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刺激植物响应蛋白基因Epl1克隆、原核表达及功能初探

遇文婧 宋小双 邓勋 平晓帆 周琦 刘志华

遇文婧, 宋小双, 邓勋, 平晓帆, 周琦, 刘志华. 刺激植物响应蛋白基因Epl1克隆、原核表达及功能初探[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(1): 17-26. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170249
引用本文: 遇文婧, 宋小双, 邓勋, 平晓帆, 周琦, 刘志华. 刺激植物响应蛋白基因Epl1克隆、原核表达及功能初探[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(1): 17-26. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170249
Yu Wen-jing, Song Xiao-shuang, Deng Xun, Ping Xiao-fan, Zhou Qi, Liu Zhi-hua. Cloning, prokaryotic expression and function of the eliciting plant response protein of Trichoderma asperellum[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(1): 17-26. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170249
Citation: Yu Wen-jing, Song Xiao-shuang, Deng Xun, Ping Xiao-fan, Zhou Qi, Liu Zhi-hua. Cloning, prokaryotic expression and function of the eliciting plant response protein of Trichoderma asperellum[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(1): 17-26. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170249

刺激植物响应蛋白基因Epl1克隆、原核表达及功能初探

doi: 10.13332/j.1000-1522.20170249
基金项目: 

国家自然科学基金项目 31670649

国家自然科学基金项目 31700564

哈尔滨市应用技术研究与开发项目科技创新人才 2016RQQXJ235

黑龙江省林科院青年基金项目 2015Q01

详细信息
    作者简介:

    遇文婧,博士,副研究员。主要研究方向:森林保护。Email:ywjlinda2008@163.com 地址:150040黑龙江省哈尔滨市南岗区哈平路134号

    通讯作者:

    刘志华,副教授。主要研究方向:森林保护。Email:lzhnefu@126.com 地址:150040黑龙江省哈尔滨市和兴路26号东北林业大学林学院

  • 中图分类号: S763.1

Cloning, prokaryotic expression and function of the eliciting plant response protein of Trichoderma asperellum

  • 摘要: 目的研究刺激植物响应蛋白Epl1对木本植物山新杨的刺激响应功能, 为开发新一代提高植物免疫的新型诱导剂奠定基础。方法从棘孢木霉ACCC30153菌株中克隆获得一个刺激植物响应蛋白基因Epl1, 并进行序列分析和原核表达, 将获得的原核重组蛋白rEpl1与山新杨组培苗进行互作, 初步探讨rEpl1蛋白对山新杨生长、生理指标、以及生长和防御相关基因转录水平的影响。结果刺激植物响应蛋白基因Epl1的cDNA序列全长为417 bp, 预测蛋白分子量12.6 kDa, 属于Cerato-platanin家族; 通过构建原核表达载体, 成功获得重组蛋白rEpl1;在1 μg/mL rEpl1诱导下, 山新杨组培苗生长较快、根系旺盛, 生物量明显增加, CAT活性在诱导第1 d时为对照的3.51倍, 可溶性糖含量和脯氨酸含量在诱导初期急剧积累; 山新杨生长素基因LAX2/AUX和水杨酸防御基因JAR2的转录水平分别在蛋白诱导2 d和12 h时达到峰值, 分别为对照的873.10和388.02倍。结论Epl1基因的克隆、序列分析和原核表达为进一步研究Epl1蛋白诱导植物系统抗病性提供了理论基础; 重组蛋白rEpl1与山新杨组培苗互作实验, 初步Epl1蛋白能够刺激木本植物在生理及分子水平上的响应, 从而促进生长, 提高抗性。
  • 图  1  Epl1基因的cDNA及DNA扩增结果

    M.DNA;1~4. cDNA扩增产物;5~8. DNA扩增产物。M, DNA marker DL2000; 1-4, PCR product of cDNA; 5-8, PCR product of DNA.

    Figure  1.  PCR analysis of DNA and cDNA of Epl1

    图  2  Epl1的cDNA序列及预测氨基酸序列

    粗体. cDNA序列;斜体. cDNA编码的预测氨基酸序列。Bold, cDNA sequence; Italic, predicted amino acid sequence of cDNA.

    Figure  2.  cDNA sequence and predicted amino acid sequence of Epl1

    图  3  Epl1基因的DNA序列

    Figure  3.  DNA sequence of gene Epl1

    图  4  Epl1基因的氨基酸组成

    Figure  4.  Amino acid composition of Epl1

    图  5  刺激植物响应蛋白Epl1保守区、信号肽及三级结构预测图

    A.Epl1的保守区预测;B.人工神经网络模型(NN)信号肽预测;C.隐马可夫模型(HMM)信号肽预测;D~F.Glu1的三级结构。

    Figure  5.  Prediction image of Epl1 protein conserved region, signal peptide site, phosphorylation site and tertiary structure

    A, prediction of Epl1 protein conserved region; B, signal peptide site predicted by NN; C, signal peptide site predicted by HMM; D-F, tertiary structure of Glu1.

    图  6  重组质粒pGEX-Epl1的检测

    A.PCR检测;B.双酶切检测;M.DNA marker;1~4.转化子质粒的PCR产物;5.转化子质粒的双酶切产物。

    Figure  6.  Detection of recombinant plasmid pGEX-Epl1

    A, PCR detection; B, double enzyme detection; M, DNA marker; 1-4, PCR product of transformant; 5, double enzyme product of transformant.

    图  7  重组蛋白rEpl1的SDS-PAGE检测

    A.不同诱导时间下重组蛋白检测;B.纯化蛋白检测;M.Protein Marker;1和2. IPTG诱导2 h的重组转化子BL21-Epl1上清和沉淀;3和4. IPTG诱导4 h的重组转化子BL21-Epl1上清和沉淀;5和6. IPTG诱导2 h的对照转化子BL21-pGEX上清和沉淀;7和8. IPTG诱导4 h的对照转化子BL21-pGEX上清和沉淀;9.纯化后的重组蛋白。

    Figure  7.  SDS-PAGE detection of recombinant protein rEpl1

    A, detection of recombinant protein under different inducing time; B, detection of purified protein; M, Protein Marker; 1 and 2, the supernatant and precipitate of recombinant BL21-Epl1 by IPTG induced for 2 hours; 3 and 4, the supernatant and precipitate of recombinant BL21-Epl1 by IPTG induced for 4 hours; 5 and 6, the supernatant and precipitate of control BL21-pGEX by IPTG induced for 2 hours; 7 and 8, the supernatant and precipitate of control BL21-pGEX by IPTG induced for 4 hours; 9, purified recombinant protein.

    图  8  rEpl1诱导后山新杨组培苗生长状态

    A为对照;B、C、D分别表示rEpl1诱导质量浓度为0.2、0.5和1 μg/mL。

    Figure  8.  Growth of poplar tissue culture seedlings induced by rEpl1

    A, the control; B-D, the inducing concentration of rEpl1 was 0.2, 0.5 and 1 μg/mL, respectively.

