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胡杨bZIP转录因子PebZIP26和PebZIP33基因的克隆及功能分析

张影 练从龙 段卉 路信 夏新莉 尹伟伦

张影, 练从龙, 段卉, 路信, 夏新莉, 尹伟伦. 胡杨bZIP转录因子PebZIP26和PebZIP33基因的克隆及功能分析[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(7): 18-30. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170109
引用本文: 张影, 练从龙, 段卉, 路信, 夏新莉, 尹伟伦. 胡杨bZIP转录因子PebZIP26和PebZIP33基因的克隆及功能分析[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(7): 18-30. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170109
ZHANG Ying, LIAN Cong-long, DUAN Hui, LU Xin, XIA Xin-li, YIN Wei-lun. Cloning and functional analysis of PebZIP26 and PebZIP33 transcription factors from Populus euphratica[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(7): 18-30. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170109
Citation: ZHANG Ying, LIAN Cong-long, DUAN Hui, LU Xin, XIA Xin-li, YIN Wei-lun. Cloning and functional analysis of PebZIP26 and PebZIP33 transcription factors from Populus euphratica[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(7): 18-30. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170109

胡杨bZIP转录因子PebZIP26和PebZIP33基因的克隆及功能分析

doi: 10.13332/j.1000-1522.20170109
基金项目: 

国家自然科学基金项目 31270656

“十二五”国家科技支撑计划项目 2015BAD07B01

详细信息
    作者简介:

    张影。主要研究方向:植物抗逆分子生物学。Email: zhangying_email@126.com  地址:100083  北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院

    通讯作者:

    夏新莉,教授,博士生导师。主要研究方向:植物抗逆分子生物学。Email:xiaxl@bjfu.edu.cn  地址:同上

    尹伟伦,教授,博士生导师。主要研究方向:植物生理与生物技术。Email:yinwl@bjfu.edu.cn  地址:同上

  • 中图分类号: S718.43;Q943.2;S792.119

Cloning and functional analysis of PebZIP26 and PebZIP33 transcription factors from Populus euphratica

  • 摘要: bZIP(basic region/leucine zipper motif)是一类在真核生物中分布广泛的超大转录因子家族,参与调节植物的生长发育、衰老、激素调控、能量代谢、病原防御等过程。胡杨是研究抗逆分子机制的模式木本植物,但是关于胡杨的bZIP功能迄今未见研究报道。本研究从胡杨中克隆得到PebZIP26和PebZIP33两个转录因子的cDNA,经分析,分别编码439与371个氨基酸且PebZIP26与PebZIP33基因的表达受干旱、脱水及盐胁迫诱导。构建植物表达载体,利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥,获得CaMV35S:PebZIP26和CaMV35S:PebZIP33超表达株系和空载体对照株系。在含有150 mmol/L NaCl及300 mmol/L甘露醇培养基上,PebZIP26和PebZIP33超表达株系根长均长于野生型,叶片嫩绿,无发黄萎蔫现象;另外,对盆土中的幼苗进行21 d的干旱处理和盐处理,超表达PebZIP26及PebZIP33株系耐旱耐盐性较强,表现为胁迫环境中植株营养生长较好,株高显著高于野生型(WT)及空载体对照株系,干旱复水后,植株存活率为61%及48%,显著高于WT的9%及空载体对照的12%。超表达PebZIP26及PebZIP33株系相比于WT和abf1及tga1(拟南芥同源基因ABF1及TGA1突变体)气孔关闭对外源ABA处理更加敏感,且对氧化胁迫的抗性较强。综上所述,胡杨PebZIP26和PebZIP33转录调节因子可能通过调控气孔开度和活性氧水平及根的生长正向调节植物抗旱耐盐性,进一步丰富了木本植物bZIP的基因功能认识,为遗传育种提供基因资源及理论依据。
  • 图  1  拟南芥各株系PCR鉴定结果及GUS染色鉴定

    M.标记DNA; WT.野生型; VC.空载体对照;1~8.条带1~8;A.拟南芥PebZIP26的DNA鉴定; B.拟南芥PebZIP33的DNA鉴定; C.拟南芥PebZIP26的GUS鉴定; D.拟南芥PebZIP33的GUS鉴定。

    Figure  1.  PCR and GUS detection of each strain of Arabidopsis thaliana

    M, DNA marker; WT, wide type; VC, vacant carrier; 1-8, line 1-8; A, PCR result of PebZIP26;B, PebZIP33 DNA identification.

    图  2  PebZIP26基因及PebZIP33基因与毛果杨同源基因编码氨基酸序列比对及基因结构图

    A.PebZIP26基因与PtrbZIP26基因的氨基酸序列比对;B.PebZIP33基因与PtrbZIP33基因氨基酸序列比对;C.PebZIP26基因与PebZIP33基因结构图。

    Figure  2.  Comparison of PebZIP26 and PebZIP33 proteins between P. euphratica and P. trichocarpa

    A, comparison of amino acid sequence between gene PebZIP26 and PtrbZIP26; B, comparison of amino acid sequence between gene PebZIP33 and PtrbZIP33; C, gene structure of PebZIP26 and PebZIP33.

