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不同季节遮荫对青钱柳生长和主要次生代谢物积累的影响

邓波 尚旭兰 刘桂华 徐丹丹 方升佐

邓波, 尚旭兰, 刘桂华, 徐丹丹, 方升佐. 不同季节遮荫对青钱柳生长和主要次生代谢物积累的影响[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(9): 66-75. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170144
引用本文: 邓波, 尚旭兰, 刘桂华, 徐丹丹, 方升佐. 不同季节遮荫对青钱柳生长和主要次生代谢物积累的影响[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(9): 66-75. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170144
DENG Bo, SHANG Xu-lan, LIU Gui-hua, XU Dan-dan, FANG Sheng-zuo. Effects of shading and season on growth and accumulation of major secondary metabolites in Cyclocarya paliurus[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(9): 66-75. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170144
Citation: DENG Bo, SHANG Xu-lan, LIU Gui-hua, XU Dan-dan, FANG Sheng-zuo. Effects of shading and season on growth and accumulation of major secondary metabolites in Cyclocarya paliurus[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(9): 66-75. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170144

不同季节遮荫对青钱柳生长和主要次生代谢物积累的影响

doi: 10.13332/j.1000-1522.20170144
基金项目: 

国家自然科学基金项目 31270673

安徽农业大学引进与稳定人才项目 yj2016-03

2016年安徽农业大学省级大学生创新创业训练计划项目 201610364037

详细信息
    作者简介:

    邓波。主要研究方向:人工林定向培育。Email: 471895431@qq.com  地址:230036 安徽省合肥市蜀山区长江西路130号安徽农业大学林学与园林学院

    通讯作者:

    方升佐,教授,博士生导师。主要研究方向:人工林定向培育、植物生理生态。Email:fangsz@njfu.edu.cn  地址:210037 江苏省南京市玄武区龙蟠路159号南京林业大学林学院

  • 中图分类号: Q945;S792.99

Effects of shading and season on growth and accumulation of major secondary metabolites in Cyclocarya paliurus

  • 摘要: 青钱柳是近年来开发利用的我国特有药食同源珍稀植物,其叶中含有的活性次生代谢物对人体健康具有促进作用。探索光照条件和收获季节等环境因子对主要次生代谢物积累的影响以及生长与次生代谢物积累间关系,有助于优化药用青钱柳人工林栽培条件。该文采用遮荫处理,研究不同遮荫水平下6—11月青钱柳叶中黄酮类和三萜类化合物积累、苗高和地径生长的变化,在此基础上分析青钱柳次生代谢与生长间的关系。结果表明:中度遮荫促进了青钱柳苗的高生长,但随遮荫程度加大,地径生长不断下降。黄酮类化合物、总三萜和青钱柳甙Ⅰ的积累受到遮荫处理的抑制,而青钱柳酸B和阿江榄仁酸的含量在遮荫条件下明显高于自然光下。在自然光下,黄酮类化合物的含量在8月和10月明显高于其他季节,呈“双峰型”变化模式。但遮荫处理推迟了黄酮类物质积累的高峰。遮荫处理并未影响三萜类化合物的季节变化模式,总三萜和三萜单体的含量在不同遮荫水平下均在9月达到最大,呈“单峰型”变化模式。相关性分析结果表明,总三萜和阿江榄仁酸的积累与青钱柳生长间存在显著负相关关系。由此可见,遮荫不仅显著降低了黄酮类化合物的积累,而且推迟了其积累高峰;而三萜的季节变异模式未受遮荫影响,但不同三萜单体对光照的响应存在差异。
  • 图  1  遮荫对青钱柳苗高(a)和地径(b)的月净生长量、年总生长量的影响

    Figure  1.  Effects of shading on monthly growth rate and annual increment of tree height (a) and basal diameter (b)

    图  2  遮荫和采样季节对青钱柳黄酮类化合物积累的影响

    Figure  2.  Effects of shading and sampling time on flavonoid accumulation in leaves of C. paliurus

    图  3  遮荫和采样季节对青钱柳三萜类化合物积累的影响

    Figure  3.  Effects of shading and sampling time on triterpenoid accumulation in leaves of C. paliurus

    表  1  试验期间(6—11月)3个不同遮荫水平白天(06:00—18:00)主要环境因子的月平均值

    Table  1.   Monthly mean values of mainly environmental factors under three shading treatments during the experimental period (from June to November) at the daytime (from 06:00 to 18:00)

    环境因子
    Environmental factor
    处理
    Treatment
    6月
    June
    7月
    July
    8月
    August
    9月
    September
    10月
    October
    11月
    November
    月均光照强度Monthly PPFD/(μmol·m-2·s-1)CK403418.1518.9391.1373.6273.3
    L196.1113.3149.6115.7113.381.7
    L240.643.660.147.545.041.7
    月均空气温度Monthly mean air temperature/℃CK30.031.134.831.324.119.5
    L126.628.632.328.422.918.5
    L225.027.130.026.621.418.1
    月均相对湿度Monthly mean RH/%CK57.866.164.765.458.563.3
    L159.376.471.673.965.368.1
    L260.080.178.179.267.770.0
    注:PPFD和RH分别表示光量子通量密度、相对湿度;CK、L1、L2分别表示全光、1层遮荫和2层遮荫。下同。Notes: PPFD and RH indicate photosynthetic photon flux density and relative humidity; CK, L1, L2 indicate no shading, one-layer shading and two-layer shading, respectively. The same below.
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    表  2  遮荫、季节及2者的交互作用对青钱柳生长、黄酮和三萜积累的影响(P值)

