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拟南芥黄化突变体k60的基因作图定位

戴楠 袁光孝 刘小敏 高宏波

戴楠, 袁光孝, 刘小敏, 高宏波. 拟南芥黄化突变体k60的基因作图定位[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(7): 40-45. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170085
引用本文: 戴楠, 袁光孝, 刘小敏, 高宏波. 拟南芥黄化突变体k60的基因作图定位[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(7): 40-45. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170085
DAI Nan, YUAN Guang-xiao, LIU Xiao-min, GAO Hong-bo. Genetic mapping of a chlorosis mutant k60 in Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(7): 40-45. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170085
Citation: DAI Nan, YUAN Guang-xiao, LIU Xiao-min, GAO Hong-bo. Genetic mapping of a chlorosis mutant k60 in Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(7): 40-45. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170085

拟南芥黄化突变体k60的基因作图定位

doi: 10.13332/j.1000-1522.20170085
基金项目: 

国家自然科学基金项目 31501090

国家自然科学基金项目 J1103516

详细信息
    作者简介:

    戴楠。主要研究方向:植物分子生物学。Email: 1506591113@qq.com  地址:100083  北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院

    通讯作者:

    刘小敏,讲师。主要研究方向:植物分子生物学。Email: liuxiaomin@bjfu.edu.cn  地址:同上

    高宏波,教授,博士生导师。主要研究方向:植物分子生物学。Email: gaohongbo@bjfu.edu.cn  地址:同上

  • 中图分类号: Q943.2

Genetic mapping of a chlorosis mutant k60 in Arabidopsis thaliana

  • 摘要: 拟南芥黄化突变体k60是从甲基磺酸乙脂诱变的拟南芥突变体库中筛选得到的。该突变体表现为叶色发黄,生长迟缓,叶绿素含量降低。遗传分析发现其为单基因控制的隐性突变。利用遗传作图的方法将突变基因定位于拟南芥5号染色体上CH5-6.0到CH5-6.24两个分子标记之间的231 kb区间内。本项工作的研究结果为该突变基因的鉴定奠定了前期基础,并且为研究拟南芥黄化基因的功能提供了新的实验材料。
  • 图  1  野生型Col与k60的表型分析

    A.Col野生型及k60植株表型,比例尺为1 cm;B. Col野生型及k60叶肉细胞中叶绿体表型,比例尺为10 μm。

    Figure  1.  Phenotype analysis of Col and k60

    A, phenotypes of Col and k60 plants, scale bar =1 cm; B, chloroplast phenotypes of Col and k60 in mesophyll cell, scale bar =10 μm.

    图  2  Col野生型与k60的叶肉细胞面积与叶绿体个数相关性分析

    Figure  2.  Correlation analysis between mesophyll cell area and chloroplast number of Col and k60

    图  3  野生型Col与k60叶绿素质量浓度分析

    Figure  3.  Chlorophyll concentration analysis of Col and k60

    图  4  k60的遗传作图

    A.k60与分子标记CH5-3.79、CH5-9.5连锁情况,星号表示有遗传交换的植株;B.k60定位的精细物理图谱,横线上方为分子标记,横线下方为该分子标记在拟南芥5号染色体上的物理位置,括号中数字为重组植株数。

    Figure  4.  Genetic mapping of k60

    A, linkage analysis of k60 with molecular markers CH5-3.79 and CH5-9.5, asterisks indicate plants with recombination; B, fine physical map of the mapping of k60. Molecular markers are indicated above the horizontal line; physical locations of the molecular markers on the chromosome 5 in Arabidopsis thaliana are indicated below the horizontal line; numbers in parentheses indicate the number of plants with recombination.

    表  1  突变体k60的遗传分析

    Table  1.   Genetic analysis of k60

    F2绿色植株数
    Green plantnumber
    黄色植株数
    Yellow plantnumber
    总植株数
    Total plantnumber
    χ2
    k60×Ler110301400.952
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    表  2  k60精细定位所用分子标记的引物序列及重组率

    Table  2.   Primer sequences and the recombination frequency of the molecular markers used in the fine mapping of k60

