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半仿生法提取细叶小檗总生物碱及抑菌性研究

符群 张海婷

符群, 张海婷. 半仿生法提取细叶小檗总生物碱及抑菌性研究[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(5): 117-123. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170345
引用本文: 符群, 张海婷. 半仿生法提取细叶小檗总生物碱及抑菌性研究[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(5): 117-123. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170345
Fu Qun, Zhang Haiting. Using the method of semi-bionic to extract total alkaloids from Berberis poiretii and to study the antibacterial property[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(5): 117-123. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170345
Citation: Fu Qun, Zhang Haiting. Using the method of semi-bionic to extract total alkaloids from Berberis poiretii and to study the antibacterial property[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(5): 117-123. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170345

半仿生法提取细叶小檗总生物碱及抑菌性研究

doi: 10.13332/j.1000-1522.20170345
基金项目: 

大熊猫肠道益生菌制剂的研制 SG1409-2

详细信息
    作者简介:

    符群,博士,高级工程师。主要研究方向:林下资源活性物质分离与性质研究。Email:nefufuqun@163.com 地址:150040 黑龙江省哈尔滨市香坊区和兴路26号东北林业大学林学院

  • 中图分类号: S793.9

Using the method of semi-bionic to extract total alkaloids from Berberis poiretii and to study the antibacterial property

  • 摘要: 目的本文通过对细叶小檗果实中生物碱的研究,为细叶小檗的有效合理利用提供参考。方法本实验以细叶小檗总生物碱提取量和抑菌圈直径为考察指标,用10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%的乙醇作为溶剂提取细叶小檗中的总生物碱,得出27%乙醇为较好的提取溶剂。以27%乙醇为提取溶剂,进行液料比、温度和超声时间的单因素试验。在单因素试验基础上,采用Plackett-Burman设计、最速上升试验以及中心复合实验响应面设计建立数学模型。结果实验结果表明,最佳提取条件为:乙醇含量27%(V/V)、液料比32mL/g、温度52℃、超声功率800W,提取液的pH值为2.2时,对应提取时间为50min;提取液的pH值为7.6时,对应提取时间为25min;提取液的pH值为8.5时,对应提取时间为25min。在此条件下,细叶小檗中总生物碱的提取量为(16.24±0.54)mg/g,比单一超声波辅助法的提取量提高了1.31倍;抑菌圈直径为(91.21±0.37)mm。结论采用超声波辅助半仿生法比单一采用超声波法对细叶小檗中总生物碱的提取效果更好,提取量提高了1.31倍;抑菌效果提高了1.07倍。相比较国内目前对于小檗属植物小檗碱的平均提取量(16.6±0.6)mg/g相接近,在抑菌活性上有明显提高。
  • 图  1  乙醇含量对细叶小檗中总生物碱提取量和抑菌活性的影响

    Figure  1.  Effects of volume concentration of ethanol on the yield of total alkaloids and antibacterial activity from Berberis poiretii

    图  2  液料比对细叶小檗中总生物碱提取量和抑菌活性的影响

    Figure  2.  Effects of ratio of liquid to solid on the yield of total alkaloids and antibacterial activity from Berberis poiretii

    图  3  温度对细叶小檗中总生物碱提取量和抑菌活性的影响

    Figure  3.  Effects of extraction temperature on the yield of total alkaloids and antibacterial activity from Berberis poiretii

    图  4  提取时间对细叶小檗中总生物碱提取量和抑菌活性的影响

    Figure  4.  Effects of extraction time on the yield of total alkaloids and antibacterial activity from Berberis poiretii

    图  5  乙醇含量、液料比和温度交互影响细叶小檗总生物碱提取量的响应面

    Figure  5.  Response surface plots for the interactive effects of volume concentration of ethanol, liquid-solid ratio and extraction temperature on the yield of total alkaloids from Berberis poiretii

