胡杨苗(1年生)购于新疆维吾尔自治区，于2012年4月初栽培于北京林业大学苗圃，培养在10 L塑料桶中，培养基质为表土和细沙等比例混合的沙土。哥伦比亚生态型(Columbia ecotype)拟南芥和农杆菌菌株GV3101保存于北京林业大学植物抗逆生理实验室；植物稳定表达载体pCAMBIA2300及植物定位载体pGreen0029，保存于北京林业大学生物化学与分子生物学实验室；大肠杆菌DH5α感受态细胞购自天根生化科技有限公司；无内毒素质粒小提试剂盒购于康为世纪生物技术有限公司；ExTaq酶和pMD18-T载体购于TaKaRa公司；RNA提取试剂盒购于科百奥生物技术有限公司；cDNA合成试剂盒购于普洛麦格(北京)生物技术有限公司；其余所用试剂或药品均为国产分析纯或进口分装。引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，测序由北京华大基因公司完成。

根据NCBI数据库中拟南芥RIN4和毛果杨(Populus trichocarpa)PtRIN4基因序列，以其开放阅读框(open reading frame，ORF)为模板，利用引物设计软件Oligo6设计引物，上游引物：5′-ATGG CACAACGTTCACATGTAC-3′，下游引物：5′-TCAG TTTCTGCCCCATGGAC-3′。

利用Trizol法提取胡杨叶片总RNA，逆转录合成cDNA第1链。以cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系为：10×Taq Buffer 2.5 μL；2.5 mmol/L dNTP mix 1 μL；F/R(10 μmol/L)各0.5 μL；cDNA 2 μL；ExTaq酶0.2 μL；补ddH₂O至总体系25 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，32 cycles；72 ℃ 10 min；4 ℃恒温。回收PCR产物，纯化后使其与pMD18-T连接，并转化至E.coli DH5α感受态细胞中，在含有卡那霉素抗性的LB平板上筛选阳性克隆并测序。

利用生物信息学数据库(NCBI, http://www.ncbi.nhn.nih.gov/blast; ORF Finder, http://www.ncbi. nlm.nih.gov/gorf/gorf)对PeRIN4氨基酸序列组成和结构进行分析。分别利用CLUSTALW和Mega 5进行氨基酸多重序列比对及系统进化树的构建。

对克隆所得目的基因PeRIN4进行酶切位点分析，选用BamH Ⅰ/SalⅠ进行双酶切，然后回收并纯化酶切产物，与pMD18-T连接，构建成中间载体，转化至E.coli DH5α感受态细胞中，筛选测序正确的阳性克隆，并提取质粒。将所提质粒与空载体pCAMBIA2300以BamH Ⅰ/SalⅠ为酶切位点，同时进行双酶切。然后回收酶切产物，纯化后将目的片段与pCAMBIA2300载体连接，转化至E.coli DH5α感受态细胞中，在含有卡那霉素抗性的LB平板上筛选阳性克隆，通过测序以验证所构建的植物稳定表达载体pCAMBIA2300-PeRIN4的正确性。

将已构建的重组质粒pCAMBIA2300-PeRIN4和表达载体pCAMBIA2300分别转化至农杆菌GV3101感受态细胞中。在加入利福平抗生素和卡那霉素的LB平板培养基中，筛选阳性克隆并测序。选取转化成功的农杆菌并扩繁，利用沾花法侵染拟南芥^[16]，此为T0代，收获的种子为T1代。

将获得的拟南芥T1代种子播种到添加有卡那霉素(50 mg/L)的MS培养基上，正常长出4片真叶的小苗即为转化苗。将其移植到土里，收获的种子继续用卡那霉素筛选，直至获得T3代纯合种子。Trizol法提取T3代野生型、转基因和转空载体拟南芥叶片总RNA，利用M-MLV反转录得到cDNA第1链，用ddH₂O稀释1倍后，取2 μL作为模板，进行半定量反转录PCR检测。利用生物学软件Oligo6设计引物，上游引物5′-GCCAGGATTTCTGGGAGA -3′，下游引物：5′- GCATGGGAAGACTCGGTAG-3′。以拟南芥Atactin2为内参基因，上游引物5′-CTA AGCTCTCAAGATCAAAGGCTTA-3′，下游引物：5′-ACTAAAACGCAAAACGAAAGCGGTT-3′。PCR反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，28个循环，72 ℃ 7 min；4 ℃保温。扩增产物长度为200 bp左右，做琼脂糖(1%)凝胶电泳检测^[17]。

