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LEC1(Leafy Cotyledon 1)基因是植物胚胎发生过程中关键调控因子，编码CCAAT-Box结合转录因子HAP3(Heme-activated protein 3)的亚单位，也是种子成熟的重要调控因子[1-2]。同时, LEC1影响着脂肪酸生物合成基因的表达，对脂肪酸生物合成和脂质积累有重要的调节作用[3]。研究表明，过表达LEC1造成拟南芥(Arabidopsis thaliana)幼苗中三酰甘油(TAG)含量的增加，同时下游Δ12-脂肪酸脱饱和酶(FAD2)基因上调[4]。FAD2是调控三酰甘油合成过程中油酸(18:1)向亚油酸(18:2)转变的关键酶基因[5]。油酸(18:1)和亚油酸(18:2)是很多植物包括一些传统油料作物种子油脂的主要成分[6]，富含油酸的食用油稳定性高，能够长时间保存，并且经过高温烹调后也不宜氧化变质。亚油酸是人体不能合成的必需脂肪酸，可以降低血液胆固醇，用于预防和治疗动脉粥样硬化等心血管疾病[5]。
文冠果(Xanthoceras sorbifolia)原产于中国西北地区，是一种木本油料树种，耐旱性强，在中国辽宁、内蒙古和新疆等沙漠和干旱地区广泛分布，对改善当地环境有重要作用。其种仁含油量高达60%，主要成分有油酸、亚油酸、硬脂酸、棕榈酸、亚麻酸等，其中不饱和脂肪酸(18:1、18:2等)含量约占90%，营养丰富，可用于食品，健康饮食和医药产品方面[7]。因此，对文冠果LEC1基因的克隆，序列分析和表达模式研究，为阐明LEC1在文冠果油脂合成中的调控机制奠定了基础，同时对生产实践中文冠果油脂品质的改良有一定的实践意义。
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以实验室光照培养箱(温度为(25±2) ℃)里正常生长的文冠果苗为试材，从植株上收集根、茎、叶和花瓣，用于RNA的提取；以北京圆明园公园生长一致，长势良好的文冠果树为材料，采集不同发育时期的蒴果，于超净工作台中取出种胚作为RNA的提取材料。
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参照Guo等[8]的方法，采用EASYspin植物快速提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)提取文冠果组织以及种胚总RNA，采用Fast Quant cDNA第1链合成试剂盒(天根生化科技有限公司)合成cDNA第1链。选取GenBank上已知的几种植物的LEC1蛋白序列，通过序列比对找出几种植物的保守区域设计核苷酸简并引物(见表 1)，引物由上海生工公司合成，参照Zhao等[9]和李茹芳等[10]的方法，以反转录生成的cDNA第1链为模板进行PCR扩增，反应总体系为50 μL：4 μL cDNA模板(200 ng)，8 μL dNTP(200 μmol/L)，上下游引物各1 μL(20 pmol/L)，0.8 μL Ex Taq DNA聚合酶(2.5 U)(TaKaRa)，5 μL 10×buffer，ddH20补足至50 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸20 s，变性到延伸步骤进行25个循环，最后72 ℃延伸10 min。反应结束后将PCR产物进行1%凝胶电泳检测，采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技有限公司)回收、纯化目的片段，然后连接于PMD-18T载体(TaKaRa)上，转化大肠杆菌Top10感受态细胞。筛选阳性克隆并进行菌液PCR鉴定，鉴定正确的重组质粒送于北京睿博兴科生物技术有限公司测序。
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在得到的XsLEC1基因中间片段基础上，采用5′-RACE和3′-RACE技术获得cDNA全长。利用巢氏PCR，设计5′-RACE特异性下游引物(5′-GSP1和5′-GSP2)和3′-RACE特异性上游引物(3′-GSP1和3′-GSP2)，其他引物由RACE试剂盒(TaKaRa)提供，所用引物见表 1。具体操作步骤参照RACE试剂盒和我们前期的方法[8]。
表 1 基因克隆所用的引物序列
Table 1. Primers used in gene cloning reactions
引物名称
Primer name引物序列
Primer sequenceLEC1-F1 5′-CATGCCWATHGCMAAYGT-3′ LEC1-R1 5′-GTKATVGTCTTVCGTTGCTC-3′ 5′-GSP1 5′-CGGTAACGGTGGAGGTAGACTG-3′ 5′-GSP2 5′-TGTCAGGGGTTCAATGTAGTCG-3′ 3′-GSP1 5′-GATCATGCGTAAGATTCTCCCTC-3′ 3′-GSP2 5′-ATGCGTAAGATTCTCCCTCCG-3′ 5′-Outer-Primer 5′-CATGGCTACATGCTGACAGCCTA-3′ 5′-Inner- Primer 5′-CGCGGATCCACAGCCTACTGATGA