    图  6  乙醇含量、液料比和温度交互影响细叶小檗总生物碱抑菌活性的响应面

    Figure  6.  Response surface plots for the interactive effects of volume concentration of ethanol, liquid-solid ratio and extraction temperature on the antibacterial activity of total alkaloids from Berberis poiretii

    表  1  Central Composite Design中的因素及水平

    Table  1.   Factors and levels in Central Composite Design

    因素Factor 水平Level
    -1 0 1
    乙醇含量Ethanol content(A)/% 20 30 40
    液料比Ratio of liquid to solid(B)/(mL·g -1) 20 30 40
    温度Extraction temperature(C)/℃ 40 50 60
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    表  2  Central Composite Design试验设计及结果

    Table  2.   Experimental design and results in the Central Composite Design

    编号No. A/% B/(mL·g -1) C/℃ 提取量Extraction
    amount/(mg·g-1)
    抑菌圈直径
    Diameter of bacteriostatic circle/mm
    1 1 -1 -1 7.403±0.55 82.884±0.34
    2 0 0 -1.682 13.925±0.34 90.051±0.65
    3 0 0 0 17.044±0.56 91.746±0.25
    4 0 0 0 16.946±0.36 92.128±0.84
    5 1 1 -1 10.647±0.15 86.547±0.36
    6 -1 -1 1 10.898±0.17 88.836±0.69
    7 0 0 0 16.896±0.71 92.618±0.86
    8 -1 1 -1 7.302±1.55 90.419±0.47
    9 0 0 0 17.145±0.51 90.345±0.35
    10 1 -1 1 10.157±0.89 84.936±0.28
    11 -1.682 0 0 11.746±0.43 89.511±0.47
    12 1 1 1 13.144±0.46 86.302±0.58
    13 0 0 1.682 14.368±0.01 90.258±0.34
    14 -1 -1 -1 7.035±0.20 86.992±0.85
    15 -1 1 1 10.774±0.50 89.953±0.61
    16 0 1.682 0 14.928±0.34 89.354±0.47
    17 1.682 0 0 14.906±0.28 83.296±0.26
    18 0 0 0 17.035±0.64 91.523±0.33
    19 0 0 0 17.227±0.33 91.554±0.54
    20 0 -1.682 0 9.358±0.48 87.717±0.35
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    表  3  Central Composite Design实验结果方差分析表(提取量)

    Table  3.   ANOVA of experimental results in central composite design (extraction amount)

    来源
    Source
    平方和
    Sum of squares
    自由度
    Degree of freedom
    均方
    Mean square
    F P 显著性
    Significance
    A 14.78 1 14.78 23.61 0.0007 S
    B 4.19 1 4.19 6.69 0.0271 S
    C 1.51 1 1.51 2.41 0.1518 NS
    AB 0.012 1 0.012 0.019 0.8937 NS
    AC 1.812×10-3 1 1.812×10-3 2.894×10-3 0.9582 NS
    BC 0.74 1 0.74 1.19 0.3013 NS
    A2 56.47 1 56.47 90.18 <0.0001 S
    B2 33.13 1 33.13 52.90 <0.0001 S
    C2 15.48 1 15.48 24.72 0.0006 S
    模型Model 110.68 9 12.30 19.64 <0.0001 S
    残差Residual 6.26 10 0.63
    失拟项Lack of fit 4.08 5 0.82 1.88 0.2533 NS
    纯误差Pure error 2.18 5 0.44
    校正总和Sum of correction 116.94 19
    注:“S”表示显著,“NS”表示不显著。下同。Notes: “S” means significant, “NS” means not significant. The same below.
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    表  4  Central Composite Design实验结果方差分析表(抑菌活性)

    Table  4.   ANOVA of experimental results in Central Composite Design(antibacterial activity)

