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旱柳野生种质资源收集及多样性分析

于振旭 秦光华 宋玉民 乔玉玲 姜岳忠 王华田

于振旭, 秦光华, 宋玉民, 乔玉玲, 姜岳忠, 王华田. 旱柳野生种质资源收集及多样性分析[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(10): 67-76. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170330
引用本文: 于振旭, 秦光华, 宋玉民, 乔玉玲, 姜岳忠, 王华田. 旱柳野生种质资源收集及多样性分析[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(10): 67-76. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170330
Yu Zhenxu, Qin Guanghua, Song Yumin, Qiao Yuling, Jiang Yuezhong, Wang Huatian. Collection and genetic diversity analysis of wild germplasm in Salix matsudana[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(10): 67-76. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170330
Citation: Yu Zhenxu, Qin Guanghua, Song Yumin, Qiao Yuling, Jiang Yuezhong, Wang Huatian. Collection and genetic diversity analysis of wild germplasm in Salix matsudana[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(10): 67-76. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170330

旱柳野生种质资源收集及多样性分析

doi: 10.13332/j.1000-1522.20170330
基金项目: 

林业公益性行业科研专项 201404107

详细信息
    作者简介:

    于振旭,博士。主要研究方向:森林培育。Email:taiyangxu2009@163.com 地址:250000 山东省济南市历下区文化东路42号

    通讯作者:

    秦光华,研究员。主要研究方向:林木遗传育种。Email:guanghuaqin@163.com 地址:同上

  • 中图分类号: S792.12

Collection and genetic diversity analysis of wild germplasm in Salix matsudana

  • 摘要: 目的在山东境内调查收集旱柳优树种质,探索旱柳种内遗传多样性水平。方法在试验区建立旱柳无性系苗期对比试验林,利用2年生苗木,分别进行表型数据观测和分子水平遗传多样性标记,分析旱柳种内遗传多样性。结果旱柳种质资源群体内存在丰富的表型变异和分子遗传变异:不同无性系枝干颜色呈黄绿、灰绿、绿色、灰褐、红褐、褐色,且色差重叠少,差异显著;主干有直立、稍弯、中等弯曲、较强弯曲、扭曲,小枝有上弯、直立、下垂,且形态差异显著;不同无性系树高变异范围为1.2~5.5m,地径为0.6~4.6cm,叶长为8.5~18cm,叶宽为0.92~3.49cm,叶面积为6.258~33.584cm2,差异极显著(P < 0.001)。叶长和叶面积的极端差异来源主要是旱柳无性系内,树高、地径、叶宽的极端差异则主要来源于无性系间。表型变异主要来源于无性系间,无性系间的性状分化对旱柳种内性状分化的贡献率达80%以上,说明无性系间的性状分化是旱柳种内性状分化的主要原因。AFLP结果显示,旱柳观测位点的平均多态性比率高达99.5%,显示出极高的多态性;多样性指数结果显示,Nei’s遗传多样度(H)为0.2322,Shannon信息指数(I)为0.3746,表明55份种质在种水平上属于同一个种,与主成分分析及聚类结果一致。结论试验证明旱柳种内存在丰富的表型及分子遗传多样性,是优良的选择和杂交育种材料。
  • 图  1  旱柳种质资源收集图

    Figure  1.  Collection of S. matsudana germplasm resources

    图  2  旱柳种内质量性状对比图

    Figure  2.  Comparison of qualitative traits of S. matsudana

    图  3  旱柳无性系个体及群体苗高、地径

    Figure  3.  Seedling height and ground diameter of S. matsudana individuals and groups

    图  4  旱柳叶长、叶宽及叶面积分布图

    Figure  4.  Distribution of leaf length, leaf width and leaf area of S. matsudana

    图  5  旱柳无性系各性状相对极差及表型分化系数图

    Figure  5.  Relative range and phenotypic differentiation coefficient of each trait of S. matsudana clones

    图  6  旱柳55份种质DNA凝胶电泳(引物组合EAGG/MCTA)

    此图为部分试验结果展示,每个泳道代表一个样品,从左到右为样品S. matsudana 1到S. matsudana 30。

    Figure  6.  Gel electrophoretic results of 55 germplasm resources of S. matsudana germplasm (primer combination EAGG/MCTA)

    This picture shows part of the whole result, and each lane means one specimen; S. matsudana 1 to S. matsudana 30 is from left to right.