    Table  2.   Summary of significance levels (two-way ANOVA) for the effects of shading, sampling time and their interaction on growth and the contents of flavonoid and triterpenoid in leaves of Cyclocarya paliurus (P value)

    指标
    Index
    变异来源 Variation source
    遮荫Shading季节Sampling time交互作用Interaction
    苗高Tree height<0.001<0.001<0.001
    地径Basal diameter<0.001<0.001<0.001
    总黄酮Total flavonoid<0.001<0.0010.215
    槲皮素Quercetin<0.001<0.001<0.001
    异槲皮苷Isoquercitrin<0.001<0.001<0.001
    山奈酚Kaempferol<0.001<0.001<0.001
    总三萜Total triterpenoid<0.001<0.0010.045
    青钱柳酸B Cyclocaric acid B<0.001<0.001<0.001
    青钱柳甙Ⅰ Cyclocarioside Ⅰ<0.001<0.001<0.001
    阿江榄仁酸Arjunolic acid<0.001<0.001<0.001
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    表  3  青钱柳叶黄酮和三萜含量与生长速率间的相关分析(n = 18)

    Table  3.   Pearson correlation coefficients between the contents of leaf flavonoid and triterpenoid and growth rate (n=18)

    项目
    Item
    苗高
    Tree height
    地径
    Basal diameter
    总黄酮Total flavonoid0.0110.31
    槲皮素Quercetin0.234-0.168
    异槲皮苷Isoquercitrin-0.150.418
    山奈酚Kaempferol0.0740.451
    总三萜Total triterpenoid-0.497*-0.223
    青钱柳酸B Cyclocaric acid B-0.209-0.179
    青钱柳甙Ⅰ Cyclocarioside Ⅰ-0.2270.174
    阿江榄仁酸Arjunolic acid-0.473*-0.470*
    注:*表示在0.05水平上显著相关(P<0.05)。Note: * indicates correlation is significant at P<0.05 level.
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出版历程
  • 收稿日期:  2017-04-19
  • 修回日期:  2017-05-31
  • 刊出日期:  2017-09-01

不同季节遮荫对青钱柳生长和主要次生代谢物积累的影响

doi: 10.13332/j.1000-1522.20170144
    基金项目:

    国家自然科学基金项目 31270673

    安徽农业大学引进与稳定人才项目 yj2016-03

    2016年安徽农业大学省级大学生创新创业训练计划项目 201610364037

    作者简介:

    邓波。主要研究方向:人工林定向培育。Email: 471895431@qq.com  地址:230036 安徽省合肥市蜀山区长江西路130号安徽农业大学林学与园林学院

    通讯作者: 方升佐,教授,博士生导师。主要研究方向:人工林定向培育、植物生理生态。Email:fangsz@njfu.edu.cn  地址:210037 江苏省南京市玄武区龙蟠路159号南京林业大学林学院
  • 中图分类号: Q945;S792.99

摘要: 青钱柳是近年来开发利用的我国特有药食同源珍稀植物,其叶中含有的活性次生代谢物对人体健康具有促进作用。探索光照条件和收获季节等环境因子对主要次生代谢物积累的影响以及生长与次生代谢物积累间关系,有助于优化药用青钱柳人工林栽培条件。该文采用遮荫处理,研究不同遮荫水平下6—11月青钱柳叶中黄酮类和三萜类化合物积累、苗高和地径生长的变化,在此基础上分析青钱柳次生代谢与生长间的关系。结果表明:中度遮荫促进了青钱柳苗的高生长,但随遮荫程度加大,地径生长不断下降。黄酮类化合物、总三萜和青钱柳甙Ⅰ的积累受到遮荫处理的抑制,而青钱柳酸B和阿江榄仁酸的含量在遮荫条件下明显高于自然光下。在自然光下,黄酮类化合物的含量在8月和10月明显高于其他季节,呈“双峰型”变化模式。但遮荫处理推迟了黄酮类物质积累的高峰。遮荫处理并未影响三萜类化合物的季节变化模式,总三萜和三萜单体的含量在不同遮荫水平下均在9月达到最大,呈“单峰型”变化模式。相关性分析结果表明,总三萜和阿江榄仁酸的积累与青钱柳生长间存在显著负相关关系。由此可见,遮荫不仅显著降低了黄酮类化合物的积累,而且推迟了其积累高峰;而三萜的季节变异模式未受遮荫影响,但不同三萜单体对光照的响应存在差异。