    来源
    Source
    平方和
    Sum of squares
    自由度
    Degree of freedom
    均方
    Mean square
    F P 显著性
    Significance
    A 49.52 1 49.52 57.60 <0.000 1 S
    B 11.14 1 11.14 12.95 <0.000 1 S
    C 0.92 1 0.92 1.07 0.004 9 S
    AB 0.029 1 0.029 0.033 0.325 6 NS
    AC 0.023 1 0.023 0.026 0.858 5 NS
    BC 2.65 1 2.65 3.08 0.874 1 NS
    A2 63.01 1 63.01 73.29 0.109 7 NS
    B2 25.79 1 25.79 30.00 <0.000 1 S
    C2 8.43 1 8.43 9.80 0.000 3 S
    Model 148.92 9 16.55 19.25 0.010 7 S
    残差Residual 8.60 10 0.86
    失拟项Lack of fit 5.62 5 1.12 1.89 0.2505 NS
    纯误差Pure error 2.97 5 0.59
    校正总和Sum of correction 157.51 19
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    , 王瑛, 王华芳, 于京民2, 刘玉军, 尹伟伦, 王建中, 王晓楠, 张志翔, 孙建华, 张兴杰, 沈应柏, 李镇宇, 陈卫平, 张庆, 王民中, 王玉春, 丁霞, 林善枝, 刘艳, 李凤兰, 刘玉军, 呼晓姝, 陶凤杰, 杨伟光, 汪植, 蒋平, 马建海, 付瑞海, 赵新丽.  苹果多酚的超声波提取及抗氧化作用研究 . 北京林业大学学报, 2007, 29(5): 137-141.
    [18] 段旭良, 王莉, 程堂仁, 周章义, 李艳华, 胡晓丹, 熊丹, 金莹, 贺窑青, 欧阳杰, 姚娜, 胡海英, 孙青, 王丰俊, 李莉, 乔海莉, 张玲, 范丙友, 孙月琴, 郝晨, 雷庆哲, 石娟, 陈佳, 曲红, 刘丽, 隋金玲, 李在留, 刘美芹, 张香, 陈发菊, 骆有庆, 续九如, 尹伟伦, 骆有庆, 冯菁, 路端正, 王建中, 张艳霞, 阎伟, 郭锐, 冯秀兰, 尹伟伦, 郑彩霞, 陆海, 周燕, 李云, 陈晓阳, 张志毅, 李凤兰, 武彦文, 张德权, 孙爱东, 赵亚美, 田呈明, 沈昕, 康向阳, 王华芳, 姜金仲, 王晓东, 马钦彦, 安新民, 赵蕾, 梁华军, 李忠秋, 高述民, 胡德夫, 孙爱东, 郝俊, 骆有庆, 胡晓丹, 梁宏伟, 王百田, 骆有庆, 蒋湘宁, 阎晓磊, 郑永唐, 卢存福, 沈繁宜, 吴晓成, 史玲玲, 武海卫, 王瑛, 温秀凤3, 骈瑞琪, 张志翔, 于京民2, 冯晓峰, 刘玉军, 李凯, 王冬梅, 王华芳, 王建中, 王晓楠, 郭晓萍, 吴坚, 王玉兵, 谢磊, 赵兵, 高荣孚, 崔彬彬
    , 冯仲科, 严晓素, 尹伟伦, 邹坤, 呼晓姝, 刘艳, 沈应柏, 杨伟光, 陶凤杰, 丁霞, 陈卫平, 王民中, 孙建华, 刘玉军, 李凤兰, 王玉春, 张庆, 张兴杰, 林善枝, 李镇宇, 蒋平, 赵新丽, 马建海, 付瑞海, 汪植.  响应面法优化超声波辅助提取桑叶多糖的工艺研究 . 北京林业大学学报, 2007, 29(5): 142-146.
    [19] 张文娟, 盖颖, 张学俭, 谢响明, 李云成, 孙宇瑞, 高鹏, 李永慈, 王岩, 李绍才, 侯旭, 何磊, 柳新伟, 张金凤, 贺庆棠, 朱妍, 罗菊春, 王盛萍, 冶民生, 蒋佳荔, 张志强, 关文彬, 孙海龙, 申卫军, 康向阳, 李吉跃, 廖学品, 昌明, 成仿云, 唐守正, 吕建雄, 王文棋, 冯仲科, 陆佩玲, 何静, 张华丽, 马道坤, 崔保山, 吴玉英, 张平冬, 路婷, 关毓秀, 赵广杰, 孙阁, 静洁, 吴斌, 蒋湘宁, 史剑波, 张桂莲, 何权, 于晓南, 石碧, 杨志荣, 李小飞, 王军辉, 王尚德, 赵燕东, 马克明, 孙晓霞, 张满良, 蒲俊文, 彭少麟, 陈永国, 汪燕, 林威, 余新晓, 胡文忠, 刘国华, 汪西林.  黄绿木霉菌代谢产物对杨树烂皮病菌抑菌能力的研究 . 北京林业大学学报, 2006, 28(1): 76-79.
    [20] 杨振德, 朱麟, 赵博光, 方杰, .  苦豆草生物碱对分月扇舟蛾体内消化酶和保护酶活性的影响 . 北京林业大学学报, 2006, 28(1): 80-83.
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出版历程
  • 收稿日期:  2017-09-25
  • 修回日期:  2017-12-15
  • 刊出日期:  2018-05-01