    图  7  旱柳无性系聚类分析

    Figure  7.  Cluster analysis of S. matsudana clones

    图  8  旱柳无性系主成分分析

    Figure  8.  Principal component analysis of S. matsudana clones

    表  1  旱柳种质资源名录

    Table  1.   List of S. matsudana germplasm resources

    编号Code 收集地
    Collection place
    纬度
    Latitude
    经度
    Longitude
    地貌
    Landform
    S. matsudana 8 滨城区
    Bincheng District
    37°27′12″N 118°05′55″E 平原Plain
    S. matsudana 24 37°27′12″N 118°05′55″E 平原Plain
    S. matsudana 34 37°27′06″N 118°06′07″E 平原Plain
    S. matsudana 16 博兴县Boxing County 37°21′32″N 118°09′11″E 河岸River bank
    S. matsudana 11 37°13′32″N 118°15′56″E 平原Plain
    S. matsudana 41 单县Shanxian County 34°36′36″N 116°00′13″E 平原Plain
    S. matsudana 12 河口区Hekou District 37°57′28″N 118°19′49″E 平原Plain
    S. matsudana 40 37°57′13″N 118°20′17″E 平原Plain
    S. matsudana 31 37°57′13″N 118°20′17″E 平原Plain
    S. matsudana 32 37°51′06″N 118°21′02″E 平原Plain
    S. matsudana 4 惠民县Huimin County 37°14′23″N 117°31′21″E 平原Plain
    S. matsudana 3 37°19′45″N 117°27′55″E 平原Plain
    S. matsudana 36 37°27′11″N 117°31′16″E 平原Plain
    S. matsudana 45 历城区Licheng District 36°43′16″N 117°08′50″E 平原Plain
    S. matsudana 25 36°26′24″N 117°07′33″E 平原Plain
    S. matsudana 50 36°26′34″N 117°07′05″E 平原Plain
    S. matsudana 43 垦利县Kenli County 37°32′57″N 118°19′30″E 平原Plain
    S. matsudana 9 利津县Lijin County 37°27′59″N 118°11′35″E 平原Plain
    S. matsudana 39 37°31′03″N 118°15′58″E 平原Plain
    S. matsudana 35 37°35′47″N 118°20′12″E 平原Plain
    S. matsudana 28 蒙阴县Mengyin County 35°36′42″N 117°59′52″E 平原Plain
    S. matsudana 19 商河县Shanghe County 37°20′56″N 117°10′44″E 平原Plain
    S. matsudana 30 37°20′50″N 117°11′08″E 平原Plain
    S. matsudana 55 37°22′37″N 117°10′34″E 平原Plain
    S. matsudana 42 37°25′46″N 117°13′26″E 平原Plain
    S. matsudana 46 37°26′02″N 117°13′33″E 平原Plain
    S. matsudana 37 37°20′23″N 117°14′49″E 平原Plain
    S. matsudana 22 37°20′16″N 117°15′46″E 平原Plain
    S. matsudana 21 泗水县Sishui County 35°39′46″N 117°15′57″E 平原Plain
    S. matsudana 18 35°39′46″N 117°15′57″E 河岸River bank
    S. matsudana 48 35°36′01″N 117°02′49″E 平原Plain
    S. matsudana 13 35°42′20″N 117°18′14″E 平原Plain
    S. matsudana 20 无棣县Wudi County 37°45′12″N 117°37′28″E 平原Plain
    S. matsudana 5 新泰市Xintai City 35°54′32″N 117°46′28″E 河岸River bank
    S. matsudana 33 35°54′30″N 117°46′27″E 河岸River bank
    S. matsudana 44 35°54′49″N 117°46′32″E 河岸River bank
    S. matsudana 10 35°56′40″N 117°51′09″E 平原Plain
    S. matsudana 23 兖州市Yanzhou City 35°42′05″N 116°41′02″E 平原Plain
    S. matsudana 1 禹城市Yucheng City 36°58′55″N 116°40′03″E 河岸River bank
    S. matsudana 6 37°03′35″N 116°41′01″E 平原Plain
    S. matsudana 47 37°10′49″N 116°42′50″E 平原Plain
    S. matsudana 53 37°01′56″N 116°37′05″E 平原Plain
    S. matsudana 27 沾化县Zhanhua County 37°40′24″N 118°05′48″E 平原Plain
    S. matsudana 15 37°39′08″N 118°04′50″E 平原Plain
    S. matsudana 14 37°42′04″N 118°08′08″E 平原Plain
    S. matsudana 51 周村区Zhoucun District 36°47′54″N 117°54′42″E 平原Plain
    S. matsudana 49 36°47′57″N 117°55′06″E 平原Plain
    S. matsudana 52 36°47′59″N 117°55′23″E 平原Plain
    S. matsudana 26 张店区Zhangdian District 36°48′10″N 117°58′00″E 河岸River bank
    S. matsudana 17 36°48′07″N 117°58′25″E 平原Plain
    S. matsudana 29 大汶流域Dawen River Basin 37°45′18″N 119°06′56″E 平原Plain
    S. matsudana 7 37°45′18″N 119°06′56″E 平原Plain
    S. matsudana 2 37°44′51″N 119°09′59″E 平原Plain
    S. matsudana 54 37°44′49″N 119°08′24″E 平原Plain
    S. matsudana 38 37°45′08″N 119°07′23″E 平原Plain
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    表  2  旱柳质量性状赋值参照表