    图  9  rEpl1对山新杨生理指标的影响

    Figure  9.  Effects of rEpl1 on physiology of poplar tissue culture seedlings

    图  10  rEpl1对山新杨生长和防御相关基因的影响

    Figure  10.  Effects of rEpl1 on growth related gene and disease-resistance gene of poplar tissue culture seedlings

    表  1  RT-qPCR引物

    Table  1.   RT-qPCR primers

    基因
    Gene
    基因全称
    Total gene name
    引物
    Primer
    序列(5′-3′)
    Sequence (5′-3′)
    产物大小
    Size of product/bp
    LAX2/AUX Auxin gene LAX2-L TCATTCGGCCTCTTCACCAAGT 213
    LAX2-R GCCATGATTGCCATCACACCTT
    JAR2 Jasmonic acid JAR1-L AGTGGTGAACCAAGCGAGGAG 241
    resistant gene JAR1-R GGATTTGCTGCACCTTGCTGTT
    Tublin β-Tublin gene tu-1 TACCGAGGCTGAGAGTAACAT 245
    tu-2 GGACCCACAACTCATTCACAT
    Ef Elongation factor gene ef-1 TCACACCTGCCACATTGCTGT 230
    ef-2 TCTTGATGACACCAACCGCCAC
    Actin Action gene actin-1 TTCCGTTGCCCTGAGGTCCTAT 239
    actin-2 TCAGGAGGAGCAACCACCTTGA
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    表  2  Epl1基因的氨基酸组成

    Table  2.   Amino acid composition of Epl1

    氨基酸Amino acid 比例Proportion/%
    Ala (A) 13.0
    Gly (G) 10.1
    Thr (T) 9.4
    Ser (S) 8.7
    Leu (L) 8.7
    Val (V) 7.2
    Asn (N) 6.5
    Asp (D) 5.1
    Gln (Q) 4.3
    Tyr (Y) 4.3
    Arg (R) 2.9
    Cys (C) 2.9
    Phe (F) 2.9
    Trp (W) 2.2
    Lys (K) 2.2
    Pro (P) 2.2
    Met (M) 1.4
    His (H) 1.4
    Glu (E) 0.0
    Sec (U) 0.0
    Pyl (O) 0.0
    Ile (I) 0.0
    Asx (B) 0.0
    Glx (Z) 0.0
    Xaa(X) 0.0
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    表  3  不同质量浓度rEpl1对山新杨组培苗生物量的影响

    Table  3.   Effects of varied concentration rEpl1 on biomass of poplar tissue culture seedlings

    生物量Biomass 对照Control 0.2 μg/mL 0.5 μg/mL 1 μg/mL
    株高Plant height 5.17±0.309 5.39±0.353 8.03±0.473 10.1±0.396
    根长Root length 1.27±0.866 1.54±0.649 3.23±0.588 4.08±0.411
    叶片数Leaf number 6.7±0.597 7.1±0.563 7.7±0.649 9.1±0.440
    鲜质量Fresh mass 0.988 5±0.708 1.142 5±0.893 1.397 3±0.686 1.616 4±0.459
    干质量Dry mass 0.223 7±2.213 0.184 04±1.103 0.383 5±1.531 0.560 8±0.678
    下载: 导出CSV
  • [1] 王允.棘孢木霉和球毛壳菌免疫诱导蛋白及其功能研究[D].哈尔滨: 哈尔滨工业大学, 2013.

    Wang Y. Immunity-inducing proteins from Trichoderma asperellum and Chaeromium globosum and their functional analysis [D]. Harbin: Harbin Institute of Technology, 2013.
    [2] Vargas W A, Djonovic's S, Sunkno S A, et al. Dimerization controls the activity of fungal elicitors that trigger systemic resistance in plants [J]. Journal of Biological Chemistry, 2008, 283(28):19804-198015. doi:  10.1074/jbc.M802724200
    [3] Wang Y, Song J Z, Wu Y J, et al. Eplt4 proteinaceous elicitor produced in Pichia pastoris has a protective effect against Cercosporidium sofinum infections of soybean leaves [J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2013, 169(3):722-737. doi:  10.1007/s12010-012-0015-z
    [4] 孙丽丽, 曹传旺, 薛旭亭, 等.棘孢木霉可湿性粉剂研制及杀菌活性测定.北京林业大学学报, 2015, 37(6):45-52. doi:  10.13332/j.1000-1522.20140438

    Sun L L, Cao C W, Xue X T, et al. Preparation and fungicidal bioactivity of wettable powder formulations of Trichoderma asperellum [J]. Journal of Beijing Forestry University, 2015, 37(6):45-52. doi:  10.13332/j.1000-1522.20140438
    [5] Buensanteai N, Mukherjee P K, Horwitz B A, et al. Expression and purification of biologically active Trichoderma virens proteinaceous elicitor Sm1 in Pichia pastoris [J]. Protein Expression and Purification, 2010, 72(1):131-138. http://www.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=perio&id=433bdb01f17d26bb6e71fca0a4ee279f
    [6] 尹大川, 杨立斌, 邓勋, 等.绿木霉对樟子松苗木生长指标及生理生化指标的影响.北京林业大学学报, 2015, 37(1):79-83. doi:  10.13332/j.cnki.jbfu.2015.01.012

    Yin D C, Yang L B, Deng X, et al. How Trichoderma virens affects growth indicators, physiological and biochemical parameters of Pinus sylvestris var. mongolica seedlings [J]. Journal of Beijing Forestry University, 2015, 37(1):79-83. doi:  10.13332/j.cnki.jbfu.2015.01.012
    [7] Djonovic'S, Pozo M J, Dangott L J, et al. Sm1, a proteinaceous elicitor secreted by the biocontrol fungus Trichoderma virens induces plant defense responses and systemic resistance [J]. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2006, 19(8):838-853. doi:  10.1094/MPMI-19-0838
    [8] Martin F, Aerts A, Ahrén D, et al. The genome of Laccaria bicolor provides insights into mycorrhizal symbiosis [J]. Nature, 2008, 452:88-92. doi:  10.1038/nature06556
    [9] Frischmann A, Neudl S, Gaderer R, et al. Self-assembly at air/water interfaces and carbohydrate binding properties of the small secretedprotein EPL1 from the fungus Trichoderma atroviride [J]. Journal of Biological Chemistry, 2013, 288(6):4278-4287. doi:  10.1074/jbc.M112.427633
    [10] 刘北东, 杨谦, 周麒, 等.绿色木霉AS3.3711的葡聚糖内切酶Ⅰ基因的克隆与表达[J].北京林业大学学报, 2004, 26(6):71-75. doi:  10.3321/j.issn:1000-1522.2004.06.014

    Liu B D, Yang Q, Zhou Q, et al. Cloning and expression of the endo-β-glucanase Ⅰ cDNA gene from Trichoderma viride AS3.3711 [J]. Journal of Beijing Forestry University, 2004, 26(6):71-75. doi:  10.3321/j.issn:1000-1522.2004.06.014
    [11] Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T. Molecular clong: a laboratory manual[M]. New York: CSHL Press, 1989.
    [12] 张立春, 金海国, 李赵志, 等.延边黄牛转铁蛋白受体2基因克隆与序列分析[J].中国农业科学, 2012, 45 (10):2022-2030. doi:  10.3864/j.issn.0578-1752.2012.10.015

