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樟子松(Pinus sylvestris var. mongolica)是欧洲赤松分布至远东地区的一个地理变种[1-2]，具有耐旱、耐寒、耐贫瘠、生长迅速等特点，是重要的防护林和用材林树种[3]。樟子松天然林分布范围小，主要位于大兴安岭北部主脊到阿尔山地区；呼伦贝尔沙地北起锡尼河沿伊敏河、浑河，经红花尔基、脑滚诺多，向南一直分布到哈拉哈河沿岸[4-5]。樟子松的遗传改良工作开始于20世纪50年代，1953年辽宁省章古台地区开展了樟子松固沙造林研究，并取得成效，为樟子松的引种工作提供了依据[6]；随后黑龙江错海[7]、陕西榆林[8]、河北围场[9]、吉林净月潭[10]、山西北部[11]等13个省(自治区)300多个县(旗)成功进行了樟子松引种栽培，并在黑龙江、吉林、辽宁、榆林等地[12]建立了大面积的初级无性系种子园；黑龙江[13]、吉林[14]等地开展的杂交育种工作也获得了大量育种资源。目前樟子松正进入高改良周期遗传改良阶段，但是不同地区樟子松育种资源调拨与交换频繁的现状，导致了育种资源信息不明确、亲缘关系混乱，增加了高改良周期种子园近交衰退现象的风险。
保持较高的遗传增益和维持一定的遗传多样性是种子园良种生产的最重要的两个方面。遗传多样性决定了良种的环境适应能力，是维持森林长期稳定的基础[15]。杂合度、近交系数等遗传参数可以体现群体的近交水平[16]，种子园无性系近交会显著导致种子产量和品质下降[17]。火炬松(Pinus teada)中，近交子代的树高和材积较平均水平分别有21%和33%的下降[18]；近交同样会使欧洲赤松(Pinus sylvestris)花粉败育率达到75.4%~86.5%[19]；近交系数F为0.75的海岸松(Pinus pinaster)群体在树高、胸径、树干通直度、球果数量方面分别出现了27%、37%、23%、89%的近交衰退[20]；近交系数F达到0.25的白皮松群体的平均预期生长量会下降19.6%[21]。通过分子标记技术估算育种资源的遗传多样性参数、明确其亲缘关系，是降低近交概率、提高种子园种子产量、增加子代遗传增益的可靠保证。
内蒙古红花尔基樟子松国家良种基地位于樟子松天然林分布区内。2009年以来该基地收集了当地樟子松第1代育种资源108份，榆林1.5代樟子松种子园育种资源28份，以及错海、榆林、泰来第2代育种资源88份。由于不同生境樟子松育种资源相互调拨和交换频繁，导致新一轮种子园营建的材料亲缘关系、遗传多样性不明确等问题。本研究以该良种基地不同世代樟子松育种资源为例，利用SSR标记技术分析樟子松育种资源的遗传多样性参数以及遗传差异情况，并明确樟子松优良单株间的亲缘关系。以期为樟子松高改良周期种子园营建提供育种资源评价信息，以促进分子标记在樟子松遗传改良工作中的应用。
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实验材料选取红花尔基良种基地1、1.5、2代樟子松种子园建园无性系当年生针叶3~5针。224株育种资源的最初种源地均为红花尔基，其中榆林、错海、泰来地区的樟子松为20世纪60、70年代从红花尔基引种种植的，并建立了初级种子园，以及后来的子代测定林等，属于同种源、不同生境的樟子松群体。2015年红花尔基林业局采集了本地天然林的部分育种资源，同时还回调了上述3个地区初级种子园、子代测定林内的育种资源，共计224株建立了不同世代的樟子松种子园。1代种子园的建园群体来源于当地良种基地、头道桥、宝根园、巴日图、红林场5个天然林分的108株优树；1.5代种子园的建园群体来源于榆林初级种子园中所筛选的28株优树；2代种子园的建园群体来源于错海、泰来、榆林初级种子园子代林的88株优树(表 1)。
表 1 实验材料信息
Table 1. Experimental material information
种子园
Seed orchard材料来源
Material source数量
Quantity1st 良种基地LiangZhongJiDi(LZJD) 57 头道桥TouDaoQiao(TOU) 15 宝根园BaoGenYuan(BAO) 11 巴日图BaRiTu(BA) 11 红林场HongLinChang(HONG) 14 1.5th 榆林YuLin1.5(YL1.5) 28 2nd 错海CuoHai(CH) 34 泰来TaiLai(TL) 33 榆林YuLin2(YL2) 21 -
采用传统的CTAB法提取樟子松的基因组DNA[22]。PCR反应体系总体积21 μL, 包含1 μL基因组DNA，0.3 μL上游引物，1 μL下游引物，0.7 μL荧光引物，10 μL Mix，8 μL ddH2O。PCR扩增反映程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃30 s，最适退火温度30 s，72 ℃延伸30 s，10个循环；95 ℃30 s，最适退火温度降低2 ℃30 s，72 ℃30 s，25个循环；72 ℃10 min；4 ℃保存。