    分子标记
    Molecular marker
    正向引物
    Forward primer (5′-3′)
    反向引物
    Reverse primer (5′-3′)
    重组率
    Recombination frequency/%
    CH5-5.468GACTAAACTGGCATTAAGTTCTGAGGATGGTTTCTAGATCGTAATGCC1.64
    CH5-5.673CCATCCATGGCTTTGGTTCCGATTTTGTTGCCCCGAG0.94
    CH5-5.858CATAGATTGTTCATGTCTCCTCAGGCTGATATGGCGCTTGAG0.47
    CH5-6.0CTGCTTGATTGGTAAGAATGAGAGGGAAGGGGAGGAAGAGATAAC0.23
    CH5-6.24CTTATCGACACTCTTGCAGGCGGACATGGCAAATGCTCGG0.47
    CH5-6.455GCTGGACACCTCAGTCACGCCTGGAAAAGCGAGGAG1.10
    下载: 导出CSV
  • [1] WATERS M T, LANGDALE J A. The making of a chloroplast[J]. The EMBO Journal, 2009, 28(19): 2861-2873. doi:  10.1038/emboj.2009.264
    [2] 李保珠, 赵孝亮, 彭雷.植物叶绿体发育及调控研究进展[J].植物学报, 2014, 49(3): 337-345. http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/zwxtb201403012

    LI B Z, ZHAO X L, PENG L. Research advances in the development and regulation of plant chloroplasts[J]. Chinese Bulletin of Botany, 2014, 49(3): 337-345. http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/zwxtb201403012
    [3] 王平荣, 张帆涛, 高家旭, 等.高等植物叶绿素生物合成的研究进展[J].西北植物学报, 2009, 29(3): 629-636. doi:  10.3321/j.issn:1000-4025.2009.03.032

    WANG P R, ZHANG F T, GAO J X, et al. An overview of chlorophyl l biosynthesis in higher plants[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2009, 29(3): 629-636. doi:  10.3321/j.issn:1000-4025.2009.03.032
    [4] 何冰, 刘玲珑, 张文伟, 等.植物叶色突变体[J].植物生理学通讯, 2006, 42(1): 1-9. http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/zwslxtx200601001