    Zhang L C, Jin H G, Li Z Z, et al. Cloning and sequence analysis of the transfer in receptor 2 gene from Yanbian yellow cattle [J]. Scientia Agricultura Sinica, 2012, 45 (10):2022-2030. doi:  10.3864/j.issn.0578-1752.2012.10.015
    [13] Liu Z H, Yang Q, Hu S, et al. Cloning and characterization of a novel chitinase gene (chi46) from Chaetomium globosum and identification of its biological activity [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2008, 80(2):241-252. doi:  10.1007/s00253-008-1543-x
    [14] Dou K, Wang Z Y, Zhang R S, et al. Cloning and characteristic analysis of a novel aspartic protease gene Asp55 from Trichoderma asperellum ACCC30536 [J]. Microbiological Research, 2014, 169(12):915-923. doi:  10.1016/j.micres.2014.04.006
    [15] Fan H J, Liu Z H, Zhang R S, et al. Functional analysis of a subtilisin-like serine protease gene from biocontrol fungus Trichoderma harzianum [J]. Journal of Microbiology, 2004, 52(2):129-138. http://d.old.wanfangdata.com.cn/Conference/8984022
    [16] 刘胜男, 刘志华, 王玉成.怪柳转录因子基因ThbZIP1的原核表达及重组蛋白纯化[J].东北林业大学学报, 2015, 26(4):23-27.

    Liu S N, Liu Z H, Wang Y C. Prokaryotic expression of transcription factor gene ThbZIP1 from Tamarix hispida and purification of recombinant rThbZIP1 protein [J]. Journal of Northeast Forestry University, 2015, 26(4):23-27.
    [17] 孙海涛, 杨化强, 杨璐军, 等.人Tau基因多表位肽段原核表达载体的构建与表达[J].南方医科大学学报, 2012, 32(2): 185-188. http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/dyjydxxb201202011

    Sun H T, Yang H Q, Yang L J, et al. Construction of a prokaryotic expression vector of human taumulti-epitope peptide and immunogenicity of the expressed product [J]. Journal of Southern Medical University, 2012, 32(2):185-188. http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/dyjydxxb201202011
    [18] 李合生.植物生理生化实验原理和技术[M].北京:高等教育出版社, 2000.

    Li H S. Principle and technology of plant physiological and biochemical experiments [M]. Beijing: Higher Education Press, 2000.
    [19] Shoresh M, Harman G E, Mastouri F. Induced systemic resistance and plant responses to fungal biocontrol agents [J]. Annual Review of Phytopathology, 2010, 48:21-43. doi:  10.1146/annurev-phyto-073009-114450
    [20] 遇文婧, 刘志华, 刁桂萍, 等.刺激植物响应蛋白基因TatEpl1的克隆及原核表达载体构建[J].北方园艺, 2015 (16):93-97. http://www.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=perio&id=bfyany201516022

    Yu W J, Liu Z H, Diao G P, et al. Cloning and prokaryotic expression vector construction of eliciting plant response protein gene TatEpl1 [J]. Northern Horticulture, 2015 (16):93-97. http://www.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=perio&id=bfyany201516022
    [21] Seidli V, Marchetti M, Schandl R, et al. Epl1, the major secreted protein of Hypocrea atroviridis on glucose, is a member of a strongly conserved protein family comprising plant defense response elicitors [J]. FEBS Journal, 2006, 273(18):4346-4359. doi:  10.1111/ejb.2006.273.issue-18
    [22] Wilson L M, Idnurm A, Howlett B J. Characterization of a gene (sp1) encoding a secreted protein from Leptosphaeria maculans, the blackleg pathogen of Brassica napus [J]. Molecular Plant Pathology, 2002, 3(6):487-493. doi:  10.1046/j.1364-3703.2002.00144.x
    [23] 司马晓娇, 郑炳松.植物生长素原初响应基因Aux/IAA研究进展[J].浙江农林大学学报, 2015, 32(2):313-318. http://www.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=perio&id=zjlxyxb201502021

    Sima X J, Zheng B S. Advances in primary auxin-responsive Aux/IAA gene family: a review[J]. Journal of Zhejiang A & F University, 2015, 32(2):313-318. http://www.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=perio&id=zjlxyxb201502021
    [24] 张立慧, 田时炳, 王志敏, 等.茄子3个Aux/IAA基因的克隆及表达分析[J].园艺学报, 2015, 42(10):2049-2058. http://www.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=perio&id=yyxb201510019

    Zhang L H, Tian S B, Wang Z M, et al. Gene cloning and expression analysis of three Aux/IAA genes in eggplant [J]. Acta Horticulturae Sinica, 2015, 42(10):2049-2058. http://www.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=perio&id=yyxb201510019
    [25] Tian Q, Uhlir N J, Reed J W. Arabidopsis SHY2/IAA3 inhibits auxin-regulated gene expression [J]. The Plant Cell, 2002, 14(2):301-319. doi:  10.1105/tpc.010283
    [26] Heath M C. Non-host resistance and nonspecific plant defenses [J]. Current Opinion in Plant Biology, 2000, 3(4):315-319. doi:  10.1016/S1369-5266(00)00087-X
    [27] Pieterse C M J, Van L L C. NPR1: the spider in the web of induced resistance signaling pathways [J]. Current Opinion in Plant Biology, 2004, 7(4):456-464. doi:  10.1016/j.pbi.2004.05.006
    [28] Weigel R R, Pfitznter U M, Gatz C. Interaction of NIMIN1 with NPR1 modulates PR gene expression in Arabidopsis [J]. The Plant Cell, 2005, 17(4):1279-1291. doi:  10.1105/tpc.104.027441
    [29] 韩雪.地被植物在哈尔滨的引种及应用试验的研究[D].哈尔滨: 东北林业大学, 2007.

