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杨树PsnGA20ox1过表达对烟草叶片发育的影响

刘露露 鲁婷婷 王爽 李美靓 赵双菁 刘莹莹 魏志刚

刘露露, 鲁婷婷, 王爽, 李美靓, 赵双菁, 刘莹莹, 魏志刚. 杨树PsnGA20ox1过表达对烟草叶片发育的影响[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(2): 22-30. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170245
引用本文: 刘露露, 鲁婷婷, 王爽, 李美靓, 赵双菁, 刘莹莹, 魏志刚. 杨树PsnGA20ox1过表达对烟草叶片发育的影响[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(2): 22-30. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170245
Liu Lu-lu, Lu Ting-ting, Wang Shuang, Li Mei-liang, Zhao Shuang-jing, Liu Ying-ying, Wei Zhi-gang. Effects of poplar PsnGA20ox1 overexpression on leaf development of tobacco[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(2): 22-30. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170245
Citation: Liu Lu-lu, Lu Ting-ting, Wang Shuang, Li Mei-liang, Zhao Shuang-jing, Liu Ying-ying, Wei Zhi-gang. Effects of poplar PsnGA20ox1 overexpression on leaf development of tobacco[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(2): 22-30. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170245

杨树PsnGA20ox1过表达对烟草叶片发育的影响

doi: 10.13332/j.1000-1522.20170245
基金项目: 

黑龙江省留学归国基金项目 LC201512

国家自然科学基金项目 31770640

详细信息
    作者简介:

    刘露露。主要研究方向:植物次生细胞壁。Email: 1398314698@qq.com 地址:150040黑龙江省哈尔滨市香坊区和兴路26号东北林业大学林学院

    通讯作者:

    魏志刚,教授。主要研究方向:植物次生细胞壁。Email:zhigangwei@nefu.edu.c 地址:同上

  • 中图分类号: S718.46;S792.11

Effects of poplar PsnGA20ox1 overexpression on leaf development of tobacco

  • 摘要: 目的赤霉素(Gibberellins, GA)参与植物多个生长发育过程,然而赤霉素在植物叶片发育中的生物学功能尚无研究报道。GA20ox是GAs生物合成途径中关键限速酶(GA20-oxidases)的编码基因,本项研究目的是揭示PsnGA20ox1在植物叶片发育中的生物学功能。方法本项研究分析了PsnGA20ox1在烟草中过表达后对烟草叶片大小、超微结构、生物量、叶绿素及生物活性GAs含量,以及细胞分裂与气孔发育相关的基因表达的影响。结果PsnGA20ox1过表达烟草叶片变大、叶绿素与GA4含量上升,叶片表皮细胞变小。而且,转基因烟草叶片栅栏组织与海绵组织厚度、表皮细胞与气孔数目、光合作用和叶片生物量与野生型烟草相比均显著增加。此外,转基因烟草叶片气孔与表皮细胞发育相关基因表达也发生了显著变化,而且变化趋势与叶片表型的改变相吻合。结论PsnGA20ox1过表达影响植物叶片的结构与功能,从而提高了叶片的生物量。
  • 图  1  PsnGA20ox1在小黑杨不同组织中表达模式

    A.顶端分生组织; B.初生区叶片; C.过渡区叶片; D.次生区叶片; E.韧皮部; F.过渡区木质部; G.次生木质部;H.次生区节间。

    Figure  1.  PsnGA20ox1 expression patterns in different tissues of Populous simonii×Populus nigra

    A, top meristem; B, newborn leaves; C, transition zone leaves; D, secondary zone leaves; E, phloem; F, transition zone xylem; G, secondary xylem; H, secondary zone internals.

    图  2  转基因烟草PsnGA20ox1表达量、GAs含量与表型

    WT为野生型烟草;L为转基因株系;L2、L5、L7、L11、L16为PsnGA20ox1过表达烟草的5个株系。下同。A.3个月生烟草表型; B.1个月生烟草功能叶片表型; C.PsnGA20ox1相对表达量; D.1个月生烟草功能叶片中GAs含量; E.3个月生烟草叶片长和宽; F.3个月生烟草叶片鲜质量与干质量。

    Figure  2.  PsnGA20ox1 expression level, GAs content and phonotype of tobacco

    WT is wild type tobacco; L is transgenic line; L2, L5, L7, L11 and L16 are PsnGA20ox1 overexpressing tobacco. The same below. A, 3-month-old tobacco phenotype; B, 1-month tobacco leaf functional phenotype; C, PsnGA20ox1 relative expression level; D, 1-month tobacco leaf functional GAs content; E, the length and width of 3-month-old tobacco leaves; F, the fresh mass and dry mass of 3-month-old tobacco leaves.