TCAGTCGATG-3′3′-Outer- Primer 5′-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3′ 3′-Inner- Primer 5′-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCA
CTATAGG-3′ -
使用NCBI网站上ORF Finder工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)预测克隆到的XsLEC1基因的开放阅读框，用NCBI BLAST程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)鉴定，DNAMAN软件分析LEC1基因的核苷酸和氨基酸序列。利用ExPASy工具Protparam (http://web.expasy.org/protparam/)分析XsLEC1蛋白的理化性质，进一步利用ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)分析其亲水性/疏水性。采用TMHMM2.0在线软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析跨膜结构域。通过SignalP-4.1在线软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对XsLEC1蛋白的信号肽进行预测，应用ProtComp9.0在线软件(http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=protcompan&group=programs&subgroup=proloc)进行亚细胞定位。二级结构采用SOPMA在线软件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)进行预测。三级结构用SWISS在线软件预测(https://swissmodel.expasy.org/)。功能结构域用MotifScan程序(http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan#GRAPHIC)和InterProScan程序(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)预测分析。用Bioedit软件ClustalW程序进行氨基酸序列的多重序列比对，系统进化树由MEGA7.0完成。
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利用RT-PCR考察LEC1基因在文冠果不同组织中的表达情况，提取实验室光照培养箱正常生长的文冠果苗不同组织(根、茎、叶和花瓣)的文冠果种胚RNA，经过反转录得到cDNA第1链用于后续实验。根据克隆的XsLEC1基因序列设计特异性引物，上游引物F2：5′-ATGGAAAGTGGAGGCGGC-3′，下游引物R2：5′-TCATTTATCATGAGCATAGGCTTC-3′，扩增长度为690 bp。以文冠果不同组织的cDNA为模板，文冠果ACTIN基因作为参考基因。PCR反应体系和反应条件与1.2.1相同。
为了检测XsLEC1基因在种胚不同时期的表达情况，利用实时荧光定量PCR检测种胚在花后1~8时期(花后33、40、47、54、61、68、75和81 d)的表达量。实验所用材料均取自北京圆明园公园，每个样品来自3株不同植株作为生物学重复。根据克隆的XsLEC1基因的核苷酸序列，设计特异性引物，上游引物F3：5′-CCTCCGCATGCCAAGATCTC-3′，下游引物R3：5′-CTCGCCCGTTATGAAGCTGA-3′，扩增长度为84 bp。所用内参基因为文冠果Actin基因，特异性引物为上游引物F4：5′- TACCGAGGCACCATTAA ATCCC-3′，下游引物R4：5′- AAGGTCCAAACGAAG AATAGCA-3′。
利用1.2.1方法，提取种胚不同时期的RNA，经过反转录得到cDNA第1链作为实时荧光定量PCR的模板。实时定量PCR的反应体系为20 μL：模板cDNA为1 μL，上下游引物各0.6 μL(引物浓度为10 μmol/L)，2×SuperReal PreMix Plus为10 μL，ddH2O补足到20 μL。反应条件为：95 ℃预变性15 min，95 ℃变性10 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，95 ℃变性到72 ℃延伸经历40个循环。扩增产物是否特异通过融解曲线来鉴定，数据结果采用2-ΔΔCt 法计算。
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使用在保守区域设计的引物，以文冠果种胚cDNA为模板进行PCR扩增后获得一条168 bp的中间片段(图 1A)，去掉引物长度为130 bp。根据中间片段序列设计特异性RACE引物，经3′-RACE和5′-RACE扩增技术分别获得了754和485 bp的3′端和5′端序列(图 1B、1C)。经拼接获得文冠果LEC1 cDNA全长为1 035 bp。经过对文冠果LEC1基因的全长序列分析得出，该基因包含一个长度为690 bp的开放阅读框(GenBank登录号：MF616360)，编码229个推定的氨基酸(图 1D)。
图 1 基因的克隆
Figure 1. Cloning of XsLEC1