    Han X. Study on application of several introduced ground cover plants [D]. Harbin: Northeast Forestry University, 2007.
    [30] 刘彤, 祝佳媛, 李鹏, 等.秋冬季自然降温过程中东北红豆杉幼苗的生理生化特性[J].东北林业大学学报, 2013, 35(2): 51-56. doi:  10.3969/j.issn.1000-5382.2013.02.013

    Liu T, Zhu J Y, Li P, et al. Physiological and biochemical characteristics of Japanese yew seedlings as natural temperature falling in autumn and winter [J]. Journal of Beijing Forestry University, 2013, 35(2): 51-56. doi:  10.3969/j.issn.1000-5382.2013.02.013
  • [1] 周晴, 吴剑, 桑亚茹, 赵征洋, 刘美芹, 张平冬.  秋水仙碱处理诱导银灰杨2n花粉与杂种三倍体创制 . 北京林业大学学报, 2020, 42(3): 119-126. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190363
    [2] 吴晓娟, 鲁俊倩, 常英英, 钟姗辰, 苏晓华, 张冰玉.  AtDME1基因‘84K’杨的获得及目的基因诱导表达分析 . 北京林业大学学报, 2020, 42(6): 26-32. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190068
    [3] 李健康, 于丹阳, 崔彬彬, 陆超, 张自和, 刘泽东, 孙宇涵, 李云.  秋水仙碱对银杏和毛新杨雄株生殖细胞的生理影响 . 北京林业大学学报, 2019, 41(7): 83-90. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190133
    [4] 杨晨阳, 于超, 马玉杰, 罗乐, 潘会堂, 张启翔.  基于SSR标记和单拷贝核基因的蔷薇属植物系统发生分析 . 北京林业大学学报, 2018, 40(12): 85-96. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180088
    [5] 孙延爽, 邢宝月, 杨光, 刘桂丰.  NaHCO3胁迫对转TaLEA基因山新杨生长及光合、叶绿素荧光特性的影响 . 北京林业大学学报, 2017, 39(10): 33-41. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170099
    [6] 曹山, 蒋璐瑶, 李丽红, 要笑云, 张强, 撖静宜, 王莹, 李慧, 陆海.  毛果杨中链酰基辅酶A合成酶的克隆及酶学分析 . 北京林业大学学报, 2016, 38(7): 9-15. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160121
    [7] 周姗, 李思达, 董恒, 詹亚光, 曾凡锁.  白桦BpHO基因非生物胁迫及信号诱导的表达模式分析 . 北京林业大学学报, 2015, 37(11): 69-75. doi: 10.13332/j.1000-1522.20140485
    [8] 郭鹏, 邢鑫, 张万筠, 姜健.  欧美杨脱水素PdDHN2b的克隆与表达分析 . 北京林业大学学报, 2015, 37(1): 22-36. doi: 10.13332/j.cnki.jbfu.2015.01.017
    [9] 曲赞霜, 钱婷婷, 侯聪, 张力杰, 魏志刚.  小黑杨碳酸酐酶家族基因表达特性分析 . 北京林业大学学报, 2015, 37(2): 94-99. doi: 10.13332/j.cnki.jbfu.2015.02.016
    [10] 师静, 刘美芹, 史军娜, 赵晓鑫, 卢存福, 尹伟伦.  沙冬青胚胎晚期发生丰富蛋白基因序列及表达特性分析 . 北京林业大学学报, 2012, 34(4): 114-119.
    [11] 史军娜, 刘美芹, 刘杰, 陈玉珍, 卢存福.  沙冬青A20/AN1锌指蛋白基因序列及表达分析 . 北京林业大学学报, 2012, 34(2): 103-108.
    [12] 史军娜, 刘美芹, 师静, 王艳萍, 智冠华, 陈玉珍, 卢存福.  沙冬青GATA型锌指蛋白基因序列及表达分析 . 北京林业大学学报, 2011, 33(3): 21-25.
    [13] 郭鹏, 邢海涛, 夏新莉, 尹伟伦.  3个新引进黑杨无性系间水分利用效率差异性研究 . 北京林业大学学报, 2011, 33(2): 19-24.
    [14] 徐筱, 徐倩, 张kai, 徐吉臣.  植物扩展蛋白基因的研究进展 . 北京林业大学学报, 2010, 32(5): 154-162.
    [15] 张冰玉, 苏晓华, 郑书星.  山新杨叶片高频率植株再生体系建立及其遗传稳定性 . 北京林业大学学报, 2008, 30(3): 68-73.
    [16] 于海霞, 周艳萍, 刘足根, 奚如春, 郑景明, 张春晓, 许景伟, 武林, 张建军, 焦雯珺, 周睿, 陆平, 宋先亮, 雷妮娅, 张志山, 郎璞玫, 吴家兵, 李俊, 马玲, 吕文华, 索安宁, 金则新, 高克昌, 李黎, 邵杰, 于文吉, 孙志蓉, 戴伟, 张小由, 朱教君, 毕华兴, 陈少良, 朱清科, 于志明, 陈勇, 赵秀海, 纳磊, 李钧敏, Kwei-NamLaw, 关德新, 郑红娟, 翟明普, 余养伦, 韦方强, 饶兴权, 李传荣, 习宝田, 葛剑平, 马履一, 赵文喆, 赵广杰, 蔡锡安, 盖颖, 赵平, 李增鸿, ClaudeDaneault, 樊敏, 李笑吟, 张宇清, 袁小兰, 王瑞刚, 谭会娟, 王天明, 张春雨, 夏良放, 于波, 江泽慧, 崔鹏, 朱艳燕, 曾小平, 李俊清, 贾桂霞, 张弥, 王文全, 杨永福, 方家强, 马履一, 何明珠, 陈雪梅, 韩士杰, 王卫东, 郭孟霞, 殷宁, 吴秀芹, 李丽萍, 李庆卫, 刘丽娟, 贺润平, 唐晓军, 袁飞, 邓宗付, 王贺新, 张欣荣, 郑敬刚, 于贵瑞, 毛志宏, 蒋湘宁, 吴记贵, 王月海, 江杰, 熊颖, 王娜, 刘鑫, 孔俊杰, 王旭琴, 李新荣, 王瑞辉, 林靓靓, 聂立水, 孙晓敏, 葛剑平, 王贵霞, 郭超颖, 董治良.  吸水剂提高群众杨的抗盐性及其机理 . 北京林业大学学报, 2007, 29(1): 79-84.