    Table  2.   Given value of qualitative characters of S. matsudana

    性状Trait 项目Item 描述分级及赋值Discrimination classification and valuation
    主干干型
    Stem form
    特征
    Trait
    直立
    Up-right
    稍弯
    Slightly curved
    中等弯曲
    Medium curved
    较强弯曲
    Highly curved
    扭曲
    Strongly curved
    赋值Value 1 2 3 4 5
    枝干颜色
    Stem color
    特征
    Trait
    黄绿
    Yellowish-green
    灰绿
    Grayish-green
    绿
    Green
    灰褐
    Grayish-brown
    红褐
    Reddish-brown
    褐色
    Brown
    赋值Value 1.3 1.6 1.9 2.3 2.6 2.9
    小枝赋值
    Value of branchlet
    1.3 1.6 1.9 2.3 2.6 2.9
    枝条形态 特征Trait 上弯Upswept 直伸Straight 下垂Droop
    Branchlet form 赋值Value 1 2 3
    叶着生方式 特征Trait 对生Opposite 互生Mutually
    Leaf growing style 赋值Value 1 2
    叶形Leaf shape 特征Trait 线形Linear 披针形Lanceolate 卵形Oval
    赋值Value 1 2 3
    叶缘Leaf margin 特征
    Trait
    全缘
    Entire
    细锯齿
    Serrulation
    宽锯齿
    Broadly blade
    赋值Value 1 2.1 2.2
    叶表/背被毛情况Pilose on/under leaf 特征
    Trait
    无或很少
    None or rarely

    Little

    Medium

    Much
    很多
    Dense
    上表面赋值Value (up) 1 2 3 4 5
    下表面赋值Value (below) 1 2 3 4 5
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    表  3  利用7对引物对55份旱柳种质的DNA扩增结果

    Table  3.   DNA amplification results of 55 germplasm resources of S. matsudana germplasm by 7 primer combinations

    引物组合
    Primer combination
    总位点数
    Total number of loci
    多态性位点数
    Number of polymorphic loci
    多态率
    Polymorphism/%
    EAAG/MCAG 172 172 100
    EAGC/MCAA 150 150 100
    EAGC/MCAG 144 142 98.61
    EAGG/MCAA 146 145 99.32
    EAGG/MCAC 212 212 100
    EAGG/MCAG 164 163 99.3
    EAGG/MCTA 134 133 99.25
    总计Total 1122 1117 99.5
    平均Mean 160.29 159.57 99.5
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出版历程
  • 收稿日期:  2017-09-12
  • 修回日期:  2018-01-26
  • 刊出日期:  2018-10-01

旱柳野生种质资源收集及多样性分析

doi: 10.13332/j.1000-1522.20170330
    基金项目:

    林业公益性行业科研专项 201404107

    作者简介:

    于振旭,博士。主要研究方向:森林培育。Email:taiyangxu2009@163.com 地址:250000 山东省济南市历下区文化东路42号

    通讯作者: 秦光华,研究员。主要研究方向:林木遗传育种。Email:guanghuaqin@163.com 地址:同上
  • 中图分类号: S792.12

摘要: 目的在山东境内调查收集旱柳优树种质,探索旱柳种内遗传多样性水平。方法在试验区建立旱柳无性系苗期对比试验林,利用2年生苗木,分别进行表型数据观测和分子水平遗传多样性标记,分析旱柳种内遗传多样性。结果旱柳种质资源群体内存在丰富的表型变异和分子遗传变异:不同无性系枝干颜色呈黄绿、灰绿、绿色、灰褐、红褐、褐色,且色差重叠少,差异显著;主干有直立、稍弯、中等弯曲、较强弯曲、扭曲,小枝有上弯、直立、下垂,且形态差异显著;不同无性系树高变异范围为1.2~5.5m,地径为0.6~4.6cm,叶长为8.5~18cm,叶宽为0.92~3.49cm,叶面积为6.258~33.584cm2,差异极显著(P < 0.001)。叶长和叶面积的极端差异来源主要是旱柳无性系内,树高、地径、叶宽的极端差异则主要来源于无性系间。表型变异主要来源于无性系间,无性系间的性状分化对旱柳种内性状分化的贡献率达80%以上,说明无性系间的性状分化是旱柳种内性状分化的主要原因。AFLP结果显示,旱柳观测位点的平均多态性比率高达99.5%,显示出极高的多态性;多样性指数结果显示,Nei’s遗传多样度(H)为0.2322,Shannon信息指数(I)为0.3746,表明55份种质在种水平上属于同一个种,与主成分分析及聚类结果一致。结论试验证明旱柳种内存在丰富的表型及分子遗传多样性,是优良的选择和杂交育种材料。