    图  3  过表达PsnGA20ox1对烟草叶片超微结构影响

    A、C、E.野生型烟草; B、D、F.PsnGA20ox1过表达烟草;A、B.放大100倍; C、D.放大300倍; E、F.放大1000倍。

    Figure  3.  Effects of PsnGA20ox1 overexpression on leaf ultrastructure of tobacco

    A, C, E, wild type tobacco; B, D, F, PsnGA20ox1 overexpression tobacco; A, B, magnification 100 times; C, D, magnification 300 times; E, F, magnification 1000 times.

    图  4  PsnGA20ox1过表达对烟草叶绿素含量与光合作用影响

    A.PsnGA20ox1过表达与野生型烟草叶绿素含量; B.PsnGA20ox1过表达与野生型烟草光合速率。

    Figure  4.  Effects of PsnGA20ox1 overexpression on chlorophyll and photosynthetic rate of tobacco

    A, PsnGA20ox1 overexpression and wild-type tobacco chlorophyll content; B, PsnGA20ox1 overexpression and wild-type tobacco photosynthetic rate.

    图  5  过表达PsnGA20ox1对烟草表皮与气孔发育相关基因表达影响

    Figure  5.  Effects of PsnGA20ox1 overexpression on the expression level of genes involved in epidermal cell and stomatal development of tobacco

    表  1  烟草气孔发育相关基因qRT-PCR引物

    Table  1.   qRT-PCR primers of genes involved in stomatal and epidermal cell development of tobacc

    基因名
    Gene name
    登录号
    Accession No.
    引物名称
    Primer name
    引物序列(5′-3′)
    Primer sequence(5′-3′)
    Actin2 AB158612.1 Actin-S
    Actin-A
    GATCTTGCTGGTCGTGATCT
    ACTTCCGGACATCTGAACCT
    ER JQ267739.1 ER-S
    ER-A
    GAAGGTTTTGGTAGTTACACGTAGC
    AGGGTGAGTCGTTGTCTAGAAGG
    ERL1 XM_009764054.1 ERL1-S
    ERL1-A
    GACTCCATTGCTTTTTGTTCTTAA
    CTCAGAAGTAAAATCCCAAGAAGC
    ERL2 XM_009785106.1 ERL2-S
    ERL2-A
    CAGGCTTTCAGGTACTCTACCATC
    GCCCTCTGAGTCTTGAAGAATTTG
    MPK3 XM_009804071.1 MPK3-S
    MPK3-A
    TGCTCGGTGTTGAATACGG
    GGTCTAAATGGCGGAGGAG
    MKK4 XM_009760486.1
    MPK4-S
    MPK4-A
    GCCTTCAGATGTGCCGTG
    CCCTTCGAGAGAGCCTTTATC
    EPF1 XM_009760610.1 EPF1-S
    EPF1-A
    GTGATGATATTGGCGGCG
    ACTTGTAGTTTCTGGCATCGG
    EPF2 XM_009791751.1 EPF2-S
    EPF2-A
    TTACCAGATTGTTCCCATGC
    TCAATTGGAAGGGACATGG
    STOMAGEN XM_009767439.1 STOMAGEN-S
    STOMAGEN-A
    ATGAGGGAAAAAGATGGGTG
    CCTCCACTGGGACTTGCTC
    SPCH XP_009801585.1 SPCH-F
    SPCH-R
    GTTCTACAATCTCTGGAGGCG
    TGGACTTTCAGGTGTGGGAC
    SCRM XP_009769541.1 SCRM-F
    SCRM-R
    GCAGCAGATGTAGACTGGTTCA
    AGTTACTATTGTTTTCAGTTTCGG
    SCRM2 XP_009769541.1 SCRM2-F
    SCRM2-R
    GCAAAACCAAAACCATACTGAC
    GAAGCTGAAGATGAAGATGAGG
    MUTE XP_009765536.1 MUTE-F
    MUTE-R
    TGCACCACAAACTGGCTTC
    GTTCCCCGTGGCCCTC
    FAMA XP_009795997.1 FAMA-F
    FAMA-R
    ACAACAACAACAACAACACGAG
    TTCCTCTGATACCTTGGCTTG
    CYCD2;1 XP_009789780.1 CYCD2;1-F
    CYCD2;1-R
    TGGAGTTTTTGCCTAAAGATG
    TCAAAATCCAATCAAGAGCC
    CYCD3;1 XP_009788121.1 CYCD3;1-F
    CYCD3;1-R
    TATTTTGGGAAGATGAAGAGC
    CACAGAATCAACACGGGC
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出版历程
  • 收稿日期:  2017-09-14
  • 修回日期:  2017-11-09
  • 刊出日期:  2018-02-01

