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NaHCO3胁迫对转TaLEA基因山新杨生长及光合、叶绿素荧光特性的影响

孙延爽 邢宝月 杨光 刘桂丰

孙延爽, 邢宝月, 杨光, 刘桂丰. NaHCO3胁迫对转TaLEA基因山新杨生长及光合、叶绿素荧光特性的影响[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(10): 33-41. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170099
引用本文: 孙延爽, 邢宝月, 杨光, 刘桂丰. NaHCO3胁迫对转TaLEA基因山新杨生长及光合、叶绿素荧光特性的影响[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(10): 33-41. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170099
SUN Yan-shuang, XING Bao-yue, YANG Guang, LIU Gui-feng. Effects of NaHCO3 stress on growth, photosynthesis and chlorophyll fluorescence characteristics in Populus davidiana × P. bolleana overexpressed TaLEA[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(10): 33-41. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170099
Citation: SUN Yan-shuang, XING Bao-yue, YANG Guang, LIU Gui-feng. Effects of NaHCO3 stress on growth, photosynthesis and chlorophyll fluorescence characteristics in Populus davidiana × P. bolleana overexpressed TaLEA[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(10): 33-41. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170099

NaHCO3胁迫对转TaLEA基因山新杨生长及光合、叶绿素荧光特性的影响

doi: 10.13332/j.1000-1522.20170099
基金项目: 

“863”国家高技术研究发展计划项目 2011AA100201

详细信息
    作者简介:

    孙延爽。主要研究方向:林木抗逆基因工程育种。Email: 343699582@qq.com  地址:150040  黑龙江省哈尔滨市香坊区和兴路51号东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室

    通讯作者:

    刘桂丰,教授,博士生导师。主要研究方向:林木遗传改良和林木抗逆基因工程育种。Email: liuguifeng@126.com   地址:同上

  • 中图分类号: S722.3+6

Effects of NaHCO3 stress on growth, photosynthesis and chlorophyll fluorescence characteristics in Populus davidiana × P. bolleana overexpressed TaLEA

  • 摘要: 为了筛选耐苏打盐渍土的转基因杨树优良株系, 以苏打盐渍土的主要成分NaHCO3胁迫处理转TaLEA基因的山新杨各株系与对照(NT),测定不同株系的苗高和地径等生长性状,测定净光合速率(Pn)、胞间CO2浓度(Ci)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)等光合参数以及最大光化学效率(Fv/Fm)、光化学猝灭系数(qP)、非光化学猝灭系数(NPQ)、实际光化学电子产量(ΦPSII)等叶绿素荧光动力学参数,利用染色法分别比较各株系的超氧离子和过氧化氢的累积情况,进而综合评价不同株系对NaHCO3胁迫的响应。结果表明,NaHCO3胁迫处理前、后各株系的苗高和地径生长量发生明显分化,由处理前的差异不显著,到处理20 d后的显著,转基因株系的苗高、地径普遍较对照高,表现突出的是转基因株系SL2号,其平均苗高和地径分别较对照提高了17.4%、15.7%;对照的盐害指数是转基因株系的3.3倍,并且转基因株系的平均存活率是对照的2.8倍。各转基因株系的光合参数和荧光参数也较对照增强,PnTr在胁迫20 d后转基因株系较对照分别高了237.38%、649.02%,GsCi在胁迫15 d时转基因株系较对照分别高了119.05%、24.56%,其中SL2号转基因株系较对照分别提高150%、25.81%。各转基因株系的Fv/Fm平均为0.68,对照只有0.45,前者的qP和ΦPSII只略高于后者,后者的NPQ却是前者的6倍。转基因株系的超氧离子和过氧化氢累积量均少于对照。在相同的碱胁迫环境下,转基因山新杨,尤其是SL2,能保持较快的生长量、较强的光合能力和较低的ROS水平,初步选择其为耐苏打盐渍土的杨树转基因优良株系。
  • 图  1  碱性盐害级值

    A.0级无盐害症状;B.1级轻度盐害(有部分叶尖、叶缘变黄);C.2级中度盐害(有大约1/2的叶片、叶缘焦枯);D.3级重度盐害(大部分叶片、叶缘焦枯或脱落);E.4级极重度盐害(复水后植株死亡)。

    Figure  1.  Level of alkaline salt stress

    A, symptom of 0 salt injury; B, level 1 for mild salt damage (the tip of leaf or leaf margin turned yellow); C, level 2 for moderate salt damage (about 1/2 blade or leaf margin turned withered); D, level 3 for severe salt damage (most of the leaf, leaf margin turned withered or was off); E, level 4 for extremely severe salt damage (plant dead after rewatering).