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选取15对基于油松转录组序列所开发的樟子松SSR引物[23]，在上游5′端连接M13引物接头，混合FAM、TAM、HEX、ROX荧光引物进行PCR扩增。扩增产物进行毛细管电泳检测，所用仪器为北京六一仪器厂的DYY-8C电泳仪。用Gene Marker V2.2软件对条带信息进行整理，最终筛选出11对条带清晰、稳定、多态性良好的SSR引物。
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用PopGene 1.32以及PowerMarker V3.25软件对各群体进行遗传多样性分析。遗传多样性分析参数包括观测等位基因数Na，Shannon多样性指数I，多态信息指数(PIC)，固定指数F等。用GenAlEx 6.5软件进行AMOVA计算，分析种子园内群体间、群体内个体间、群体间个体间的遗传差异情况。
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用PowerMarker V3.25软件计算基于等位基因频率的Nei 1983距离，并对Nei1983距离进行UPGMA聚类，用MEGV7.0.14查看聚类结果，根据聚类结果分析亲缘关系情况。
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利用224株无性系对15对SSR引物进行PCR扩增，筛选出了11对条带清晰、稳定、可重复的SSR引物(表 2)。引物片段大小在135~309 bp之间，退火温度范围为42~55 ℃。各引物位点PIC的变化范围是0.184~0.831，平均值为0.487，多态信息指数(PIC)＞0.5的高度多态性位点占总数的54.55%，0.25＜PIC＜0.5的中度多态位点占总数的27.27%，其中引物lw_isotig 21953和lw_isotig 11166的多态信息指数较高，可以提供丰富的遗传多样性信息。结果表明实验所用的11对引物具有良好的多态性，可以用于樟子松遗传多样性的研究。
表 2 樟子松SSR多态性引物
Table 2. Polymorphic SSR primers of Pinus sylvestris var. mongolica
编号
NO.位点
Locus引物序列
Primer sequence (5′ -3′)退火温度
Annealing
temperature/℃重复基元
Repeat motif片段大小
Fragment
size/bp多态信息含量
Polymorphism information
content (PIC)1 lw_isotig05123 F:TGTGCGTATAGGAGGTGGAG
R:ATGAAAGGTGACAAAGCGGT55 (GAG)6 180~186 0.184 2 lw_isotig07383 F:CAAACAAAAAACAGTCTGCA R:ATCGTCATCATCATCGTCAC 55 (GAT)8 198~216 0.555 3 lw_isotig26230 F:GGGCATTACATAAACACGGG R:TGCCCTTGAGCATTTGATTA 55 (TA)10 263~291 0.393 4 lw_isotig02138 F:ATGCATCTTGTCCTCTCT
R:TTCCTGATTCACACTCCC42 (AG)6 135~143 0.200 5 lw_isotig01420 F:TCCGTGACCCTATTACGT R:CGATTAGTTGCTTGCCTT 50 (CTG)5 184~196 0.520 6 lw_isotig04306 F:GCCATTTTTTTCTTCTCTCCT R:GGTCGGTTTCTGAATTTCTAA 55 (TCC)7 197~215 0.555 7 lw_isotig04204 F:CTCCGTTTGGGTTGTGTTTG R:ATCCTTGCCGCCAGATTTGT 55 (CGGCT)5 243~263 0.291 8 lw_isotig11166 F:ACACACACTGAGCTCCAATTT R:AGTCCCACCTCTGCTGATACA 55 (TA)7 160~170 0.715 9 lw_isotig10603 F:CAAAATCGTCTACTTCTCCCCC R:CAAAGCAAAAGAACTCCAACGA 55 (CAG)7 208~223 0.443 10 lw_isotig21953 F:ATGGTGTGTTTGAAGCGGAA R:ATTGCAGCCACTGGTGTCTT 55 (ATGGG)7 217~309 0.831 11 lw_isotig20215 F:AGAGGTGATCGCAGTCAAAGA
CAAAAAGACCAAACCGTAG55 (TA)7 194~212 0.665 -
按照育种资源的来源，观测等位基因数(Na)和有效等位基因数(Ne)的变化范围分别是3.636~4.909、2.312~2.705，良种基地的观测等位基因数最大，TOU的有效等位基因数最大；Shannon多样性指数(I)的变化范围是0.879~1.002；观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)的变化范围分别是0.388~0.536、0.467~0.534(表 3)。作为子代的YL2群体与亲本YL1.5群体相比，等位基因数量等各项遗传参数都有所下降，说明高强度的人为选择可能会降低群体的多样性水平。各个群体本身都具有良好的遗传基础，在9个群体中，良种基地(LZJD)、头道桥(TOU)、榆林1.5(YL1.5)、泰来(TL)具有较高的遗传多样性水平，宝根园(BAO)和榆林(YL)相对较低。为了保持种子园遗传增益与遗传多样性的平衡，对种子园进行疏伐、改建以及更高改良周期种子园的营建时，更应该注重这4个群体无性系的保存工作，防止优秀育种资源丢失。