    图  3  胡杨PebZIP26和PebZIP33蛋白的系统进化树分析

    Figure  3.  Molecular phylogenetic tree analysis of PebZIP26 and PebZIP33 species

    图  4  不同处理下胡杨PebZIP26和PebZIP33基因在胡杨叶片中的表达

    A.脱水处理下PebZIP26的表达量; B.脱水处理下PebZIP33的表达量; C.不同水势下PebZIP26的表达量; D.不同水势下PebZIP33的表达量;E.200 mmol/L NaCl处理下PebZIP26的表达量;F.200 mmol/L NaCl处理下PebZIP33的表达量;RC.对C组(30%水势)进行复水。不同字母表示在P<0.05水平上差异显著。

    Figure  4.  Expression of PebZIP26 and PebZIP33 in leaf under treatments in Populus euphratica

    A, expression of PebZIP26 under dehydrate treatment; B, expression of PebZIP33 under dehydrate treatment; C, expression of PebZIP26 under different water potentials; D, expression of PebZIP33 under different water potentials; E, expression of PebZIP26 under 200 mmol/L NaCl treatment; F, expression of PebZIP26 under 200 mmol/L NaCl treatment; RC, rewater of C group (30% water potentral); Different letters mean significant difference at P < 0.05 level.

    图  5  3个株系(WT、PebZIP26、PebZIP33)在不同处理下的根长比较

    A~F:不同处理条件下的根长表型;G.不同处理条件下的根长统计。不同字母表示在P<0.05水平上差异显著。

    Figure  5.  Comparison in root length of three lines (WT, PebZIP26, PebZIP33)

    A-F, root length under different treatment conditions; G, statistics of root length under different treatment conditions. Different letters mean significant difference at P < 0.05 level.

    图  6  干旱和盐胁迫下各株系的(野生型、空载体、超表达)株高的比较及复水后存活率

    A.干旱处理21 d,野生型与超表达PebZIP26株系株高对比;B.干旱处理21 d,野生型与超表达PebZIP33株系株高对比;C.盐胁迫处理21 d,野生型与超表达PebZIP26株系株高对比;D.盐胁迫处理21 d,野生型与超表达PebZIP33株系株高对比; E.复水后植株存活率;F.株高统计。

    Figure  6.  Comparison in stem length of four lines (WT, VC, PebZIP26, PebZIP33) and survival rate being rewatered after drought and salt stress

    A, stem length of WT and PebZIP26 after 21days drought treatment; B, stem length of WT and PebZIP33 after 21days drought treatment; C, stem length of WT and PebZIP26 after 21days drought treatment. D, stem length of WT and PebZIP33 after 21days drought treatment. E, survival rate 5 days later being rewatered after drought. F, statistics of stem length.

    图  7  离体叶片失水率以及地上部分干物质含量

    Figure  7.  Water loss rate of cut leaves and dry matter content in Populus euphratica

    图  8  离体叶片脱水处理2 h以及5 μmol/L外源ABA处理2 h时的组织化学染色检测活性氧

    Figure  8.  Histochemical staining assay detection of H2O2 and O2 accumulation with diaminobenzidin followed dedehydrate and 5 μmol/L exogenous ABA treatment

    图  9  5及10 μmol/L外源ABA处理后各株系的气孔开度

    A.外源ABA处理后各株系气孔开度对比图;B.不同处理下各株系气孔开放宽度与长度比例。

    Figure  9.  Stomatal aperture ratio in response to ABA treatment in each strain

    A, comparison of stomatal aperture of each strain after ABA treatment in WT and PebZIP26, PebZIP33 transgenic and corresponding mutant A. thaliana plants; B, the ratio of width and length of stomatal in different treatments.

    图  10  PebZIP33延缓种子的萌发及植株的营养生长

    A.PebZIP33与WT及tga1在150 mmol/L NaCl培养基的发芽趋势;B.PebZIP33与WT及TGA1在300 mmol/L甘露醇培养基的发芽趋势;C.同一时期WT与PebZIP33植株比较。

    Figure  10.  PebZIP33 delay the germination of seed and nutritional growth

    A, germination trend of PebZIP33 and WT and tga1 on 150 mmol/LNaCl medium; B, germination trend of PebZIP33 and WT and tga1 on 300 mmol/L mannitol medium; C, comparison of WT and PebZIP33 on leaf area at the period.

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出版历程
  • 收稿日期:  2017-03-29
  • 修回日期:  2017-04-20
  • 刊出日期:  2017-07-01

胡杨bZIP转录因子PebZIP26和PebZIP33基因的克隆及功能分析

doi: 10.13332/j.1000-1522.20170109
    基金项目:

    国家自然科学基金项目 31270656

    “十二五”国家科技支撑计划项目 2015BAD07B01

    作者简介:

    张影。主要研究方向:植物抗逆分子生物学。Email: zhangying_email@126.com  地址:100083  北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院

    通讯作者: 夏新莉,教授,博士生导师。主要研究方向:植物抗逆分子生物学。Email:xiaxl@bjfu.edu.cn  地址:同上; 尹伟伦,教授,博士生导师。主要研究方向:植物生理与生物技术。Email:yinwl@bjfu.edu.cn  地址:同上
  • 中图分类号: S718.43;Q943.2;S792.119