English Abstract

于振旭, 秦光华, 宋玉民, 乔玉玲, 姜岳忠, 王华田. 旱柳野生种质资源收集及多样性分析[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(10): 67-76. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170330
引用本文: 于振旭, 秦光华, 宋玉民, 乔玉玲, 姜岳忠, 王华田. 旱柳野生种质资源收集及多样性分析[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(10): 67-76. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170330
Yu Zhenxu, Qin Guanghua, Song Yumin, Qiao Yuling, Jiang Yuezhong, Wang Huatian. Collection and genetic diversity analysis of wild germplasm in Salix matsudana[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(10): 67-76. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170330
Citation: Yu Zhenxu, Qin Guanghua, Song Yumin, Qiao Yuling, Jiang Yuezhong, Wang Huatian. Collection and genetic diversity analysis of wild germplasm in Salix matsudana[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(10): 67-76. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170330
  • 柳树(Salix spp.)属杨柳科(Salicaceae)柳属(Salix)。全世界柳属植物约有520种,主要分布在北半球温带、寒带及亚热带,南半球极少,而大洋洲则无野生种。中国有柳属植物257种,122变种与33变型,全国各地均有分布[1]。柳树具有速生、优质,树姿美观、耐水湿、耐寒、耐旱、耐盐碱与耐污染等优点,是重要的用材及生物质能源树种,也是重要的绿化和生态型树种。大力发展柳树栽培,对于缓解我国木材供需矛盾、改善生态环境和城乡景观具有重要意义。

    木本植物遗传多样性的研究历史悠久,自1968—1990年,已有322个木本植物种群的研究报道,早期的研究发现木本植物在等位酶、生活模式等方面的种群遗传多样性丰富,种间生活史和生态特性存在较大差异[2];近年来研究发现,岛屿植物群体的遗传多样性受气候变迁的影响[3];而种群遗传多样性水平能够影响种群生态进程及物种对外界干扰的响应[4]。蒿柳(Salix viminalis)作为易丛生物种成为群落遗传结构研究的热点[5-7],Berlin等[8]通过微卫星标记、物候观测及生物量特性评估等方式对蒿柳的表型变异、种群结构和遗传多样性进行了系统研究。20世纪90年代英国筹建的柳树种质资源中心(National Willow Collection),收集了约1500份柳树种质材料[9],成为世界上最大的柳树种质资源库。多年来,柳树分类研究一直是众多学者关注的重点[10-12],Skvortsov[13]在其关于柳树的专著中提出的柳树分类体系在国际上得到广泛认可。近年来,有关柳属的应用研究[14]、栽培技术研究[15-16]及抗逆性研究方面[17-20]已有大量报道,并取得了较大进展。

    旱柳(Salix matsudana)为柳属柳组(Sect. Salix)乔木树种,是我国重要的用材树种。木材白色,材质细腻,材性稳定,可供建筑、器具、造纸等多种用途,也是固沙保土和城乡绿化的优良树种,叶还可作木本蔬菜和饲料[1]。国内外有关旱柳的研究报道较少,仅有的研究集中在旱柳抗逆性的分子机制方面,Qiao等[21]和Zhou等[22]分别采用蛋白质组和转录组分析的方法研究了旱柳对盐胁迫的响应和miRNAs的表达特征,从分子水平上阐明旱柳的耐盐机理;Yang等[23]研究发现了Tamarix hispida ThMT3基因的超表达可以增加旱柳植物的耐铜性和不定根的分化。有关旱柳遗传多样性方面的研究迄今未见报道。鉴于此,本研究旨在通过对旱柳表型与分子的系统检测,阐述旱柳种内性状及遗传多样性水平,为旱柳的研究及生产利用提供参考。

    • 山东是旱柳的天然分布区,野生旱柳主要分布于鲁中南山地丘陵和鲁北滨海盐碱地,收集范围为山东省境内的滨州、东营、济南、菏泽、泰安、临沂、淄博、济宁、枣庄、德州等10市19县(市、区),共调查收集55株旱柳优树(表 1图 1)。在山东省济南市长清区西仓村(36°34′34″N、116°41′02″E),利用1年生健壮枝条扦插繁育建立旱柳无性系苗期对比试验林。试验采用随机区组设计,每小区10株,重复3次,测定材料2年生苗木。

