋白配置成终质量浓度为0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg/mL的蛋白酶液50 μL,在各管中加入500 μL的考马斯亮蓝G-250,摇匀后静置5 min,测定其在595 nm处的吸收值,绘制蛋白标准曲线,以此来计算各样品中所含有的蛋白含量。

    • 参照Deng等[15]的方法测定eATP浓度:将各基因型拟南芥种子播种于1/2 MS固体培养基(24孔板)中,每孔点种6颗种子,并加入200 μL蒸馏水以防止培养基过度水分蒸发及保湿。将板置于光照下培养7 d后,吸掉蒸馏水,加入不同盐浓度的1/2 MS液体培养基处理12 h后,吸取20 μL溶液,使用Enlighten ATP Assay System Bioluminescence kit (Promega)在冷光仪(Promega Corp., Madison, WI, USA)中测定各样品中的eATP浓度。

    • 根长长度可以直观反映植株的生长状态。本文研究了不同NaCl浓度对PeAPY过表达(PeAPY1-OEPeAPY2-OE)、Atapy突变体(Atapy1、Atapy2)、空载体(VC)与野生型(WT)拟南芥根系生长的影响。通过比较不同基因型的根长(图 1A),可以发现,在50 mmol/L NaCl胁迫下,拟南芥幼苗的根长生长受抑制程度较小,各基因型根长与对照没有显著差异,但突变体较其他基因型根长略小(图 1A)。在100 mmol/L NaCl胁迫下,拟南芥幼苗生长状态受抑制程度较高,但从图 1B中可以看出,PeAPY过表达株系的根长高出突变体株系约18%(图 1B),差异达到显著水平(P < 0.05)。这说明PeAPY过表达株系的耐盐性高于野生型植株、Atapy突变体。

      图  1  NaCl对PeAPY过表达株系、Atapy突变体、空载体、野生型拟南芥生长的影响

      Figure 1.  Effects of NaCl on root growth of PeAPY-transgenic plants, Atapy mutants, vector control and wild-type arabidopsis

    • 细胞膜对于植物正常生长与生理代谢活动具有十分重要地作用。当植物受到逆境胁迫时,会引起细胞膜损伤,从而使胞质的胞液外渗而使相对电导率值变大,电导率的高低在一定程度上反映了细胞膜受损伤的情况,电导率越大,说明植物受损伤程度愈高。本文通过测定盐胁迫条件下相对电导率的变化来比较不同基因型耐盐能力的高低。在无NaCl条件下,各基因型的电导率无较大差别(图 2)。随着盐处理浓度的增加过表达株系与突变体株系的电导率逐渐增大:在50 mmol/L NaCl胁迫下,各基因型的电导率值上升幅度相对较小,而在100 mmol/L NaCl胁迫下,各株系电导率明显提高,但过表达株系的电导率显著低于突变体株系(P < 0.05)。这表明高盐浓度对植物细胞膜的伤害程度加大,但PeAPY过表达株系能够维持膜系统的稳定性以保证植物正常地进行生长与代谢活动。

      图  2  NaCl对PeAPY过表达株系、Atapy突变体、空载体、野生型拟南芥生长的影响

      Figure 2.  Effects of NaCl on relative electrolyte leakage of PeAPY-transgenic plants (PeAPY1-OE, PeAPY2-OE), Atapy mutants (Atapy1, Atapy2), vector control (VC) and wild-type (WT) arabidopsis

    • 荧光素二乙酸酯(Fluorescein diacetate, FDA)在活细胞的酯酶作用下,FDA迅速被分解放出荧光素,因此可根据细胞荧光强度判定细胞活力的大小。对各株系根细胞在不同盐浓度处理下荧光强度的测定发现,在高NaCl浓度(100 mmol/L)胁迫下,过表达株系荧光值明显高于野生型和突变体株系(图 3);在较低盐浓度(50 mmol/L NaCl)胁迫下,各基因型之间的荧光值差别较小,但过表达株系略高于突变体株系(图 3)。荧光定量结果显示,突变体株系在较高盐浓度处理下,其细胞活力值比对照下降了42%,而过表达株系仅下降了24%(图 3)。这表明PeAPY过表达植株在盐胁迫条件下能够保持相对较高的细胞活力,这对植物生长、代谢的正常进行具有十分重要的意义。

      图  3  NaCl对PeAPY过表达株系、Atapy突变体、空载体、野生型拟南芥细胞活力的影响

      Figure 3.  Effects of NaCl on cell viability of PeAPY-transgenic plants (PeAPY1-OE, PeAPY2-OE), Atapy mutants (Atapy1, Atapy2), vector control (VC) and wild-type (WT) arabidopsis