English Abstract

邓波, 尚旭兰, 刘桂华, 徐丹丹, 方升佐. 不同季节遮荫对青钱柳生长和主要次生代谢物积累的影响[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(9): 66-75. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170144
引用本文: 邓波, 尚旭兰, 刘桂华, 徐丹丹, 方升佐. 不同季节遮荫对青钱柳生长和主要次生代谢物积累的影响[J]. 北京林业大学学报, 2017, 39(9): 66-75. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170144
DENG Bo, SHANG Xu-lan, LIU Gui-hua, XU Dan-dan, FANG Sheng-zuo. Effects of shading and season on growth and accumulation of major secondary metabolites in Cyclocarya paliurus[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(9): 66-75. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170144
Citation: DENG Bo, SHANG Xu-lan, LIU Gui-hua, XU Dan-dan, FANG Sheng-zuo. Effects of shading and season on growth and accumulation of major secondary metabolites in Cyclocarya paliurus[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2017, 39(9): 66-75. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170144
  • 青钱柳(Cyclocarya paliurus)是我国特有的药食同源珍稀植物,研究表明其叶片中含有大量有益人体健康的生理活性物质,包括黄酮类和三萜类[1-2]。由于自然资源稀少,且主要分布于自然保护区中,目前主要以发展人工林为主。而随着青钱柳产业化的推进,在栽培上以获取主要次生代谢产物为目标的培育措施和调控技术成为药用青钱柳人工林发展的必然要求。

    作为一种木本药用植物,青钱柳的生长和次生代谢物积累是我们需要关注的两个方面,因为生长是产量形成的基础,而次生代谢物的积累量是原料品质的重要保证。但目前关于环境条件对青钱柳生长和次生代谢物积累(尤其是三萜)方面的研究和报道较少。根据已有研究,许多环境因子都对次生代谢有重要影响,其中光照条件被认为是与植物发育及次生代谢关系最为密切的环境因子之一[3-4]。如遮荫处理显著提高了喜树中喜树碱的含量[5]。而且由于植物次生代谢物在提高植物抗逆性和协调与环境关系上的重要作用,它们的合成和积累与初级代谢产物相比更易受到环境条件的影响[6-7]。因此,可通过栽培措施对药用植物产量和品质进行调控。另外,对于植物次生代谢与光照强度间的关系,之前的研究已经进行了一些报道。碳素/营养平衡假说认为在养分充足的条件下,遮荫使光合作用受到抑制,植物体内的C/N下降,从而以C为基础的酚类(包括黄酮类化合物)、萜烯类物质减少[8]

    许多研究还发现收获季节对药用植物的化学成分和产量具有重要影响。Fang等[9]发现青钱柳中黄酮类化合物的积累高峰为7月和10月。多年生饲料作物苜蓿中的三萜类物质的含量同样受到收割季节的明显影响,从而影响其可饲性[10]。综上所述,非生物环境和发育阶段等因子都会对植物的生长和次生代谢物合成和积累产生影响。青钱柳作为一个木本药用树种,收获的主要部位为叶片。在生产实践中,我们关心的不仅是目标次生代谢产物在植物组织中的含量,还需要知道在一个特定环境条件中植物的生长状况。因此,通过评价光照条件和采收季节对青钱柳生长和主要次生代谢产物积累的影响,可以加深环境条件与青钱柳次生代谢关系的认识,还可以为确定药用青钱柳最佳栽培条件及采样期提供理论依据,以改善原料品质。

    • 试验地位于江苏镇江扬子江苗圃基地,其地理坐标为32°16′40″ N、119°32′52″ E。该地属北亚热带湿润季风区,雨热同季,光照和热量充足。年均温度为14.1 ℃,年降水量为1 000~1 100 mm,且主要集中在6—9月,占全年降雨量的60%左右,无霜期为220 d;土壤类型为砂壤土,有机质含量为1.77%,水解氮、有效磷、速效钾含量分别为77、14.9、132.6 mg/kg[9]

    • 2009年10月从天然林中收集不同地理种源的青钱柳种子,并将从四川沐川(28°58′ N,103°47′ E)单株采种的种子作为本次试验的试材。这些种子经自然风干、脱种翅等处理后,首先进行酸蚀,然后分别用赤霉素(GA3)浸泡、低温层积以打破其休眠[11]。层积大约3个月后,将萌芽的幼苗移栽到塑料杯中。待幼苗高约6 cm时再次移栽到位于镇江苗圃的苗床上,株行距为40 cm×40 cm。

      2010年6月将苗床上的青钱柳苗移栽到试验地中,株行距为40 cm×50 cm。次年3月将所有植株地上3 cm以上的部分进行截杆,以进行矮化管理。当年4月开始进行遮荫处理,试验包括:1)全光(CK);2)遮阳网遮1层(L1);3)遮阳网遮2层(L2)。试验重复3次,共9个试验单元,每个试验单元20株青钱柳苗。遮阳网为黑色的聚乙烯材料,放置于地面之上约2 m的位置。试验期间,每个试验处理的光照强度用农业气象监测仪(TNHY系列,浙江托普仪器公司)进行实时监测,同时记录空气的温度和湿度。光量子通量密度每30 min采集1次,而空气温湿度每10 min采集1次数据。除遮荫处理和每月1次的人工除草外,未对青钱柳苗进行额外水肥管理。