    HE B, LIU L L, ZHANG W W, et al. Plant leaf color mutants[J]. Plant Physiology Communications, 2006, 42(1): 1-9. http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/zwslxtx200601001
    [5] GUSTAFSSON A. The plasitd development in various types of chlorophyll mutations[J]. Hereditas, 1942, 28(3/4): 483-492.
    [6] BEALE S I. Green genes gleaned[J]. Trends Plant Sci, 2005, 10(7): 309-12. doi:  10.1016/j.tplants.2005.05.005
    [7] WANG Z, ZOU Y, LI X, et al. Cytoplasmic male sterility of rice with boro Ⅱ cytoplasm is caused by a cytotoxic peptide and is restored by two related PPR motif genes via distinct modes of mRNA silencing[J]. The Plant Cell, 2006, 18(3): 676-87. doi:  10.1105/tpc.105.038240
    [8] JUNG K H, HUR J, RYU C H. Characterization of a rice chlorophyll-deficient mutant using the T-DNA gene-trap system[J]. Plant Cell Physiol, 2003, 44(5): 463-472. doi:  10.1093/pcp/pcg064
    [9] TERRY M J, KENDRICK R E. Feedback inhibition of chlorophyll synthesis in the phytochrome chromophore-deficient aurea and yellow-green-2 mutants of tomato[J]. Plant Physiology, 1999, 119(1): 143-152. https://www.jstor.org/stable/4278606
    [10] TILLER N, WEINGARTNER M, THIELE W, et al. The plastid-specific ribosomal proteins of Arabidopsis thaliana can be divided into non-essential proteins and genuine ribosomal proteins[J]. The Plant Journal, 2012, 69(2): 302-16. http://www.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=perio&id=b9d299fbddad4846f324ce4ce2c6a89a
    [11] VICENTINI F, HORTENSTEINER S, SCHELLENBERG M, et al. Chlorophyll breakdown in senescent leaves: identification of the biochemical lesion in a stay-green genotype of Festuca pratensis Huds[J]. New Phytologist, 2010, 129(2): 247-252. doi:  10.1111/j.1469-8137.1995.tb04294.x
    [12] KUSABA M, ITO H, MORITA R, et al. Rice NON-YELLOW COLORING1 is involved in light-harvesting complexⅡ and grana degradation during leaf senescence[J]. The Plant Cell, 2007, 19(4): 1362-1375. doi:  10.1105/tpc.106.042911
    [13] PARK S Y, YU J W, PARK J S, et al. The senescence-induced staygreen protein regulates chlorophyll degradation[J]. The Plant Cell, 2007, 19(5): 1649-1664. doi:  10.1105/tpc.106.044891
    [14] SATO Y, MORITA R, KATSUMA S, et al. Two short-chain dehydrogenase/reductases, NON-YELLOW COLORING 1 and NYC1-LIKE, are required for chlorophyll b and light-harvesting complexⅡ degradation during senescence in rice[J]. The Plant Journal, 2009, 57(1): 120-131. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18778405/
    [15] SCHELBERT S, AUBRY S, BURLA B, et al. Pheophytin pheophorbide hydrolase (pheophytinase) is involved in chlorophyll breakdown during leaf senescence in arabidopsis[J]. The Plant Cell, 2009, 21(3): 767-785. doi:  10.1105/tpc.108.064089
    [16] CHEN G, BI Y R, LI N. EGY1 encodes a membrane-associated and ATP-independent metalloprotease that is required for chloroplast development[J]. The Plant Journal, 2005, 41(3): 364-375. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15659096
    [17] SERGEI K, ELENA B, SERGEI S, et al. A mutation of the mitochondrial ABC transporter Sta1 leads to dwarfism and chlorosis in the arabidopsis mutant starik[J]. The Plant Cell, 2001, 13: 89-100. doi:  10.1105/tpc.13.1.89
    [18] LICHTENTHALER H K. Chlorophylls and carotenoids: pigments of photosynthetic biomembranes[J]. Methods in Enzymology, 1987, 148(1): 350-382. doi:  10.1016-0076-6879(87)48036-1/
    [19] PORRA R J, THOMPSON W A, KRIEDEMANN P E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 1989, 975(3): 384-394. doi:  10.1016/S0005-2728(89)80347-0
    [20] SUN T, SHI X, FRISO G, et al. A zinc finger motif-containing protein is essential for chloroplast RNA editing[J]. Plos Genetics, 2015, 11(3): e1005028.[2017-02-27]. http://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.1005028.