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利用ExPASy工具Protparam分析XsLEC1蛋白的理化性质，推测其分子式为C1088H1689N325O345S11，相对分子质量为25 195.01，理论等电点为6.06，蛋白不稳定指数(Ⅱ)为35.14，脂溶指数为77.63，亲水性平均值为-0.610，因此预测该蛋白为稳定的，亲水性蛋白。使用在线软件ProtScale对XsLEC1蛋白的亲水性进一步分析表明，该蛋白为亲水性蛋白(图 2A)，这与之前的Protparam预测结果一致。
图 2 XsLEC1蛋白亲水性、信号肽以及跨膜结构的分析预测
Figure 2. Analysis and prediction of hydrophilicity, signal peptide and transmembrane domains of XsLEC1
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通过SignalP-4.1在线软件预测XsLEC1的信号肽(图 2B)；C值表示剪切位点值，S值表示信号肽分值，Y值为综合考虑C值与S值的参数[11]；XsLEC1蛋白的剪切曲线平滑，S值稳定，不存在明显的信号肽特征，因此认为XsLEC1不具有信号肽。采用TMHMM2.0在线软件分析，XsLEC1蛋白没有跨膜区(图 2C)。ProtComp9.0在线软件预测该蛋白和拟南芥LEC1蛋白的亚细胞定位结果见表 2，结果显示XsLEC1蛋白大都定位于细胞核，和拟南芥LEC1蛋白一致，这与有关拟南芥和麻风树(Jatropha carcas)的LEC1蛋白报道也一致[12]。
表 2 XsLEC1和AtLEC1蛋白亚细胞定位结果
Table 2. Results of subcellular localizations in XsLEC1 and AtLEC1
亚细胞定位
Subcellular localizationXsLEC1蛋白的概率
Probability of XsLEC1AtLEC1蛋白的概率
Probability of the AtLEC1细胞核Nuclear 8.81 8.87 质膜Plasma membrane 0.60 0.67 细胞外Extracellular 0.04 0.02 线粒体Mitochondrial 0.06 0.02 过氧化物酶体Peroxisomal 0.08 0.05 叶绿体Chloroplast 0.08 0.06 液泡Vacuolar 0.33 0.31 -
采用SOPMA在线软件预测XsLEC1蛋白的二级结构见表 3。由表 3分析可知，XsLEC1蛋白二级结构主要由α螺旋(占42.79%)和无规则卷(占36.68%)组成，然后是β转角(占11.35%)，最后是延伸链(占9.17%)。AtLEC1蛋白主要由α螺旋(占24.79%)和无规则卷(占46.64%)组成，其次是延伸链(占18.91%)，最后是β转角(占9.66%)。分析结果显示文冠果和拟南芥的LEC1蛋白二级结构主体相似，但是也有一定差别。
表 3 XsLEC1和AtLEC1蛋白二级结构的比较
Table 3. Comparison of secondary structure in XsLEC1 and AtLEC1
结构
StructureXsLEC1蛋白概率
Probability of XsLEC1AtLEC1蛋白概率
Probability of AtLEC1α螺旋Alpha helix 98(42.79%) 59(24.79%) 延伸链Extended strand 21(9.17%) 45(18.91%) β转角Beta turn 26(11.35%) 23(9.66%) 无规则卷Random coil 84(36.68%) 111(46.64%) -
采用Motif Scan程序对XsLEC1蛋白进行motif分析，结果显示该蛋白含有3个N-糖基化位点(ASN_GLYCOSYLATION)、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(CK2_PHOSPHO_SITE)，5个豆蔻酰化位点(MYRISTYL)，2个蛋白激酶C磷酸化位点(PKC_PHOSPHO_SITE)(表 4)。这些磷酸化位点在调节文冠果LEC1蛋白构象变化以及核定位过程中占有极其重要的地位，起着重要的作用[13]。NCBI-CDD及InterProScan预测结果表明，该类LEC1基因所编码的蛋白质属于NFYB/HAP3亚基家族的成员，含有CBFD/NFYB/HMF特异位点。
表 4 XsLEC1蛋白motif预测
Table 4. Putative functional motif of XsLEC1
功能位点
Functional site氨基酸位置
Amino acid
position氨基酸序列
Amino acid
sequenceN-糖基化位点
N-glycosylation site15~18
34~37
41~44NSSS
NQTN
NNSD酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点
Phosphorylation site of casein kinaseⅡ49~52
83~86
112~115TVRE
TIQE
TAED豆蔻酰化位点