    • 按常规方法于5月中旬开始对各试验单元中所有青钱柳植株的苗高和地径生长进行测定,最后计算各试验单元的平均树高和地径生长状况。以后每月中旬进行重复调查,直至生长基本停止的11月中旬。

    • 每月测定生长指标后,按照混合采样法从试验单元中的青钱柳植株中上部采集完全功能叶。6月中旬第1次采集,直至11月,共进行6次采样。采集的样品经去叶柄、烘干、磨碎后密封后保存在0~4 ℃冷库。

    • 每个植物样品称取约2 g左右,用滤纸包好后放入250 mL索氏提取器并用石油醚在80 ℃水浴锅中回流提取4 h,以去除叶样品中极性较小的脂溶性成分。丢弃提取液将药渣在室温下自然晾干,挥干后的药渣作为黄酮和三萜提取的样品。本试验采用超声波辅助提取法[12]。用75%乙醇水溶液在65 ℃条件下超声提取45 min,在同样条件下提取2次,并将两次提取液合并。合并后的提取液挥至近干,再以甲醇反复清洗残渣并定容至10 mL作为总黄酮和总三萜测定的样品。

      总黄酮的测定参照Bao等[13]所描述的优化后的比色法进行测定。精密吸取1 mL提取液置于10 mL容量瓶,加入0.3 mL 5% NaNO2溶液,在室温下放置5 min后加入0.3 mL 1%的AlCl3甲醇溶液,而后加入1 m NaOH溶液混匀并在室温下显色15 min,最后在410 nm处测定吸光度。提取液中总黄酮含量以芦丁标准品(中国药品生物制品检定所,北京)为对照品进行计算(线性范围为:2.2~56.0 μg/mL,R2>0.99),最后以每克青钱柳叶干样品中含有相当于芦丁当量的毫克数表示。

      黄酮单体采用HPLC-DAD法测定,共测定3个单体:槲皮素、异槲皮苷和山奈酚。在进入高效液相分析前,所有待测样品过0.45 μm有机滤膜。本试验采用Agilent 1200系列液相色谱(Waldbronn,德国)进行分析,其中异槲皮苷采用梯度洗脱,洗脱程序为(A-色谱纯甲醇,B-0.5%磷酸):0~25 min,15% A;15~26 min,15%~90% A;26~36 min,90% A;36~37 min,90%~15% A;37~45 min,15% A。检测波长为350 nm,柱温和流动相流速分别为30 ℃,1.0 mL/min。而槲皮素和山奈酚则参照《中华人民共和国药典》(2010)有关银杏黄酮水解的方法,将提取液用酸水解为苷元后测定。取1 mL提取液于广口瓶中,挥干溶剂,残渣中加入25 mL体积比为4:1的甲醇-25% HCL,加热回流30 min,冷却后定容至25 mL。槲皮素和山奈酚检测的流动相为A-色谱纯甲醇,B-0.3%磷酸,采用VA:VB=55:45等度洗脱。检测波长为365 nm,柱温和流动相流速与异槲皮苷检测条件相同。试验中用于获得外标校准曲线的异槲皮苷购自中国药品生物制品检定所(北京),槲皮素和山奈酚购自Sigma-Aldrich公司(St. Louis,MO,USA)。

    • 参照Fan等[14],采用比色法测定青钱柳叶中的总三萜含量。精密吸取0.5 mL提取液,于60 ℃水浴中挥干溶剂,分别加入0.5 mL 5%香草醛-冰醋酸和1.4 mL高氯酸,置70 ℃水浴中显色15 min,冷却后转移至10 mL容量瓶,用乙酸乙酯反复清洗并定容,摇匀后在560 nm处测定吸光度。样品中总三萜含量以齐墩果酸(中国药品生物制品检定所,北京)标准品为对照品进行计算(线性范围为:3.8~24.6 μg/mL,R2>0.99),最后以每克青钱柳叶干样品中含有相当于齐墩果酸当量的毫克数表示。

      本试验选择测定的三萜单体包括青钱柳酸B、青钱柳甙Ⅰ和阿江榄仁酸。以Waters 2695 Alliance (Waters Crop. Milford,American)高效液相系统测定它们的含量。青钱柳酸B用UVD 2996二极管阵列检测器检测,检测波长为210 nm,流动相为A-色谱纯甲醇,B-0.5%磷酸。梯度洗脱程序为:0~16 min,20%~70% A;16~20 min,70%~90% A;20~32 min,90% A;32~37 min,90%~20% A;37~47 min,20% A。而青钱柳甙Ⅰ和阿江榄仁酸的定量用2424 ELSD检测,流动相为A-色谱纯甲醇,B-0.3%冰乙酸。梯度洗脱程序为:0~20 min,20%~90% A;20~35 min,90%~90% A;35~37 min,90%~20% A;37~45 min,20%~20% A。漂移管的温度为60 ℃,氮气流速为2.4 L/min。试验中用于获得外标校准曲线的青钱柳酸B和青钱柳甙Ⅰ由南京中医药研究所张建教授实验室提供,阿江榄仁酸购自云南西力生物制药有限公司(昆明)。