    [17] 邓小文, 胡胜华, 吴彩燕, 秦爱光, 颜绍馗, 张洪江, 胡万良, 何亚平, 黄荣凤, 殷亚方, 王芳, 袁怀文, 毛俊娟, 张璧光, 白岗栓, 杨平, 魏潇潇, 刘杏娥, 高黎, 张莉俊, 王费新, 李瑞, 郑小贤, 周永学, 张克斌, 孙向阳, 谭学仁, 赵天忠, 王小青, 费世民, NagaoHirofumi, 王兆印, 张岩, 杜社妮, 罗晓芳, 汪思龙, 王正, 刘燕, 戴思兰, 王胜华, 王晓欢, 崔赛华, 李猛, 樊军锋, 常旭, 乔建平, 徐嘉, 高荣孚, KatoHideo, 范冰, 江泽慧, 李华, 李昀, 韩士杰, 张旭, 江玉林, , 孔祥文, 龚月桦, 王海燕, 刘云芳, 张占雄, 陈放, 张双保, 刘秀英, 任海青, 李晓峰, 李媛良, 郭树花, 陈秀明, 陈宗伟, 杨培华, 常亮, 侯喜录, 丁磊, , IdoHirofumi, 高建社, , , 徐庆祥, 费本华, 陈学平, 张代贵, 李考学, 张桂兰, 薛岩, 蒋俊明, , 刘永红, 金鑫, 涂代伦, 续九如, 王晓东, 李雪峰, , , 张红丽, 丁国权, .  鼎湖山主要林下层植物光合生理特性对模拟氮沉降的响应 . 北京林业大学学报, 2007, 29(6): 1-9.
    [18] 隋金玲, 曲红, 姚娜, 刘丽, 贺窑青, 孙月琴, 石娟, 胡晓丹, 刘美芹, 程堂仁, 李在留, 乔海莉, 陈佳, 范丙友, 段旭良, 王莉, 欧阳杰, 周章义, 张玲, 熊丹, 雷庆哲, 李莉, 郝晨, 金莹, 胡海英, 王丰俊, 孙青, 李艳华, 赵亚美, 尹伟伦, 王建中, 路端正, 陆海, 周燕, 张艳霞, 郑彩霞, 骆有庆, 骆有庆, 田呈明, 续九如, 武彦文, 阎伟, 孙爱东, 李凤兰, 陈发菊, 冯菁, 尹伟伦, 康向阳, 张德权, 冯秀兰, 李云, 郭锐, 张香, 张志毅, 陈晓阳, 沈昕, 马钦彦, 李忠秋, 梁华军, 赵蕾, 郝俊, 武海卫, 郑永唐, 史玲玲, 梁宏伟, 卢存福, 王百田, 王华芳, 骆有庆, 安新民, 阎晓磊, 骆有庆, 胡德夫, 高述民, 蒋湘宁, 王晓东, 吴晓成, 孙爱东, 胡晓丹, 姜金仲, 沈繁宜, 王晓楠, 王玉兵, 王瑛, 李凯, 严晓素, 温秀凤3, 王冬梅, 张志翔, 冯晓峰, 郭晓萍, 赵兵, 于京民2, 冯仲科, 骈瑞琪, 崔彬彬
    , 高荣孚, 刘玉军, 吴坚, 王建中, 邹坤, 尹伟伦, 谢磊, 王华芳, 王民中, 王玉春, 林善枝, 呼晓姝, 刘玉军, 沈应柏, 李凤兰, 刘艳, 陈卫平, 孙建华, 李镇宇, 张庆, 杨伟光, 张兴杰, 陶凤杰, 丁霞, 马建海, 赵新丽, 汪植, 蒋平, 付瑞海.  山西植物新资料(二) . 北京林业大学学报, 2007, 29(5): 106-109.
    [19] 李国平, 张煜星, 施婷婷, 李贤军, 张展羽, 程金新, 黄心渊, 王志玲, 赵俊卉, 崔彬彬, 江泽慧, 周志强, 宗世祥, 陈伟, 曹伟, 雷相东, 肖化顺, 刘志军, 周国模, 徐剑琦, 程丽莉, 刘智, 杜官本, 于寒颖, 雷霆, 张彩虹, 丁立建, 张璧光, 王海, 王正, 雷洪, 张则路, 苏淑钗, 曹金珍, 黄群策, 吴家森, 关德新, 骆有庆, 刘童燕, 李云, 张贵, 杨谦, 郝雨, 苏里坦, 张璧光, 王正, 郭广猛, 李云, 吴家兵, 姜培坤, 常亮, 方群, 宋南, 贺宏奎, 张大红, 张佳蕊, 张书香, 王勇, 刘大鹏, 张国华, 秦广雍, 黄晓丽, 张慧东, 金晓洁], 周晓燕, 许志春, 刘彤, 李文军, 陈晓光, 秦岭, 张金桐, 姜静, 高黎, 蔡学理, 李延军, 刘海龙, 苏晓华, 于兴华, 张弥, 陈燕, 姜金仲, 刘建立, 冯慧, 尹伟伦, 王德国, 王安志, 张冰玉, 陈绪和, 周梅, 成小芳, 王谦, 朱彩霞, 聂立水, 陈建伟3, 金昌杰, 张勤, 亢新刚, 冯大领, 张连生, 梁树军, 崔国发, 胡君艳, 韩士杰, 姚国龙.  核盘菌EPSP合酶基因在大肠杆菌中的表达 . 北京林业大学学报, 2006, 28(6): 103-108.
    [20] 李绍才, 陈文汇, 范丙友, 朱教君, 金小娟, 时尽书, 吕建雄, 翟明普, 胡晓丽, 李世东, 孙晓梅, 王玉杰, 高峻, 谭伟, 窦军霞, 肖生春, 李发东, 杨振德, 潘存德, 颜容, 南海龙, 张冰玉, 徐双民, 张宇清, 周春江, 康宏樟, 冯仲科, 谢益民, 张一平, 三乃, 孟平, 韩海荣, 李建章, 刘红霞, 田小青, 孙海龙, 张守攻, 刘俊昌, 师瑞峰, 骆秀琴, 王云琦, 朱清科, 宋献方, 胡诗宇, 苏晓华, 肖洪浪, 蔡怀, 岳良松, 王笑山, 吴斌, 陆海, 马钦彦, 李义良, 赵博光, 姜伟, 杨志荣, 张雁, 周文瑞, 蒋佳荔, 刘昌明, 齐实, 齐实, 赵双菊, 李智辉, 何磊, 张劲松, 蒲俊文, 张永安, 宋清海, 蒋湘宁, 赵有科, 伊力塔, 朱金兆, 姚山, 葛颂, 齐力旺, 张德荣, 张岩, 于静洁, 刘元, 褚建民, 石丽萍, 杨聪, 吕守芳, 吴庆利, 曲良建, 康峰峰, 马超德, 崔保山, 刘鑫宇, 王玉珠, 王建华, 朱林峰, 刘相超, 胡堃, 田颖川, 唐常源.  毛白杨4-香豆酸: 辅酶A连接酶可溶性原核表达及活性检测 . 北京林业大学学报, 2006, 28(2): 1-8.
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出版历程
  • 收稿日期:  2017-07-19
  • 修回日期:  2017-10-11
  • 刊出日期:  2018-01-01