N-myristoylation site5~10
19~24
147~152
187~192
201~206GGFHGY
GLKLTE
GSIRGE
GGGGAT
GTAGAT蛋白激酶C磷酸化位点
Phosphorylation site of protein kinase C49~51
148~150TVR
SIR -
将推定的文冠果LEC1蛋白序列与龙眼(Dimocarpus longan)LEC1蛋白(Genbank登录号为：ADD82425.2)，麻风树(Jatropha carcas)LEC1蛋白(AEO22132.1)，毛果杨(Populus trichocarpa)LEC1蛋白(XP_002323119.2)，拟南芥LEC1蛋白(NP_173616.2)和水稻(Oryza sativa)LEC1蛋白(AAP22065.1)序列进行比对(图 3A)，发现推定的文冠果LEC1蛋白序列包含HAP3亚基的保守功能域B区域，该保守功能域内含有组蛋白折叠中的3个α螺旋(α1、α2、α3)和两个短环结构(L1、L2)，这与预测的保守功能域的三级结构一致(图 3B)。其中三螺旋结构对蛋白二聚化是至关重要的，在第1个螺旋内包含了DNA结合区(MPIANV)，第2个螺旋内包含了组蛋白亚基间的相互结合区域(QECVSEFISFI)，几乎所有的HAP3蛋白，包括LEC1，由3个结构域组成，即N末端A结构域，中心B结构域和C末端C结构域[14]，DNA结合域处于B结构域并与CCAAT结合因子相互作用[15]。
图 3 LEC1蛋白序列多重比对和XsLEC1保守结构域的三级结构预测
Figure 3. Multiple sequence alignments of LEC1 and steric structure prediction of conserved domain in XsLEC1
由图 3A也可以看出，这6种植物的LEC1蛋白在B区域高度保守，而紧邻B区域的A区和C区差别很大。相比于其他植物，文冠果LEC1蛋白序列与龙眼的LEC1蛋白序列相似性较高，可能是由于两者都为无患子科(Sapindaceae)，亲缘关系较近。
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使用NJ法构建系统发生树(图 4)。分析表明，文冠果的LEC1蛋白与龙眼的LEC1蛋白聚在同一进化枝上，两者亲缘关系最近，这与氨基酸序列比对结果一致；然后和麻风树、毛果杨聚到一大枝上。文冠果为木本油料树种，麻风树和毛果杨均为木本植物，且麻风树也是油料树种，和文冠果的亲缘关系较近。草本植物中与大豆(Glycine max)，花生(Arachis hypogaea)等双子叶植物进化距离较近，而与单子叶禾本科(Poaceae)植物如玉米(Zea mays)、水稻距离较远。上述物种与江南卷柏(Selaginella moellendorffii)等蕨类植物、欧洲落叶松(Larix decidua)等裸子植物分属两个大分枝。结果直接表明了文冠果LEC1蛋白与其他植物的相似性和亲缘关系远近，也间接看出植物的进化顺序，同时也为以后通过转基因鉴定LEC1基因功能提供了参考。
图 4 XsLEC1蛋白的进化树分析
Figure 4. Phylogenetic tree analysis of protein in XsLEC1
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RT-PCR实验表明，XsLEC1在文冠果根、茎、叶及花瓣中均无表达，而在种子中有较高的表达(图 5A)，这与已知报道的拟南芥[16]和花生[17]LEC1基因的组织表达模式一致。鉴于已经确定LEC1在种子中表达，接下来通过RT-PCR和实时荧光定量PCR进一步检测其在种胚发育的哪些时期表达，以及表达量的差异。结果显示(图 5B、5C)，XsLEC1在文冠果种胚发育的前期(花后33、40、47 d)表达较高，在种胚发育的后期(花后54、61、68 d)表达较低，至花后75 d时仅有微量表达，而在完全成熟的种胚(花后81 d)中未检测到XsLEC1的表达，表明XsLEC1基因在种胚中有明显的时序表达特性。由此推断，LEC1基因主要在胚胎发育前期起调控作用。
图 5 XsLEC1基因表达模式分析
Figure 5. Expression pattern analysis of XsLEC1
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本研究通过RACE技术克隆到文冠果LEC1转录因子基因，该类LEC1基因所编码的蛋白质属于NFYB/HAP3亚基家族的成员，含有CBFD/NFYB/HMF特异位点。HAP(NF-Y/CBF)是一类重要的转录因子，包含3个不等亚基HAP2(NF-YA/CBF-B)、HAP3(NF-YB/CBF-A)和HAP5(NF-YC/CBF-C)，这3种亚基相互作用形成一个与下游DNA的CCAAT基序结合的复合体[18]。LEC1可能是以一个转录因子亚基的身份来调控胚胎发育等相关基因的表达以达到调节胚胎发生的作用[19]。序列分析表明，XsLEC1基因的氨基酸序列包含HAP3亚基的保守功能域B区域(图 3A)，麻风树、毛果杨、拟南芥和水稻等物种的LEC1基因也都有此区域，说明LEC1基因的保守功能域B区域在进化上是高度保守的，这种保守性对鉴别此类转录因子起到重要作用。