表 3 不同地区樟子松群体遗传多样性水平
Table 3. Genetic diversity level of Pinus sylvestris var. mongolica populations in different regions
种子园
Seed orchard群体
Population观测等位基因
Observe number of
allele (Na)有效等位基因
Effectivenumber
of allele (Ne)Shannon多样性指数
Shannon’s
diversity
index (I)观测杂合度
Nei’s observed
heterozygosity
(Ho)期望杂合度
Nei’sexpected
heterozygosity
(He)LZJD 4.909 2.519 0.995 0.453 0.528 TOU 4.091 2.705 1.002 0.505 0.533 1st BAO 3.636 2.549 0.890 0.417 0.470 BA 3.636 2.376 0.910 0.455 0.498 HONG 4.000 2.576 0.975 0.536 0.522 1.5th YL1.5 4.818 2.600 1.000 0.488 0.511 CH 4.636 2.446 0.963 0.425 0.499 2nd TL 4.364 2.611 0.995 0.484 0.534 YL2 3.818 2.312 0.879 0.388 0.467 按育种资源的世代，观测等位基因数(Na)和有效等位基因数(Ne)变化范围分别是4.818~5.455、2.600~2.635；基因型数(number of genotype)变化范围是7.000~12.091；Shannon多样性指数(I)的变化范围是1.000~1.034；观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)变化范围分别是0.438~0.468、0.511~0.533(表 4)。以上述参数作为参考，说明不同世代种子园都维持着很丰富的遗传多样性水平，呈现出1代园＞2代园＞1.5代园的趋势，但差异并不明显。导致1.5代园多样性水平较低的原因可能是其群体样本较少，包含的遗传信息不全面。2代园的近交系数F(0.173)与1代园(0.091)、1.5代园(0.081)相比，有了较为明显的提升，说明2代园偏离了哈迪-温伯格平衡，亲本杂合子较少，纯合子过量。
表 4 不同世代樟子松种子园遗传多样性
Table 4. Genetic diversity of seed orchards in different generations of Pinus sylvestris var. mongolica
位点
编号
Locus
No.观测等位基因
Observe number of
allele (Na)有效等位基因
Effective number
of allele (Ne)基因型数
Number of genotype观测杂合度
Nei’s observed
heterozygosity (Ho)期望杂合度
Nei’s expected
heterozygosity (He)Shannon多样性指数
Shannon’s
diversity
index (I)多态信息含量
Polymorphism
information content(PIC)近交系数
Inbreeding
coefficient (F)1 3/3/3 1.182/1.241/1.342 4/3/4 0.130/0.214/0.273 0.154/0.195/0.255 0.316/0.389/0.459 0.145/0.181/0.228 0.159/-0.102/-0.064 2 5/5/7 2.218/2.387/2.531 11/5/13 0.463/0.321/0.409 0.549/0.581/0.605 1.072/1.123/1.286 0.509/0.530/0.576 0.157/0.447/0.329 3 3/3/3 1.991/2.013/1.923 5/5/4 0.287/0.357/0.125 0.498/0.503/0.480 0.771/0.815/0.715 0.399/0.420/0.375 0.423/0.290/0.742 4 4/2/2 1.379/1.074/1.174 7/2/2 0.292/0.071/0.161 0.275/0.069/0.148 0.511/0.154/0.280 0.274/0.067/0.137 -0.064/-0.037/-0.082 5 5/5/4 2.337/2.644/2.245 9/7/7 0.639/0.643/0.625 