    [21] RUTSCHOW H, YTTERBERG A G, NILSSON R, et al. Quantitative proteomics of a chloroplast SRP54 sorting mutant and its genetic interactions with CLPC1 in arabidopsis[J]. Plant Physiology, 2008, 148(1): 156-175. http://d.old.wanfangdata.com.cn/OAPaper/oai_pubmedcentral.nih.gov_2528104
    [22] WALTER B, PIETA T, SCHVNEMANN D. Arabidopsis thaliana mutants lacking cpFtsY or cpSRP54 exhibit different defects in photosystem Ⅱ repair[J]. Frontiers in Plant Science, 2015, 6: 250. http://www.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=perio&id=Doaj000004617728
  • [1] 武霞, 张一南, 赵楠, 张莹, 赵瑞, 李金克, 周晓阳, 陈少良.  过表达胡杨PeAnn1负调控拟南芥的抗旱性 . 北京林业大学学报, 2020, 42(6): 14-25. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200031
    [2] 吴晓娟, 鲁俊倩, 常英英, 钟姗辰, 苏晓华, 张冰玉.  AtDME1基因‘84K’杨的获得及目的基因诱导表达分析 . 北京林业大学学报, 2020, 42(6): 26-32. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190068
    [3] 李双, 苏艳艳, 王厚领, 李惠广, 刘超, 夏新莉, 尹伟伦.  胡杨miR1444b在拟南芥中正调控植物抗旱性 . 北京林业大学学报, 2018, 40(4): 1-9. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180043
    [4] 王俊秀, 周扬颜, 韩潇, 安轶, 郭惠红, 夏新莉, 尹伟伦, 刘超.  超表达杨树SBPase基因促进拟南芥光合作用及营养生长 . 北京林业大学学报, 2018, 40(3): 26-33. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170436
    [5] 胡晓晴, 陈智鑫, 邓王姝颖, 王晟宇, 张淇, 张正一, 刘雪梅.  白桦雄花发育异常突变体的成熟花药及花粉特征 . 北京林业大学学报, 2018, 40(5): 29-36. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170282
    [6] 崔永耀, 程玉祥.  基于Cas9/gRNA创制毛果杨COBRA3基因突变体 . 北京林业大学学报, 2018, 40(4): 10-15. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170421
    [7] 李劲宇, 高原, 张琴, 刘小敏, 高宏波.  拟南芥叶绿体分裂突变体x17-3和pd50的基因鉴定与分析 . 北京林业大学学报, 2018, 40(4): 86-95. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170433
    [8] 姚琨, 练从龙, 王菁菁, 王厚领, 刘超, 尹伟伦, 夏新莉.  胡杨PePEX11基因参与调节盐胁迫下拟南芥的抗氧化能力 . 北京林业大学学报, 2018, 40(5): 19-28. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180086
    [9] 邓佳音, 张艳丽, 张一南, 赵瑞, 李金克, 周晓阳, 刘香芬, 陈少良.  胡杨PeAPY1和PeAPY2调控拟南芥耐盐机制研究 . 北京林业大学学报, 2017, 39(6): 13-21. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170034
    [10] 张一南, 王洋, 张会龙, 尧俊, 邓佳音, 赵瑞, 沈昕, 陈少良.  过表达胡杨PeRIN4基因拟南芥提高质膜H+-ATPase活性和耐盐性 . 北京林业大学学报, 2017, 39(11): 1-8. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170124
    [11] 张影, 练从龙, 段卉, 路信, 夏新莉, 尹伟伦.  胡杨bZIP转录因子PebZIP26和PebZIP33基因的克隆及功能分析 . 北京林业大学学报, 2017, 39(7): 18-30. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170109
    [12] 王丹, 安轶, 韩潇, 周扬颜, 王厚领, 郭惠红, 夏新莉, 尹伟伦.  超表达杨树RPEase基因促进了拟南芥的生长发育 . 北京林业大学学报, 2016, 38(5): 67-76. doi: 10.13332/j.1000-1522.20150507
    [13] 李岚, 王厚领, 赵琳, 赵莹, 李惠广, 夏新莉, 尹伟伦.  异源表达Peu-miR473a增强拟南芥的抗旱性 . 北京林业大学学报, 2015, 37(5): 30-39. doi: 10.13332/j.1000-1522.20140461
    [14] 张晓菲, 路信, 段卉, 练从龙, 夏新莉, 尹伟伦.  胡杨NAC转录因子PeNAC045基因的克隆及功能分析 . 北京林业大学学报, 2015, 37(6): 1-10. doi: 10.13332/j.1000-1522.20150066
    [15] 刘玲, 刘福妹, 陈肃, 林琳, 李慧玉, 刘桂丰, 姜静.  转TaLEA小黑杨矮化突变体的鉴定及侧翼序列分析 . 北京林业大学学报, 2013, 35(1): 45-52.
    [16] 郑冬超, 夏新莉, 尹伟伦.  生长素促进拟南芥AtNRT1.1基因表达增强硝酸盐吸收 . 北京林业大学学报, 2013, 35(2): 80-85.
    [17] 王翊, 付建新, 亓帅, 戴思兰.  拟南芥lfy 突变体表型及氨基酸序列突变位点分析 . 北京林业大学学报, 2013, 35(3): 108-115.
    [18] 赵伶俐, 石少川, 孙佳琦, 张启翔, 高亦珂.  拟南芥HsfA2基因转化地被菊的研究 . 北京林业大学学报, 2011, 33(5): 97-102.
    [19] 段中鑫, 覃玉蓉, 夏新莉, 尹伟伦.  超量表达胡杨peuMIR156j基因增强拟南芥耐盐性 . 北京林业大学学报, 2011, 33(6): 1-7.
    [20] 周成理, 徐基良, 刘秀萍, 徐向舟, 马尔妮, 姚洪军, 雷加富, 何亚平, 王旭, 李瑞, 任琴, 余雁, 白新祥, 宋颖琦, 耿玉清, 武广涛, 王顺忠, 王清奎, 王尚德, 齐实, 惠刚盈, 俞国胜, 白翠霞, 周国逸, 杨莉, 云琦, 杨谦, 费世民, 赵广杰, 徐海, 费本华, 刘大庆, 汪思龙, 崔国发, 张克斌, 胡可, 史军义, 石玉杰, 陈丽华, 康向阳, 王飞, 张红武, 李代丽, 冯宗炜, 孙阁, 孙阁, 宋维峰, 徐秉玖, 胡艳波, 李忠, 蒋俊明, 秦跟基, 陈晓鸣, 赵铁蕊, 戴思兰, 张恒明, 胡永建, 王百田, 张波, 朱金兆, 董占地, 瞿礼嘉, 张德强, 杨晓晖, 王亮生, 易传辉, 陈华君, 王树森, 高荣孚, 张慧, 王戈, 代力民, 陈秀明, 陈峻崎, 王庆礼, 肖玉保, 石雷, 闫俊华, 金幼菊, 武波, 朱明东, 乔锋, 余英, 陈晓阳, 赵辉, 唐森强, 李镇宇, 杨海龙, 杨俊杰, 杨莉, SteveMcNulty.  AtPIP5K2基因参与拟南芥盐胁迫的调节过程 . 北京林业大学学报, 2006, 28(5): 78-83.
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出版历程
  • 收稿日期:  2017-03-22
  • 修回日期:  2017-04-20
  • 刊出日期:  2017-07-01