RT-PCR表明，XsLEC1基因只在种子表达，具有组织特异性(图 5A)。实时荧光定量实验进一步表明，XsLEC1在种胚发育早期(花后33~47 d)有较高的表达，而在发育晚期(花后54~82 d)表达下降至停止(图 5B、5C)，呈现出特异的表达时序性。我们推测XsLEC1的时序表达特异性与其多重功能有关。我们的前期研究已经证实，文冠果花后至47 d左右为种胚形态建成阶段[20-21]。XsLEC1在花后33~47 d有较高的表达，说明其参与了文冠果种胚形态建成的调控。在对龙眼[13]和拟南芥[16]胚胎发育的研究中也发现，LEC1在胚胎发育的早期阶段有较高的表达，这与我们的实验结果是一致的。XsLEC1在种胚完成形态建成后表达虽有所下降，但仍有一定的表达(花后54~68 d)，这说明XsLEC1可能还有其他的功能。我们的前期研究发现[20]，文冠果种子含油量高，首先观察到油体的存在是在花后33 d的绿色种胚中，然后在花后40~68 d快速累积。这表明XsLEC1在文冠果种胚油脂合成过程中可能发挥作用，其在胚胎发育早期激活对下游油脂合成相关基因的表达后，表达量减少，而下游基因开始行使功能，参与种胚中油脂的合成。
种子中的油脂主要以TAG形式存在，TAG的合成首先是在质体中合成棕榈酸和硬脂酸两种饱和脂肪酸(16:0、18:0)，这两种饱和脂肪酸可在脱饱和酶的催化下进一步脱饱和形成单不饱和与多不饱和脂肪酸，如18:0通过硬脂酰-ACP脱饱和酶(SAD)和FAD2催化生成油酸(18:1)和亚油酸(18:2)。这些脂肪酸可直接、或经进一步脱饱和、或经碳链延长后，酯化到甘油骨架上生成TAG[21-22]。研究表明，过表达拟南芥LEC1使FAD2基因上调，并且TAG含量增加，影响了油脂合成中油酸与亚油酸的比例。同时过表达拟南芥LEC1增强了拟南芥营养器官，包括根、下胚轴、子叶、叶片中脂质和油体的形成，激活了参与油脂合成的转录因子FUSCA3 (FUS3)，ABSCISIC ACID INSENSITIVE3 (ABI3)和WRINKLED1 (WRI1)的表达，而LEC1调控脂肪酸生物合成途径也依赖FUS3、ABI3和WRI1[4]。研究还发现，LEC1及其家族的另一个成员LEC2通过调节ABI3和FUS3，进而调控种子储藏蛋白Seed Storage Protein(SSP)基因的表达，且在调控SSP基因表达时功能部分冗余[4, 23]。
因此，对LEC1基因的研究可以作为油料植物种子品质改良的重要切入点。然而目前为止对于LEC1表达调控机制的了解还很有限，直接与LEC1相互作用的调控基因也未见报道，LEC1与参与油脂合成的其他调控因子的作用方式也有待研究。因此，本研究对文冠果LEC1基因的序列和表达模式研究，为以后深入了解XsLEC1的功能和调控机制奠定了重要基础。
Cloning and expression analysis of LEC1 gene from Xanthoceras sorbifolia embryos
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摘要:
目的文冠果隶属无患子科, 是我国北方重要的油料树种, 种子含油量高, 是制备食用油、生物柴油等的优质原料。本研究旨在克隆文冠果Leafy Cotyledon 1(XsLEC1)基因, 进行序列及表达模式的分析。 方法以文冠果种胚为试材, 利用RT-PCR和RACE技术克隆文冠果LEC1基因。采用Protparam及TMHMM2.0软件预测XsLEC1蛋白的理化性质和跨膜结构域, ProtComp9.0及Motif Scan软件预测XsLEC1蛋白的亚细胞定位及蛋白功能, BioEdit及MEGA7软件分析XsLEC1蛋白的多重序列比对和进化关系。运用RT-PCR和实时荧光定量PCR分析XsLEC1基因的表达模式。 结果XsLEC1 cDNA全长1 035 bp, 包含一个长度为690 bp的开放阅读框(GenBank号为MF616360), 可编码229个氨基酸。推导的氨基酸序列包含一个HAP3亚基的保守功能域B。该保守功能域内含有组蛋白折叠中的3个α螺旋(α1、α2、α3)和两个短环结构(L1、L2)。在线预测该蛋白为稳定的, 亲水性蛋白, 无信号肽和跨膜区域, 定位于细胞核, 存在多个磷酸化位点。二级结构主要由α螺旋和无规则卷组成。进化分析表明, 该蛋白序列与同科龙眼亲缘关系最近, 其次为麻风树和毛果杨。RT-PCR实验得出, XsLEC1基因在文冠果的根、茎、叶及花中均无表达, 在种子中出现较高表达。实时荧光定量PCR结果进一步显示, XsLEC1基因在种胚中有明显的时序表达特性, 在种胚发育的前期(花后33、40、47 d)表达较高, 在种胚发育的后期(花后54、61、68 d)表达较低, 至花后75 d时仅有微量表达, 而在完全成熟的种胚(花后81 d)中未检测到XsLEC1的表达。 结论文冠果LEC1基因的克隆及表达分析, 为以后深入研究XsLEC1的功能奠定了分子基础, 同时对生产实践中文冠果油脂品质的改良有一定的实践意义。 