0.572/0.622/0.555 1.032/1.144/0.992 0.513/0.555/0.500 -0.117/-0.034/-0.121 6 6/5/4 2.477/2.469/2.849 10/7/9 0.611/0.821/0.659 0.596/0.595/0.649 1.093/1.052/1.183 0.528/0.511/0.591 -0.025/-0.380/-0.01 7 2/2/2 1.693/1.280/1.453 2/2/2 0.574/0.250/0.386 0.409/0.219/0.312 0.599/0.377/0.491 0.326/0.195/0.263 -0.403/-0.143/-0.234 8 6/6/6 3.807/4.000/4.260 17/12/16 0.519/0.679/0.648 0.737/0.750/0.765 1.498/1.522/1.564 0.696/0.712/0.727 0.297/0.095/0.159 9 5/4/4 2.192/2.253/2.088 7/6/7 0.593/0.464/0.523 0.544/0.556/0.521 0.900/0.939/0.858 0.446/0.465/0.430 -0.090/0.165/0.002 10 11/10/14 6.487/5.809/6.156 37/17/33 0.704/0.778/0.779 0.846/0.828/0.838 2.043/1.959/2.071 0.828/0.808/0.819 0.168/0.060/0.076 11 10/8/8 3.113/3.431/2.967 24/11/16 0.340/0.333/0.232 0.679/0.709/0.663 1.536/1.439/1.346 0.690/0.664/0.610 0.499/0.530/0.654 总计
Total5.455/4.818/5.182 2.625/2.600/2.635 12.091/7.000/10.273 0.468/0.448/0.438 0.533/0.511/0.526 1.034/1.000/1.022 0.487/0.464/0.478 0.091/0.081/0.173 注：“/”左边、中间、右边分别代表：1、1.5、2代园的遗传参数。Notes：the genetic parameters of the1st, 1.5th and 2nd seed orchards were on the left, middle and right. -
遗传分化系数Fst是反应各群体间遗传分化的重要指标之一[24]。1、2代种子园的遗传分化系数Fst分别为0.041、0.045(表 5)，说明樟子松种子园育种资源群体间的遗传分化程度很低，不同群体之间没有发生明显的变异。AMOVA分析也表明：在1代园中，几乎所有的遗传变异发生在个体间(100%)；在2代园中，大部分的遗传变异依然产生在个体之间(96%)，群体间的方差分量仅占4%，说明同种源的樟子松在群体间的遗传分化不明显，经过一个世代、40年左右不同生境因素的影响，同种源、不同生境的樟子松产生了极小程度的变异，无法与原始种源地的群体区分开。
表 5 樟子松分子方差分析与固定指数
Table 5. Analysis of molecular variance and fixation index of Pinus sylvestris var. mongolica
种子园Seed orchard 变异来源Source of variation 自由度Degree of freedom 方差Variance 均方差Mean variance 估计方差Est. Var. 变异系数Coefficient of variation/% 固定指数Fixation index(Fst) 1st 群体间Among populations 4 51.633 3.908 0.015 0 群体内个体间Among individuals within population 103 347.849 3.377 0.408 14 0.041 群体间个体间Among individuals between populations 108 276.500 2.560 2.560 86 总计Total 215 639.981 2.983 100 2nd 群体间Among populations 2 22.060 11.030 0.134 4 群体内个体间Among individuals within population 85 282.713 3.326 0.467 16 0.045 群体间个体间Among individuals between populations 88 210.500 2.392 2.392 80 总计Total 175 515.273 2.993 100 -