半仿生法提取细叶小檗总生物碱及抑菌性研究

doi: 10.13332/j.1000-1522.20170345
    基金项目:

    大熊猫肠道益生菌制剂的研制 SG1409-2

    作者简介:

    符群,博士,高级工程师。主要研究方向:林下资源活性物质分离与性质研究。Email:nefufuqun@163.com 地址:150040 黑龙江省哈尔滨市香坊区和兴路26号东北林业大学林学院

  • 中图分类号: S793.9

摘要: 目的本文通过对细叶小檗果实中生物碱的研究,为细叶小檗的有效合理利用提供参考。方法本实验以细叶小檗总生物碱提取量和抑菌圈直径为考察指标,用10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%的乙醇作为溶剂提取细叶小檗中的总生物碱,得出27%乙醇为较好的提取溶剂。以27%乙醇为提取溶剂,进行液料比、温度和超声时间的单因素试验。在单因素试验基础上,采用Plackett-Burman设计、最速上升试验以及中心复合实验响应面设计建立数学模型。结果实验结果表明,最佳提取条件为:乙醇含量27%(V/V)、液料比32mL/g、温度52℃、超声功率800W,提取液的pH值为2.2时,对应提取时间为50min;提取液的pH值为7.6时,对应提取时间为25min;提取液的pH值为8.5时,对应提取时间为25min。在此条件下,细叶小檗中总生物碱的提取量为(16.24±0.54)mg/g,比单一超声波辅助法的提取量提高了1.31倍;抑菌圈直径为(91.21±0.37)mm。结论采用超声波辅助半仿生法比单一采用超声波法对细叶小檗中总生物碱的提取效果更好,提取量提高了1.31倍;抑菌效果提高了1.07倍。相比较国内目前对于小檗属植物小檗碱的平均提取量(16.6±0.6)mg/g相接近,在抑菌活性上有明显提高。