杨树PsnGA20ox1过表达对烟草叶片发育的影响

doi: 10.13332/j.1000-1522.20170245
    基金项目:

    黑龙江省留学归国基金项目 LC201512

    国家自然科学基金项目 31770640

    作者简介:

    刘露露。主要研究方向:植物次生细胞壁。Email: 1398314698@qq.com 地址:150040黑龙江省哈尔滨市香坊区和兴路26号东北林业大学林学院

    通讯作者: 魏志刚,教授。主要研究方向:植物次生细胞壁。Email:zhigangwei@nefu.edu.c 地址:同上
  • 中图分类号: S718.46;S792.11

摘要: 目的赤霉素(Gibberellins, GA)参与植物多个生长发育过程,然而赤霉素在植物叶片发育中的生物学功能尚无研究报道。GA20ox是GAs生物合成途径中关键限速酶(GA20-oxidases)的编码基因,本项研究目的是揭示PsnGA20ox1在植物叶片发育中的生物学功能。方法本项研究分析了PsnGA20ox1在烟草中过表达后对烟草叶片大小、超微结构、生物量、叶绿素及生物活性GAs含量,以及细胞分裂与气孔发育相关的基因表达的影响。结果PsnGA20ox1过表达烟草叶片变大、叶绿素与GA4含量上升,叶片表皮细胞变小。而且,转基因烟草叶片栅栏组织与海绵组织厚度、表皮细胞与气孔数目、光合作用和叶片生物量与野生型烟草相比均显著增加。此外,转基因烟草叶片气孔与表皮细胞发育相关基因表达也发生了显著变化,而且变化趋势与叶片表型的改变相吻合。结论PsnGA20ox1过表达影响植物叶片的结构与功能,从而提高了叶片的生物量。

English Abstract

刘露露, 鲁婷婷, 王爽, 李美靓, 赵双菁, 刘莹莹, 魏志刚. 杨树PsnGA20ox1过表达对烟草叶片发育的影响[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(2): 22-30. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170245
引用本文: 刘露露, 鲁婷婷, 王爽, 李美靓, 赵双菁, 刘莹莹, 魏志刚. 杨树PsnGA20ox1过表达对烟草叶片发育的影响[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(2): 22-30. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170245
Liu Lu-lu, Lu Ting-ting, Wang Shuang, Li Mei-liang, Zhao Shuang-jing, Liu Ying-ying, Wei Zhi-gang. Effects of poplar PsnGA20ox1 overexpression on leaf development of tobacco[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(2): 22-30. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170245
Citation: Liu Lu-lu, Lu Ting-ting, Wang Shuang, Li Mei-liang, Zhao Shuang-jing, Liu Ying-ying, Wei Zhi-gang. Effects of poplar PsnGA20ox1 overexpression on leaf development of tobacco[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(2): 22-30. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170245
  • 赤霉素(gibberellins,简称GA)是一类四环二萜类化合物,至今已发现130余种,总称赤霉素类(GAs)[1],但只有部分在植物生长与发育过程具有生物学活性[2]。GAs生物合成最后一阶段是在植物细胞质中进行,由GA12醛在GA20氧化酶(GA20ox)、GA3氧化酶(GA3ox)和GA2氧化酶(GA2ox)作用下合成不同种类的GAs。GA20ox能在GA生物合成的最后阶段催化从GA12到GA9及GA53到GA20一系列的氧化反应,经连续氧化失去CO2的过程,最后形成具有生物活性的GA4和GA1,因此其被认为是活性GAs生物合成调控过程中的关键限速酶。研究表明,GA20ox与植物株高、纤维素、花、果和种子发育,以及抗逆性状的形成相关。如棉花(Gossypium hirsutum)[3]和毛白杨(Populus tomentosa)[4]过量表达GA20ox植株变高,而水稻(Oryza sativa)[5-6]和烟草(Nicotiana tabacum)[7]反义转基因植株显矮化。赤松(Pinus densiflora)GA20ox1过量表达转化杨,促进了纤维细胞的次生壁增厚和伸长[8]。棉花GhGA20ox1过表达转化番茄(Lycopersicon esculentum)果实变小,单个果实的种子数减少[9]。水稻OsGA20ox2干扰转基因植株提高了对稻瘟病和白叶枯病菌的抗性,而OsGA20ox3过表达植株则易受到病原体侵染[10]。结缕草(Zoysia Japonica)GA20ox遗传转化高羊茅(Festuca elata),其转正义基因的高羊茅植株表型呈生长较快,植株变细,叶色变浅;转反义基因的植株生长较缓慢,叶子变粗[11]