明确种子园中无性系的亲缘关系，可以有效控制近交，提高子代杂合率。通过计算单株间的遗传距离以及聚类分析，发现各无性系间都存在着不同程度的亲缘关系(图 1)。相同来源地的群体并没有根据亲缘关系的远近而聚为一类，相反，各群体无性系分布较为均匀，这一结果与遗传分化分析结果类似。同时，随着种子园世代的提升，聚类现象逐渐明显。1代种子园中，BA12在遗传相似系数0.692处就与其余107株无性系分离，与其他优良无性系的亲缘关系最远，可能是群体中较为稀缺的育种资源。1.5代种资源的聚类情况开始明显，在遗传相似系数0.789 5处聚为两类，陕红(SH1、SH34、SH65)3株无性系在一类中。2代园个体之间的遗传距离有部分完全一致的育种资源(CH3、CH10组和TL1417、TL1411组)，在分子层面上推断这两组无性系可能为相同无性系或亲缘关系过于接近。在配置种子园时，应该舍弃重复的资源或保持较远的距离，避免发生近交。
图 1 樟子松1代(a)、1. 5代(b)和2代(c)种子园无性系亲缘关系
Figure 1. Phylogenetic relationship tree of the 1st(a), 1. 5th(b) and 2nd(c) seed orchards
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樟子松天然林分布范围小，榆林、错海、泰来3地樟子松种子园材料均为20世纪60、70年代从红花尔基进行的引种栽培。目前来自种源地的1代园群体不存在明显的遗传结构，几乎100%的遗传变异都存在于个体之间。经过自然环境和人工选择的作用，生境不同的2代园群体之间产生了4%的遗传变异，但大部分(96%)的遗传变异还是存在于个体之间。
遗传多样性研究是育种资源评价的重要手段。与海岸松[25]、油松(Pinus tabuliformis)[26-27]、华北落叶松(Larix principis-rupprechtii)[28]、马尾松(Pinus massoniana)[29]不同世代种子园相比，樟子松种子园保持着较高的遗传多样性水平，表明樟子松的育种改良工作拥有广阔的遗传基础和发展空间。对于本研究的材料来说，二代种子园已经出现了观测等位基因数、基因型数、杂合度等参数下降的现象。说明在樟子松育种过程中，以表型性状为标准，高强度的人工选择可能会获得显著的短期遗传增益，但同时会存在育种资源遗传多样性降低的风险，进而降低育种资源对自然环境的适应能力和遗传改良潜力。所以，分子辅助育种与传统育种相结合，必然是未来樟子松育种改良的发展趋势。
营建种子园的主要目标是获得更大的遗传增益，同时保持较高的遗传多样性，主要重视材料的遗传品质和亲缘关系。所以，樟子松高改良周期种子园内的育种资源不必过分强调世代之分，可以包含重叠世代，或前向选择世代的优良无性系。因此，近交现象就成为了特别需要注意的问题。大多数的林木物种发生近交会导致很严重的衰退现象，如果将其忽略，就会显著影响改良效果[30]。同时，和初级种子园相比，高改良周期种子园的亲本数量更少、亲缘关系更加复杂[31]。本研究中涉及到的种子园建园材料之间的亲缘关系和谱系缺失，根据分析结果发现，2代园樟子松的近交系数提升明显，可能是泰来、榆林、错海3地初级园材料的亲缘关系较近所导致的。同时，在2代园中发现了两组完全一致的育种资源，很可能就是在调拨、交换过程中出现了错误，导致相同无性系出现了不同编号。根据其他针叶树[19-22]的研究结果，红花尔基良种基地的2代樟子松种子园可能会面临一定程度的种子产量降低和子代性状下降的风险，应该进一步加强无性系配置研究，减少近交衰退。
根据同种源、不同生境下的樟子松没有发生明显的遗传变异，且拥有较为接近亲缘关系的研究结论可知，在高改良周期种子园营建工作必须以无性系间的亲缘关系为依据进行配置设计。为了减小种子园子代近交衰退、遗传增益降低的风险，红花尔基樟子松国家良种基地应该以亲缘关系为参考进行疏伐、改建以及育种资源保存等工作。
Genetic evaluation of breeding resources of Pinus sylvestris var. mongolica from different improved generations
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摘要: 当前樟子松遗传改良正处于升级换代的关键时期，但是不同地区育种资源调拨与交换频繁，导致了育种资源信息模糊、亲缘关系混乱，增加了樟子松遗传改良工作中近交衰退的风险，因此开展育种资源评价研究是樟子松优良单株利用的重要基础。本文以樟子松1、1.5、2代种子园224个无性系为研究对象，开展了基于SSR的遗传多样性和单株亲缘关系分析以及遗传差异分析。结果表明：按育种资源的来源分析，良种基地、头道桥、榆林1.5和泰来4个群体的遗传多样性水平较高，宝根园和榆林群体相对较低；按育种资源的世代分析，不同世代樟子松育种资源维持着较高的遗传多样性水平，高世代种子园的遗传多样性水平有所下降，2、1.5代种子园的期望杂合度He较1代种子园分别下降4.13%、1.31%。2代种子园群体的近交系数F值(0.173)较高，纯合子较多，显著偏离了哈迪-温伯格平衡。同种源、不同生境的樟子松育种资源没有发生明显的变异，主要的遗传变异存在于个体之间(96%)；随着种子园世代的提高，无性系之间的亲缘关系聚类现象逐渐明显，2代种子园内存在两组完全一致的无性系(CH3、CH10组和TL1417、TL1411组)。研究结果完善了樟子松育种资源评价体系，确定了不同世代育种资源的亲缘关系，为樟子松高级遗传改良工作提供了材料和信息基础。