English Abstract

符群, 张海婷. 半仿生法提取细叶小檗总生物碱及抑菌性研究[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(5): 117-123. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170345
引用本文: 符群, 张海婷. 半仿生法提取细叶小檗总生物碱及抑菌性研究[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(5): 117-123. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170345
Fu Qun, Zhang Haiting. Using the method of semi-bionic to extract total alkaloids from Berberis poiretii and to study the antibacterial property[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(5): 117-123. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170345
Citation: Fu Qun, Zhang Haiting. Using the method of semi-bionic to extract total alkaloids from Berberis poiretii and to study the antibacterial property[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(5): 117-123. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170345
  • 细叶小檗(Berberis poiretii)为小檗科(Berberidaceae)小檗属浆果,俗名细叶小檗、针雀、酸狗奶子等。细叶小檗果实中的化学成分具有一定的营养保健潜力,因此可以为人类的身体健康起到有益的作用[1]。从小檗属植物中既可以分离得到维生素、矿物质、蛋白质和脂质等基本营养成分,也可以分离出各种生物碱、萜类化合物、甾醇、花青素、木脂素和类胡萝卜素等[1]。在小檗属植物中,分离出的生物碱有小檗碱、小檗胺、巴马汀、哥伦胺和苦参碱[2-3],其中小檗碱含量高并且具有较强的生物活性[4-5]。研究表明[6-10]小檗属植物具有消炎、抗氧化、抗肝脏保护、抗肿瘤、降血糖和降血压特性等。

    目前,生物碱类物质的提取大多以水和乙醇为提取溶剂,采用传统浸提回流提取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法以及生物酶提取法来提取植物中的总生物碱[11]。单一的提取方法不仅提取时间长,提取量低,而且会对原料造成损失。随着化工技术的快速发展,半仿生提取法与超声波辅助提取技术相结合被广泛应用于植物分离中,通常是模拟人体胃(pH 2.2左右)、小肠(pH 7.6左右)和大肠(pH 8.5左右)的体液酸度(即最佳pH),先用酸性溶液提取目标物质、再用碱性溶液进行提取,最后将提取液进行离心和浓缩[12]。半仿生法主要从生物药剂学角度出发对提取工艺进行分析,首先人工模拟有效成分胃肠道的消化吸收环境,然后采用导向分离法进一步有针对性的进行系统提取,从而保证被提取物的生物活性[12]。半仿生技术作为一种有效提取方法,辅助以超声波工艺,对目标物质的提取率可呈现大幅度提升[13]。本研究以东北林区特有的细叶小檗果实为原料,通过超声波辅助半仿生技术提取总生物碱,同时对乙醇含量、液料比、提取温度和提取时间等因素对总生物碱提取量和抑菌活性的影响进行探讨,并采用Central Composite Experiment响应面设计对提取工艺进行优化,得到提取细叶小檗总生物碱的最佳工艺参数,并对提取物的抑菌活性进行研究,以期为细叶小檗总生物碱的开发、应用提供参考。

    中国小檗属植物资源达到全球的半数,祖国医药中应用较多的部分是植株的根、茎、根皮及茎皮,鲜用果实;国内相关文献对细叶小檗根及根茎的开发研究较多,但对细叶小檗果实的研究较少[14]。本文通过对细叶小檗果实中生物碱的研究,证明其果实中含有较为丰富的生物碱,既为将来细叶小檗果实的研究提供思路,也为细叶小檗的有效合理利用提供参考。

    • 细叶小檗果实采自于黑龙江省鹤岗市;供试菌种大肠杆菌(Escherichia coli)由东北林业大学微生物实验室提供;盐酸总生物碱标准品(纯度≥95%,源叶生物);牛肉膏;蛋白胨;琼脂粉;乙醇、盐酸、氢氧化钠、氯化钠均为分析纯。

    • ME204分析天平(Mettler-Toledo);PHS-3E pH计(上海精密科学仪器有限公司);KQ-300DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);UV-1810型紫外分光光度计(上海普析通用);IS-RSD3台式恒温振荡器(美国精骐有限公司);超净工作台(美国西盟有限公司)。

    • 本试验采用紫外分光光度法测定盐酸总生物碱的含量[15]。精确称取总生物碱标准品0.0411g,用乙醇溶解并移至100mL容量瓶中作为储备液。精密吸取盐酸总储备液2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5mL于25mL容量瓶中定容,在紫外分光光度计的波长345nm处分别测定其吸光度值y,以吸光度值y、盐酸总生物碱浓度x,得到总生物碱标准曲线方程为y=0.0603x-0.0062,R2=0.9994。