刺激植物响应蛋白基因Epl1克隆、原核表达及功能初探

doi: 10.13332/j.1000-1522.20170249
    基金项目:

    国家自然科学基金项目 31670649

    国家自然科学基金项目 31700564

    哈尔滨市应用技术研究与开发项目科技创新人才 2016RQQXJ235

    黑龙江省林科院青年基金项目 2015Q01

    作者简介:

    遇文婧,博士,副研究员。主要研究方向:森林保护。Email:ywjlinda2008@163.com 地址:150040黑龙江省哈尔滨市南岗区哈平路134号

    通讯作者: 刘志华,副教授。主要研究方向:森林保护。Email:lzhnefu@126.com 地址:150040黑龙江省哈尔滨市和兴路26号东北林业大学林学院
  • 中图分类号: S763.1

摘要: 目的研究刺激植物响应蛋白Epl1对木本植物山新杨的刺激响应功能, 为开发新一代提高植物免疫的新型诱导剂奠定基础。方法从棘孢木霉ACCC30153菌株中克隆获得一个刺激植物响应蛋白基因Epl1, 并进行序列分析和原核表达, 将获得的原核重组蛋白rEpl1与山新杨组培苗进行互作, 初步探讨rEpl1蛋白对山新杨生长、生理指标、以及生长和防御相关基因转录水平的影响。结果刺激植物响应蛋白基因Epl1的cDNA序列全长为417 bp, 预测蛋白分子量12.6 kDa, 属于Cerato-platanin家族; 通过构建原核表达载体, 成功获得重组蛋白rEpl1;在1 μg/mL rEpl1诱导下, 山新杨组培苗生长较快、根系旺盛, 生物量明显增加, CAT活性在诱导第1 d时为对照的3.51倍, 可溶性糖含量和脯氨酸含量在诱导初期急剧积累; 山新杨生长素基因LAX2/AUX和水杨酸防御基因JAR2的转录水平分别在蛋白诱导2 d和12 h时达到峰值, 分别为对照的873.10和388.02倍。结论Epl1基因的克隆、序列分析和原核表达为进一步研究Epl1蛋白诱导植物系统抗病性提供了理论基础; 重组蛋白rEpl1与山新杨组培苗互作实验, 初步Epl1蛋白能够刺激木本植物在生理及分子水平上的响应, 从而促进生长, 提高抗性。

English Abstract

遇文婧, 宋小双, 邓勋, 平晓帆, 周琦, 刘志华. 刺激植物响应蛋白基因Epl1克隆、原核表达及功能初探[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(1): 17-26. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170249
引用本文: 遇文婧, 宋小双, 邓勋, 平晓帆, 周琦, 刘志华. 刺激植物响应蛋白基因Epl1克隆、原核表达及功能初探[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(1): 17-26. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170249
Yu Wen-jing, Song Xiao-shuang, Deng Xun, Ping Xiao-fan, Zhou Qi, Liu Zhi-hua. Cloning, prokaryotic expression and function of the eliciting plant response protein of Trichoderma asperellum[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(1): 17-26. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170249
Citation: Yu Wen-jing, Song Xiao-shuang, Deng Xun, Ping Xiao-fan, Zhou Qi, Liu Zhi-hua. Cloning, prokaryotic expression and function of the eliciting plant response protein of Trichoderma asperellum[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(1): 17-26. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170249
  • Cerato-platanin(CP)蛋白是一种含有约150个氨基酸的小分子蛋白,以四个半胱氨酸残基形成两个二硫键为特点的小分子蛋白,由丝状真菌分泌,能够被一些植物组织识别,因此在丝状真菌与宿主互作时起到非常重要的作用[1]。其中一些CP蛋白能够刺激植物相关防卫基因表达、产生抗毒素等,从而引起植物防卫反应[2]

    木霉属(Trichoderma spp.)分泌CP蛋白家族中的刺激植物响应蛋白(Epl1)不仅能够诱导植物系统抗病性,还能促进植物生长[3-6]。绿木霉(T. virens)Gv29-8菌株中分泌的Sm1蛋白(Epl1)通过刺激棉花和水稻子叶过氧化氢的变化因此防卫响应[7];并且一些研究也表明SM1或Epl1蛋白需要以单体的形式才能表现出刺激作用[8];Frischmann等对深绿木霉(T. atroviride)ATCC74058菌株的纯化的天然蛋白Epl1的研究发现,Epl1很容易在空气/水交界面自我组装,形成蛋白层,从而重新溶解在水里,也能够结合各种形式的聚合几丁质[9]。来自绿木霉TvSMOE38菌株的天然蛋白SM1,在酵母中重组蛋白rSM1的表达量较高(约55 mg/L),并且能够诱导玉米的防御基因表达[5];王允等也证实来自棘孢木霉(T. asperellum)T4的酵母重组蛋白rEplt4能提高大豆叶片对大豆灰斑病(Cercosporidium sofinum)的免疫能力[3]。目前,关于Epl1蛋白诱导植物抗病性的研究主要集中于水稻(Oryza sativa)、棉花(Gossypium hirsutum)和玉米(Zea mays)等草本植物的系统抗病性[6]。但是,关于Epl1蛋白刺激木本植物系统抗病性的研究还未见报道。

    因此,本研究克隆了棘孢木霉(T. asperellum)ACCC30536的刺激植物响应蛋白基因Epl1,并进行序列分析;通过原核表达,将Epl1基因整合到大肠杆菌BL21中,检测重组蛋白rEpl1的表达情况;通过重组蛋白rEpl1与山新杨组培苗互作实验,探讨rEpl1对山新杨(Poplus davidiana × P. alba var. pyramidlis)生长、酶活及与生长和防御相关基因转录水平的刺激作用。对刺激植物响应蛋白Epl1进行深入研究,将为开发新一代提高植物免疫的新型诱导剂提供理论依据,具有重要的经济价值和广泛的应用前景。

    • 供试菌株棘孢木霉(T. asperellum)ACCC30536(中国农业微生物保藏管理中心);供试菌株大肠杆菌BL21菌株;原核表达质粒为pGEX-4T-2;供试树种为一年生山新杨组培苗。

    • 将棘孢木霉ACCC30536置于PD液体培养基中,震荡培养48 h后过滤菌丝,用CTAB法提取菌丝基因组DNA。并利用TRIzol提取RNA,用DNA酶消化RNA中的DNA,反转录获得cDNA。通过测序得到Epl1的DNA和cDNA序列。利用引物Epl1-1:5′-ATGCAATTGTCCAACCTCTTC-3′和Epl1-2:5′-CTAGAGGCCGCAGTTGCTCAC-3′对纯化后的DNA和cDNA进行PCR扩增,产物送生物测序公司测序[10-12]

    • 利用ORF(http://www.bioinformatics.org/sms2/orf_find.html)寻找开放读码框;ExPASy ProtParam(http://www.expasy.org/)分析分子量和等电点;SignalP 4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测信号肽;ProtComp 9.0进行亚细胞定位分析;NCBI Conserved Domains search(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行保守区和蛋白家族预测;Swissmodel(https://www.swissmodel.expasy.org/)预测蛋白的三维结构,模式选自动建模[13-15]

    • 根据Epl1基因序列和原核表达载体序列设计带有酶切位点的引物,Epl1-c1:5′-ATCGGGATCCGATACCGT CTCGTACGATAC-3′(下划线为BamHI酶切位点)Epl1-c2:5′ -CGATGTCGACCCGAGGCCG CAGTTGCTCACAGC-3′(下划线为SalI酶切位点),以棘孢木霉ACCC30536的cDNA为模板,Epl1-c1和Epl1-c2为引物进行PCR扩增。用BamHI和SalI限制性内切酶对PCR产物及pGEX-4T-2质粒进行双酶切,T4 DNA Ligase连接后,转入感受态TOP10中,含终质量浓度50 mg/L羧苄青霉素的LB固体培养基中筛选阳性转化子,并进行双酶切检测。将获得的阳性重组质粒转入大肠杆菌BL21感受态,置于含氨苄霉素的培养基中培养单菌落,挑取单菌落进行菌落PCR[16]。将阳性转化子接种于3 mL含适量羧苄青霉素的LB液体培养基中培养12 h。次日测定培养液OD600=0.4~0.6,加入1.0 mmol/L IPTG诱导培养4 h,对照为不加IPTG的培养液和空载体(只含pGEX-4T-2质粒的DNA)培养液,并进行SDS-PAGE检测。并将变性复性后的蛋白利用电转化法进行纯化[17]