摘要: bZIP(basic region/leucine zipper motif)是一类在真核生物中分布广泛的超大转录因子家族,参与调节植物的生长发育、衰老、激素调控、能量代谢、病原防御等过程。胡杨是研究抗逆分子机制的模式木本植物,但是关于胡杨的bZIP功能迄今未见研究报道。本研究从胡杨中克隆得到PebZIP26和PebZIP33两个转录因子的cDNA,经分析,分别编码439与371个氨基酸且PebZIP26与PebZIP33基因的表达受干旱、脱水及盐胁迫诱导。构建植物表达载体,利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥,获得CaMV35S:PebZIP26和CaMV35S:PebZIP33超表达株系和空载体对照株系。在含有150 mmol/L NaCl及300 mmol/L甘露醇培养基上,PebZIP26和PebZIP33超表达株系根长均长于野生型,叶片嫩绿,无发黄萎蔫现象;另外,对盆土中的幼苗进行21 d的干旱处理和盐处理,超表达PebZIP26及PebZIP33株系耐旱耐盐性较强,表现为胁迫环境中植株营养生长较好,株高显著高于野生型(WT)及空载体对照株系,干旱复水后,植株存活率为61%及48%,显著高于WT的9%及空载体对照的12%。超表达PebZIP26及PebZIP33株系相比于WT和abf1及tga1(拟南芥同源基因ABF1及TGA1突变体)气孔关闭对外源ABA处理更加敏感,且对氧化胁迫的抗性较强。综上所述,胡杨PebZIP26和PebZIP33转录调节因子可能通过调控气孔开度和活性氧水平及根的生长正向调节植物抗旱耐盐性,进一步丰富了木本植物bZIP的基因功能认识,为遗传育种提供基因资源及理论依据。

English Abstract

张影, 练从龙, 段卉, 路信, 夏新莉, 尹伟伦. 胡杨bZIP转录因子PebZIP26和PebZIP33基因的克隆及功能分析[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(7): 18-30. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170109
引用本文: 张影, 练从龙, 段卉, 路信, 夏新莉, 尹伟伦. 胡杨bZIP转录因子PebZIP26和PebZIP33基因的克隆及功能分析[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(7): 18-30. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170109
ZHANG Ying, LIAN Cong-long, DUAN Hui, LU Xin, XIA Xin-li, YIN Wei-lun. Cloning and functional analysis of PebZIP26 and PebZIP33 transcription factors from Populus euphratica[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(7): 18-30. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170109
Citation: ZHANG Ying, LIAN Cong-long, DUAN Hui, LU Xin, XIA Xin-li, YIN Wei-lun. Cloning and functional analysis of PebZIP26 and PebZIP33 transcription factors from Populus euphratica[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(7): 18-30. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170109
  • bZIP(basic region/leucine zipper motif)类转录因子广泛存在于真核生物中,是较为保守的一类转录因子,参与调控植物的多种生命活动[1]。大多数bZIP转录因子包含两个特定结构:一是N端的16个碱性氨基酸残基构成的DNA结合区域,含有核定位信号,能够识别启动子上的特定元件,并与之结合;二是C末端的亮氨酸拉链寡聚结构域,行使基因的转录激活或抑制功能[2]

    随着生物信息学的发展,多种植物的多个bZIP转录因子陆续被报道。到目前为止,拟南芥(Arabidopsis thaliana)中包含127个bZIP转录因子,毛果杨(Populus trichocarpa)和胡杨(P. euphratica)分别有214、101个[3]。Jakoby等[4]将拟南芥中的bZIP转录因子分为A、B、C、D、E、F、G、H、I和S 10个亚族,同一个亚族之间具有相似的功能。不同的bZIP转录因子在植物中行使不同的功能。拟南芥的bZIP11能够平衡细胞的能量资源集中应对植物生长以适应不利环境[5]。大豆(Glycine max)的GmbZIP44、GmbZIP62、GmbZIP78是ABA信号的负调控因子,提高转基因拟南芥对盐胁迫和低温胁迫的抗性[6]。拟南芥AtbZIP16转录因子的启动子上含有GA和ABA信号通路,能通过整合光和激素信号通路来调节早期幼苗发育,在幼苗萌发早期阶段促进种子发芽和下胚轴伸长[7]。TGA作为bZIP转录因子的一个亚家族,在逆境胁迫研究中较少,拟南芥中TGA2、TGA5、TGA6是水杨酸(Salysalic acid,SA)/乙烯(Ethylane)诱导的防御反应的必须活化剂,tga256三重突变体显示出对坏死性灰葡萄孢菌的敏感性较高[8]。拟南芥TGA7参与植物抗旱胁迫[9]TGA9-TGA10参与植物免疫应答[10]。对TGA的研究,大多数集中在植物免疫反应。同一个转录因子在不同的植物中,也可能具有不同的功能。bZIP1转录因子在拟南芥中通过影响糖介导的基因来参与到葡萄糖的应答反应[11],且bZIP1的表达明显受到盐、干旱、渗透压以及低温胁迫的诱导[12]。在杨树(Populus spp.)中,PtabZIP1L基因主要在杨树的侧根表达,过表达PtabZIP1L基因使杨树的侧根原基(lateral-root primordia,LRP)及侧根(lateral-root,LR)成熟较早,而当PtabZIP1L基因受抑制时,LRP和LR的形成显著受抑制。PtabZIP1L基因能够通过调节多个代谢途径来促进侧根的发生,增加植株的耐旱性[13]

    胡杨生长在荒漠区,耐旱耐涝,生命顽强,是树木抗逆分子机制模式材料。根据本实验室以往对干旱胁迫下胡杨转录组测序分析,筛选获得多个干旱响应的bZIP转录因子成员[14]。本研究对其中与毛果杨基因POPTR_0004s14790.1和POPTR_0005s08370.1同源的两个成员作进一步的功能研究。其中POPTR_0004s14790.1基因结构中含有ABA应答顺式作用元件(ABRE,PyACGTGGC),且与拟南芥ABF家族的bZIP结构域的蛋白序列高度同源,是毛果杨14个ABF亚家族成员之一[15];POPTR_0005s08370.1,经序列比对,与拟南芥TGA1高度同源。我们克隆获得胡杨同源基因PebZIP26与PebZIP33,构建表达载体转化到拟南芥中,初步验证了PebZIP26与PebZIP33的功能,PebZIP26与PebZIP33基因能够通过调节气孔运动、根的生长以及增强植株的抗氧化性来提高拟南芥的抗旱性与耐盐性,研究为作物抗逆性改良及遗传育种提供基因资源及理论依据。