    • 本试验以双因素方差分析结果来比较遮荫、季节以及二者的交互作用对青钱柳生长和代谢等相关数量指标的影响;以Duncan’s多重比较来分析处理之间的差异。次生代谢产物含量与青钱柳生长速率间的关系及整个生长期内次生代谢产物含量与环境因子间的关系采用Pearson相关系数分析法。所有统计数据均由SPSS进行分析(version 16.0,SPSS Inc. Chicago,IL,USA),分析结果表示在95%的置信水平上的显著水平。

    • 遮荫处理使微气候环境受到影响,其中主要包括光照强度、空气温度和相对湿度等。试验期间(6—11月)实时记录了上述环境因子每天的变化情况,然后分别统计每日白天(06:00—18:00)的平均值,最后计算出每月白天的平均值(表 1)。

      表 1  试验期间(6—11月)3个不同遮荫水平白天(06:00—18:00)主要环境因子的月平均值

      Table 1.  Monthly mean values of mainly environmental factors under three shading treatments during the experimental period (from June to November) at the daytime (from 06:00 to 18:00)

      环境因子
      Environmental factor
      处理
      Treatment
      6月
      June
      7月
      July
      8月
      August
      9月
      September
      10月
      October
      11月
      November
      月均光照强度Monthly PPFD/(μmol·m-2·s-1)CK403418.1518.9391.1373.6273.3
      L196.1113.3149.6115.7113.381.7
      L240.643.660.147.545.041.7
      月均空气温度Monthly mean air temperature/℃CK30.031.134.831.324.119.5
      L126.628.632.328.422.918.5
      L225.027.130.026.621.418.1
      月均相对湿度Monthly mean RH/%CK57.866.164.765.458.563.3
      L159.376.471.673.965.368.1
      L260.080.178.179.267.770.0
      注:PPFD和RH分别表示光量子通量密度、相对湿度;CK、L1、L2分别表示全光、1层遮荫和2层遮荫。下同。Notes: PPFD and RH indicate photosynthetic photon flux density and relative humidity; CK, L1, L2 indicate no shading, one-layer shading and two-layer shading, respectively. The same below.

      随着遮荫程度的加深,光照强度急剧下降,整个试验期间(6—11月),全光、1层和2层遮荫条件下白天的平均光照强度分别为396.3、111.6和46.4 μmol/(m2·s)。在全光条件下,8月白天的月平均光照强度最大(518.9 μmol/(m2·s)),其次是6月和7月,从9—11月光照强度呈直线下降趋势。其他遮荫处理下的光量子通量密度均呈现相似的月动态变化规律。试验期间,遮荫还直接影响了空气温度,白天的空气温度与光照强度在不同遮荫处理间以及不同月份间都呈相似的变化规律,全光、1层和2层遮荫下白天空气温度的总平均值分别为28.5、26.2、24.7 ℃。然而,白天空气相对湿度对遮荫处理的响应与光照强度和空气温度对遮荫处理的响应相反,试验期间全光、1层和2层遮荫下白天的空气相对湿度分别为62.6%、69.1%、72.5%。

    • 2011年3—11月青钱柳植株的苗高月生长动态见图 1a。不同遮荫水平下的青钱柳苗具有相似的生长节律,5—8月是青钱柳苗高的旺盛生长期,该期间的生长量占年总生长量的72%以上。其中,6—7月的苗高生长速率最快,其后依次为7—8月、5—6月、3—5月、8—9月、9—10月,10月中旬以后青钱柳的苗高生长基本停止。轻度遮荫促进了青钱柳苗的高生长,其年总生长量达241.2 cm,但两层遮荫下青钱柳苗的高生长受到抑制,年生长量仅为105.0 cm(图 1a)。地径与苗高具有相似的生长节律,但二者又存在一些差异(图 1b)。地径的旺盛生长期较苗高生长要长,5—9月青钱柳苗地径生长较高,占年生长量的80%以上。另外,随着遮荫程度的不断提高,地径年生长量不断下降。方差分析结果表明,遮荫、季节及二者的交互作用均对苗高和地径的年生长量产生了显著的影响(P<0.001,表 2)。因此,光照条件的改变对青钱柳的生长和初级生产力都可能产生重要影响。

      图  1  遮荫对青钱柳苗高(a)和地径(b)的月净生长量、年总生长量的影响

      Figure 1.  Effects of shading on monthly growth rate and annual increment of tree height (a) and basal diameter (b)

      表 2  遮荫、季节及2者的交互作用对青钱柳生长、黄酮和三萜积累的影响(P值)

      Table 2.  Summary of significance levels (two-way ANOVA) for the effects of shading, sampling time and their interaction on growth and the contents of flavonoid and triterpenoid in leaves of Cyclocarya paliurus (P value)