      表 1  旱柳种质资源名录

      Table 1.  List of S. matsudana germplasm resources

      编号Code 收集地
      Collection place
      纬度
      Latitude
      经度
      Longitude
      地貌
      Landform
      S. matsudana 8 滨城区
      Bincheng District
      37°27′12″N 118°05′55″E 平原Plain
      S. matsudana 24 37°27′12″N 118°05′55″E 平原Plain
      S. matsudana 34 37°27′06″N 118°06′07″E 平原Plain
      S. matsudana 16 博兴县Boxing County 37°21′32″N 118°09′11″E 河岸River bank
      S. matsudana 11 37°13′32″N 118°15′56″E 平原Plain
      S. matsudana 41 单县Shanxian County 34°36′36″N 116°00′13″E 平原Plain
      S. matsudana 12 河口区Hekou District 37°57′28″N 118°19′49″E 平原Plain
      S. matsudana 40 37°57′13″N 118°20′17″E 平原Plain
      S. matsudana 31 37°57′13″N 118°20′17″E 平原Plain
      S. matsudana 32 37°51′06″N 118°21′02″E 平原Plain
      S. matsudana 4 惠民县Huimin County 37°14′23″N 117°31′21″E 平原Plain
      S. matsudana 3 37°19′45″N 117°27′55″E 平原Plain
      S. matsudana 36 37°27′11″N 117°31′16″E 平原Plain
      S. matsudana 45 历城区Licheng District 36°43′16″N 117°08′50″E 平原Plain
      S. matsudana 25 36°26′24″N 117°07′33″E 平原Plain
      S. matsudana 50 36°26′34″N 117°07′05″E 平原Plain
      S. matsudana 43 垦利县Kenli County 37°32′57″N 118°19′30″E 平原Plain
      S. matsudana 9 利津县Lijin County 37°27′59″N 118°11′35″E 平原Plain
      S. matsudana 39 37°31′03″N 118°15′58″E 平原Plain
      S. matsudana 35 37°35′47″N 118°20′12″E 平原Plain
      S. matsudana 28 蒙阴县Mengyin County 35°36′42″N 117°59′52″E 平原Plain
      S. matsudana 19 商河县Shanghe County 37°20′56″N 117°10′44″E 平原Plain
      S. matsudana 30 37°20′50″N 117°11′08″E 平原Plain
      S. matsudana 55 37°22′37″N 117°10′34″E 平原Plain
      S. matsudana 42 37°25′46″N 117°13′26″E 平原Plain
      S. matsudana 46 37°26′02″N 117°13′33″E 平原Plain
      S. matsudana 37 37°20′23″N 117°14′49″E 平原Plain
      S. matsudana 22 37°20′16″N 117°15′46″E 平原Plain
      S. matsudana 21 泗水县Sishui County 35°39′46″N 117°15′57″E 平原Plain
      S. matsudana 18 35°39′46″N 117°15′57″E 河岸River bank
      S. matsudana 48 35°36′01″N 117°02′49″E 平原Plain
      S. matsudana 13 35°42′20″N 117°18′14″E 平原Plain
      S. matsudana 20 无棣县Wudi County 37°45′12″N 117°37′28″E 平原Plain
      S. matsudana 5 新泰市Xintai City 35°54′32″N 117°46′28″E 河岸River bank
      S. matsudana 33 35°54′30″N 117°46′27″E 河岸River bank
      S. matsudana 44 35°54′49″N 117°46′32″E 河岸River bank
      S. matsudana 10 35°56′40″N 117°51′09″E 平原Plain
      S. matsudana 23 兖州市Yanzhou City 35°42′05″N 116°41′02″E 平原Plain
      S. matsudana 1 禹城市Yucheng City 36°58′55″N 116°40′03″E 河岸River bank
      S. matsudana 6 37°03′35″N 116°41′01″E 平原Plain
      S. matsudana 47 37°10′49″N 116°42′50″E 平原Plain
      S. matsudana 53 37°01′56″N 116°37′05″E 平原Plain
      S. matsudana 27 沾化县Zhanhua County 37°40′24″N 118°05′48″E 平原Plain
      S. matsudana 15 37°39′08″N 118°04′50″E 平原Plain
      S. matsudana 14 37°42′04″N 118°08′08″E 平原Plain
      S. matsudana 51 周村区Zhoucun District 36°47′54″N 117°54′42″E 平原Plain
      S. matsudana 49 36°47′57″N 117°55′06″E 平原Plain
      S. matsudana 52 36°47′59″N 117°55′23″E 平原Plain
      S. matsudana 26 张店区Zhangdian District 36°48′10″N 117°58′00″E 河岸River bank
      S. matsudana 17 36°48′07″N 117°58′25″E 平原Plain
      S. matsudana 29 大汶流域Dawen River Basin 37°45′18″N 119°06′56″E 平原Plain
      S. matsudana 7 37°45′18″N 119°06′56″E 平原Plain
      S. matsudana 2 37°44′51″N 119°09′59″E 平原Plain
      S. matsudana 54 37°44′49″N 119°08′24″E 平原Plain
      S. matsudana 38 37°45′08″N 119°07′23″E 平原Plain