设计能够去除终止密码子编码序列的引物，并在上、下游引物的5′端分别加上酶切位点EcoRⅠ和PstⅠ。上游引物为5′-GAATTCATGGCACAACGTTCA CATGTAC-3′；下游引物为5′-CTGCAGAGTTTCTGCC CCATGGA-3′，以PeRIN4基因序列为模板进行PCR。将去除终止子的目的片段连接至中间载体pMD18-T，筛选测序正确的阳性克隆，并提取质粒，将质粒与定位载体pGreen0029以EcoRⅠ/PstⅠ为酶切位点，同时进行双酶切。然后回收并纯化酶切产物，进行连接后转化至E.coli DH5α感受态细胞中。筛选阳性克隆并测序以验证成功构建的定位表达载体pGreen0029- PeRIN4。

将构建成功的植物定位载体pGreen0029-PeRIN4和pGreen0029空载体，参考文献[18]的方法，采用PEG介导拟南芥叶肉细胞原生质体转化法，室温暗培养16 h后，利用激光共聚焦显微镜检测PeRIN4的亚细胞定位。

1) 生存率测定：将野生型(WT)、转基因(OE1、OE8)和转空载体(VC)拟南芥分别播种到含有0或100 mmol/L NaCl的MS培养基上，于光照16 h、暗8 h、22 ℃的恒温培养箱培养10 d，统计各株系生存率并拍照。

2) 根长生长测定：野生型(WT)、转基因(OE1、OE8)和转空载体(VC)拟南芥在不含NaCl的MS培养基上垂直生长7 d，再转移至含有0或100 mmol/L NaCl的MS培养基上继续垂直生长，盐处理3 d后测量并统计各株系的根长并拍照。

以上实验均重复3次。

H⁺离子流：野生型(WT)、转基因(OE1、OE8)和转空载体(VC)拟南芥在MS培养基上生长7 d。用非损伤微测技术检测各株系拟南芥根尖分生区的H⁺离子流。在不含NaCl的测试液中先稳定测定10 min，然后在测试液中瞬时加入NaCl(终浓度为100 mmol/L)，继续测定20 min，每种株系测定7个重复，检测方法参照文献[15]。

Na⁺、K⁺离子流：野生型(WT)、转基因(OE1、OE8)和转空载体(VC)拟南芥在MS培养基上生长7 d。然后移至含有0或100 mmol/L NaCl的液体培养基中处理12 h，测定稳态Na⁺和K⁺离子流10 min。每种株系测7个重复。

使用两相法提取拟南芥质膜H⁺-ATPase^[19]，并测定质膜H⁺-ATPase水解ATP的活性^[20]。比较野生型(WT)、转基因(OE1、OE8)和转空载体(VC)拟南芥质膜H⁺-ATPase水解活性的差异，重复3次。

所有数据使用软件SPSS进行统计学分析。

基因序列分析表明，PeRIN4的开放阅读框(ORF)有795 bp、编码265个氨基酸。

再对PeRIN4进行了氨基酸序列分析：将PeRIN4和来自毛果杨、拟南芥、大麦(Hordeum vulgare)、苜蓿(Medicago truncatula)和玉蜀黍(Zea mays)等5种植物中的RIN4蛋白同源序列进行氨基酸多重序列比对。从图 1A中的比对结果发现，PeRIN4与其他物种RIN4同源序列的同源性保持在44%~97%之间，说明PeRIN4在进化过程中具有高度保守性。

图  1  胡杨PeRIN4序列分析

Figure 1.  Bioinformatic analysis of amino acid sequence encoded by PeRIN4

系统进化树分析结果表明，PeRIN4与其他物种中的RIN4有高度相似性，并且与毛果杨RIN4的亲缘关系最为接近，说明PeRIN4属于RIN4同源蛋白(图 1B)。