    • Apyrase是水解eATP的关键酶,因此eATP浓度成为判定植物调控耐盐能力高低的重要指标[14]。我们检测了盐胁迫条件下根部eATP的浓度变化,发现在盐胁迫条件下拟南芥根部eATP浓度升高。如图 4所示,在低盐胁迫下,根部eATP浓度略高于对照,当盐浓度上升至100 mmol/L时,各株系eATP浓度高出对照处理9%,而且,突变体与过表达株系之间就表现出了较大的浓度差异(P < 0.05):与WT和Atapy突变体相比较,PeAPY过表达株系的eATP浓度较低(图 4)。这些结果表明,PeAPY过表达株系水解eATP的能力较强,避免了高浓度eATP浓度诱发的细胞的程序化死亡[13],从而使PeAPY过表达植株的耐盐能力高于拟南芥apyrase突变体。

      图  4  NaCl对PeAPY过表达株系、Atapy突变体、空载体、野生型拟南芥胞外ATP的影响

      Figure 4.  Effects of NaCl on extracellular ATP of PeAPY-transgenic plants (PeAPY1-OE, PeAPY2-OE), Atapy mutants (Atapy1, Atapy2), vector control (VC) and wild-type (WT) arabidopsis

    • 在盐胁迫条件下,植物细胞活性氧水平的提高会导致膜系统的过氧化[32-33]。本文利用H2O2特异性荧光探针—H2DCFDA来检测各基因型拟南芥根细胞内源H2O2的水平变化。如图 5所示,在50 mmol/L NaCl处理下,H2O2含量比对照处理植株略有升高,且各基因型之间无明显差异;在用100 mmol/L NaCl胁迫下,NaCl诱导突变体株系H2O2含量显著增加,但PeAPY过表达株系H2O2的水平显著低于突变体株系(P < 0.05),表明过表达植株在盐胁迫条件下能有效调控活性氧的水平,以减轻对膜系统的过氧化破坏。

      图  5  NaCl对PeAPY过表达、Atapy突变体、空载体、野生型拟南芥根细胞内源H2O2水平的影响

      Figure 5.  Effects of NaCl on endogenous H2O2 of PeAPY-transgenic plants (PeAPY1-OE, PeAPY2-OE), Atapy mutants (Atapy1, Atapy2), vector control (VC) and wild-type (WT) arabidopsis

    • 为了探讨apyrase在活性氧平衡方面的作用,我们利用不同NaCl浓度(50、100 mmol/L)进行胁迫处理,并检测盐胁迫对拟南芥植株抗坏血酸过氧化酶(APX)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物岐化酶(SOD)酶活性的影响。

      图 6中可以看出,与对照处理相比,植株在盐胁迫条件下APX酶活力逐渐降低。然而,随着盐处理浓度的提高,过表达株系与突变体之间的差异在显著增大(P < 0.05):突变体株系在50 mmol/L和100 mmol/L NaCl胁迫下APX活性分别下降了26%和48%;而过表达株系在相应的NaCl胁迫下APX活性分别下降了23%和31%(图 6A)。

      图  6  NaCl对PeAPY过表达株系、Atapy突变体、空载体、野生型拟南芥抗氧化酶APX、CAT和SOD酶活力的影响

      Figure 6.  Effects of NaCl on antioxidase APX (A), CAT (B) and SOD (C) of PeAPY-transgenic plants (PeAPY1-OE, PeAPY2-OE), Atapy mutants (Atapy1, Atapy2), vector control (VC) and wild-type (WT) arabidopsis

      CAT酶活在低盐胁迫和高盐胁迫条件下都有所下降,但过表达株系与突变体之间有明显差异(P < 0.05)。与对照相比,突变体株系在50 mmol/L和100 mmol/L NaCl胁迫下CAT活性分别下降了44%和15%,而过表达株系在50 mmol/L NaCl和100 mmol/L NaCl胁迫下CAT活性只下降了20%和1%(图 6B)。

      与CAT相对应,突变体株系的SOD酶活在低盐浓度胁迫条件下下降约50%,而过表达株系的SOD酶活下降幅度较小,约30%(图 6C)。在盐胁迫浓度上升至100 mmol/L NaCl时,各株系SOD酶活与低盐胁迫时无明显差别,但过表达株系的SOD酶活要显著高于野生型和突变体(图 6C)。