Abstract:ObjectiveXanthoceras sorbifolia, belonging to the family Sapindaceae, is one of the most valuable oil trees widely distributed in northern China. Its seeds contain a large amount of oil that is high-quality raw material for food and biodiesel purposes. This study aims to clone Xanthoceras sorbifolia Leafy Cotyledon 1gene (XsLEC1) and analyze its sequence and expression pattern. MethodXsLEC1 gene was cloned by RT-PCR and RACE methods from developing X. sorbifolia embryos. Physicochemical properties and transmembrane regions of the deduced XsLEC1 protein were predicted via Protparam and TMHMM2.0 programs, respectively. Subcellular localization and function of XsLEC1 protein were predicted by ProtComp9.0 and Motif Scan programs, respectively. Multiple sequence alignment was carried out using BioEdit software and phylogenetic analysis was achieved by MEGA7 software. Expression pattern of XsLEC1 was analyzed by RT-PCR and quantitative real-time PCR. ResultXsLEC1 cDNA was 1 035 bp in length, containing a 690 bp ORF (GenBank accession numbers: MF616360) and encoding a putative protein with 229 amino acids. The deduced amino acid sequence of XsLEC1 contained a conserved B domain of the HAP3 subunit. The B domain contained three α-helices (α1, α2, α3) and two loops (L1, L2) in the histone fold motif. The predicted XsLEC1 was a stable hydrophilic protein without signal peptide and transmembrane regions. The protein was located in the nucleus and contained many phosphorylation sites. The secondary structure of XsLEC1 protein was mainly consisted of alpha helix and random coil. Phylogenetic analysis showed that XsLEC1 was the closest to DlLEC1, followed by JcLEC1 and PtLEC1. The RT-PCR revealed that XsLEC1 was not expressed in roots, stems, leaves, and petals, but highly expressed in the developing embryos. Quantitative real-time PCR indicated that XsLEC1 had temporal expression pattern in developing X. sorbifolia embryos. The XsLEC1 expression was higher in early embryo development (33, 40 and 47 days after anthesis) than in late embryo development (54, 61 and 68 days after anthesis). With the embryo maturation, the XsLEC1 expression was very low at 75 days after anthesis and no transcript was detected at 81 days after anthesis. ConclusionThe cloning and expression analysis of XsLEC1 gene provide an important foundation to further study the function of XsLEC1 and are of practical significance for improving the quality of the X. sorbifolia oil. -
图 1 基因的克隆
A.中间序列PCR扩增；B.3′端PCR扩增；C.5′端PCR扩增；D.核苷酸与其推导的氨基酸序列。