    图  2  NaHCO3胁迫对叶片光合参数的影响

    A.叶片的净光合速率(Pn);B.胞间CO2浓度(Ci);C.蒸腾速率(Tr);D.气孔导度(Gs)。A, net photosynthetic rate (Pn); B, intercellular CO2 concentration (Ci); C, transpiration rate (Tr); D, stomatal conductance (Gs).

    Figure  2.  Effects of NaHCO3 stress on photosynthetic parameters of leaves

    图  3  NaCHO3胁迫对叶片叶绿素荧光动力学参数的影响

    A.最大光化学效率(Fv/Fm);B.光化学猝灭系数(qP);C.非光化学猝灭系数(NPQ);D.实际光化学电子产量(ΦPSII)。

    Figure  3.  Effects of NaCHO3 stress on chlorophyll fluorescence kinetics parameters of leaves

    A, maximum photochemical efficiency (Fv/Fm); B, photochemical quenching coefficient (qP); C, non-photochemical quenching coefficient (NPQ); D, actual photochemical electron yield (ΦPSII).

    图  4  NaHCO3胁迫下转基因山新杨与NT细胞内超氧离子累积比较

    Figure  4.  Comparison of superoxide anion accumulation in the cells of transgenic lines and NT under NaHCO3 stress

    图  5  NaHCO3胁迫下转基因山新杨与NT细胞内过氧化氢累积比较

    Figure  5.  Comparison of hydrogen peroxide accumulation in transgenic poplar and NT cells under NaHCO3 stress

    表  1  NaHCO3胁迫前后高生长比较

    Table  1.   Comparison in height growth before and after NaHCO3 stress

    株系
    Line
    胁迫前、后平均苗高
    Average height before and after stress/cm
    非胁迫条件下
    平均苗高
    Average height
    without stress/cm
    NaHCO3对高生长的
    影响Effect of
    NaHCO3 on height
    growth/%
    胁迫前
    Before stress
    胁迫后
    After stress
    绝对高生长
    Absolute height growth
    NT 85.55±3.67 122.11±5.02 c 36.55±5.40 b 147.78±4.42 17.37±2.07ab
    SL1 84.33±2.36 130.17±2.79 bc 46.00±8.38 ab 147.17±1.01 11.55±1.53ab
    SL2 88.67±3.21 143.33±7.23 a 54.44±6.16 a 149.67±8.21 4.21±1.75d
    SL3 85.33±2.60 128.89±6.50 bc 43.56±5.54 ab 145.00±4.58 10.96±7.31bc
    SL4 85.56±2.14 122.19±2.72 c 37.08±3.83 b 150.67±5.69 18.80±4.36 a
    SL5 86.30±4.39 132.89±6.44 b 46.92±7.87 ab 139.22±5.42 4.57±1.20 cd
    SL6 87.05±1.25 127.22±3.53 bc 40.17±2.42 b 143.17±2.56 11.10±3.59ab
    平均Mean 86.11±2.80 129.54±4.89 43.53±5.66 146.09±4.55 11.21±2.73
    注:不同小写字母表示在P < 0.05水平上差异显著。下同。Notes:different lowercase letters mean significant differences at P < 0.05 level. Same as below.
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    表  2  NaHCO3胁迫前后地径生长比较