    • 胡杨树苗购自新疆地区,种于北京林业大学苗圃,浇水间隔3 d,生长3个月后取生长一致树苗进行处理。野生型拟南芥(wild type,WT)为哥伦比亚生态型(Columbia-0),突变体SALK_069523(为拟南芥ABF1基因的突变体,命名为abf1)和SALK_028210(为拟南芥TGA1的突变体,命名为tga1)购自ARBC(Arabidopsis Biological Rescource Center)网站,T1代提取DNA,用PCR方法检测阳性株系,单株收种至T3代,获得纯合体。根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)为GV3101菌株,植物表达载体为pCAMA 1301载体。拟南芥种子播种时,无菌水清洗,70%的酒精浸泡5 min,清水冲洗5次,均匀播在1/2MS固体培养基上。4 ℃冰箱春化3 d,后置16 h光照/8 h黑暗条件下培养,7 d后移栽至盆土(V花卉土:V草炭:V蛭石=3:3:1)中。

    • 实验中胡杨总RNA使用EASYspin plus植物RNA快速提取试剂盒(Aidlab Biotech, Beijing, China)提取自胡杨叶片,用M-MLV反转录酶反转录出cDNA第1条链,根据毛果杨中与胡杨的同源基因序列,使用DNAMAN设计特异性引物(PebZIP26-F:TGTGTAGTTGGACCGAGAATGT,PebZIP26-R:CACTGCTTCTACCATCCACAA;PebZIP33-F:CATCA CAAGTCCAGGGAGAATGAAT,PebZIP33-R:GGTCC TTCTAATACGAATCTAGGC),以胡杨cDNA为模板,使用LATaq酶PCR扩增(反应体系25 μL, 含1 μL稀释的cDNA模板,上下游引物各2 μL,0.25 μL Takara LA Taq,2.5 μL 10×PCR buffer,2.5 μL MgCl2,4 μL dNTP, 12.5 μL ddH2O;)PebZIP26与PebZIP33基因,回收产物连接到pMD18-T,转化大肠杆菌Top10,培养,挑菌,摇菌,菌检,阳性克隆送测。

    • 将上述测序结果通过Phytozome v9.1(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)进行序列信息分析。得到的基因的蛋白序列在ExPASy(http://www.expasy.org/)网站使用ProtParama进行蛋白质分子质量以及等电点等信息的分析,并在National Center for Biotechnology Information(NCBI;https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)用Blastp将PebZIP26和PebZIP33转录因子的氨基酸序列与其他物种进行比对,比对结果用DNAMAN(Version 5.2.2.0 Lynnon Biosoft USA)进行分析,通过植物转录因子数据库(PTFD:Plant Transcription Factor Database,http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)找到拟南芥、毛果杨、胡杨、水稻的bZIP转录因子的信息。使用MEGA6的邻接法(NJ,Neighbor-Jioning method)将胡杨的PebZIP26和PebZIP33基因与毛果杨的同源基因PtrbZIP26和PtrbZIP33,以及与其他物种中同源的bZIP家族成员之间的蛋白质序列构建系统发育进化树。

    • 为了研究胡杨中目的基因与非生物胁迫具有一定相关性,对长势一致的胡杨材料进行脱水、干旱和盐处理,200 mmol/L NaCl处理0、1、2、4、8 d,每个处理3盆,每盆5株苗。干旱处理:用土壤水分仪(Field Scout TDR 300)将盆土水势分别控制在A为42%、B为35%、C为30%、D为25%、E为C组干旱后复水,30 d后收集各个梯度含水量的胡杨叶片,冻存于液氮。脱水处理:将胡杨苗从盆中取出,清水将根冲洗干净,用报纸吸干全株水分之后,置于干净的报纸上,自然晾干,取样时间点为:0、0.5、1、2、4、8 h,处理结束后,用锡箔纸包裹,冻存于液氮,保存于-80 ℃的冰箱,用于后续实验。上述每个实验重复3次。处理结束后,提取叶片RNA,反转录为cDNA,以此为模板,用NCBI设计特异性引物(PebZIP26-F:GAAAGCGCAATGGGGAGGTA, PebZIP26-R:CCA TGCTCACCACACAAATGG; PebZIP33-F:TACTTCC AACGGCTTAGG, PebZIP33-R:CCTTTCTGAGTATG GCTCTGGT),Ubiquitin作为内参进行实时荧光定量PCR,每个实验重复3次以上。

    • PebZIP26和PebZIP33转录因子基因全长获取后,在基因两端加上限制性酶切位点Knp-I(F:TCTAGAGGATCCCCGGGTCA, R:ACCATGGTGGCG ACCGGTAC),将产物与Knp-I单酶切的1301载体回收产物通过seemless assembly(AidLab:CV12-Seamless Assembly and Cloning kit CV1201)连接酶连接得到表达载体pCAM1301-PebZIP26和pCAM1301-PebZIP33,转化大肠杆菌感受态,送测无误,使用液氮冻融法将质粒转入农杆菌(GV3101)感受态。