Figure 1. Cloning of XsLEC1
A, PCR amplification of central fragment; B, PCR amplification of 3′ end; C, PCR amplification of 5′ end; D, nucleotide and deduced amino acid sequences; M, marker.
图 2 XsLEC1蛋白亲水性、信号肽以及跨膜结构的分析预测
A.XsLEC1蛋白的亲水性分析，纵坐标正值表示疏水，负值表示亲水，负值越大表示越亲水，介于+0.5~－0.5之间的主要为两性氨基酸；B.XsLEC1蛋白信号肽预测；C.XsLEC1蛋白跨膜预测。图中红色线表示跨膜可能性。
Figure 2. Analysis and prediction of hydrophilicity, signal peptide and transmembrane domains of XsLEC1
A, analysis of hydrophilicity of XsLEC1. The positive values on vertical axis indicate hydrophobicity and the negative values indicate hydrophilicity, the more negative the value is, the higher the hydrophilicity of the amino acids is, the values between +0.5 and －0.5 mainly denote amphoteric amino acids; B, prediction of signal peptide of XsLEC1; C, prediction of transmembrane domains of XsLEC1. The red line in the figure represents the possibility of transmembrane.
图 3 LEC1蛋白序列多重比对和XsLEC1保守结构域的三级结构预测
A.XsLEC1与其他植物来源的LEC1蛋白序列的多重比对。黑底和灰底部分分别代表几个物种相同和相似的氨基酸残基；黑色实线(α)和虚线(L)代表组蛋白折叠区的α螺旋和环结构；黑色方框代表DNA结合区和组蛋白亚基间的相互结合区；Xs.文冠果；Dl.龙眼；Jc.麻风树；Pt.毛果杨；At.拟南芥；Os.水稻；B.保守结构域的三级结构预测。α螺旋和环结构用蓝线画出。
Figure 3. Multiple sequence alignments of LEC1 and steric structure prediction of conserved domain in XsLEC1
A, multiple sequence alignments of XsLEC1 with other plant LEC1s. Identical and similar amino acid residues are shaded in black and grey, respectively; the α-helices and loops in the histone fold motif were indicated as continuous and dashed black lines, respectively; the DNA-binding region and the histone subunit interaction region were shown in black boxes, respectively; Xs, Xanthoceras sorbifolia; Dl, Dimocarpus longan; Jc, Jatropha carcas; Pt, Populus trichocarpa; At, Arabidopsis thaliana; Os, Oryza sativa. B, steric structure prediction of conserved domain. The α-helices and loops were indicated as blue lines.
图 4 XsLEC1蛋白的进化树分析
文冠果.Xanthoceras sorbifolium；龙眼.Dimocarpus longan；麻风树.Jatropha curcas；毛果杨.Populus trichocarpa；大豆.Glycine max；花生.Arachis hypogaea；胭脂树.Bixa orellana；拟南芥.Arabidopsis thaliana；油菜.Brassica napus；水稻.Oryza sativa；玉米.Zea mays；江南卷柏.Selaginella moellendorffii；蔓出卷柏.Selaginella davidii；山胡椒.Lindera glauca；扭叶松.Pinus contorta；欧洲落叶松.Larix decidua；花旗松.Pseudotsuga menziesii；中华水韭.Isoetes sinensis。推导的文冠果LEC1序列位置用箭头标出。The position of deduced XsLEC1 was indicated by an arrow.