用Trizol法提取野生型、T3代纯合子转PeRIN4拟南芥和转空载体拟南芥的叶片总RNA，进行半定量反转录PCR检测。结果显示：在拟南芥内参基因Atactin2表达一致的情况下，5个转PeRIN4基因株系均扩增出目的片段(约200 bp)，分别为OE1、OE2、OE7、OE8、OE11。野生型(WT)和转空载体(VC)拟南芥中未检测到目的基因PeRIN4的表达(图 2)。选择表达量高的两个转基因株系OE1、OE8进行之后的生理生化实验，从转空载体拟南芥中选择一个株系作为对照。

图  2  拟南芥各株系半定量反转录PCR

Figure 2.  Semi-quantitative reverse transcription PCR analysis of PeRIN4 in arabidopsis

将带有GFP绿色荧光标签的重组载体瞬时转化至拟南芥叶肉细胞原生质体中，观察绿色荧光在细胞内的分布情况。从图 3中可以看出，pGreen0029-PeRIN4-GFP融合蛋白在胞质中表达，说明目的蛋白PeRIN4是胞质蛋白。

图  3  PeRIN4的亚细胞定位

Figure 3.  Subcellular location of PeRIN4

生存率：将野生型(WT)、转基因(OE1、OE8)和转空载体(VC)拟南芥分别播种到含有0或100 mmol/L NaCl的MS培养基上，生长10 d。从图 4A、4B中可以看出，在无盐培养基上各基因型拟南芥长势一致；而在含有100 mmol/L NaCl培养基上，各株系拟南芥的生长均受到抑制，然而转基因拟南芥OE1和OE8的长势均明显好于野生型(WT)与转空载体(VC)拟南芥。而且，野生型(WT)与转空载体(VC)拟南芥大部分叶片发黄且存活率低(37%~40%)，而转基因株系OE1、OE8大部分幼苗叶片生长正常为嫩绿色，且存活率(74%~78%)明显高于野生型(WT)与转空载体(VC)拟南芥(图 4A、4B)。

图  4  NaCl对拟南芥生存率和根长生长的影响

Figure 4.  Effects of NaCl on survival rate and root length of arabidopsis grown on MS medium

根长：在无盐培养基上各基因型拟南芥根长生长差别不大，在用NaCl(100 mmol/L)处理后，转基因拟南芥(OE1、OE8)根长明显长于野生型(WT)与转空载体(VC)拟南芥(图 4C、4D)。

以上表型实验结果说明，在100 mmol/L的NaCl处理下，各基因型(WT、VC、OE1和OE8)拟南芥的生长均受到抑制，但是转基因拟南芥的生存率和根长都明显高于WT与VC(图 4)。说明PeRIN4基因能够提高拟南芥耐盐性。

H⁺流：在无盐的测试液中，野生型(WT)、转基因(OE1、OE8)和转空载体(VC)拟南芥的H⁺流幅度相近，而在瞬时加入NaCl(终浓度100 mmol/L)后各株系H⁺外流流速均增强，但过表达株系(OE1和OE8)的H⁺的外流流速显著高于WT与VC(图 5A )。我们前期药理学的实验结果已经证实，盐处理激发的H⁺流为质膜H⁺-ATPase活性提高所致^[20]。

Na⁺流：对照情况下，Na⁺表现为轻微外流，且各株系相差不大。100 mmol/L NaCl处理后，各基因型幼苗Na⁺ 离子的外流均有所增强，且过表达株系(OE1和OE8)的Na⁺离子外流速度明显高于WT与VC(图 5B)。说明PeRIN4能够提高拟南芥根外排Na⁺的能力。

图  5  NaCl对拟南芥根尖H⁺、Na⁺和K⁺离子流的影响

Figure 5.  Effects of NaCl on H⁺, Na⁺ and K⁺ fluxes in arabidopsis root tips

K⁺流：对照情况下，K⁺表现为轻微内流，各株系间差异不显著，100 mmol/L NaCl处理后，各株系K⁺ 离子的流动方向由内流转为外流，然而过表达株系(OE1和OE8)K⁺ 离子外流流速均低于WT与VC(图 5C)。表明PeRIN4能够减少拟南芥根K⁺的流失。