      指标
      Index
      变异来源 Variation source
      遮荫Shading季节Sampling time交互作用Interaction
      苗高Tree height<0.001<0.001<0.001
      地径Basal diameter<0.001<0.001<0.001
      总黄酮Total flavonoid<0.001<0.0010.215
      槲皮素Quercetin<0.001<0.001<0.001
      异槲皮苷Isoquercitrin<0.001<0.001<0.001
      山奈酚Kaempferol<0.001<0.001<0.001
      总三萜Total triterpenoid<0.001<0.0010.045
      青钱柳酸B Cyclocaric acid B<0.001<0.001<0.001
      青钱柳甙Ⅰ Cyclocarioside Ⅰ<0.001<0.001<0.001
      阿江榄仁酸Arjunolic acid<0.001<0.001<0.001
    • 青钱柳叶中的黄酮含量(包括总黄酮和3个黄酮单体:槲皮素、异槲皮苷和山奈酚)受到遮荫、收获季节的明显影响(图 2)。其中,最主要的黄酮单体为异槲皮苷,其变异范围为0.07~4.19 mg/g,其次为山奈酚(0.06~3.24 mg/g)和槲皮素(0.04~1.51 mg/g),而总黄酮在处理间的变异范围为19.5~53.0 mg/g。遮荫处理使青钱柳叶中的总黄酮及黄酮单体含量均显著下降,但1层遮荫和2层遮荫下,黄酮含量并无显著差异(图 2表 2)。如10月份1层遮荫下青钱柳叶片中的总黄酮、槲皮素、异槲皮苷和山奈酚平均含量仅为全光下的59.7%、25.0%、20.6%和32.8%。由此可知,遮荫处理引起的环境条件的变化抑制了青钱柳叶中黄酮类化合物的积累。

      图  2  遮荫和采样季节对青钱柳黄酮类化合物积累的影响

      Figure 2.  Effects of shading and sampling time on flavonoid accumulation in leaves of C. paliurus

      另外,青钱柳叶中的黄酮类化合物在不同季节也发生的显著的变异(图 2表 2)。6—11月,总黄酮和黄酮单体的含量在全光下均呈现“双峰型”的变化模式。含量最高的月份为8月和10月,这两个月青钱柳叶中的黄酮含量较其他月份高。而在青钱柳旺盛生长的前期(6月和7月)及生长后期(11月)黄酮含量较低。8—10月的总黄酮、槲皮素、异槲皮苷和山奈酚的含量较其他月份平均高出31.7%、65.1%、74.3%和69.3%。然而遮荫处理使黄酮含量的季节变化动态发生了一定的变化。其中,槲皮素的含量在遮荫条件下从6—11月呈现直线增长模式(图 2b)。总黄酮的含量在1层遮荫下在9月达到峰值,随后开始下降(图 2a)。同样,异槲皮苷和山奈酚的含量在1层遮荫下在9月达到最高,而在两层遮荫下在10月达到最高,总体表现为“单峰型”变化模式(图 2a2c2d)。此外,我们还可以发现,随遮荫强度的加大,青钱柳叶中黄酮类物质积累的高峰发生推迟。总之,青钱柳叶中的黄酮类化合物的积累呈现明显的季节变异模式,而且遮荫可以改变黄酮类化合物的季节变异模式。

    • 青钱柳叶中三萜类化合物的积累也受到遮荫、收获季节的显著影响(P<0.001,表 2)。在检测的三萜单体中主要的三萜类化合物为阿江榄仁酸,其变异范围为0.00~5.99 mg/g,其后依次为青钱柳甙Ⅰ(0.35~3.67 mg/g)和青钱柳酸B(0.05~2.91 mg/g)(图 3)。总三萜在处理间的变异范围为13.2~40.7 mg/g dm。与黄酮类化合物相比,不同的三萜类物质对遮荫的响应并不一致。总黄酮和青钱柳甙Ⅰ的含量在全下高于遮荫条件下,但在6月、7月和11月与遮荫条件下的差异并不显著。另外两个三萜单体青钱柳酸B和阿江榄仁酸的含量对遮荫的响应则完全相反,在三萜积累的高峰期(7—11月)遮荫处理促进了它们在青钱柳叶中的积累,而重度遮荫下的含量又低于中度遮荫下。因此,黄酮与三萜及不同三萜类单体化合物对遮荫引起的环境变化的响应存在差异。

      图  3  遮荫和采样季节对青钱柳三萜类化合物积累的影响

      Figure 3.  Effects of shading and sampling time on triterpenoid accumulation in leaves of C. paliurus

      总三萜和三萜单体含量的季节变化动态如图 3所示。在不同的遮荫水平下,三萜积累具有相似的季节变化动态,含量均在9月达到最大,呈现“单峰型”的变化模式。总三萜、青钱柳酸B、青钱柳甙Ⅰ和阿江榄仁酸在9月的平均含量与其他月份相比,分别高出56.9%、191.1%、166.5%和168.6%。另外,总三萜和青钱柳甙Ⅰ的含量在7月最低,其中青钱柳甙Ⅰ的含量在9月后迅速下降,而总三萜在该时期含量变化较小(图 3ac)。但另外两个五环三萜青钱柳酸B和阿江榄仁酸在6月的含量极低,其中我们未在6月采集的青钱柳叶中发现阿江榄仁酸的积累(图 3bd)。从6—9月,青钱柳酸B和阿江榄仁酸的含量呈直线上升,之后又迅速下降。综上所述,遮荫仅仅影响到三萜在青钱柳叶中的积累量,但并未影响到季节的变化动态。