    小黑杨(Populus simonii ×P.nigra)是小叶杨(P. simonii)与欧洲黑杨(P.nigra)的杂交种,具有适应性好、抗逆性强、生长速度较大等优点,是东北地区的主要栽培杨树品种。前期工作中,我们克隆了小黑杨PsnGA20ox1并发现其过表达会对烟草纤维长度、次生细胞壁组份等性状产生显著影响[12]。同时,转基因烟草叶片变大、颜色加深,我们推测PsnGA20ox1过表达对烟草叶片发育也产生了影响。因此,本项研究在分析PsnGA20ox1在小黑杨各组织中表达特异性的同时,系统分析了PsnGA20ox1过表达对烟草叶片大小与生物量、叶片超微结构,叶绿素和生物活性GAs含量,叶片表皮细胞与气孔发育相关基因表达的影响。本项研究有助于进一步了解GA20ox在植物叶片发育过程中的生物学功能。

    • PsnGA20ox1组织表达特异性分析材料为温室内1年生小黑杨,分别取初生分生茎顶芽(顶端分生组织)、次生区节间、韧皮部、过渡区木质部、次生区木质部、初生区叶片、过渡区叶片和次生区叶片,液氮速冻后于-80℃保存用于RNA提取。

      野生型烟草与PsnGA20ox1过表达二代烟草种子由东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室保存。PsnGA20ox1过表达二代烟草转基因株系的种子在抗性MS培养基(含50mg/mL Kan)培养筛选,野生型烟草种子在不含KanMS培养基上培养。1周后,待幼苗长出3~4片叶子,将其移植到土中,保持室内温度(25±2)℃。转基因烟草生长1个月时,取第3~5个叶片材料液氮速冻后于-80℃保存,用于GAs含量和叶绿素含量测定和基因表达分析。取第4叶片用于超微结构分析。

    • PsnGA20ox1过表达烟草生长到3个月时,测定第4和第5叶片长和宽,并采收所有叶片称量鲜质量。随后,叶片在烘箱中80℃烘干2h,接着60℃烘干至恒质量测定干质量。

    • 新鲜烟草叶片叶绿素含量按照文献[13]中的乙醇(95%乙醇)提取法提取后,在波长652nm下测定吸光度,叶绿素总量根据下式求导:D652=34.5C,式中:D652为叶绿素a与b在红光区吸收光谱曲线的交叉点(等吸收点)处测定叶绿素溶液的光密度,C为叶绿素总量,34.5为叶绿素a、b在波长652nm处的吸收系数。以对应提取剂为空白,每个植物样品重复3次。

    • 烟草中活性GAs主要为GA1和GA4,而GA20和GA9分别是前2者的前体物质,因此本实验中对上述4种GAs的含量进行了测定。

      色谱条件:Merck RP-C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm,Merck,德国);柱温25℃;进样量5μL;流动相A:0.05%甲酸水溶液;流动相B:乙腈;流速为1mL/min;梯度洗脱程序:0~20min,30%B~70%B。