    Table  2.   Comparison in ground diameter growth before and after NaHCO3 stress

    株系
    Line
    胁迫前、后平均地径
    Average ground diameter before and after stress/mm
    非胁迫条件下
    平均地径Mean
    ground diameter
    without stress/mm
    NaHCO3对地径生长
    的影响Effect of
    NaHCO3 on ground
    diameter growth/%
    胁迫前
    Before stress
    胁迫后
    After stress
    绝对地径生长
    Absolute ground diameter growth
    NT 2.18±0.017 6.48±0.133 c 4.30±0.51 7.53±0.59 13.57±7.71
    SL1 2.16±0.10 7.22±0.18 ab 5.06±0.15 8.18±0.63 11.68±8.57
    SL2 2.23±0.036 7.50±0.055 a 5.27±0.38 8.49±0.42 11.60±4.02
    SL3 2.04±0.058 6.80±0.084 bc 4.77±0.26 7.88±0.63 13.24±7.11
    SL4 2.18±0.079 6.92±0.38 bc 4.68±0.35 8.04±0.46 13.87±5.64
    SL5 2.18±0.085 6.71±0.36 c 4.53±0.78 7.99±0.47 15.64±8.71
    SL6 2.20±0.046 6.79±0.26 bc 4.58±0.35 7.96±0.49 14.50±6.86
    平均Mean 2.17±0.063 6.92±0.23 4.74±0.40 8.01±0.52 13.44±6.94
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    表  3  碱性盐害指数及存活率

    Table  3.   Index of salt-alkaline stress and survival rate

    株系
    Line
    碱害指数
    Index of salt-alkaline stress
    存活率
    Survival rate/%
    NT 0.79 30
    SL1 0.13 87
    SL2 0.28 100
    SL3 0.30 80
    SL4 0.18 90
    SL5 0.22 90
    SL6 0.34 62
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出版历程
  • 收稿日期:  2017-03-24
  • 修回日期:  2017-05-09
  • 刊出日期:  2017-10-01

NaHCO3胁迫对转TaLEA基因山新杨生长及光合、叶绿素荧光特性的影响

doi: 10.13332/j.1000-1522.20170099
    基金项目:

    “863”国家高技术研究发展计划项目 2011AA100201

    作者简介:

    孙延爽。主要研究方向:林木抗逆基因工程育种。Email: 343699582@qq.com  地址:150040  黑龙江省哈尔滨市香坊区和兴路51号东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室

    通讯作者: 刘桂丰,教授,博士生导师。主要研究方向:林木遗传改良和林木抗逆基因工程育种。Email: liuguifeng@126.com   地址:同上
  • 中图分类号: S722.3+6

摘要: 为了筛选耐苏打盐渍土的转基因杨树优良株系, 以苏打盐渍土的主要成分NaHCO3胁迫处理转TaLEA基因的山新杨各株系与对照(NT),测定不同株系的苗高和地径等生长性状,测定净光合速率(Pn)、胞间CO2浓度(Ci)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)等光合参数以及最大光化学效率(Fv/Fm)、光化学猝灭系数(qP)、非光化学猝灭系数(NPQ)、实际光化学电子产量(ΦPSII)等叶绿素荧光动力学参数,利用染色法分别比较各株系的超氧离子和过氧化氢的累积情况,进而综合评价不同株系对NaHCO3胁迫的响应。结果表明,NaHCO3胁迫处理前、后各株系的苗高和地径生长量发生明显分化,由处理前的差异不显著,到处理20 d后的显著,转基因株系的苗高、地径普遍较对照高,表现突出的是转基因株系SL2号,其平均苗高和地径分别较对照提高了17.4%、15.7%;对照的盐害指数是转基因株系的3.3倍,并且转基因株系的平均存活率是对照的2.8倍。各转基因株系的光合参数和荧光参数也较对照增强,PnTr在胁迫20 d后转基因株系较对照分别高了237.38%、649.02%,GsCi在胁迫15 d时转基因株系较对照分别高了119.05%、24.56%,其中SL2号转基因株系较对照分别提高150%、25.81%。各转基因株系的Fv/Fm平均为0.68,对照只有0.45,前者的qP和ΦPSII只略高于后者,后者的NPQ却是前者的6倍。转基因株系的超氧离子和过氧化氢累积量均少于对照。在相同的碱胁迫环境下,转基因山新杨,尤其是SL2,能保持较快的生长量、较强的光合能力和较低的ROS水平,初步选择其为耐苏打盐渍土的杨树转基因优良株系。