Abstract: Nowadays, the genetic improvement of Pinus sylvestris var. mongolica is in a critical period of upgrading and updating. But the frequent allocation and exchange of breeding resources in different areas lead to unclear information of breeding resources and confusion of genetic relationship, which increases the risk of inbreeding depression during genetic improvement of Pinus sylvestris var. mongolica. Therefore, the evaluation of breeding resources is an important basis for the utilization of superior individuals of Pinus sylvestris var. mongolica. In this paper, 224 clones of Pinus sylvestris var. mongolica from the 1st, 1.5th and 2nd seed orchards were studied. Genetic diversity, phylogenetic relationship and genetic diversity were analyzed based on SSR, and the population of BaogenYuan and Yulin was relatively low according to breeding resource analysis; the genetic diversity of four populations of LiangZhongJiDi, TouDaoQiao, YuLin1.5 and TaiLai was higher.According to improved generation analysis, different generations of Pinus sylvestris var. mongolica breeding resources maintained a high level of genetic diversity; the genetic diversity of the high generation seed orchard decreased, and the expected heterozygosity (He) of the 2nd and 1.5th generation seed orchards decreased by 4.13% and 1.31% respectively compared with the 1st generation seed orchard; the 2nd generation seed orchard group had more higher inbreeding coefficient (the F-value was 0.173) and homozygote, which significantly deviated from Hardy-Weinberg equilibrium; Pinus sylvestris var. mongolica breeding resources in different habitats and the same source had no obvious variation, the genetic variation mainly existed among individuals (96%); with the generation seed orchard increased, phylogenetic relationship clustering phenomenon among clones gradually became obvious, two sets of breeding resource clones were identified completely genetic consistent in the 2nd generation seed orchard. The results of this research improve the breeding resource evaluation system of Pinus sylvestris var. mongolica, determine the genetic relationship of different generation breeding resources, and provide the material and information basis for the advanced genetic improvement work of Pinus sylvestris var. mongolica.