      质谱条件:MS/MS (Agilent HPLC-UV 1200三重四极杆串联质谱仪6460);电喷雾离子源;毛细管电压:2kV;气体温度:250℃;气体流量:10L/min;压力:138kPa(20psi);鞘气温度:250℃;鞘气流量:12L/min;鞘气与碰撞气均为氮气(N2,99.999%)。

      试剂:C18(50μm,Dikma公司),尼龙注射器滤器(4mm,0.45μm,美国National Scientific公司),甲醇、乙腈、正己烷(德国Merck公司),甲酸(美国Sigma公司),所用试剂均为色谱纯。GA1、GA4、GA20和GA9标准样品(纯度≥98%)购自Sigma-Aldrich。混合标准储备液中GA1、GA4、GA20和GA9浓度均为1mg/mL。采用乙腈配制,棕色瓶-20℃。

      测定程序:烟草叶片在液氮下研磨储存于-20℃下备用。取0.5g处理后的样品于预冷研钵中,加入2g C18填料,加入2mL正己烷研磨3min。将该混合物放入10mL SPE柱管中,柱管上下分别用聚乙烯滤片压紧形成MSPD柱。将该MSPD柱用千式真空泵抽3min。以10mL 80%冷甲醇水溶液(v/v)于4℃下冼脱。收集洗脱液,室温下氮吹后用冷冻干燥机进行冷冻干燥,用50μL甲醇定容;经0.45μm尼龙注射器滤器过滤至样品瓶后,供HPLC-MS/MS (Agilent HPLC-UV 1200三重四极杆串联质谱仪6460)测定。每个植物样品重复3次。

    • 第3或第4叶片经液氮速冻淬断后直接置于电镜样品台上, 离子溅射仪(日立E1010)喷金和镀膜后,在扫描电镜(日立S-4800)下观察样品、拍摄图片。

    • 杨树各组织与烟草组织RNA提取按参考文献[14]方法,随后采用DNase I (Qiagen)去除基因组DNA。

      小黑杨不同组织和烟草叶片5μg总RNA合成cDNA后分别用于不同基因相对表达量分析。采用荧光定量试剂盒(罗氏FastStart Universal SYBR Green Master)和Applied Biosystems 7500实时定量PCR仪进行qRT-PCR反应。PsnGA20ox1在小黑杨各组织和过表达烟草中qRT-PCR分析所用引物见表 1

      表 1  烟草气孔发育相关基因qRT-PCR引物

      Table 1.  qRT-PCR primers of genes involved in stomatal and epidermal cell development of tobacc

      基因名
      Gene name
      登录号
      Accession No.
      引物名称
      Primer name
      引物序列(5′-3′)
      Primer sequence(5′-3′)
      Actin2 AB158612.1 Actin-S
      Actin-A
      GATCTTGCTGGTCGTGATCT
      ACTTCCGGACATCTGAACCT
      ER JQ267739.1 ER-S
      ER-A
      GAAGGTTTTGGTAGTTACACGTAGC
      AGGGTGAGTCGTTGTCTAGAAGG
      ERL1 XM_009764054.1 ERL1-S
      ERL1-A
      GACTCCATTGCTTTTTGTTCTTAA
      CTCAGAAGTAAAATCCCAAGAAGC
      ERL2 XM_009785106.1 ERL2-S
      ERL2-A
      CAGGCTTTCAGGTACTCTACCATC
      GCCCTCTGAGTCTTGAAGAATTTG
      MPK3 XM_009804071.1 MPK3-S
      MPK3-A
      TGCTCGGTGTTGAATACGG
      GGTCTAAATGGCGGAGGAG
      MKK4 XM_009760486.1
      MPK4-S
      MPK4-A
      GCCTTCAGATGTGCCGTG
      CCCTTCGAGAGAGCCTTTATC
      EPF1 XM_009760610.1 EPF1-S
      EPF1-A
      GTGATGATATTGGCGGCG
      ACTTGTAGTTTCTGGCATCGG
      EPF2 XM_009791751.1 EPF2-S
      EPF2-A
      TTACCAGATTGTTCCCATGC
      TCAATTGGAAGGGACATGG
      STOMAGEN XM_009767439.1 STOMAGEN-S
      STOMAGEN-A
      ATGAGGGAAAAAGATGGGTG
      CCTCCACTGGGACTTGCTC
      SPCH XP_009801585.1 SPCH-F
      SPCH-R
      GTTCTACAATCTCTGGAGGCG
      TGGACTTTCAGGTGTGGGAC
      SCRM XP_009769541.1 SCRM-F
      SCRM-R
      GCAGCAGATGTAGACTGGTTCA
      AGTTACTATTGTTTTCAGTTTCGG
      SCRM2 XP_009769541.1 SCRM2-F
      SCRM2-R
      GCAAAACCAAAACCATACTGAC
      GAAGCTGAAGATGAAGATGAGG
      MUTE XP_009765536.1 MUTE-F
      MUTE-R
      TGCACCACAAACTGGCTTC
      GTTCCCCGTGGCCCTC
      FAMA XP_009795997.1 FAMA-F
      FAMA-R
      ACAACAACAACAACAACACGAG
      TTCCTCTGATACCTTGGCTTG
      CYCD2;1 XP_009789780.1 CYCD2;1-F
      CYCD2;1-R
      TGGAGTTTTTGCCTAAAGATG
      TCAAAATCCAATCAAGAGCC
      CYCD3;1 XP_009788121.1 CYCD3;1-F
      CYCD3;1-R
      TATTTTGGGAAGATGAAGAGC
      CACAGAATCAACACGGGC