English Abstract

孙延爽, 邢宝月, 杨光, 刘桂丰. NaHCO3胁迫对转TaLEA基因山新杨生长及光合、叶绿素荧光特性的影响[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(10): 33-41. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170099
引用本文: 孙延爽, 邢宝月, 杨光, 刘桂丰. NaHCO3胁迫对转TaLEA基因山新杨生长及光合、叶绿素荧光特性的影响[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(10): 33-41. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170099
SUN Yan-shuang, XING Bao-yue, YANG Guang, LIU Gui-feng. Effects of NaHCO3 stress on growth, photosynthesis and chlorophyll fluorescence characteristics in Populus davidiana × P. bolleana overexpressed TaLEA[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(10): 33-41. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170099
Citation: SUN Yan-shuang, XING Bao-yue, YANG Guang, LIU Gui-feng. Effects of NaHCO3 stress on growth, photosynthesis and chlorophyll fluorescence characteristics in Populus davidiana × P. bolleana overexpressed TaLEA[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(10): 33-41. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170099
  • 东北松嫩平原盐碱化土地约342万hm2,是世界三大苏打盐渍土集中分布区之一[1]。苏打盐渍土的主要成分是NaHCO3,土壤的盐碱化造成了土壤板结及肥力下降,严重制约了当地农林业生产和农民增收[2]。改善环境、开发利用盐碱化土地已成为当地政府的重要任务之一。采用排灌、淡水洗涤、利用水电工程等方法,可获得一定的效果,但是因其耗资大而难以推广。因此,通过基因工程育种培育耐碱林木新品种等生物手段治理盐碱荒地,可成为投资少、见效快的有效方法之一[3]

    LEA蛋白是一类在种子胚胎发育后期高度富集的蛋白[4]。研究发现该蛋白在植物受到干旱、低温、盐碱等非生物胁迫后造成的脱水组织中也可表达[5]。已有大量研究表明将外源LEA基因在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)等植物中过量表达,可以显著提高其抵抗非生物胁迫的能力[6]。本研究团队通过农杆菌介导法将来自柽柳(Tamarix androssowii)的TaLEA基因转入山新杨(Populus davidiana× P. bolleana)中,前期研究表明该基因提高了杨树耐中性盐(NaCl)胁迫的能力[7]。而对于苏打盐渍土(NaHCO3)胁迫下,转基因杨树的抗性情况尚不知晓,为此开展了本项研究。

    • 实验中的转基因山新杨SL1、SL2、SL3、SL4、SL5、SL6等株系由本研究团队获得,利用非转基因山新杨无性系NT作为对照[7]。2013年4月末,选取1年生转基因及对照植株,在中下部剪取插穗,插穗长14 cm、粗0.8 cm左右,5月初,将插穗扦插在深20 cm,直径为15 cm的花盆中(基质为V(草炭土):V(河沙):V(黑土)=4:2:2),每个花盆下垫一个托盘,花盆置于东北林业大学林木遗传育种基地的塑料大棚内。期间进行定杆、浇水、施肥、病虫害防治等苗期管理。培养2个月后,扦插苗达到80 cm左右,选取长势一致的苗木作为胁迫处理材料。

      每个株系各选择30盆,其中15盆为处理组,另外15盆为非处理组。处理组自7月13日开始用0.5 L 0.6%的NaHCO3水溶液处理,每3天1次,期间根据蒸发量适时补充水分,至8月2日结束,共进行20 d,待胁迫结束后对所有苗木进行复水。非处理组每3天浇1次水,其他管理与处理组相同。

    • 用钢尺和游标卡尺分别对胁迫前后的苗高和地径进行测量。绝对苗高生长量=胁迫后苗高-胁迫前苗高,绝对地径生长量=胁迫后地径-胁迫前地径;NaHCO3对苗高生长的相对影响=(非胁迫条件下苗高-胁迫后苗高)/非胁迫条件下苗高×100%,NaHCO3对地径生长的相对影响=(非胁迫条件下地径-胁迫后地径)/非胁迫条件下地径×100%。

    • 复水15 d后调查各株系存活率与碱性盐害指数。

      存活率=存活植株/总植株数。

      碱性盐害指数= ∑ (盐害级值×相应盐害叶片数)/(总叶片数×盐害最高级值)×100%[8]。其中,盐害级值的确定方法:无盐害症状为0级;轻度盐害(有少部分叶尖、叶缘变黄)为1级;中度盐害(有大约1/2的叶片、叶缘焦枯)为2级;重度盐害(大部分叶片、叶缘焦枯或脱落)为3级;极重度盐害(复水后植株死亡)为4级。

    • 采用LI-6400便携光合作用测定系统,分别于处理开始后的0、5、10、15和20 d的上午08:30—11:30测定净光合速率(Pn)、胞间CO2浓度(Ci)、气孔导度(Gs)和蒸腾速率(Tr)。每个株系随机选择3株,每株选择1片上部功能叶,每片叶测5次,取平均值。