    • 阳性菌株使用花序侵染法侵染拟南芥。T0代种子播种在筛选压为潮霉素(Hygromicin)25 mg/L的1/2MS培养基上,1周后将能够正常生根并长出2片真叶的幼苗移至盆土中。长至6~8片真叶时,剪取叶片,进行GUS染液染色,GUS染色阳性株系剪取叶片提取DNA,分子检测为阳性的植株继续培养,单株收取种子,筛选至T3代获得转基因纯合体株系。

    • 根长实验:将春化后在培养皿中生长7 d,长势一致的WT、PebZIP26、PebZIP33幼苗各12株,整齐摆放在含有150 mmol/L NaCl和300 mmol/L甘露醇的1/2MS培养基上,根垂直向下,生长8 d后观察拍照记录根长情况,使用ImageJ测量。实验重复3次。

    • 为了找出目的基因与盐胁迫之间的关联,我们对盆土中生长14 d的WT、空载体对照(Vacant Carrier,VC)、PebZIP26、PebZIP33拟南芥苗进行处理,每个株系12盆,每盆4株,共计48株。每隔3 d,用200 mmol/L NaCl浇透土壤。对照组正常浇水。处理14 d后,对植株表型拍照测量,进行数据分析。

    • 盆土中生长2周的幼苗不同株系各12盆,每盆4株,共计48株,盆土中生长2周后,浇足量水,待水分吸收饱和,将盆中余水倒掉,后续4周进行干旱处理。正常浇水植株作对照。待处理结束后,拍照记录并进行分析。继而进行复水,5 d后拍照记录复水情况以及统计复水后植株的存活率。实验重复3次。

    • 各株系植株移栽至盆土2周后,剪取各个株系幼苗(未抽薹且生长状况良好)地上莲座部分各9株,放在称量纸上,剪下后立即称质量,然后在实验室环境中自然干燥,取样时间点分别为:0、0.5、1、2、4、8 h,用电子天平实时称质量,记录质量,分析并计算叶片失水率。另取各株系地上部分,每株系5株,称鲜质量记录,将植株装入已称质量的干燥的信封,放在60 ℃烘箱中烘干至2次称质量之间间隔小于0.001 g,记录并计算各株系干物质含量。实验重复3次,每次3个平行。

      图  1  拟南芥各株系PCR鉴定结果及GUS染色鉴定

      Figure 1.  PCR and GUS detection of each strain of Arabidopsis thaliana

    • 取WT、PebZIP26、PebZIP33、abf1、tga1株系生长状况良好拟南芥成熟叶片4~5片,对照组无任何处理。处理组a:脱水2 h;处理组b:用5 μmol/L ABA处理液浸泡30 min。之后根据说明书操作:用蒸馏水将叶片冲洗干净后置于2 mL离心管中,取DAB染液A液和B液混合,每管中加入1 mL染液,离心管用锡箔纸包好,避光置于37 ℃恒温箱中过夜,次日吸出染液,加入酒精煮沸脱色,观察染色结果,拍照记录。

    • 实验在温室进行处理,选取WT、PebZIP26、PebZIP33以及突变体abf1、tga1的长势良好成熟叶片4~5片,浸泡在气孔开放液中,光照2.5 h,撕取叶片下表皮,制片观察,拍照记录。然后将叶片分别转移到含有ABA 5和10 μmol/L的处理液中继续光照2 h。随后用镊子撕取叶片下表皮,制片观察,拍照记录。并用ImageJ software分析测量气孔的长和宽,计算气孔开度并比较。

      $$ 气孔开度=宽度/长度 $$
    • 选取WT、空载体、突变体tga1、超表达PebZIP33 4个株系播种在分别含有150 mmol/L NaCl及300 mmol/L甘露醇的1/2MS培养基上,春化3 d后转入16 h光照/8 h黑暗条件下水平培养。统计发芽率。

    • 经潮霉素培养基筛选的拟南芥,初步进行GUS染色,阳性植株进一步提取DNA进行鉴定。筛选GUS染色及DNA鉴定均为阳性的植株。单株收种,用于后续实验。

    • 将基因送测结果拼接后进行生物信息学分析,PebZIP26基因位于胡杨的第4号染色体上,开放阅读框为1 320 bp,编码439个氨基酸,与毛果杨氨基酸序列比对结果相似度为94.53%(图 2A),相对分子质量为47 505.91,理论pI(Protein isoelectric point)为9.70,基因结构上具有4个外显子,3个内含子(图 2C)。PebZIP33基因位于胡杨第5号染色体,ORF为1 116 bp,编码371个氨基酸,与毛果杨氨基酸序列比对结果相似度为90.62%(图 2B),相对分子质量为41 417,理论pI为5.03, 基因结构具有7个外显子,6个内含子(图 2C)。

      图  2  PebZIP26基因及PebZIP33基因与毛果杨同源基因编码氨基酸序列比对及基因结构图

      Figure 2.  Comparison of PebZIP26 and PebZIP33 proteins between P. euphratica and P. trichocarpa