    • 在得到不同遮荫水平下青钱柳的苗高和地径生长节律、黄酮和三萜类化合物季节变化动态的基础上,进一步分析青钱柳次生代谢物积累与生长间的关系,结果见表 3。其中,苗高和地径生长与青钱柳中黄酮类化合物的积累无明显关系,相关分析结果都不显著。而三萜类化合物与生长间均呈负相关,其中总三萜和阿江榄仁酸的积累与苗高生长间的相关性达到显著水平(P<0.05),分别为-0.497和-0.473(n=18)。另外,阿江榄仁酸的积累还与地径生长间呈显著负相关关系(P<0.05)。因此,在青钱柳中的两类次生代谢产物中,三萜类化合物与生长间的关系更为紧密。

      表 3  青钱柳叶黄酮和三萜含量与生长速率间的相关分析(n = 18)

      Table 3.  Pearson correlation coefficients between the contents of leaf flavonoid and triterpenoid and growth rate (n=18)

      项目
      Item
      苗高
      Tree height
      地径
      Basal diameter
      总黄酮Total flavonoid0.0110.31
      槲皮素Quercetin0.234-0.168
      异槲皮苷Isoquercitrin-0.150.418
      山奈酚Kaempferol0.0740.451
      总三萜Total triterpenoid-0.497*-0.223
      青钱柳酸B Cyclocaric acid B-0.209-0.179
      青钱柳甙Ⅰ Cyclocarioside Ⅰ-0.2270.174
      阿江榄仁酸Arjunolic acid-0.473*-0.470*
      注:*表示在0.05水平上显著相关(P<0.05)。Note: * indicates correlation is significant at P<0.05 level.
    • 光照条件是影响植物生长发育、生理代谢、形态建成的重要环境因子。本试验中,中度遮荫促进的青钱柳的高生长,但遮荫抑制了地径生长。另外,遮荫也影响了青钱柳活性次生代谢产物的积累,从而影响叶片的品质或利用价值。之前已经有很多研究发现,黄酮类和萜类等植物次生代谢产物的合成和积累受光照、水分、土壤养分、发育时期等多种生物因子与非生物因子的广泛影响[15-18]。在本试验中,遮荫处理抑制了青钱柳叶中黄酮类化合物的积累(图 2),这一结果与我们之前得到的结果一致[19]。Cronin等[20]也发现自然光下两种淡水植物体中的酚类物质的含量较遮荫条件下高72%。黄酮类物质在植物体内具有重要的生态功能,其中最重要的功能就是作为抗氧化物质,保护植物组织不受自由基的破坏,吸收太阳辐射中的紫外线等[21-24],因此,它的含量与组成受到光强和紫外辐射的调节[22]。还有一些研究发现生长于自然光下的越桔(Vaccinium myrtillus),编码苯丙氨酸解氨酶、查耳酮合酶以及黄烷酮-3-β-羟化酶的基因表达量增加,使其叶中的槲皮素和山奈酚含量上升[25]。另外,也有研究表明紫外照射使黄酮合成相关酶的基因表达量、蛋白质含量及酶活性上升,最终使黄酮的积累量增大[26-27]。这些研究都表明强光照对黄酮的合成与积累具有促进作用。碳素/营养平衡假说也认为,光照条件的限制将会使以碳为基础的植物次生代谢产物的含量减少,如黄酮类和三萜类[28]。相应的,目前的研究中也发现全光条件下青钱柳叶中积累了更多的黄酮,这也证明了他们在光保护机制中所发挥的作用。

      萜类化合物是一类重要的次生代谢产物,在植物中它们常见于被子植物,在一些蕨类植物中也有发现[29]。但目前对其开展的研究较少,对它们的生态功能、生物合成途径以及环境因子对它们的调控机理都还不是十分清楚。据我们所知,目前还没有关于田间条件下环境因子对青钱柳中三萜类化合物积累影响的研究和报道。本试验中,遮荫处理也对青钱柳总三萜和三萜单体青钱柳酸B、阿江榄仁酸的含量产生了显著影响。Houle等[30]发现生长于树冠顶部的成熟阿比希尼亚柿(Diospyros abyssinica)果实中的三萜皂苷比下部低将近2倍,这些三萜皂苷(桦木醇和桦木脂酸)具有潜在的毒性,因而影响到果实的品质。Fournier等[31]也发现生长于较低光照强度(光量子通量密度不大于自然光下的35%)下的西洋参,通过延长光照时间可以使一年生和两年生西洋参中的人参皂苷含量分别提高48%和62%。如果使光照强度增大,不仅使光合作用受到抑制,还使西洋参中的人参皂苷的合成和积累量减少。这也进一步证实了三萜皂苷的合成和积累与植物本身的光合代谢密切相关。此外,本试验中,除总三萜和青钱柳甙Ⅰ的积累受到遮荫抑制外,另外两个三萜单体青钱柳酸B和阿江榄仁酸的含量均在自然光下最低(图 3)。Shimoyamada等[32]也发现,在发芽的大豆(Glycine max)种子中,处于白天-黑夜交替过程种子中的萜类化合物含量较完全黑暗中的高,但不同萜类化合物响应模式并不一致,这一结果与我们目前的结论基本一致。这也表明,不同类型的萜类物质的合成和积累对光照条件的响应存在差异。本试验所测试的三萜单体中,青钱柳酸B和阿江榄仁酸为齐墩果烷型五环三萜,而青钱柳甙Ⅰ为达玛烷型四环三萜。这两类三萜物质拥有共同的合成前体物质2, 3-氧鲨烯,但有不同的合成路径[33]。但环境因子对不同三萜化合物合成影响的机制还需要进一步研究。