      富含亮氨酸的受体激酶ERECTA家族基因ERERL1和ERL2[15-16], 促分裂原蛋白活化激酶级联信号通路基因MPK3和MPK4[17], 表皮模式因子基因EPF1、EPF2[18-19],和成熟叶片的叶肉模式调控因子STOMAGEN[20]是叶片气孔发育调控网络信号传导的主要基因。SPEECHLESS (SPCH)、MUTEFAMASCREAM (SCRM)、SCREAM2 (SCRM2)是直接调控气孔发育bHLH类转录因子基因[21-22]。细胞分裂周期蛋白基因CYCD2;1和CYCD3;1与细胞分裂速度相关[23]。本项研究采用qRT-PCR技术分析了PsnGA20ox1过表达烟草叶片中上述同源基因的相对表达量。各基因qRT-PCR分析时所用引物见表 1,各基因相对参考基因NtActin2的表达量采用2-ΔΔCT法计算。所有数据均为3次生物学重复和3次技术重复。

    • 转基因烟草与野生型对照数据采用学生氏t test (http://www.graphpad.com/quickcalcs/ttest1.cfm)进行统计分析。图表中数据为3次生物学重复的均值,且垂直线代表标准偏离值。两组群体间数据差异显著(P < 0.05)或极显著(P < 0.01)。

    • 为了确定PsnGA20ox1是否参与叶片发育过程,首先利用qRT-PCR技术对PsnGA20ox1在小黑杨各组织中的表达情况进行了研究。结果(图 1)表明,PsnGA20ox1在小黑杨的顶端分生组织、次生区节间、韧皮部、过渡区木质部、次生区木质部、初生区叶片、过渡区叶片和次生区叶片中均表达,但相对表达量不同。其中,次生区木质部中其表达丰度最高,其次为初生区叶片,在过渡区木质部、韧皮部、顶端分生组织中则表达丰度中等,而在过渡区叶片、次生区叶片和次生节间组织中表达丰度相对最低。上述结果初步表明,PsnGA20ox1主要功能是参与节间生长和次生组织形成外,同时在叶片发育中也发挥一定作用。

      图  1  PsnGA20ox1在小黑杨不同组织中表达模式

      Figure 1.  PsnGA20ox1 expression patterns in different tissues of Populous simonii×Populus nigra

    • 为了确认转基因烟草株高增加和叶片增大(图 2A2B)是由PsnGA20ox1的过表达所致,我们利用qRT-PCR技术分析了转基因烟草中PsnGA20ox1的表达量。结果(图 2C)表明,转基因烟草株系中PsnGA20ox1的mRNA表达量极高,而野生型烟草中无PsnGA20ox1的表达。