    • 将在生根培养基中培养生根后的山新杨组培苗分别置于含有0、0.2、0.5和1 μg/mL粗提蛋白液的诱导培养基中,对照为不含重组蛋白的培养基。生长10 d后观测组培苗生长状态,测定株高、根长、叶片数、鲜质量和干质量。选择诱导效果较好的处理,在重组蛋白诱导0、0.5、1、3、5和7 d取山新杨新鲜叶片适量,采用蒽酮法测定可溶性糖含量,茚三酮显色法测定脯氨酸含量,催化H2O2为H2O和O2的方法测定过氧化氢酶(CAT)活性[18]。每组重复10次。

    • 选择诱导效果较好的蛋白浓度,在重组蛋白诱导0 h、6 h、12 h、1 d、2 d、5 d和7 d取山新杨叶片,利用CTAB法提取RNA,并反转录成cDNA,利用表 1引物进行qRT-PCR,反应体系为2×SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL,引物1(10 μM)0.5 μL,引物2(10 μM)0.5 μL,模板(10×cDNA)2 μL,RNase Free ddH2O 7 μL,总体积20 μL。反应程序为预变性95 ℃ 30 s;变性95 ℃ 5 s,退火59 ℃ 15 s,延伸72 ℃ 10 s,45个循环;补平82 ℃ 1 s;每间隔0.5 ℃读板1 s。引物参考KEGG plant hormone signal transduction-reference pathway山新杨转录路径(http://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?map04075)确定内参及基因序列[19]

      表 1  RT-qPCR引物

      Table 1.  RT-qPCR primers

      基因
      Gene
      基因全称
      Total gene name
      引物
      Primer
      序列(5′-3′)
      Sequence (5′-3′)
      产物大小
      Size of product/bp
      LAX2/AUX Auxin gene LAX2-L TCATTCGGCCTCTTCACCAAGT 213
      LAX2-R GCCATGATTGCCATCACACCTT
      JAR2 Jasmonic acid JAR1-L AGTGGTGAACCAAGCGAGGAG 241
      resistant gene JAR1-R GGATTTGCTGCACCTTGCTGTT
      Tublin β-Tublin gene tu-1 TACCGAGGCTGAGAGTAACAT 245
      tu-2 GGACCCACAACTCATTCACAT
      Ef Elongation factor gene ef-1 TCACACCTGCCACATTGCTGT 230
      ef-2 TCTTGATGACACCAACCGCCAC
      Actin Action gene actin-1 TTCCGTTGCCCTGAGGTCCTAT 239
      actin-2 TCAGGAGGAGCAACCACCTTGA
    • 利用PCR扩增,获得棘孢木霉ACCC30536菌株Epl1基因的cDNA和DNA序列如图 1。cDNA序列为417 bp(GenBank接受号JN966996),可编码138个aa(图 2);DNA序列为481 bp(GenBank接受号JN966997),含1个内含子和2个外显子(图 3)。ProtParam预测表明,该蛋白的分子量为12.6 kDa,理论等电点为6.68。

      图  1  Epl1基因的cDNA及DNA扩增结果

      Figure 1.  PCR analysis of DNA and cDNA of Epl1

      图  2  Epl1的cDNA序列及预测氨基酸序列

      Figure 2.  cDNA sequence and predicted amino acid sequence of Epl1

      图  3  Epl1基因的DNA序列

      Figure 3.  DNA sequence of gene Epl1

      氨基酸序列预测结果如图 4表 2,含量最多的为Ala(13.0%),含量最少的为His(1.4%),但不含有Glu、Sec、Pyl、Ile、Asx、Glx和Xaa。其中负电荷氨基酸总数(Asp + Glu)和正电荷氨基酸总数(Arg + Lys)均为7。不稳定系数16.86,预测为稳定的蛋白质。

      图  4  Epl1基因的氨基酸组成

      Figure 4.  Amino acid composition of Epl1

      表 2  Epl1基因的氨基酸组成

      Table 2.  Amino acid composition of Epl1

      氨基酸Amino acid 比例Proportion/%
      Ala (A) 13.0
      Gly (G) 10.1
      Thr (T) 9.4
      Ser (S) 8.7
      Leu (L) 8.7
      Val (V) 7.2
      Asn (N) 6.5
      Asp (D) 5.1
      Gln (Q) 4.3
      Tyr (Y) 4.3
      Arg (R) 2.9
      Cys (C) 2.9
      Phe (F) 2.9
      Trp (W) 2.2
      Lys (K) 2.2
      Pro (P) 2.2
      Met (M) 1.4
      His (H) 1.4
      Glu (E) 0.0
      Sec (U) 0.0
      Pyl (O) 0.0
      Ile (I) 0.0
      Asx (B) 0.0
      Glx (Z) 0.0
      Xaa(X) 0.0
    • 通过BlastP进行保守区预测(图 5A),Epl1为CP家族蛋白(pfam07249),具有CP家族保守区结构域(20~138位的氨基酸)。神经网络算法NN与隐马可夫HMM模型预测N端70个氨基酸中第18和第19个氨基酸中间有一个信号肽酶剪切位点VSA//DT存在(图 5B5C)。ProtComp在线工具进行亚细胞定位预测胞外蛋白的分值为9.9。预测的三级结构(图 5D5E5F)表明,Epl1蛋白为球状体,并且由2个ψβ-桶状结构组成,ψβ-桶状结构由两个α-螺旋和6个β-折叠形成。

      图  5  刺激植物响应蛋白Epl1保守区、信号肽及三级结构预测图

      Figure 5.  Prediction image of Epl1 protein conserved region, signal peptide site, phosphorylation site and tertiary structure

    • 对构建的重组载体转化子pGEX-Epl1提取质粒,并进行PCR和双酶切检测,如图 6图 6A显示,1~4泳道的条带大小约为417 bp,与目的基因大小基本一致。图 6B显示,用BamHI和SalI限制性内切酶进行双酶切后,泳道1的两条片段大小分别为4 970和417 bp,分别与目的基因和pGEX-4T-2质粒大小一致。因此,目的基因与质粒连接成功。

      图  6  重组质粒pGEX-Epl1的检测

      Figure 6.  Detection of recombinant plasmid pGEX-Epl1

    • 通过原核表达获得的大肠杆菌阳性转化子BL21-Epl1进行IPTG诱导后进行SDS-PAGE检测,结果如图 7图 7A显示,泳道2和4均有大小约38.6 kDa(12.6 kDa目的蛋白+26 kDa GST标签),而且诱导时间越长,分泌的蛋白含量越多。图 7B显示,对变性复性后的蛋白进行电纯化后,获得纯化后的目的蛋白rEpl1。因此,证明Epl1基因成功整合到大肠杆菌中。