      收获季节也是影响活性次生代谢物积累及青钱柳叶片质量的重要影响因子。在之前的研究中,Fang等[9]发现从6月至10月,青钱柳黄酮在7月和10月的含量明显高于其他月份,呈现双峰变化的时间模式,这与我们目前所得到的结果基本一致。但本试验中,从6至11月,在全光条件下8月和10月是黄酮积累的高峰期。在18年生核桃叶(Juglans regia)中,Amaral等[34]发现黄酮和酚酸的含量在5月最高,而且从5—9月呈直线下降趋势。但在遮荫条件下,青钱柳叶黄酮积累的变化模式与全光下相比发生了巨大变化,总体上黄酮积累的高峰期在不同程度上发生推迟。据我们所知,目前没有进行相关遮荫与采样时间的交互作用对黄酮积累影响的研究。在生长期内,随着收获时间的推迟,也伴随着植物叶片的生理老化,这将使植物组织中的自由基水平提高[35]。作为一种植物保护性物质或抗氧化剂,黄酮含量的增加可以更好的保护植物组织不被自由基所损伤[18, 36]。Schmidt等[17]发现从10月到次年1月,随着收获季节的推迟,甘蓝叶中的槲皮素及槲皮素山奈酚含量比都增大了。另外,Camargo等[37]认为光照是影响植物物候发展的关键环境因子。本试验中,黄酮单体积累高峰的推迟,可能意味着遮荫处理推迟了青钱柳叶片的生理老化速度。

      三萜含量随采样时间的推移也发生了明显的变异。遮荫水平除对三萜的含量产生影响外,并未对三萜积累的季节动态产生影响。Alqahtani等[38]发现澳大利亚积雪草中的总三萜含量在夏季更高,而在冬季较低,这与我们目前的结果基本一致。Tava等[39]也指出收获季节和生理状况是影响紫花苜蓿(Medicago sativa)中三萜皂苷含量主要因子。通过监测生长期苜蓿中两种含量最多的三萜皂苷(medicagenic acid, zanhic acid)的含量,他发现medicagenic acid的含量从春季至夏季直线上升,然后从夏季到秋季又开始下降。而zanhic acid的含量从春季至秋季一直上升,并在夏末和秋季达到最高。在另外一个研究中,也发现苜蓿中三萜皂苷的含量在初春和夏季中期最低[40]。这些研究都是针对三萜在饲料作物中积累的变化从而提出合理的采收季节,避免过高含量的三萜皂苷可能对动物造成的毒害。最近,还有一些针对以三萜皂苷为主要活性成分的药用植物的研究,以确定采收期、提高药材质量[41-42]。总之,光照条件、发育时期都会影响黄酮类和三萜类物质的积累。因此,在青钱柳人工林培育过程中,系统研究立地条件、培育措施和采样季节对青钱柳生长或单位面积上青钱柳叶产量、重要次生代谢物积累的影响,从而为药用青钱柳筛选出优化的定向培育模式至关重要。

      植物的初级代谢与次生代谢紧密相连,初生代谢为次生代谢提供了原料[43]。最佳防御假说认为植物次生代谢产物的产生是以减少植物生长的机会成本为代价的[44-45]。目前,已经有多个假说被提出用以解释植物的生长与次生代谢间的这种取舍平衡的关系[8]。本试验中,总三萜和阿江榄仁酸与生长间呈显著负相关,其他三萜单体与生长则无显著相关性(表 3)。之前有研究也指出由于不同树种间生长节律的差异,而可能导致得到正的或负的生长与次生代谢物积累的相关关系[46]。另外,在整个较长的年生长期内,植物次生代谢产物的积累同时受到环境因子(包括生物与非生物)和自身生理状况的影响,环境条件与发育时期的交互作用可能使某些植物次生代谢的积累难以被预测。但本试验结果表明,青钱柳的生长与次生代谢物积累间关系较弱。关于植物次生代谢与初级代谢间的关系,有待于从植物生理生化及基因表达等方面进行深入研究。

      综上所述,遮荫处理显著影响了环境中的光照强度、空气温度和相对湿度,并进一步影响了青钱柳的苗高和地径生长、黄酮类和三萜类化合物的积累,但不同次生代谢物对光照的响应存在差异。另外,从6—11月,遮荫不仅降低了黄酮类化合物的积累量,还推迟了其积累高峰期,但三萜类物质积累的季节变异模式未受遮荫影响。而关于不同三萜单体对光照的响应,以及次生代谢与初级代谢间的关系还需进行深入研究。

参考文献 (46)

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