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图 1 樟子松1代(a)、1. 5代(b)和2代(c)种子园无性系亲缘关系
Figure 1. Phylogenetic relationship tree of the 1st(a), 1. 5th(b) and 2nd(c) seed orchards
表 1 实验材料信息
Table 1. Experimental material information
种子园
Seed orchard材料来源
Material source数量
Quantity1st 良种基地LiangZhongJiDi(LZJD) 57 头道桥TouDaoQiao(TOU) 15 宝根园BaoGenYuan(BAO) 11 巴日图BaRiTu(BA) 11 红林场HongLinChang(HONG) 14 1.5th 榆林YuLin1.5(YL1.5) 28 2nd 错海CuoHai(CH) 34 泰来TaiLai(TL) 33 榆林YuLin2(YL2) 21 
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表 2 樟子松SSR多态性引物
Table 2. Polymorphic SSR primers of Pinus sylvestris var. mongolica
编号
NO.位点
Locus引物序列
Primer sequence (5′ -3′)退火温度
Annealing
temperature/℃重复基元
Repeat motif片段大小
Fragment
size/bp多态信息含量
Polymorphism information
content (PIC)1 lw_isotig05123 F:TGTGCGTATAGGAGGTGGAG
R:ATGAAAGGTGACAAAGCGGT55 (GAG)6 180~186 0.184 2 lw_isotig07383 F:CAAACAAAAAACAGTCTGCA R:ATCGTCATCATCATCGTCAC 55 (GAT)8 198~216 0.555 3 lw_isotig26230 F:GGGCATTACATAAACACGGG R:TGCCCTTGAGCATTTGATTA 55 (TA)10 263~291 0.393 4 lw_isotig02138 F:ATGCATCTTGTCCTCTCT
R:TTCCTGATTCACACTCCC42 (AG)6 135~143 0.200 5 lw_isotig01420 F:TCCGTGACCCTATTACGT R:CGATTAGTTGCTTGCCTT 50 (CTG)5 184~196 0.520 6 lw_isotig04306 F:GCCATTTTTTTCTTCTCTCCT R:GGTCGGTTTCTGAATTTCTAA 55 (TCC)7 197~215 0.555 7 lw_isotig04204 F:CTCCGTTTGGGTTGTGTTTG R:ATCCTTGCCGCCAGATTTGT 55 (CGGCT)5 243~263 0.291 8 lw_isotig11166 F:ACACACACTGAGCTCCAATTT R:AGTCCCACCTCTGCTGATACA 55 (TA)7 160~170 0.715 9 lw_isotig10603 F:CAAAATCGTCTACTTCTCCCCC R:CAAAGCAAAAGAACTCCAACGA 55 (CAG)7 208~223 0.443 10 lw_isotig21953 F:ATGGTGTGTTTGAAGCGGAA R:ATTGCAGCCACTGGTGTCTT 55 (ATGGG)7 217~309 0.831 11 lw_isotig20215 F:AGAGGTGATCGCAGTCAAAGA
CAAAAAGACCAAACCGTAG55 (TA)7 194~212 0.665
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表 3 不同地区樟子松群体遗传多样性水平
Table 3. Genetic diversity level of Pinus sylvestris var. mongolica populations in different regions
种子园
Seed orchard群体
Population观测等位基因
Observe number of
allele (Na)有效等位基因
Effectivenumber
of allele (Ne)Shannon多样性指数
Shannon’s
diversity
index (I)观测杂合度
Nei’s observed
heterozygosity
(Ho)期望杂合度
Nei’sexpected
heterozygosity
(He)LZJD 4.909 2.519 0.995 0.453 0.528 TOU 4.091 2.705 1.002 0.505 0.533 1st BAO 3.636 2.549 0.890 0.417 0.470 BA 3.636 2.376 0.910 0.455 0.498 HONG 4.000 2.576 0.975 0.536 0.522 1.5th YL1.5 4.818 2.600 1.000 0.488 0.511 CH 4.636 2.446 0.963 0.425 0.499 2nd TL 4.364 2.611 0.995 0.484 0.534 YL2 3.818 2.312 0.879 0.388 0.467
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表 4 不同世代樟子松种子园遗传多样性
Table 4. Genetic diversity of seed orchards in different generations of Pinus sylvestris var. mongolica
位点
编号
Locus
No.观测等位基因
Observe number of
allele (Na)有效等位基因
Effective number
of allele (Ne)基因型数