    • 用PAM-2500(WALZ,Germany)荧光测定仪于胁迫的0、5、10、15和20 d的晚上20:00以后分别测定叶片的最大光化学效率(Fv/Fm)、光化学猝灭系数(qP)、非光化学猝灭系数(NPQ)和实际光化学电子产量(ΦPSII)。取植株中上部的功能叶,每个株系测定不同的5片叶。

    • 分别用四唑氮蓝(Nitro-blue tetrazolium NBT)染色法和二氨基联苯胺(Diaminobenzidine,DAB)染色法比较各株系超氧离子和过氧化氢累积量[9]

    • 用SPSS16.0统计软件对数据进行方差分析,Ducan法进行不同数据组间差异的分析,并运用Excel进行图表绘制。

    • 调查了山新杨各转基因株系及对照在NaHCO3胁迫前、后的高生长和地径生长,对所得结果进行方差分析和多重比较,结果见表 12。在胁迫前,各山新杨株系的苗高差异不显著(P >0.05)。而胁迫后,不同株系间的差异达到了显著水平(P < 0.05);其中,转基因株系SL2长的最高,其平均苗高达到143.33 cm,绝对苗高达到54.44 cm,分别较对照高17.4%、48.9%,并与对照间的差异达到显著水平;NaHCO3胁迫明显抑制山新杨的高生长,胁迫条件下的平均苗高为129.54 cm,低于非胁迫条件下各株系的平均苗高的146.09 cm。但胁迫对转基因株系影响较对照小,其中SL2、SL5的影响值仅为4.21%、4.57%,而对照的影响值为17.37%,在6个转基因株系中只有SL4的影响值高于对照,其他转基因株系的影响值均较对照低。

      表 1  NaHCO3胁迫前后高生长比较

      Table 1.  Comparison in height growth before and after NaHCO3 stress

      株系
      Line
      胁迫前、后平均苗高
      Average height before and after stress/cm
      非胁迫条件下
      平均苗高
      Average height
      without stress/cm
      NaHCO3对高生长的
      影响Effect of
      NaHCO3 on height
      growth/%
      胁迫前
      Before stress
      胁迫后
      After stress
      绝对高生长
      Absolute height growth
      NT 85.55±3.67 122.11±5.02 c 36.55±5.40 b 147.78±4.42 17.37±2.07ab
      SL1 84.33±2.36 130.17±2.79 bc 46.00±8.38 ab 147.17±1.01 11.55±1.53ab
      SL2 88.67±3.21 143.33±7.23 a 54.44±6.16 a 149.67±8.21 4.21±1.75d
      SL3 85.33±2.60 128.89±6.50 bc 43.56±5.54 ab 145.00±4.58 10.96±7.31bc
      SL4 85.56±2.14 122.19±2.72 c 37.08±3.83 b 150.67±5.69 18.80±4.36 a
      SL5 86.30±4.39 132.89±6.44 b 46.92±7.87 ab 139.22±5.42 4.57±1.20 cd
      SL6 87.05±1.25 127.22±3.53 bc 40.17±2.42 b 143.17±2.56 11.10±3.59ab
      平均Mean 86.11±2.80 129.54±4.89 43.53±5.66 146.09±4.55 11.21±2.73
      注:不同小写字母表示在P < 0.05水平上差异显著。下同。Notes:different lowercase letters mean significant differences at P < 0.05 level. Same as below.

      表 2  NaHCO3胁迫前后地径生长比较

      Table 2.  Comparison in ground diameter growth before and after NaHCO3 stress

      株系
      Line
      胁迫前、后平均地径
      Average ground diameter before and after stress/mm
      非胁迫条件下
      平均地径Mean
      ground diameter
      without stress/mm
      NaHCO3对地径生长
      的影响Effect of
      NaHCO3 on ground
      diameter growth/%
      胁迫前
      Before stress
      胁迫后
      After stress
      绝对地径生长
      Absolute ground diameter growth
      NT 2.18±0.017 6.48±0.133 c 4.30±0.51 7.53±0.59 13.57±7.71
      SL1 2.16±0.10 7.22±0.18 ab 5.06±0.15 8.18±0.63 11.68±8.57
      SL2 2.23±0.036 7.50±0.055 a 5.27±0.38 8.49±0.42 11.60±4.02
      SL3 2.04±0.058 6.80±0.084 bc 4.77±0.26 7.88±0.63 13.24±7.11
      SL4 2.18±0.079 6.92±0.38 bc 4.68±0.35 8.04±0.46 13.87±5.64
      SL5 2.18±0.085 6.71±0.36 c 4.53±0.78 7.99±0.47 15.64±8.71
      SL6 2.20±0.046 6.79±0.26 bc 4.58±0.35 7.96±0.49 14.50±6.86
      平均Mean 2.17±0.063 6.92±0.23 4.74±0.40 8.01±0.52 13.44±6.94