      图  2  转基因烟草PsnGA20ox1表达量、GAs含量与表型

      Figure 2.  PsnGA20ox1 expression level, GAs content and phonotype of tobacco

      GA20ox1是GAs合成的限速酶基因,PsnGA20ox1表达量升高势必引起烟草叶片GAs含量上升。为此,利用HPLC-MS/MS串联质谱仪对烟草叶片GA1、GA4、GA9和GA20含量进行了测定。结果(图 2D)表明,与野生型相比,PsnGA20ox1过表达烟草中活性GA4含量增加约300%,且其前体物质GA9含量也增加31.2%。然而,活性GA1及其前体物质GA20含量仅略高于对照,但无显著差异。PsnGA20ox1过表达对烟草叶片长宽与生物量统计分析表明,转基因烟草叶片长与宽,鲜质量与干质量与野生型相比分别增加了40.1%和24.5%、210%和180%(图 2E2F)。上述结果表明,PsnGA20ox1在烟草中被正确翻译成GA20ox后促进了活性GA4的生物合成,从而导致叶片变大、生物量增加。

    • 我们推测导致PsnGA20ox1过表达烟草叶片大小与生物量变化的直接原因,可能是叶片超微结构的变化,为此我们利用扫描电镜对烟草叶片的超微结构进行了观测。结果表明,与野生型相比(图 3A3C3E)过表达PsnGA20ox1烟草表皮细胞明显变小、气孔数量增加约3倍(图 3B3D),而且栅栏组织长度与海绵组织厚度均有明显增加(图 3F)。

      图  3  过表达PsnGA20ox1对烟草叶片超微结构影响

      Figure 3.  Effects of PsnGA20ox1 overexpression on leaf ultrastructure of tobacco

      栅栏组织与海绵组织体积变化以及气孔数量增加可能对叶绿素含量和光合作用产生影响,为此我们对转基因烟草叶片叶绿素含量和光合速率进行了测定和分析。结果(图 4A4B)表明,与野生型相比,转基因烟草叶绿素含量与光合速率分别增加了31.3%和49%。上述结果表明,PsnGA20ox1过表达影响叶片的超微结构,从而提高了转基因烟草的叶绿素含量和光合速率。

      图  4  PsnGA20ox1过表达对烟草叶绿素含量与光合作用影响

      Figure 4.  Effects of PsnGA20ox1 overexpression on chlorophyll and photosynthetic rate of tobacco

    • 为初步了解转基因烟草叶片表皮细胞大小与气孔数量变化背后的分子机制,我们采用qRT-PCR方法研究了PsnGA20ox1过表达烟草叶片表皮细胞与气孔发育相关基因的表达水平。结果(图 5)表明,与野生型烟草相比,转基因烟草气孔发育负调控信号传导基因ERERL1、ERL2、MAPK3、MAPK4、EPF1和EPF2表达量显著下降,而气孔发育正调控信号传导基因STOMAGEN表达量显著上升。同时,气孔发育正调控转录因子SPCHMUTEFAMASCRMSCRM2,细胞分裂周期蛋白基因CYCD2;1和CYCD3;1表达量极显著上升。

      图  5  过表达PsnGA20ox1对烟草表皮与气孔发育相关基因表达影响

      Figure 5.  Effects of PsnGA20ox1 overexpression on the expression level of genes involved in epidermal cell and stomatal development of tobacco

    • 本研究发现,PsnGA20ox1过表达烟草除株高增加外[12],叶片大小、生物量与超微结构均发生了显著变化。如叶片栅栏组织与海绵组织明显加厚。Fagoaga等[24]在过表达CcGA20ox1甜橙(Citrus sinensis)的叶片解剖结构分析时也发现了同样的变化。此外,Biemelt等[25]也发现过表达AtGA20ox1烟草叶片有增厚现象。同时,qRT-PCR和活性GAs含量测定表明,过表达烟草中PsnGA20ox1能正确翻译且活性GA4含量增加近3倍。而另一方面,由于叶片超微结构变化和气孔数量的增加,提高了PsnGA20ox1过表达烟草叶绿素含量和光合速率,从而促进了叶片碳水化合物的积累,最终导致叶片鲜质量与干质量显著增加。考虑到GAs在植物生长发育过程中生物学功能[26],我们推测PsnGA20ox1过表达引起的GA4含量上升可能造成叶片上述性状发生了变化。