Number of genotype观测杂合度
Nei’s observed
heterozygosity (Ho)期望杂合度
Nei’s expected
heterozygosity (He)Shannon多样性指数
Shannon’s
diversity
index (I)多态信息含量
Polymorphism
information content(PIC)近交系数
Inbreeding
coefficient (F)1 3/3/3 1.182/1.241/1.342 4/3/4 0.130/0.214/0.273 0.154/0.195/0.255 0.316/0.389/0.459 0.145/0.181/0.228 0.159/-0.102/-0.064 2 5/5/7 2.218/2.387/2.531 11/5/13 0.463/0.321/0.409 0.549/0.581/0.605 1.072/1.123/1.286 0.509/0.530/0.576 0.157/0.447/0.329 3 3/3/3 1.991/2.013/1.923 5/5/4 0.287/0.357/0.125 0.498/0.503/0.480 0.771/0.815/0.715 0.399/0.420/0.375 0.423/0.290/0.742 4 4/2/2 1.379/1.074/1.174 7/2/2 0.292/0.071/0.161 0.275/0.069/0.148 0.511/0.154/0.280 0.274/0.067/0.137 -0.064/-0.037/-0.082 5 5/5/4 2.337/2.644/2.245 9/7/7 0.639/0.643/0.625 0.572/0.622/0.555 1.032/1.144/0.992 0.513/0.555/0.500 -0.117/-0.034/-0.121 6 6/5/4 2.477/2.469/2.849 10/7/9 0.611/0.821/0.659 0.596/0.595/0.649 1.093/1.052/1.183 0.528/0.511/0.591 -0.025/-0.380/-0.01 7 2/2/2 1.693/1.280/1.453 2/2/2 0.574/0.250/0.386 0.409/0.219/0.312 0.599/0.377/0.491 0.326/0.195/0.263 -0.403/-0.143/-0.234 8 6/6/6 3.807/4.000/4.260 17/12/16 0.519/0.679/0.648 0.737/0.750/0.765 1.498/1.522/1.564 0.696/0.712/0.727 0.297/0.095/0.159 9 5/4/4 2.192/2.253/2.088 7/6/7 0.593/0.464/0.523 0.544/0.556/0.521 0.900/0.939/0.858 0.446/0.465/0.430 -0.090/0.165/0.002 10 11/10/14 6.487/5.809/6.156 37/17/33 0.704/0.778/0.779 0.846/0.828/0.838 2.043/1.959/2.071 0.828/0.808/0.819 0.168/0.060/0.076 11 10/8/8 3.113/3.431/2.967 24/11/16 0.340/0.333/0.232 0.679/0.709/0.663 1.536/1.439/1.346 0.690/0.664/0.610 0.499/0.530/0.654 总计
Total5.455/4.818/5.182 2.625/2.600/2.635 12.091/7.000/10.273 0.468/0.448/0.438 0.533/0.511/0.526 1.034/1.000/1.022 0.487/0.464/0.478 0.091/0.081/0.173 注：“/”左边、中间、右边分别代表：1、1.5、2代园的遗传参数。Notes：the genetic parameters of the1st, 1.5th and 2nd seed orchards were on the left, middle and right.
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表 5 樟子松分子方差分析与固定指数
Table 5. Analysis of molecular variance and fixation index of Pinus sylvestris var. mongolica
种子园Seed orchard 变异来源Source of variation 自由度Degree of freedom 方差Variance 均方差Mean variance 估计方差Est. Var. 变异系数Coefficient of variation/% 固定指数Fixation index(Fst) 1st 群体间Among populations 4 51.633 3.908 0.015 0 群体内个体间Among individuals within population 103 347.849 3.377 0.408 14 0.041 群体间个体间Among individuals between populations 108 276.500 2.560 2.560 86 总计Total 215 639.981 2.983 100 2nd 群体间Among populations 2 22.060 11.030 0.134 4 群体内个体间Among individuals within population 85 282.713 3.326 0.467 16 0.045 群体间个体间Among individuals between populations 88 210.500 2.392 2.392 80 总计Total 175 515.273 2.993 100
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