拟南芥黄化突变体k60的基因作图定位

doi: 10.13332/j.1000-1522.20170085
    基金项目:

    国家自然科学基金项目 31501090

    国家自然科学基金项目 J1103516

    作者简介:

    戴楠。主要研究方向:植物分子生物学。Email: 1506591113@qq.com  地址:100083  北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院

    通讯作者: 刘小敏,讲师。主要研究方向:植物分子生物学。Email: liuxiaomin@bjfu.edu.cn  地址:同上; 高宏波,教授,博士生导师。主要研究方向:植物分子生物学。Email: gaohongbo@bjfu.edu.cn  地址:同上
  • 中图分类号: Q943.2

摘要: 拟南芥黄化突变体k60是从甲基磺酸乙脂诱变的拟南芥突变体库中筛选得到的。该突变体表现为叶色发黄,生长迟缓,叶绿素含量降低。遗传分析发现其为单基因控制的隐性突变。利用遗传作图的方法将突变基因定位于拟南芥5号染色体上CH5-6.0到CH5-6.24两个分子标记之间的231 kb区间内。本项工作的研究结果为该突变基因的鉴定奠定了前期基础,并且为研究拟南芥黄化基因的功能提供了新的实验材料。

English Abstract

戴楠, 袁光孝, 刘小敏, 高宏波. 拟南芥黄化突变体k60的基因作图定位[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(7): 40-45. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170085
引用本文: 戴楠, 袁光孝, 刘小敏, 高宏波. 拟南芥黄化突变体k60的基因作图定位[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(7): 40-45. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170085
DAI Nan, YUAN Guang-xiao, LIU Xiao-min, GAO Hong-bo. Genetic mapping of a chlorosis mutant k60 in Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(7): 40-45. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170085
Citation: DAI Nan, YUAN Guang-xiao, LIU Xiao-min, GAO Hong-bo. Genetic mapping of a chlorosis mutant k60 in Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(7): 40-45. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170085
  • 根据内共生学说,叶绿体起源于蓝细菌,经过漫长的进化过程,叶绿体已经完全融入到植物的细胞中,是光合作用的主要场所,从根本上支撑了全球的生态系统[1]。叶绿体由前质体发育而来,根据所在的组织以及光照的程度,前质体分化成包括叶绿体在内的功能各异的质体[2]。叶绿素是叶绿体内参与光合作用的主要色素,多数的叶色突变会影响叶绿素的合成和降解,从而影响光合效率降低作物产量,严重时甚至会导致植物死亡[3-4]

    叶色突变是一种常见的突变表型,在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、大麦(Hordeum vulgare)、小麦(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays)、水稻(Oryza sativa)等植物中均有报道,其主要特点是叶色表型发生改变。叶色突变可分为白化、黄化、淡绿、条纹、斑点等[5]。导致叶色突变的基因可从多种途径直接或间接地改变叶色,因此叶色突变的分子机制极为复杂。根据已有的叶色突变体研究报道,导致叶色突变的途径大致可分为下列几种类型[4]:叶绿素生物合成途径中的基因突变、血红素到光敏色素生色团生物途径中的基因突变、叶绿体其他编码蛋白的基因突变、其他与光合作用有关的基因突变以及与光合系统无直接关系但是与叶绿体发育和功能维持有关的基因突变。