    • 为了解胡杨中PebZIP26和PebZIP33基因与毛果杨同源基因PtrbZIP26和PtrbZIP33及其他物种同源基因的进化关系,采用MEGA6.0的邻接法(Neighbor-Joining Method, NJ)构建系统发育进化树(bootstrap replication:1 00)。选取几种植物的同源基因编码的氨基酸序列,分别为蓖麻(Ricinus communisXP_015574413.1)、麻风树(Jatropha curcas XP_012066866.1、XP_012075186.1)、青梅(Prunus mume XP_008236589.1)、葡萄(Vitis vinifera XP_010647747.1、XP_001652847.1)、巨桉(Eucalyptus grandis XP_010066019.1、XP_0100 25492.1)、拟南芥(Arabidopsis thaliana AtABF1、AtTGA1)、毛果杨(Populus trichocarpa Potri.005G082000.1、Potri.004G140500.1)、胡杨(Populus euphratica PebZIP26、PebZIP33)、水稻(Oryza sativa XP_015612550、XP_015636710.1)、玉米(Zea maysONMO3667、ONMO 13218.1)、可可(Theobroma cacaoXP_007048077.1)、桃子(Prunus persica XP_008234522.1)、大豆(Glycine maxNP_001238287.1)、棉花(Gossypium hirsutum XP_016742270.1、Gossypium arboreum XP_017644690.1),绘制进化树(如图 3)。PebZIP26在亲缘关系上与拟南芥的ABF1亲缘关系相近,推测为同源基因、功能相似;与毛果杨PtrbZIP26(Potri.004G140600.1)亲缘关系最近,与木本植物麻风树、蓖麻的同源基因在一个小分支上,在进化上关系较近。PebZIP33与拟南芥的同源基因属于TGA亚家族,与拟南芥的TGA1亲缘关系相近,在进化上同样与毛果杨的亲缘关系最近,另与大豆及桃子分支较近。

      图  3  胡杨PebZIP26和PebZIP33蛋白的系统进化树分析

      Figure 3.  Molecular phylogenetic tree analysis of PebZIP26 and PebZIP33 species

    • 胡杨PebZIP26和PebZIP33基因在不同逆境胁迫处理后表达关系如图 4。脱水处理时,胡杨叶片中PebZIP26和PebZIP33基因的表达随着脱水时间的增加,都受到了不同程度的诱导,PebZIP26基因在脱水8 h表达量最高,为对照组的1.5倍。PebZIP33基因受诱导程度较强,在脱水1 h时,表达量为对照组的4倍,随后逐渐下降;这说明了PebZIP26和PebZIP33基因对脱水胁迫有应答。在图 4C4D中,随着水势的降低,两个基因的表达趋势有所不同,PebZIP26基因随着水势的降低,表达量有所升高,在土壤水势为25%,表达量达到最大值。PebZIP33基因则是先上升后下降,在土壤水势为30%,表达量达到2.6倍,随后下降;在干旱后恢复浇水,两个基因表达量回落到对照水平。在图 4E4F中,在200 mmol/L NaCl的处理下,两个基因的表达量受诱导的情况明显不同,PebZIP26基因随着NaCl处理的时间的增长,表达量呈先上升后下降的趋势,在处理2 d的时候达到最高值,约为对照组的6倍;而PebZIP33基因的表达量则呈先下降,后上升的趋势。以上说明,胡杨PebZIP26和PebZIP33基因响应逆境胁迫。

      图  4  不同处理下胡杨PebZIP26和PebZIP33基因在胡杨叶片中的表达

      Figure 4.  Expression of PebZIP26 and PebZIP33 in leaf under treatments in Populus euphratica

    • 植物的根系作为吸水的主要器官,根系的生长状况决定了植物水分利用效率的关键。在正常条件下,WT株系与PebZIP26及PebZIP33超表达株系根长没有差别(如图 5A5B)。在甘露醇和盐的渗透胁迫处理时,WT和PebZIP26以及PebZIP33超表达株系的生长均受到不同程度的抑制,但超表达株系的耐受性较好,根明显长于野生型,叶片较绿;WT则出现叶片发黄、萎蔫、叶片较小等表型。在150 mmol/L的NaCl培养基上, WT株系的生长明显受到抑制,如图 5E5FPebZIP26与PebZIP33超表达株系叶片鲜绿,叶面积相对较大,状态良好,主根长度显著长于野生型。300 mmol/L甘露醇模拟干旱培养基上,如图 5C5D,各株系生长受抑制较明显,WT叶片失绿,根长较短;超表达株系叶片颜色无明显变黄,受胁迫症状相对较轻。以上结果表明,在盐胁迫和渗透胁迫条件下,超表达PebZIP26与PebZIP33拟南芥植株的耐受性增强。

      图  5  3个株系(WT、PebZIP26、PebZIP33)在不同处理下的根长比较

      Figure 5.  Comparison in root length of three lines (WT, PebZIP26, PebZIP33)

    • 对照组,超表达PebZIP26拟南芥平均株高26 cm明显高于WT及空载体对照组的22 cm,PebZIP33株系株高低于WT组(图 6B)。干旱胁迫3周后,各个株系的生长都受到一定程度的抑制。但PebZIP26的长势明显优于对照组,主枝平均高度为22 cm,高于WT及空载体对照组的17及15 cm。对照组表现出植株矮小,叶片萎蔫,种夹个数较少等干旱胁迫症状。

      图  6  干旱和盐胁迫下各株系的(野生型、空载体、超表达)株高的比较及复水后存活率

      Figure 6.  Comparison in stem length of four lines (WT, VC, PebZIP26, PebZIP33) and survival rate being rewatered after drought and salt stress