      生物活性GA1和GA4分别通过13-羟基化和非-13-羟基化2条平行途径合成,并且在不同植物中这2种活性物质及其对应的合成途径所占的比例是不同的[27]。如GA1是豌豆(Pisum sativum)中主要活性GA[28],而拟南芥(Arabidopsis)中则为GA4[29]。研究表明,烟草中活性GAs主要是GA1而非GA4[30]。然而,本项研究却发现PsnGA20ox1过表达烟草GA4含量增加而GA1含量无显著变化。同时,GA4前体物质GA9含量也显著增加,而GA1前体物质GA20却与野生型相比无显著差异。这一结果与过表达CcGA20ox烟草中活性GA4含量增加是一致的[31]。造成上述差异的原因可能是GA20ox过表达促进了非-13-羟基化途径、抑制了13-羟基化合成途径,从而使GA9及活性GA4含量显著提高,而GA20及活性GA1含量无显著变化。然而,研究发现,过表达CcGA20ox1甜橙中GA1和GA4含量却增加[24]。上述结果表明,过表达GA20ox植株中哪种活性GAs含量上升随转化物种不同而不同。

      GA20ox过表达杨树和桔树等多年生乔木,植株节间长度的增加是细胞分裂的结果[32]。而当年生植物拟南芥与烟草等,GA20ox过表达植株节间长度的增加依赖于细胞的伸长而非细胞分裂[33-34]。如前期对过表达PsnGA20ox1烟草次生性状研究时发现,转基因植株高生长增加、茎间纤维长度显著增加[12]。然而,本项研究却发现,过表达PsnGA20ox1烟草叶片表皮细胞变小,而且控制细胞分裂的细胞周期蛋白基因CYCD2;1和CYCD3;1表达量显著提高。由此可见,过表达PsnGA20ox1烟草叶片长宽增大的直接原因是细胞分裂加速。这不仅与GA20ox过表达导致草本植物节间细胞伸长的结果不符,而且与过表达PsnGA20ox1烟草茎部纤维长度增加的现象也不同。我们推测PsnGA20ox1过表达对烟草细胞分裂和伸长的影响可能随组织和器官的不同而异。然而,这种差异的具体机制仍需进一步研究。

      过表达PsnGA20ox1烟草气孔大小不变、但数量明显增加。qRT-PCR研究进一步发现,转基因烟草中抑制气孔发育的信号肽基因ERERL1和ERL2以及小分子分泌肽基因MAPK3、MAPK4、EPF1和EPF2表达量显著下降,而促进气孔发育的小分子分泌肽基因STOMAGEN显著上升。此外,促进气孔发育的转录调控因子SPCHMUTEFAMASCRMSCRM2均显著上调表达。已有研究证明,植物激素油菜素甾醇(Brassino steroids, BRs)、脱落酸(ABA)和生长素对气孔发育具有直接调控作用[35]。如BR通过磷酸化MAPKKK蛋白激酶(YODA)和SPCH转录因子来调控气孔的发育[36-37]。ABA作用于SPCHMUTE的上游调节气孔发育[38]。Zhang等[39]发现生长素反应因子ARF5可直接与STOMAGEN启动子区域结合而抑制STOMAGEN的转录, 从而降低对EPF1/2-TMM/ERECTA-MAPK通路的抑制作用, 使得气孔发育减弱。虽然没有证据表明PsnGA20ox1过表达导致的活性GA4含量上升是造成了上述基因表达量变化的直接原因,但研究表明,GAs可通过GAGID1-DELLA复合物, 尤其是DELLA蛋白可与植物体内多种激素互作从而形成复杂的网络参与植物的生长发育过程[40]。如活性GAs和IAA能各自正向调节对方的生物合成和水平,并通过控制不同过程共同促进茎的伸长[41]。因此,我们推测过表达PsnGA20ox1烟草中GA4含量上升使植物体各种内激素含量的平衡状态被打破,导致各激素对上述气孔发育相关基因表达调控发生了改变,从而使转基因烟草气孔数量发生改变。虽然过表达PsnGA20ox1导致叶片结构发生改变的分子机制仍需进一步研究,但本项研究对于全面了解植物GA20ox1的生物学功能有积极的推动作用。

参考文献 (41)

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