      NaHCO3胁迫前后的地径变化趋势与苗高变化趋势基本一致。在胁迫前,山新杨各株系的地径差异不显著(P>0.05)。而胁迫后各株系有显著差异(P<0.05),其中SL1与SL2的地径显著高于对照,其余4个转基因株系虽然与NT差异较小,但它们的平均地径为6.8 mm,高于NT约5%。

    • 胁迫初期,各转基因株系叶片均没有出现可观察到的伤害,随着胁迫程度的累积,部分叶片开始变黄、焦枯(图 1)。胁迫20 d后,碱性盐害指数和存活率结果显示(表 3),各转基因株系的碱性盐害指数明显低于NT,在0.13~0.34之间,而NT的碱性盐害指数高达0.79,是转基因株系的3.3倍。相应地,碱性盐害指数较小的转基因株系有较高的存活率,平均存活率为84.83%,为对照的2.8倍。

      图  1  碱性盐害级值

      Figure 1.  Level of alkaline salt stress

      表 3  碱性盐害指数及存活率

      Table 3.  Index of salt-alkaline stress and survival rate

      株系
      Line
      碱害指数
      Index of salt-alkaline stress
      存活率
      Survival rate/%
      NT 0.79 30
      SL1 0.13 87
      SL2 0.28 100
      SL3 0.30 80
      SL4 0.18 90
      SL5 0.22 90
      SL6 0.34 62
    • NaHCO3胁迫前后不同山新杨株系的净光合速率(Pn)、胞间CO2浓度(Ci)、蒸腾速率(Tr)和气孔导度(Gs)等性状均有不同程度的变化(图 2A~2D)。其中,在胁迫前后变化最小的是胞间CO2浓度,在胁迫15、20 d后,除了对照株系降低较为明显外,转基因株系均没有明显降低(图 2B)。而另外3个光合参数在胁迫10或15 d后明显下降。不同株系的净光合速率(Pn)(图 2A)和蒸腾速率(Tr)(图 2C)分别在胁迫10、15 d后降低明显,而且对照株系下降的最多,在胁迫20 d后,其下降到初始参数的91%~93%,而6个转基因株系虽然也下降,但净光合速率和蒸腾速率分别较对照高237.38%、649.02%。不同山新杨株系叶片的气孔导度(图 2D)在胁迫前,SL1、SL2的Gs略低于其他株系,但胁迫15 d时转基因株系较对照株系提高了。

      图  2  NaHCO3胁迫对叶片光合参数的影响

      Figure 2.  Effects of NaHCO3 stress on photosynthetic parameters of leaves

      综合分析上述各转基因株系与对照的光合参数变化,证明转基因株系的净光合速率(Pn)、胞间CO2浓度(Ci)、蒸腾速率(Tr)和气孔导度(Gs)等均较对照高,TaLEA基因提高了山新杨的耐盐性。

    • Fv/Fm为最大PSⅡ光能转换效率[10],在非胁迫条件下该参数的变化极小,Fv/Fm恒定于0.8~0.83之间,不会因物种和环境的变化而改变;而胁迫条件下该参数明显下降。如图 3A所示,各山新杨株系的Fv/Fm在胁迫前的平均值为0.807;但逆境胁迫条件下该参数明显下降,胁迫20 d时下降的明显,此时对照的降幅高达45%,其值显著低于各转基因株系(P < 0.01);但在转基因株系中也存在差异,其中SL2和SL5的降幅只有12.58%,说明这两个转基因株系的光能利用率较高,能较适应一定浓度的NaHCO3