    • 从拟南芥根长生长的反应可以看出,随着盐浓度的提高NaCl对各株系的影响也不断增大。低盐浓度对各基因型拟南芥幼苗根长生长抑制程度较小,而高盐浓度对拟南芥幼苗抑制程度提高,但与Atapy1、Atapy2突变体、野生型植株相比,PeAPY1、PeAPY2过表达株系根系生长状态良好,所受影响相对较小(图 1)。这表明PeAPY1、PeAPY2过表达植株的耐盐性高于Atapy1、Atapy2突变体和野生型拟南芥[34-35]。与之相对应,细胞活力的测试结果也反映了相同的趋势(图 3)。PeAPY1、PeAPY2过表达株系耐盐性的提高与其调控膜稳定性和活性氧平衡的能力有关。相对电导率是反映植物细胞膜系统状况的重要指标。拟南芥在盐胁迫下,细胞膜受损会引起胞液外渗继而使相对电导率增大(图 2)。而在高盐浓度下,PeAPY1、PeAPY2过表达株系较Atapy1、Atapy2突变体及野生型植株所受影响较小(图 2),这是由于PeAPY1、PeAPY2基因能够抑制活性氧对膜脂的过氧化作用,降低了盐胁迫对细胞的伤害程度。实验室前期的研究显示,细胞活性氧的产生与eATP有关[13]。在植物受到渗透胁迫时,ATP被释放到胞外空间,通过eATP信号网络诱发活性氧的累积,诱发植物应激反应[14]。有研究显示,AtAPY2过表达可以降低机械损伤引起的活性氧积累,说明在损伤引起的信号转导过程中,apyrase可能通过降解eATP而抑制其诱发的下游反应[36]。Sun等[14]发现盐诱发 的ATP的瞬时释放能够通过调控细胞活性氧平衡提高胡杨细胞耐盐性,随后(20<min)eATP水平下降。这可能是胡杨细胞利用apyrase水解eATP,避免高浓度的eATP诱发的PCD[13],以维持细胞的活力。再有,胡杨apyrase 2能够调控eATP水平,提高植物的低温耐受性[15]。由此可见,apyrase对eATP浓度的有效控制,对植物耐受胁迫环境至关重要。

      拟南芥eATP的浓度变化显示,在高浓度NaCl胁迫下,PeAPY1、PeAPY2过表达株系的eATP含量明显低于Atapy1、Atapy2突变体,这是由于PeAPY1、PeAPY2过表达提高了apyrase酶活,apyrase通过分解eATP抑制了由eATP诱发的一系列毒害作用,如活性氧的爆发[13]。本文H2O2的测试结果也显示,高浓度NaCl诱导突变体株系H2O2含量显著增加,过表达株系H2O2含量显著低于突变体株系(图 5)。我们的研究结果还表明,PeAPY1、PeAPY2过表达株系除了通过控制eATP水平调控活性氧,还能提高抗氧化酶活性控制活性氧的积累。在高盐胁迫下PeAPY1、PeAPY2过表达株系抗氧化酶SOD、APX、CAT的酶活均高于Atapy1、Atapy2突变体(图 6)。结合拟南芥根细胞内源H2O2水平的变化,我们推测盐胁迫下PeAPY1、PeAPY2过表达株系还能通过提高抗氧化酶活抑制H2O2的升高,进而降低盐胁迫对细胞的伤害作用。

      综上所述,我们提出了胡杨apyrase(PeAPY1和PeAPY2)调控拟南芥耐盐的信号通路(图 7):在高盐胁迫下,PeAPY1、PeAPY2过表达株系通过提高apyrase酶活下调eATP浓度,并提高抗氧化酶SOD、APX、CAT酶活力来抑制H2O2的水平,降低活性氧对膜脂的过氧化,从而维持膜的稳定性,保持细胞的活力和生长,最终提高了植物耐盐性。

      图  7  胡杨apyrase (PeAPY1和PeAPY2)调控拟南芥耐盐性的信号通路

      Figure 7.  A schematic model showing the role of Populus euphratica apyrase (PeAPY1 and PeAPY2) in salt tolerance in Arabidopsis thaliana

      鉴于胡杨apyrase能够有效调控胞外ATP浓度,在阻断eATP诱发PCD的同时,还能通过上调抗氧化酶活性增强对胞内活性氧的控制,因此,在对树木进行耐盐性遗传改良的过程中,可以通过基因工程手段过表达胡杨PeAPY1和PeAPY2,以提高盐敏感树木的抗盐性。

参考文献 (36)

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