    叶绿素合成过程从谷氨酰-tRNA开始至叶绿素a、叶绿素b合成结束[6]。在这一过程中,任何基因的突变都可能导致叶绿素合成受阻,引起叶色突变。多数的叶色突变都是由于叶绿素合成异常引起的[7],如水稻的OsCHLH基因[8]。除叶绿素的生物合成之外,四吡咯生物合成途径的另一个分支是血红素的生物合成。细胞内血红素的含量会影响叶绿素合成速率,血红素形成光敏色素生色团途径中的基因发生突变,会导致细胞内血红素含量上升,从而抑制叶绿素的合成,引起叶色突变[9]。叶绿体其他编码蛋白的基因则主要通过3种途径引起叶色突变[4]。第1,间接干扰叶绿素生物合成。如降低质体特异性核糖体蛋白基因的表达,会导致叶绿素含量降低,引起叶色改变[10]。第2,干扰叶绿素生物降解。有些常绿突变体在叶绿素降解过程中由于基因发生突变,减缓或抑制叶绿素的降解,导致叶片长时间保持绿色[11],如Sgr1基因、NYC1基因、PPH基因等[12-15]。第3,影响光合色素的稳定性。比如叶绿体类囊体的基粒片层发育缺陷突变体,也会影响到叶绿体色素的含量及比例,导致叶色突变[16]。另外,光合系统以外的基因突变同样可以引起叶色变异,但不少突变基因的作用机制还不很清楚。有一些基因可能与细胞内核-质间信号转导有关[17]

    叶色突变体可从自发突变、化学或物理诱变、插入突变、基因沉默突变等多种途径获得[4]。本研究所用黄化突变体是通过筛选甲基磺酸乙脂(ethyl methane sulphonate, EMS)化学诱变Col野生型拟南芥的随机突变体库得到的。突变体k60表现为植株发黄,生长发育迟缓,叶绿素含量下降,其黄化表型贯穿整个生长周期。通过图位克隆的方法对突变体k60进行粗定位与精细定位,为该突变基因的鉴定提供了前期基础。

    • 野生型拟南芥植物为Columbia (Col)和Landsberg erecta (Ler)。通过筛选EMS诱变Col的突变体库得到本实验所用突变体材料k60。

      植物材料种植于V珍珠岩:V蛭石:V草炭土=1:1:1混合的培养基质中,或经75%的酒精消毒后种植于1/2 MS培养基中,放于人工培养间中培养。培养条件:温度为20~22 ℃,光周期为16 h光照/8 h黑暗,光照强度为90~120 μmol/(m2·s),相对湿度约为60%。

    • 本实验所需数据信息来源于: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/(NCBI)http://www.Arabidopsis.org/(TAIR)

    • 选取4周左右的拟南芥植物叶片,浸泡于3.5%戊二醛中,黑暗处理1 h,将戊二醛吸出,加入0.1 mol/L EDTA·Na2 (pH=9),置于55 ℃水浴锅中处理2 h。利用光学显微镜OLYMPUS-CX21进行观察。采用图像分析软件Image Analysis System 10.0统计照片中细胞平面面积及叶绿体个数。

    • k60突变体为母本,Ler野生型为父本,杂交得到F1代。F1代自交得到F2代,将F2种子种于1/2 MS培养基中,观察植物叶片颜色,统计F2代群体中黄化植株与正常叶色植株的比例,确定突变基因的显隐性。

    • 观察F2群体,挑选出30株黄化植株,单株提取DNA,每株取等量DNA混成一个DNA池,以此作为粗定位PCR扩增模板。选择在两亲本Ler与Col之间有明显多态性,并且均匀分布于拟南芥5条染色体上的23对分子标记进行PCR扩增,3%琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果。

      先粗定位确定连锁位置在5号染色体上,然后采用连锁区段附近的分子标记CH5-3.79和CH5-9.5对F2群体中挑选出的更多的突变植株进行单株PCR扩增分析,再在该区间内设计新的分子标记。扩大F2群体,逐步缩小定位区间,将基因锁定在很小的一段区间内。本实验共分析了639株突变植株的基因型,精细定位涉及12个分子标记。分子标记紧密连锁的程度参照重组率进行判定(重组率=重组配子数/总配子数×100%)。

    • 选取在土中生长4周的Col野生型及k60植株,称取100 mg叶片,液氮中研磨,加入1 mL 100%甲醇浸提,2 500 r/min离心10 min,吸取上清,定容至2 mL。分光光度计测定A665A652A470,根据叶绿素质量浓度计算公式[18-19]算出叶绿素a(Chl a)、叶绿素b(Chl b)、类胡萝卜素(Car)及总叶绿素(Chls a+b)的质量浓度Ca + b(μg/mL)。叶绿素质量浓度计算公式为:

      $$ \begin{align} & \ \ \ \ {{C}_{\text{a}}}=16.29{{A}_{665}}-8.54{{A}_{652}}~ \\ & \ \ \ \ {{C}_{\text{b}}}=30.66{{A}_{652}}-13.58{{A}_{665}}~ \\ & \ \ \ {{C}_{\text{a}+\text{b}}}=22.12{{A}_{652}}+2.71{{A}_{665}}~ \\ & {{C}_{\text{c}}}=(1\text{ }00{{A}_{470}}-1.63{{C}_{\text{a}}}-104.96{{C}_{\text{b}}})/221 \\ \end{align} $$