      图  3  NaCHO3胁迫对叶片叶绿素荧光动力学参数的影响

      Figure 3.  Effects of NaCHO3 stress on chlorophyll fluorescence kinetics parameters of leaves

      qP一定程度上反应PSⅡ原初电子受体质子醌QA的氧化程度[11]。qP降低,是PSⅡ反应中心大幅关闭造成的。如图 3B,胁迫5 d时各株系的qP就开始大幅下降,15 d后各株系的qP降到最低;在5、10 d时对照株系下降的幅度较转基因株系大,但在胁迫15 d后对照与转基因株系的qP值趋于相同。

      NPQ反映的是PSⅡ天线色素吸收的光不能用于光合电子传递而以热的形式耗散掉的那部分能量[11]。因此,胁迫条件下,植物的NPQ呈缓慢上升趋势。如图 3C所示,胁迫前及胁迫5、10、15 d时各株系间的NPQ无明显差异(P>0.05);而胁迫20 d后,转基因株系的NPQ小幅上升,上升幅度介于15.57%~77.25%, 而对照株系的NPQ升幅高达378.06%,约是转基因株系NPQ平均值的6倍,且差异显著(P < 0.01)。

      ΦPSII是反应中心在环境胁迫时的实际原初光能捕获效率,可以反应PSⅡ中心的开放程度[11]。如图 3D所示,胁迫5 d后,各株系的ΦPSII较胁迫前明显下降,转基因株系与对照间差异不显著。

    • 氮蓝四唑(nitroblue tetrazolium NBT)可以被植物细胞内的超氧离子O2·-氧化,产生蓝色甲腙,可以根据蓝色的深浅及面积来反映O2·-含量。盐胁迫下,植物细胞受到伤害后往往产生大量的超氧离子O2·-,伤害的越重产生的O2·-越多,用NBT染色时呈现的颜色越深。因此,本研究用NBT染色法判断转基因株系与对照的耐盐性。从图 4可以看出,各株系均染有不同蓝色程度的色斑,且转基因株系的蓝色色斑数量要明显少于NT。其中,SL2叶片表面的蓝色色斑颜色最浅且面积最小,说明SL2株系细胞中的O2·-含量最少,而胁迫使得NT植株细胞中产生大量O2·-

      图  4  NaHCO3胁迫下转基因山新杨与NT细胞内超氧离子累积比较

      Figure 4.  Comparison of superoxide anion accumulation in the cells of transgenic lines and NT under NaHCO3 stress

    • 细胞中的过氧化酶会将氧释放出来,释放出的氧可以与DAB结合产生棕色沉淀,可以通过棕色的深浅来反映H2O2含量的多少。盐胁迫下,植物细胞受到伤害后往往产生大量的过氧化氢H2O2,伤害的越重产生的H2O2越多,用DAB染色时呈现的颜色越深。因此,本研究用DAB染色法判断转基因株系与对照的耐盐性。图 5显示,NT的边缘及叶脉间产生大量的棕色斑点,SL3、SL6也有较大面积的斑点,而SL2只零星见到一些面积小且颜色淡的斑点,说明胁迫下NT产生的H2O2要多于转基因株系,尤其多于SL2。

      图  5  NaHCO3胁迫下转基因山新杨与NT细胞内过氧化氢累积比较

      Figure 5.  Comparison of hydrogen peroxide accumulation in transgenic poplar and NT cells under NaHCO3 stress

    • 盐碱胁迫抑制叶绿素合成,降低光合速率,使同化物与能量供给减小,从而影响植物的正常生长发育[12]。故此,在评价植物抗盐碱能力的研究中,生长状况和形态表型是最直观的表现,高盐碱环境对植物的毒害可以从植物生长量减少和存活率的降低得到验证[13]。本研究中,胁迫前,各株系苗高和地径无明显差异(P>0.05),NaHCO3胁迫20 d后,各转基因无性系与NT的生长均受到抑制,且转基因植株的受抑制程度要低于NT。比较各无性系的生长发现,所有转基因株系的绝对苗高生长量和绝对地径生长量在胁迫后均高于NT,且SL2与NT差异显著。存活率是表现植株抗盐碱能力的可靠指标[14], 叶片症状可以作为衡量苗木耐盐碱性的一种辅助方法[15],可以根据叶片受害症状来划分碱害指数,使表象转化为更直观的数字。随着NaHCO3胁迫时间的延长,各株系的叶片相继出现不同程度的卷曲,枯黄和脱落。胁迫结束时,各转基因株系的碱害指数介于0.13~0.34,远远低于NT的0.79,复水15 d后的存活率调查发现NT只有30%的存活率,SL6的存活率约为NT的2倍,其余转基因株系的存活率平均值是NT的3倍。本研究结果与Dalal等[16]的研究结果一致,他认为在胁迫后,转基因拟南芥与对照相比,有更高的高生长和存活率[16]