      图  7  重组蛋白rEpl1的SDS-PAGE检测

      Figure 7.  SDS-PAGE detection of recombinant protein rEpl1

    • 重组蛋白rEpl1诱导山新杨组培苗后,对山新杨生物量、生长和生理指标的影响如表 2图 89表 2图 8所示,1 μg/mL rEpl1诱导下的山新杨组培苗的株高、根长、叶片数、鲜质量和干质量都最高(表 3),而且与对照相比山新杨组培苗生长较快,根系发达密集(图 8A)。此外,1 μg/mL rEpl1诱导下,山新杨组培苗的CAT活性随着时间的增加呈先上升后下降的趋势,在诱导第1 d时急剧上升到峰值,为对照的3.51倍;可溶性糖和脯氨酸含量在诱导初期12 h时就明显增加,分别在2和1 d到达最大值,为71.143和50.849 mg/mL,3 d恢复到对照水平(图 9)。因此,重组蛋白rEpl1能够影响山新杨组培苗生理上的变化。

      图  8  rEpl1诱导后山新杨组培苗生长状态

      Figure 8.  Growth of poplar tissue culture seedlings induced by rEpl1

      图  9  rEpl1对山新杨生理指标的影响

      Figure 9.  Effects of rEpl1 on physiology of poplar tissue culture seedlings

      表 3  不同质量浓度rEpl1对山新杨组培苗生物量的影响

      Table 3.  Effects of varied concentration rEpl1 on biomass of poplar tissue culture seedlings

      生物量Biomass 对照Control 0.2 μg/mL 0.5 μg/mL 1 μg/mL
      株高Plant height 5.17±0.309 5.39±0.353 8.03±0.473 10.1±0.396
      根长Root length 1.27±0.866 1.54±0.649 3.23±0.588 4.08±0.411
      叶片数Leaf number 6.7±0.597 7.1±0.563 7.7±0.649 9.1±0.440
      鲜质量Fresh mass 0.988 5±0.708 1.142 5±0.893 1.397 3±0.686 1.616 4±0.459
      干质量Dry mass 0.223 7±2.213 0.184 04±1.103 0.383 5±1.531 0.560 8±0.678
    • 重组蛋白rEpl1诱导山新杨组培苗后,对山新杨的生长素信号转导路径中的生长素基因LAX2/AUX和茉莉酸信号转导路径中的防御基因JAR2的转录水平的影响如图 10图 10A显示,在诱导初期,山新杨生长素基因LAX2/AUX与对照都呈负表达,在第2 d时急剧升高呈正调控,并达到峰值,为对照的873.10倍;图 10B显示,在诱导后,JAR2基因与对照一致呈正调控,但是都高于对照,6 h时急剧上升,在12 h达到峰值,为对照的388.02倍。因此,rEpl1能够刺激山新杨生长素及防御相关基因的转录水平。

      图  10  rEpl1对山新杨生长和防御相关基因的影响

      Figure 10.  Effects of rEpl1 on growth related gene and disease-resistance gene of poplar tissue culture seedlings

    • 木霉菌种类繁多,代谢产物丰富,能够分泌一些小分子蛋白能够刺激寄主植物对病原真菌产生防御响应,从而促进植物生长[20-22]。本研究从棘孢木霉ACCCC30536菌株基因组中克隆到一个刺激植物响应蛋白基因Epl1,cDNA序列全长417 bp,由138个氨基酸组成,通过生物信息学分析推测此酶属于Cerato-platanin蛋白家族。绿色木霉(T. virens)分泌的CP家族的Sm1(Epl1)蛋白不仅无毒,反而能够诱导植物产生系统抗病性[7]。因此,本研究中的Epl1蛋白可能具有与Sm1一样的生防特性。为研究Epl1蛋白的刺激植物响应功能,我们将克隆到的Epl1基因转入大肠杆菌中,获得重组蛋白rEpl1,通过诱导山新杨实验研究rEpl1蛋白对木本植物的刺激响应功能。

      生长激素途径参与植物生长过程,并调节生理反应[23]。在植物生长素信号传导路径中,LAX2/AUX基因是生长素汇集媒介,能够被生长素(auxin)所激发[24]。Tian等[25]也发现生长素能够调节生长素信号转导路径中的相关基因。生长素信号转导路径在木霉与寄主互作过程中起到重要的调控作用[24]。本研究中,经过rEpl1诱导后,山新杨生长素基因LAX2/AUX在诱导6 h后与对照相反呈正调控,可见rEpl1同生长素一样,能够刺激植物生长素信号路径中的LAX2/AUX基因的变化。而且,在rEpl1诱导下的山新杨生长较快,根系发达,株高、根长、叶片数、鲜质量和干质量等生物量明显增加,进一步证明rEpl1不仅能够诱导木本植物山新杨生长素信号路径中的生长素调控基因的转录水平,而且在生理上促进了木本植物山新杨的生长。

      刺激植物响应蛋白不仅能够促进植物生长,而且能有效刺激植物产生系统抗病性。植物识别和接受激发子信号后,会通过各种途径将信号从胞外传递到细胞核,引起茉莉酸或乙烯信号转导路径中防卫基因的表达,通过调节一些生理组分,如过氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶和过氧化氢酶的积累来获得诱导系统抗性ISR(Induced system resistance)[26-28]。在本研究中,rEpl1蛋白诱导后的山新杨过氧化氢酶(CAT)活性在诱导1 d时明显升高,为对照的3.51倍,这可能是rEpl1触发了山新杨茉莉酸信号路径中的防御基因,从而引起相关酶的积累。进一步检测诱导后的山新杨茉莉酸信号路径中的茉莉酸防御基因JAR1的转录水平,诱导初期即达到峰值,而且远远高于对照,可见rEpl1能够刺激木本植物山新杨的茉莉酸防御基因的响应,并可能激活山新杨组培苗的ISR。此外,我们也检测了经过rEpl1蛋白诱导后山新杨组培苗与抗性相关的2个生理指标,可溶性糖含量和脯氨酸含量都在诱导初期急剧积累。这2个生理指标与植物抗性都有密切关系,可溶性糖的积累可以维持膜的完整性,从而提高植物抗逆性,其贮量愈高,植物的抗性和萌发力就愈强[29];在正常环境条件下,植物体内游离脯氨酸含量很低,但在逆境条件下会显著增加,且积累指数与植物抗性有关[30]。因此,rEpl1对山新杨组培苗生理指标上的影响再一次证实其能够刺激木本植物山新杨产生生理上的响应,从而提高山新杨的抗性。

      综上所述,Epl1基因的克隆、序列分析和原核表达为进一步研究Epl1蛋白诱导植物系统抗病性提供了理论基础;重组蛋白rEpl1与山新杨组培苗互作实验,也初步阐明rEpl1蛋白能够刺激木本植物激素信号路径中的生长或者防御相关基因的调控水平,调节生理变化,从而促进生长,提高抗性。因此,对刺激植物响应蛋白进行深入系统的研究,将为开发安全有效的提高植物免疫功能的生物农药奠定基础。

参考文献 (30)

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