      式中:Ca为叶绿素a的质量浓度,μg/mL;Cb为叶绿素b的质量浓度,μg/mL;Ca+b为总叶绿素的质量浓度,μg/mL;Cc为类胡萝卜素的质量浓度,μg/mL。

    • 与Col野生型相比,突变体k60植株发黄,发育迟缓,黄化表型贯穿整个生长周期(图 1A)。戊二醛固定Col野生型及突变体叶片,利用光学显微镜观察叶绿体形态,并统计叶肉细胞内的叶绿体数量。与野生型相比,突变体的叶绿体颜色发黄(图 1B)。对Col野生型及k60突变体的叶肉细胞平面面积和其中的叶绿体数量进行统计,结果显示野生型平均每个叶肉细胞中含有58个叶绿体,突变体中含有41个,说明突变体中叶绿体的数量受到影响。此外,野生型与突变体的叶肉细胞面积与细胞内叶绿体个数大体上呈正相关(图 2),即随着细胞增大,叶绿体数目增加,但突变体的决定系数(R2=0.534 9)小于野生型(R2=0.826 6),说明突变体中叶肉细胞面积与叶绿体数量的线性相关性要小于野生型。由趋势线也可以看出,在相同的叶肉细胞面积下,突变体中的叶绿体个数少于野生型,数量差距随细胞面积的增大而增加。

      图  1  野生型Col与k60的表型分析

      Figure 1.  Phenotype analysis of Col and k60

      图  2  Col野生型与k60的叶肉细胞面积与叶绿体个数相关性分析

      Figure 2.  Correlation analysis between mesophyll cell area and chloroplast number of Col and k60

      为确定突变体k60发生突变的显隐性以及是否为单基因突变,将突变体k60与Ler野生型杂交,获得F1代种子,F1代植株与野生型一致,无黄化表型,故确定其为隐性突变。F1代自交得到F2代种子,F2植株发生性状分离,共种植140株植物,有110株为正常表型,30株为黄化表型(表 1),分离比接近3:1 (χ2χ(P=0.05)2=3.84),符合孟德尔遗传定律,确定其为单基因控制的隐性突变。

      表 1  突变体k60的遗传分析

      Table 1.  Genetic analysis of k60

      F2绿色植株数
      Green plantnumber
      黄色植株数
      Yellow plantnumber
      总植株数
      Total plantnumber
      χ2
      k60×Ler110301400.952
    • k60为黄化突变体,推测其叶绿素含量可能与野生型有差异。故选取土中生长4周的Col野生型拟南芥和k60突变体植株,测量其叶绿素浓度(图 3)。突变体中的叶绿素a(Chl a)浓度约为野生型的80%,有少量减少,叶绿素b(Chl b)的浓度约为野生型的20%,减少幅度较大,总叶绿素(Chls a+b)质量浓度约为野生型的61%,而类胡萝卜素(Car)浓度则为野生型的119%,有少量增加。

      图  3  野生型Col与k60叶绿素质量浓度分析

      Figure 3.  Chlorophyll concentration analysis of Col and k60

    • 以突变体k60与Ler野生型杂交的F2代为作图群体,用平均分布在拟南芥5条染色体上的23条分子标记进行粗略的定位分析,将突变基因初步定位到拟南芥5号染色体上。

      为进一步确定突变基因在染色体上的位置,用分子标记CH5-3.79和CH5-9.5对F2群体中挑选出的突变植株进行分析(图 4A)。然后在这两个分子标记之间的区间内开发新的合适的分子标记。利用这些新的分子标记,进行精细定位。将在分子标记CH5-3.79和CH5-9.5处有遗传交换的植株用新的分子标记CH5-4.886,CH5-7.843继续作图,依次类推,并向内继续开发新的合适的分子标记(表 2),通过PCR扩增及凝胶电泳鉴定分析,统计各分子标记的重组植株数,计算其重组率(表 2)。最终分析了639株突变体单株的基因型,将突变基因锁定在CH5-6.0及CH5-6.24这两个分子标记之间的231 kb区间内(图 4B)。根据NCBI所提供的数据,在这一区间内含有63个基因,可将候选基因锁定在这63个基因中。