    • 牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏1.5g,蛋白胨5.0g,NaCl 2.5g,配置至500mL,氢氧化钠溶液调节pH至7.0左右,用于培养细菌。

      琼脂培养基:牛肉膏1.5g,蛋白胨5.0g,NaCl 2.5g,琼脂粉9g,配置至500mL,氢氧化钠溶液调节pH至7.0左右,用于培养细菌。

    • 将4℃冷藏的受试大肠杆菌菌种活化,挑取适量菌落于斜面培养基上,于37℃恒温培养箱中培养24h,全程无菌操作[16]

    • 取1.3.3大肠杆菌斜面一只,将菌苔轻刮入装有无菌生理盐水的100mL锥形瓶中,震荡,摇匀,于台式恒温振荡器中,37℃培养24h,使菌悬液终含量约为105~106cfu/mL[17]

    • 选取乙醇含量(V/V)、液料比、温度、时间进行单因素实验。准确称取烘干至质量恒定的细叶小檗果实粉末1.00g,分别研究乙醇含量(10%、20%、30%、40%、50%、60%和70%),液料比(10、15mL/g、20、25、30和35mL/g),温度(30、40、50、60和70℃),时间(60、80、100、120、140和160min)。在张汇慧[12]提取方法的基础上进行修改,第1阶段当pH值为2.2时,提取时间依次为30、40、50、60、70和80min;第2阶段当pH值为7.6时,提取时间依次为15、20、25、30、35和40min;第3阶段当pH值为8.5时,提取时间依次为15、20、25、30、35和40min,对细叶小檗提取量和抑菌活性的影响。

    • 在单因素实验基础上采用Central Composite Experiment响应面设计,将乙醇含量、液料比、温度3因素取3水平,对最佳提取工艺及抑菌活性进行优化。

    • 采用十字交叉法以游标卡尺测量抑菌圈直径,每个处理3次重复,取平均值[18]

    • 每个实验3次重复,数据采用Excel、Minitab 17.0、Design-Expert 8.0.6软件进行分析处理并作图。

    • 图 1可知,乙醇含量在10%~30%范围时,细叶小檗总生物碱的提取量和抑菌活性随着乙醇含量的增大而升高;乙醇溶液浓度为30%时,细叶小檗总生物碱的提取量最高,提取量为14.885mg/g,抑菌圈直径为82.200mm;随着乙醇含量的不断增大,细叶小檗总生物碱的提取量和抑菌活性呈现迅速下降趋势。该现象是由于乙醇含量高,导致提取溶剂极性降低,导致细叶小檗总生物碱在较高浓度乙醇中的溶出率下降。

      图  1  乙醇含量对细叶小檗中总生物碱提取量和抑菌活性的影响

      Figure 1.  Effects of volume concentration of ethanol on the yield of total alkaloids and antibacterial activity from Berberis poiretii

    • 图 2可知,当液料比在10~25mL/g范围内时,细叶小檗总生物碱的抑菌活性有些许降低;当液料比在25~35mL/g时,总生物碱的抑菌活性显著升高;当液料比为35mL/g时,抑菌活性最强,抑菌圈直径为122.126mm;随着液料比的增大,总生物碱的抑菌活性变化不明显。

      图  2  液料比对细叶小檗中总生物碱提取量和抑菌活性的影响

      Figure 2.  Effects of ratio of liquid to solid on the yield of total alkaloids and antibacterial activity from Berberis poiretii