以上实验结果说明，在高盐环境下，PeRIN4能够提高拟南芥根外排H⁺的能力。一方面可以维持较高的跨膜质子梯度，有利于激活Na⁺/H⁺逆向转运蛋白，增强Na⁺的外排；另一方面能够抑制盐诱导的去极化，从而降低去极化激活的外向型K⁺ 通道(DA-KORCs)和非选择性阳离子通道(DA-NSCCs)的活性，使得K⁺ 外流受阻，最终维持了细胞内的K⁺/Na⁺平衡，使得拟南芥更好地适应盐环境。

用两相法提取野生型(WT)、转基因(OE1和OE8)和转空载体(VC)拟南芥的质膜微囊，并测定质膜H⁺-ATPase水解ATP释放Pi的能力，由此推断H⁺-ATPase水解活性的强弱。从图 6的数据可以看出，转基因拟南芥OE1和OE8的质膜H⁺-ATPase水解活性约2倍于WT与VC，说明PeRIN4有助于提高拟南芥质膜H⁺-ATPase水解活性。此结果与活体实验中PeRIN4促进盐处理拟南芥H⁺ 离子外流的结果相一致(图 5A)，说明PeRIN4能够增强拟南芥质膜H⁺-ATPase活性，提高耐盐性。

图  6  拟南芥质膜H⁺-ATPase水解活性分析

Figure 6.  Hydrolytic activity of PM H⁺-ATPase in arabidopsis

本文从胡杨叶片中克隆得到PeRIN4基因，并将其构建到植物稳定表达载体pCAMBIA2300上，通过对转基因株系的筛选鉴定得到稳定转化的纯合子株系。在100 mmol/L NaCl处理下，拟南芥PeRIN4过表达株系对NaCl的耐受性更强，生存率和根长生长均明显高于野生型与转空载体拟南芥，说明PeRIN4基因能够提高拟南芥植株的耐盐性。本研究中，还构建了pGreen0029-PeRIN4-GFP定位载体，利用PEG介导的拟南芥叶肉细胞原生质体瞬时转化法，对PeRIN4蛋白进行亚细胞定位，结果显示PeRIN4定位于细胞质中，说明该蛋白可能在质膜内侧与质膜上的质子泵蛋白结合以调控其活性^[11]。

高盐环境会导致植物细胞的损伤和营养的匮乏，因此，在盐胁迫环境中植物维持自身的K⁺/Na⁺ 离子平衡对其应对盐胁迫至关重要^[21-22]。植物质膜H⁺-ATPase不仅能为离子转运提供能量，还能通过感知离子胁迫并调控胞内的离子平衡，对维持K⁺/Na⁺离子平衡具有重要贡献。我们发现，PeRIN4过表达拟南芥株系的质膜H⁺-ATPsae活性高于野生型和转空载体拟南芥。动态离子流的数据表明，PeRIN4过表达株系在NaCl(100 mmol/L)瞬时处理后，外排H⁺的能力要高于野生型和转空载体拟南芥。稳态Na⁺和K⁺离子流的结果也显示，PeRIN4能够促进拟南芥Na⁺离子的外排，并且抑制K⁺离子的流失，从而有利于过表达拟南芥更好地维持根系中的K⁺/Na⁺平衡。离子平衡调控的具体机制如下：

1) 质膜H⁺-ATPsae活性的提高增强了PeRIN4过表达株系H⁺泵的质子动力势，外排H⁺能力的增强，进而驱动Na⁺/H⁺逆向转运蛋白外排Na⁺ 离子，同时，还能补偿因跨膜离子流而消耗的跨膜质子梯度，为Na⁺的持续外排提供动力^[23-24]。

2) 质膜H⁺-ATPase还对减少K⁺的流失起到重要作用^[25]，这主要是因为质子泵的激活降低了质膜去极化程度，抑制了去极化激活的外向型K⁺通道(DA-KORCs)和非选择性阳离子通道(DA-NSCCs)所介导的K⁺的外流^[25-26]。

综上，质膜H⁺-ATPsae上述的两种作用最终导致Na⁺的外排和K⁺外流的减弱，实现了植物体内K⁺/Na⁺离子平衡，从而使PeRIN4过表达拟南芥株系能够更好的适应高盐环境。总之，本文从分子水平上阐明了胡杨PeRIN4在调控植物离子平衡和耐盐性中的重要作用。