      LEA蛋白富含甘氨酸、赖氨酸等亲水氨基酸,其显著理化性质是高亲水性和热稳定性,当受到外界胁迫时,LEA蛋白可以作为水分结合蛋白防止细胞内水分的丧失和高浓度的Na+对细胞的毒害作用[17]。而盐碱胁迫对植物造成的危害主要是离子毒害、渗透胁迫,进而导致植物的光合作用受到抑制[18]。因此,植物内部LEA蛋白大量富集就会减轻盐碱胁迫对细胞的毒害作用, 使光合作用受抑制的情况得到缓解。Pn是反应植物对胁迫响应及鉴定植物抗逆性的有效指标[19],本研究中,胁迫20 d时,NT的Pn下降了91.01%,高于各转基因株系的61.27%~70.52%,GsTr的变化也有相似的趋势,即胁迫后NT的降幅均大于转基因株系,且SL2的降幅最小,说明NT光合器官的结构和功能受到了比转基因无性系更严重的破坏,这正是因为转基因山新杨在胁迫期间积累了大量LEA蛋白,减小了细胞受损程度,从而保护了光合系统。许大全[20]认为,胁迫下植物的光合速率下降可以分为气孔限制和非气孔限制,在Gs下降时,Ci同时下降表明是气孔限制所致;若Gs下降,Ci不变或者升高,则是非气孔限制所致。本实验中,胁迫后NT的Ci下降17.92%,SL3,SL4分别下降2.37%和6.97%,而SL1、SL2、SL5、SL6的Ci分别上升了2.56%、9.72%、4.80%、4.49%,认为NT、SL3、SL4光合速率下降时由于气孔因素的限制,而SL1、SL2、SL5、SL6光合速率下降是由于非气孔因素的限制。

      生物或非生物胁迫对植物光合作用的各过程产生的影响都可通过叶片叶绿素荧光动力学参数的变化反映出来[21]。由于叶绿素荧光动力学技术在测定叶片光合作用中光系统对光能的吸收、传递、耗散、分配方面具有独特的作用,被称为测定叶片光合作用快速、无损伤的探针[22],在植物耐盐品种选育方面显示出较好的应用前景[23-24]。研究结果表明,NT的Fv/Fm下降幅度最大,是SL2的3倍多,可解释为强光下D1蛋白破坏使PSⅡ活性受影响,导致叶绿体吸收和传递能力下降,反应中心不能得到用于转化成生物化学能的激发能,使得电子传递效率下降[25],反应在叶绿素荧光动力学参数上是Fv/Fm下降,转基因株系由于大量LEA蛋白的保护作用,Fv/Fm下降程度小于NT。NaHCO3胁迫下,山新杨的qP和ΦPSII剧烈下降,NT的下降幅度只略大于转基因无性系,原因可能是碱性条件对植物形成离子和高pH的双重毒害,致使光合电子传递链严重破坏,阻碍了原初电子受体质子醌QA的氧化和反应中心光能捕获能力;因此植物受到的伤害要远远大于中性盐胁迫。同时,NT的NPQ上升幅度几乎是转基因无性系的6倍,说明NT的电子传递链失活,大部分的光能只能以热的形式被无效的耗散掉了,使参与光合电子传递的光能大量减少,光合电子传递效率大大降低。

      非生物胁迫下,植物体内的本底平衡的ROS系统会遭到破坏,使得ROS大量富集并产生氧化应激作用[26]。因此,在胁迫条件下,相较于对照株系,转基因株系ROS水平更低。这意味着,氧化应激作用在转基因株系体内的作用要弱于对照株系,故前者有更强的抗胁迫能力。

      植物耐盐碱性是一个复杂的过程,任何一个单一的指标都不能完全地评价植物的耐盐碱能力,因此,利用形态、生理和生化等指标对植物耐盐碱性进行综合评价是比较科学的方法[27]。本研究综合生长生理评价指标,筛选出SL2为抗逆性优良的转基因山新杨,为今后的育种造林提供了材料。

参考文献 (28)

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