      当液料比在10~20mL/g范围内时,细叶小檗总生物碱的提取量随溶剂用量的升高而升高,但斜率较低;当液料比在20~30mL/g范围内时,细叶小檗总生物碱的提取量随溶剂用量的升高而显著升高;当液料比为30mL/g时,细叶小檗总生物碱的提取量达到最大,提取量为11.473mg/g;随着液料比的增大,细叶小檗总生物碱提取量变化不明显。这可能是由于细叶小檗中一些其他物质溶解,妨碍了总生物碱的提取分离,导致提取量下降。

    • 图 3可知,当温度在30~40℃时,细叶小檗总生物碱提取量和抑菌活性变化不明显;随着温度的升高,当温度升至60℃左右时,细叶小檗总生物碱提取量达到11.061mg/g,抑菌圈直径为76.495mm;当温度在50~70℃时,总生物碱提取量和抑菌活性趋于平缓,无明显增加的趋势。这是由于高温可以增强细胞壁的渗透性,同时使得提取物的溶解度和扩散系数也得到增加,降低了溶剂黏度,从而提高了细叶小檗总生物碱的提取量。

      图  3  温度对细叶小檗中总生物碱提取量和抑菌活性的影响

      Figure 3.  Effects of extraction temperature on the yield of total alkaloids and antibacterial activity from Berberis poiretii

    • 图 4显示,细叶小檗总生物碱的提取量与提取时间呈现显著正相关,当提取时间在80和120min之间时,细叶小檗总生物碱提取量和抑菌活性存在最优值,提取量为17.060mg/g,抑菌圈直径为91.743mm;随后细叶小檗总生物碱提取量和抑菌活性下降。由于超声波本身存在热效应,较长时间的超声处理会导致热敏感组分的转化降解,使得细叶小檗总生物碱提取量降低。从实际节约成本的角度出发,选择100min左右作为进一步优化提取条件的时间范围。

      图  4  提取时间对细叶小檗中总生物碱提取量和抑菌活性的影响

      Figure 4.  Effects of extraction time on the yield of total alkaloids and antibacterial activity from Berberis poiretii

    • 根据实验方案(表 1)及实验结果(表 2),分别拟合出小檗碱提取量和拟菌活性多项式方程。

      表 1  Central Composite Design中的因素及水平

      Table 1.  Factors and levels in Central Composite Design

      因素Factor 水平Level
      -1 0 1
      乙醇含量Ethanol content(A)/% 20 30 40
      液料比Ratio of liquid to solid(B)/(mL·g -1) 20 30 40
      温度Extraction temperature(C)/℃ 40 50 60

      表 2  Central Composite Design试验设计及结果

      Table 2.  Experimental design and results in the Central Composite Design

      编号No. A/% B/(mL·g -1) C/℃ 提取量Extraction
      amount/(mg·g-1)
      抑菌圈直径
      Diameter of bacteriostatic circle/mm
      1 1 -1 -1 7.403±0.55 82.884±0.34
      2 0 0 -1.682 13.925±0.34 90.051±0.65
      3 0 0 0 17.044±0.56 91.746±0.25
      4 0 0 0 16.946±0.36 92.128±0.84
      5 1 1 -1 10.647±0.15 86.547±0.36
      6 -1 -1 1 10.898±0.17 88.836±0.69
      7 0 0 0 16.896±0.71 92.618±0.86
      8 -1 1 -1 7.302±1.55 90.419±0.47
      9 0 0 0 17.145±0.51 90.345±0.35
      10 1 -1 1 10.157±0.89 84.936±0.28
      11 -1.682 0 0 11.746±0.43 89.511±0.47
      12 1 1 1 13.144±0.46 86.302±0.58
      13 0 0 1.682 14.368±0.01 90.258±0.34
      14 -1 -1 -1 7.035±0.20 86.992±0.85
      15 -1 1 1 10.774±0.50 89.953±0.61
      16 0 1.682 0 14.928±0.34 89.354±0.47
      17 1.682 0 0 14.906±0.28 83.296±0.26
      18 0 0 0 17.035±0.64 91.523±0.33
      19 0 0 0 17.227±0.33 91.554±0.54
      20 0 -1.682 0 9.358±0.48 87.717±0.35