      图  1  旱柳种质资源收集图

      Figure 1.  Collection of S. matsudana germplasm resources

    • 2015年7月中旬,全面调查树高和胸径,每个无性系选3株标准株(每个小区1株),参照《植物新品种特异性、一致性、稳定性测试指南柳属》(GB/T 26910—2011),调查表型质量性状并赋值(表 2);选择标准株树冠中上部当年生健壮枝条,取中部成熟叶片4枚,yaxin-1241叶面积仪测定叶长、叶宽、叶面积。生长季结束后,测量树高和胸径。

      表 2  旱柳质量性状赋值参照表

      Table 2.  Given value of qualitative characters of S. matsudana

      性状Trait 项目Item 描述分级及赋值Discrimination classification and valuation
      主干干型
      Stem form
      特征
      Trait
      直立
      Up-right
      稍弯
      Slightly curved
      中等弯曲
      Medium curved
      较强弯曲
      Highly curved
      扭曲
      Strongly curved
      赋值Value 1 2 3 4 5
      枝干颜色
      Stem color
      特征
      Trait
      黄绿
      Yellowish-green
      灰绿
      Grayish-green
      绿
      Green
      灰褐
      Grayish-brown
      红褐
      Reddish-brown
      褐色
      Brown
      赋值Value 1.3 1.6 1.9 2.3 2.6 2.9
      小枝赋值
      Value of branchlet
      1.3 1.6 1.9 2.3 2.6 2.9
      枝条形态 特征Trait 上弯Upswept 直伸Straight 下垂Droop
      Branchlet form 赋值Value 1 2 3
      叶着生方式 特征Trait 对生Opposite 互生Mutually
      Leaf growing style 赋值Value 1 2
      叶形Leaf shape 特征Trait 线形Linear 披针形Lanceolate 卵形Oval
      赋值Value 1 2 3
      叶缘Leaf margin 特征
      Trait
      全缘
      Entire
      细锯齿
      Serrulation
      宽锯齿
      Broadly blade
      赋值Value 1 2.1 2.2
      叶表/背被毛情况Pilose on/under leaf 特征
      Trait
      无或很少
      None or rarely

      Little

      Medium

      Much
      很多
      Dense
      上表面赋值Value (up) 1 2 3 4 5
      下表面赋值Value (below) 1 2 3 4 5
    • 旱柳发叶初期,采集2年生幼树标准株树冠中上部健壮枝条的中部新鲜嫩叶置于装有干燥剂的密封袋内,保存于冰盒内带回实验室,采用CATB法提取DNA。每个无性系选取3个标准株,每个标准株采集1份。

    • DNA模板200ng,接头40pmol,EcoR I/MseI 8U/8U,10×Reaction buffer 2.5μL,T4 Ligase 3U,加ddH2O补足至25μL,混匀离心数秒后于37℃保温5h,8℃保温4h,4℃过夜,用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测酶切连接产物。

    • 模板DNA 20ng,Pre-ampmix 1μL,dNTPs (各2.5mmol/L)1μL,10× PCR buffer 2.5μL,Taq酶1U,加ddH2O补足至25μL,离心数秒,按下列参数进行PCR扩增:先94℃ 2min,然后按照94℃ 30s,56℃ 30s,72℃ 80s进行30次循环,最后72℃ 5min,4℃贮藏。用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测预扩产物。

    • 预扩产物1:20稀释后,吸取2μL作为选扩模板。10×PCR buffer 2.5μL,dNTP (各2.5mmol/L)0.5μL,EcoRI引物5ng,MseI引物30ng,Taq酶1U,ddH2O补足至25μL,离心数秒,进行PCR循环:第1轮扩增参数:94℃ 30s,65℃ 30s,72℃ 80s,以后每轮循环退火温度递减0.7℃,共扩增12个循环,按照以下参数:94℃ 30s,55℃ 30s,72℃ 80s循环23次,4℃贮藏。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测预扩产物。