Figure 4. Phylogenetic tree analysis of protein in XsLEC1
图 5 XsLEC1基因表达模式分析
A.XsLEC1在不同组织表达的RT-PCR分析。泳道1~5分别表示根、茎、叶、花和胚5个组织；B.XsLEC1在种胚发育不同阶段表达的RT-PCR分析。泳道1~8分别表示花后33、40、47、54、61、68、75和82 d；C.XsLEC1在种胚发育不同阶段表达的实时荧光定量PCR分析。不同字母表示差异性显著P＜0.05。
Figure 5. Expression pattern analysis of XsLEC1
A, RT-PCR analysis of XsLEC1 tissue-specific expression. Lanes 1-5 represent roots, stems, leaves, petals, and embryos; B, RT-PCR analysis of XsLEC1 expression at different embryo development stages. Lanes 1-8 represent 33, 40, 47, 54, 61, 68, 75 and 82 days after anthesis; C, quantitative real-time PCR analysis of XsLEC1 expression at different embryo development stages. Different letters indicate significant differences at P < 0.05 level.
表 1 基因克隆所用的引物序列
Table 1. Primers used in gene cloning reactions
引物名称
Primer name引物序列
Primer sequenceLEC1-F1 5′-CATGCCWATHGCMAAYGT-3′ LEC1-R1 5′-GTKATVGTCTTVCGTTGCTC-3′ 5′-GSP1 5′-CGGTAACGGTGGAGGTAGACTG-3′ 5′-GSP2 5′-TGTCAGGGGTTCAATGTAGTCG-3′ 3′-GSP1 5′-GATCATGCGTAAGATTCTCCCTC-3′ 3′-GSP2 5′-ATGCGTAAGATTCTCCCTCCG-3′ 5′-Outer-Primer 5′-CATGGCTACATGCTGACAGCCTA-3′ 5′-Inner- Primer 5′-CGCGGATCCACAGCCTACTGATGA
TCAGTCGATG-3′3′-Outer- Primer 5′-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3′ 3′-Inner- Primer 5′-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCA
CTATAGG-3′
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表 2 XsLEC1和AtLEC1蛋白亚细胞定位结果
Table 2. Results of subcellular localizations in XsLEC1 and AtLEC1
亚细胞定位
Subcellular localizationXsLEC1蛋白的概率
Probability of XsLEC1AtLEC1蛋白的概率
Probability of the AtLEC1细胞核Nuclear 8.81 8.87 质膜Plasma membrane 0.60 0.67 细胞外Extracellular 0.04 0.02 线粒体Mitochondrial 0.06 0.02 过氧化物酶体Peroxisomal 0.08 0.05 叶绿体Chloroplast 0.08 0.06 液泡Vacuolar 0.33 0.31
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表 3 XsLEC1和AtLEC1蛋白二级结构的比较
Table 3. Comparison of secondary structure in XsLEC1 and AtLEC1
结构
StructureXsLEC1蛋白概率
Probability of XsLEC1AtLEC1蛋白概率
Probability of AtLEC1α螺旋Alpha helix 98(42.79%) 59(24.79%) 延伸链Extended strand 21(9.17%) 45(18.91%) β转角Beta turn 26(11.35%) 23(9.66%) 无规则卷Random coil 84(36.68%) 111(46.64%)
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表 4 XsLEC1蛋白motif预测
Table 4. Putative functional motif of XsLEC1
功能位点
Functional site氨基酸位置
Amino acid
position氨基酸序列
Amino acid
sequenceN-糖基化位点
N-glycosylation site15~18
34~37
41~44NSSS
NQTN
NNSD酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点
Phosphorylation site of casein kinaseⅡ49~52
83~86
112~115TVRE
TIQE
TAED豆蔻酰化位点
N-myristoylation site5~10
19~24
147~152
187~192
201~206GGFHGY
GLKLTE
GSIRGE
GGGGAT
GTAGAT蛋白激酶C磷酸化位点
Phosphorylation site of protein kinase C49~51
148~150TVR
SIR
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