      对拟南芥WT、空载体对照组及超表达株系进行干旱处理,处理14 d时,WT及空载体对照组叶片出现萎蔫,而超表达株系生长良好,处理结束后对拟南芥的表型进行数据分析及统计。WT与空载体对照组植株大多已经干枯,而超表达株系在复水之前也表现出相应的抗逆性状,即叶片生长状况差,颜色深绿,叶展较小,叶缘发黄干枯,茎较细。干旱21 d回复浇水,超表达株系生长较好,逐渐长出新叶。大部分对照组植株死亡,WT存活率只有9%,空载体对照组为12%,而转基因组的长势较好, 复水后存活率PebZIP26为61%,PebZIP26为48%(图 6F)。说明PebZIP26和PebZIP33基因能够提高拟南芥植株对干旱的耐受性。

    • 植物的抗旱性可以表现在多个方面,如水分运输能力,根系生长情况,蒸腾作用强弱等[16]PebZIP26、PebZIP33超表达株系叶片萎蔫比野生型出现得较晚,我们推测不同株系有可能在控制气孔关闭上存在差异,进而导致蒸腾作用速率的不同。因此,进一步利用离体叶片失水实验对这个推测进行验证。结果如图 7A,实验结果表明转基因幼苗株系的失水率明显低于WT和空载体对照组。此外,图 7B中能看出,超表达植株的干物质含量相对较高。

      图  7  离体叶片失水率以及地上部分干物质含量

      Figure 7.  Water loss rate of cut leaves and dry matter content in Populus euphratica

    • 由于细胞内活性氧水平能够体现植株对氧化胁迫的敏感程度[17],因此通过DAB染色,在细胞水平上评价不同株系的H2O2含量,比较各株系在胁迫条件下的活性氧水平。染色结果如图 8,脱水结束后,PebZIP26相对WT及突变体abf1,叶表面棕色较浅。在经过5 μmol/L ABA浸泡30 min后,PebZIP26株系叶片表面棕色加深不明显,abf1及WT叶表面具有明显大的棕色斑点。表明相对于abf1及WT,PebZIP26株系叶片内H2O2含量较低。PebZIP33相对WT、tga1棕色斑点较小、稀疏。在脱水及ABA处理下,WT及tga1氧化胁迫较明显,叶片棕色重,面积大。由此看出PebZIP33表现出对脱水胁迫的抗性及外源ABA的敏感性,能够提高植株对氧化胁迫的抗性。

      图  8  离体叶片脱水处理2 h以及5 μmol/L外源ABA处理2 h时的组织化学染色检测活性氧

      Figure 8.  Histochemical staining assay detection of H2O2 and O2 accumulation with diaminobenzidin followed dedehydrate and 5 μmol/L exogenous ABA treatment

    • 植物水分的流失主要与气孔有关,而气孔的开合又受到ABA的控制[18]。气孔开度试验显示,在一定程度上,随着外源ABA浓度的升高,气孔的开度整体呈逐渐下降趋势。不同的株系对ABA的敏感度不同,在ABA浓度为10 μmol/L时,PebZIP26株系的气孔开度最小,推测PebZIP26基因通过调节气孔运动响应ABA,增强植物的抗旱性。突变体株系abf1对外源ABA的敏感程度相对较低,随ABA含量的增加,气孔开度变化较小。PebZIP33株系随ABA浓度的升高,气孔的开度逐渐减小,在ABA浓度为10 μmol/L时,气孔的开度较WT及tga1小,在一定程度上能响应外源ABA,调控气孔的活动。表明PebZIP33基因能通过调节气孔的活动应对非生物胁迫(图 9)。

      图  9  5及10 μmol/L外源ABA处理后各株系的气孔开度

      Figure 9.  Stomatal aperture ratio in response to ABA treatment in each strain

    • 在含有150 mmol/L NaCl的培养基上,超表达PebZIP33拟南芥种子的萌发率远远低于tga1株系,相对于WT及VC株系,发芽率依然较低,在盐胁迫处理统计到第6天时,tga1株系发芽率接近100%,而超表达PebZIP33基因拟南芥发芽率不到总数的1/3。在甘露醇模拟干旱培养基上,发芽趋势与盐胁迫培养基相似,只是甘露醇模拟干旱胁迫对于WT及tag1的抑制作用较盐胁迫培养基缓和,这个数据表明,超表达PebZIP33基因能够使拟南芥种子在胁迫环境中处于休眠状态,延缓种子的萌发。生长2周后对WT及超表达株系的叶面积对比发现,同一时期的WT植株叶面积较大,而超表达PebZIP33株系叶面积较小(图 10C)。

      图  10  PebZIP33延缓种子的萌发及植株的营养生长

      Figure 10.  PebZIP33 delay the germination of seed and nutritional growth

    • 干旱和盐分是阻碍植物生长并严重降低农业生产力的2个主要环境因素,植物进化出多种途径来应对逆境胁迫。bZIP基因家族是植物中最大的TF家族之一,已知调节广泛的生物过程,包括对非生物胁迫的应答。bZIP中的ABF家族是胁迫环境中应答ABA的转录调控因子[19],水稻基因OsbZIP12能提高植株的抗旱性,并使幼苗对ABA高度敏感[20],葡萄的bZIP39基因在拟南芥中也表现出对多种生物胁迫的抗性[21]。本研究结果也显示,超表达PebZIP26拟南芥幼苗在渗透胁迫处理时的根长显著长于WT(图 5C5E)。对在盆土中生长2周的拟南芥WT及PebZIP26株系进行干旱和盐处理,我们发现,转基因PebZIP26株系无论是在株高还是干旱后复水的植株存活率,都比WT组有优势(图 6E6F)。对胡杨进行非生物胁迫处理后,PebZIP26基因的表达量均有不同程度的上调:在NaCl处理第2天时,表达量可高达6.1倍;干旱处理时,PebZIP26基因表达量显著升高。可见胡杨PebZIP26基因作为转录调控因子,通过上调表达响应盐胁迫与干旱胁迫。