    • 利用ABI377测序仪进行AFLP多态性分析,利用GENESCAN3.1和Binthere软件进行数据提取。

      Nei’s遗传多样度指数$H=-\ln \frac{J_{X Y}}{\sqrt{J_{X Y}}}$,其中${J_X} = \sum\limits_u {\sum\limits_l {\frac{{X_u^2}}{L}} } , {J_Y} = \sum\limits_u {\sum\limits_l {\frac{{Y_u^2}}{L}} } , {J_{XY}} = \sum\limits_u {\sum\limits_l {\frac{{{X_u}{Y_l}}}{L}} } $L,式中:L表示观测位点总数,XY表示观测相同位点数的两个种群,u表示等位基因数,l表示位点数。

      Shannon信息指数$I=-\sum p_{i}\left(\ln p_{i}\right)$,式中pi表示样品中属于第i个种的个体比例。

    • 生长量数据的处理及分析利用Excel和SAS软件完成,群体AFLP多样性分析利用NTsys和POPgene软件完成。

    • 对比分析质量性状看出(图 2),旱柳的干型、小枝形态、主枝及小枝颜色等性状差异较大,存在着较强的种内分化情况。叶片的相关质量性状差异较小,性状分化较弱,不同无性系的叶表、背面的被毛性状有差异,但叶形、叶缘及叶片着生方式上均无差异。主干和小枝的形态及颜色等质量性状分化明显,表明旱柳种内质量性状多样性丰富。

      图  2  旱柳种内质量性状对比图

      Figure 2.  Comparison of qualitative traits of S. matsudana

    • 观测无性系个体地径和树高(图 3A)发现,旱柳不同种质之间高、径生长分化明显,多样性水平较高。其中,地径0.6~4.6cm,均值2.1cm,极差为均值2倍;树高1.2~5.5m,均值3.6m,极差约为均值1.2倍。单因素方差分析显示,不同无性系之间树高与地径差异性极显著(P < 0.0001);根据树高均值差异,多重比较将55个无性系划分为20个水平(A-T,α=0.05);根据地径均值差异,将55个无性系划分为25个水平(A-Y,α=0.05)。旱柳种内无性系间的树高1.7~4.7m(图 3B),树高极差约为均值(3.6m)的0.8倍;地径变异范围0.9~3.2cm(图 3C),地径极差约为均值(2.1cm)1倍左右。

      图  3  旱柳无性系个体及群体苗高、地径

      Figure 3.  Seedling height and ground diameter of S. matsudana individuals and groups

      图 4看出,旱柳种内叶表型性状差异显著,数量分化明显,表型多样性丰富。叶长8.5~18cm,均值12.98cm,极差为均值的0.7倍;叶宽0.92~3.49cm,均值1.54cm,极差为均值的1.7倍;叶面积6.258~33.584cm2,均值14.55cm2,极差为均值的1.9倍。单因素方差分析显示,旱柳种内各无性系间叶长、叶宽及叶面积差异极显著(P < 0.0001)。根据均值差异,多重比较将叶长分为20个水平(A-T,α=0.05),将叶宽分为24个水平(A-X,α=0.05),将叶面积分为23个水平(A-W,α=0.05)。

      图  4  旱柳叶长、叶宽及叶面积分布图

      Figure 4.  Distribution of leaf length, leaf width and leaf area of S. matsudana

    • 将无性系内各数量性状极差占样本总极差的百分比作为相对极差(图 5A),探寻各性状的极端变异来源。叶长及叶面积的极端变异来源有74.04%和54.44%来源于无性系内部,无性系内的极端差异是导致性状极端分化的主要原因;苗高、地径和叶宽等性状的样本极端变异主要来自无性系间,无性系间的极端差异是性状极端分化的主要原因。

      图  5  旱柳无性系各性状相对极差及表型分化系数图

      Figure 5.  Relative range and phenotypic differentiation coefficient of each trait of S. matsudana clones

      图 5B中可以看出,旱柳种内各数量性状表型分化系数较大,表明性状变异主要来源于旱柳无性系间,无性系间的遗传分化是各性状分化的主要原因。其中,苗高、地径、叶宽及叶面积等性状的遗传分化系数超过90%,无性系内的变异对旱柳种内的多样性影响极小,无性系间的性状差异代表了旱柳种内多样性水平。

    • 在64对引物中选取效果最好的7对AFLP引物(表 3)对55份旱柳无性系进行分析,共检测到1122个位点,其中多态位点1117个,多态性百分率为99.5%,每对引物的多态百分率为98.61%~100%之间,表明旱柳DNA具有极高的多态性,在分子水平上具有极为广泛的变异;Nei’s遗传多样度(H)为0.2322,Shannon信息指数(I)为0.3746,这是因为所收集的旱柳无性系之间的遗传亲缘关系较近,属于同一个种,所以遗传多样性指数较低,这与旱柳种内分子水平上易产生变异的广泛性不矛盾。