      图  4  k60的遗传作图

      Figure 4.  Genetic mapping of k60

      表 2  k60精细定位所用分子标记的引物序列及重组率

      Table 2.  Primer sequences and the recombination frequency of the molecular markers used in the fine mapping of k60

      分子标记
      Molecular marker
      正向引物
      Forward primer (5′-3′)
      反向引物
      Reverse primer (5′-3′)
      重组率
      Recombination frequency/%
      CH5-5.468GACTAAACTGGCATTAAGTTCTGAGGATGGTTTCTAGATCGTAATGCC1.64
      CH5-5.673CCATCCATGGCTTTGGTTCCGATTTTGTTGCCCCGAG0.94
      CH5-5.858CATAGATTGTTCATGTCTCCTCAGGCTGATATGGCGCTTGAG0.47
      CH5-6.0CTGCTTGATTGGTAAGAATGAGAGGGAAGGGGAGGAAGAGATAAC0.23
      CH5-6.24CTTATCGACACTCTTGCAGGCGGACATGGCAAATGCTCGG0.47
      CH5-6.455GCTGGACACCTCAGTCACGCCTGGAAAAGCGAGGAG1.10
    • 光合作用是植物体内的极其重要的代谢过程,也是地球上碳循环的重要组成部分。叶绿素作为植物光合作用的主要色素,其合成和降解对光合作用的效率有着至关重要的影响。因此研究叶色突变对提高植物光合效率、促进植物的生长发育、增加作物产量和改善全球碳循环均具有非常重要的意义[4]

      通过EMS化学诱变Col野生型,本实验室筛选随机突变体库得到黄化突变体k60。将突变体k60与Ler野生型杂交,进行遗传分析,发现F1代植株表现为野生型表型,无叶色突变表型,并且F2代植株发生性状分离,分离比约为3:1,符合孟德尔遗传定律,确定k60为单基因控制的隐性突变。由于很多叶色突变都是由叶绿素合成异常引起的,我们对Col野生型及突变体k60进行了表型分析及叶绿素质量浓度的测定,发现突变体与Col野生型相比,植株发黄,生长发育较为迟缓,细胞内叶绿体发黄,叶肉细胞内叶绿体数量有少量减少,叶绿素含量明显降低。k60叶绿素含量的下降可能会导致光合作用效率降低,植物生长所需能量积累不足,从而使突变体植株生长缓慢。另外,k60单个叶肉细胞内叶绿体数量少于野生型,并且随着细胞面积的增大,叶绿体数量减少程度也随之增大,这表明k60突变基因对叶绿体的数量有一定影响。

      由于叶色突变的分子机制极为复杂,且该机制受生理和遗传等多方面影响,与叶色相关的任何途径发生突变都有可能导致植株叶色发黄。根据测定的叶绿素质量浓度,k60与Col野生型相比,突变体中的叶绿素a(Chl a)质量浓度有少量减少,叶绿素b(Chl b)的质量浓度大幅度降低,只有野生型的1/5,总叶绿素(Chls a+b)质量浓度约减少为野生型的一半,而类胡萝卜素(Car)质量浓度有少量增加。这说明k60突变基因主要抑制了叶绿素b的合成,推测其可能处于与叶绿素b合成或降解有关的途径中,并对叶绿素a及类胡萝卜素的合成有一定影响。另外,除了叶绿素合成途径中产生突变会导致叶绿素含量降低外,其他有关途径的突变也会使叶色改变以及叶绿素含量降低,如参与叶绿体RNA编辑的相关基因发生突变[20],核基因编码的叶绿体蛋白进入叶绿体的途径中的突变致使其受阻等[21-22]。因此,目前还不确定导致k60叶色发黄,叶绿素含量下降是哪条途径中的基因发生了突变。

      本研究利用图位克隆的方法将突变基因锁定在拟南芥5号染色体上CH5-6.0和CH5-6.24这两个分子标记之间的231 kb的区间内,根据NCBI所提供的数据信息,在此区间内含有63个基因。根据TAIR上所提供的基因注释,在这63个基因中挑选出可能导致叶色发黄的基因作为候选基因进行测序分析,结果未发现突变基因,接下来将进一步进行实验分析,以确定突变基因。对突变体k60的研究为突变基因的鉴定奠定了前期工作基础,同时也为叶色突变分子机制的研究提供了新的实验材料。

参考文献 (22)

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