      非生物胁迫下,植物体内活性氧(ROS:Reactive oxygen species)含量增加,引起细胞组分氧化损伤[22]干旱胁迫能导致植物细胞膜脂过氧化,因此我们将离体叶片进行脱水处理后进行DAB染色,观察植物叶片中的H2O2积累,积累量越多,说明植物自身清除活性氧的能力较低,易对自身细胞造成损伤,因此,抗氧化胁迫能力较差,抵抗力较低。本研究结果PebZIP26提高了植物的叶片对活性氧的抗性,叶片染色相对较浅(图 8),说明PebZIP26对氧化胁迫有一定的抗性。该结果与Tu[21]的结果一致。

      外源ABA能够促进气孔关闭,在干旱条件下,喷施ABA,有助于缓解植株的抗旱表型的出现[23]图 9所示,PebZIP26超表达株系的气孔开度随着ABA浓度增加,气孔开度逐渐变小,且小于其他几个株系,推测PebZIP26基因通过降低气孔的开度,降低叶片在干旱环境中的水分蒸腾,进而增强植株抗旱性。

      此外,对PebZIP26基因的启动子元件分析含有以下几个重要原件:ABRE(ABA应答的顺式作用元件);ERE(乙烯应答元件);HSE(热胁迫应答的顺式作用元件)等。推测PebZIP26基因对高温胁迫和乙烯可能有应答反应,可以在后续实验中进行验证。

    • 种子萌发实验(图 10A10B)显示超表达PebZIP33株系在150 mmol/L NaCl及300 mmol/L甘露醇培养基的萌发率远低于WT与突变体,关于bZIP转录因子与种子休眠并抑制植株生长相关的报道较少,孙明月等[24]通过qRT-PCR结果表明PpbZIPs基因可能参与调节休眠。Dekkers等[25]发现DOG1基因是种子诱导休眠所必需的,但经过转录组学和代谢组学对DOG1突变体进行分析,发现DOG1的功能不仅限于种子休眠,能影响数百个基因的表达。另外,Huo等人[26]也验证了在莴苣(Lactuca sativa)中,DOG1调节种子的休眠与开花时间,抑制DOG1的表达,使种子在高温下发芽,并促进早期开花;这个结果与miR156表达减少和miR172的水平增加相关,拟南芥中MIR156基因的过表达使miR156水平增加,进而增强了种子休眠和延迟开花。超表达PebZIP33拟南芥植株在良好环境下,其生长速度较慢,株高较矮(图 6E),同一时期的叶面积显著小于野生型(图 10C),对该基因进行序列分析,发现在基因结构中, 除了具有bZIP家族的保守序列,还有DOG1(Delay of germination1)家族的保守基因序列,DOG1曾被证明与种子休眠相关[27]。那么PebZIP33基因在胁迫下的种子萌发率降低和生长延迟是否也是DOG作用还需要进一步研究。

      对WT及超表达PebZIP33幼苗进行盐胁迫以及甘露醇模拟干旱处理,根长明显长于野生型,且超表达株系的叶片长势较好(图 5D5F)。盆土中的幼苗进行干旱胁迫及盐胁迫处理,超表达PebZIP33株系主枝高度较野生型高(图 6B6D6E),干旱复水之后,存活率远高于野生型(图 6F), 该结果与胡杨脱水及干旱处理时PebZIP33基因表达量上调有相关性。盐处理胡杨时,随处理天数增加,PebZIP33基因表达量下调(图 3F),表明PebZIP33基因应对非生物胁迫有上调和下调两种调节方式,最终都能提高植物的抗逆性。

      在DAB染色实验中,PebZIP33株系叶片在脱水处理时及ABA处理时,叶片H2O2含量低于WT及tga1,气孔开度也随ABA浓度升高而降低,且开度小于WT及tga1。表明PebZIP33株系对外源ABA更加敏感,使气孔开度变小,失水率降低,进而提高植株抗旱性。

      以上数据表明的PebZIP33基因抗逆性主要表现在胁迫环境中根的生长较好、对外源ABA敏感、气孔较早关闭。但超表达PebZIP33拟南芥种子在渗透胁迫环境中发芽缓慢,种子萌发后植株的营养生长有所抑制,如图 6E,在良好环境中,PebZIP33株系主枝高度明显低于野生型,且叶面积较小(图 10C)。

      分析PebZIP33基因的启动子,发现含有以下几个元件:CCAAT-box(MYBHv1结合位点);Box-W1(真菌诱发元件);CGTCA-box(茉莉酸应答的顺式调节因子);MBS(干旱诱导的MYB结合位点);TC-rich重复片段(胁迫应答顺式作用元件);P-box(赤霉素应答元件)等,说明PebZIP33基因有可能对赤霉素及茉莉酸有应答,本文从胡杨中克隆到PebZIP26和PebZIP33基因,并通过植物遗传转化等手段进行基因功能鉴定和调控机理研究。但植物响应逆境胁迫的机制比较复杂,基因参与调控时,上下游基因变化及相关蛋白调控机制有必要研究。且推测PebZIP33基因有更多功能,有继续研究的价值。

参考文献 (27)

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