      表 3  利用7对引物对55份旱柳种质的DNA扩增结果

      Table 3.  DNA amplification results of 55 germplasm resources of S. matsudana germplasm by 7 primer combinations

      引物组合
      Primer combination
      总位点数
      Total number of loci
      多态性位点数
      Number of polymorphic loci
      多态率
      Polymorphism/%
      EAAG/MCAG 172 172 100
      EAGC/MCAA 150 150 100
      EAGC/MCAG 144 142 98.61
      EAGG/MCAA 146 145 99.32
      EAGG/MCAC 212 212 100
      EAGG/MCAG 164 163 99.3
      EAGG/MCTA 134 133 99.25
      总计Total 1122 1117 99.5
      平均Mean 160.29 159.57 99.5

      图  6  旱柳55份种质DNA凝胶电泳(引物组合EAGG/MCTA)

      Figure 6.  Gel electrophoretic results of 55 germplasm resources of S. matsudana germplasm (primer combination EAGG/MCTA)

      利用遗传相似系数作为参考值对55份无性系进行聚类分析(图 7),相关性检验表明聚类效果较好(r=0.818)。遗传相似系数越大,表明亲缘关系越近,当相似系数取值为0.79时,55个无性系被聚为2类,表明各个无性系之间的亲缘关系较近。

      图  7  旱柳无性系聚类分析

      Figure 7.  Cluster analysis of S. matsudana clones

      主成分分析结果支持聚类分析的结论。根据主成分权重进行聚类作图,总体将55个无性系分为两个大类,从图 8中可以看出,两个椭圆的长轴均更倾向于纵坐标轴,表明第1主成分包含了更多的数据信息。根据降维的思想,第1主成分对两个大类可做出足够的解释,且第1聚类类群的变化范围包含了第2聚类类群,主成分对两类的解释无明显差异,两类群之间遗传距离不大,表明55个无性系同属于旱柳种内。

      图  8  旱柳无性系主成分分析

      Figure 8.  Principal component analysis of S. matsudana clones

    • 表型变异研究是遗传学研究的重要途径,在植物群体遗传学、保育遗传学及生物遗传多样性研究中得到广泛应用[24-26]。本研究通过对旱柳无性系的表型性状系统观测发现,旱柳具有丰富的表型变异。质量性状分析发现,旱柳无性系之间主干、小枝的干型及颜色等性状差异显著;地径0.6~4.6cm,苗高1.2~5.5m,叶长8.5~18cm,叶宽0.92~3.49cm,叶面积6.258~33.584cm2,表明旱柳种内表型数量性状存在着显著的分离分化现象,多样性十分丰富。

      遗传多样性是居群适应环境变化所必需的,它可以通过一系列分子和数量的方法来评价,而维持遗传多样性是保护生物学的核心目标,但分子检测只是对进化潜能判断提供一个初步的提示[25]

      旱柳具有极高频率的多态性,群体遗传多样性丰富,虽试验群体略有差异,但这与贾会霞等[27]的研究结论一致。本研究发现,旱柳观测位点的多态比率接近100%,表明其在DNA分子水平上存在着极为广泛的变异或变异潜力,是导致旱柳表型多样性的主要原因,同时表明旱柳在有性繁殖过程中将会产生更多的等位基因交换组合,使旱柳成为多目标育种的优良试材。本研究同时发现,55份旱柳试材的Shannon指数及Nei’s指数均较低,分别为0.2322和0.3746,表明旱柳种内不同无性系之间亲缘关系较近,在种的水平上遗传物质相对稳定。

      表型变异来源分析对旱柳的育种及多方向研究利用具有参考价值。本研究表明,旱柳树高与地径的变异主要来源于无性系间,无性系间性状分化现象明显,无性系内变异较小;由于变异来源于基因型与环境因子共同作用,无性系的变异更多的来源于环境因子,所以无性系内的变异对旱柳种内的变异贡献较少。这对于旱柳优良无性系的筛选具有指导意义,优选无性系是获得具有稳定重复性状种质资源的基本保障。但本研究因为取样范围的设计,不能够完全代表旱柳种内的遗传多样性信息,且对旱柳种群内及种群间遗传差异及多样性分析不够深入,具有一定的局限性,可在今后的研究中着重讨论,深入探索,以期获得更有价值的旱柳多样性相关信息。

参考文献 (27)

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