      小檗碱提取量多项式方程如下:

      $$ \begin{array}{l}{Y=15.89-1.04 A+0.55 B+0.33 C-0.038 A B+} \\ {0.015 A C-0.30 B C-1.98 A^{2}-1.52 B^{2}-1.04 C^{2}}\end{array} $$

      P<0.0001说明模型显著性高,表 3也显示出模型失拟结果不显著;模型R2=0.9464,Radj2=0.8983,表明模型的相关性良好。从表 3P值可知,对提取量影响顺序为乙醇含量(A)>液料比(B)>温度(C),且P值均小于0.05,对响应值影响显著。

      表 3  Central Composite Design实验结果方差分析表(提取量)

      Table 3.  ANOVA of experimental results in central composite design (extraction amount)

      来源
      Source
      平方和
      Sum of squares
      自由度
      Degree of freedom
      均方
      Mean square
      F P 显著性
      Significance
      A 14.78 1 14.78 23.61 0.0007 S
      B 4.19 1 4.19 6.69 0.0271 S
      C 1.51 1 1.51 2.41 0.1518 NS
      AB 0.012 1 0.012 0.019 0.8937 NS
      AC 1.812×10-3 1 1.812×10-3 2.894×10-3 0.9582 NS
      BC 0.74 1 0.74 1.19 0.3013 NS
      A2 56.47 1 56.47 90.18 <0.0001 S
      B2 33.13 1 33.13 52.90 <0.0001 S
      C2 15.48 1 15.48 24.72 0.0006 S
      模型Model 110.68 9 12.30 19.64 <0.0001 S
      残差Residual 6.26 10 0.63
      失拟项Lack of fit 4.08 5 0.82 1.88 0.2533 NS
      纯误差Pure error 2.18 5 0.44
      校正总和Sum of correction 116.94 19
      注:“S”表示显著,“NS”表示不显著。下同。Notes: “S” means significant, “NS” means not significant. The same below.

      小檗碱抑菌活性多项式方程如下:

      $$ \begin{array}{l}{Y=91.72-1.90 A+0.90 B+0.26 C+0.060 A B+} \\ {0.053 A C-0.58 B C-2.09 A^{2}-1.34 B^{2}-0.76 C^{2}}\end{array} $$

      P<0.0001说明模型极显著;失拟项P值为0.2505,失拟不显著;模型的R2=0.9454,Radj2=0.8963,相关性和解释度较好。表 4 P值显示,3因素对抑菌活性的影响顺序为乙醇含量(A)>液料比(B)>温度(C),且P<0.05,对响应值存在显著性影响。

      表 4  Central Composite Design实验结果方差分析表(抑菌活性)

      Table 4.  ANOVA of experimental results in Central Composite Design(antibacterial activity)

      来源
      Source
      平方和
      Sum of squares
      自由度
      Degree of freedom
      均方
      Mean square
      F P 显著性
      Significance
      A 49.52 1 49.52 57.60 <0.000 1 S
      B 11.14 1 11.14 12.95 <0.000 1 S
      C 0.92 1 0.92 1.07 0.004 9 S
      AB 0.029 1 0.029 0.033 0.325 6 NS
      AC 0.023 1 0.023 0.026 0.858 5 NS
      BC 2.65 1 2.65 3.08 0.874 1 NS
      A2 63.01 1 63.01 73.29 0.109 7 NS
      B2 25.79 1 25.79 30.00 <0.000 1 S
      C2 8.43 1 8.43 9.80 0.000 3 S
      Model 148.92 9 16.55 19.25 0.010 7 S
      残差Residual 8.60 10 0.86
      失拟项Lack of fit 5.62 5 1.12 1.89 0.2505 NS
      纯误差Pure error 2.97 5 0.59
      校正总和Sum of correction 157.51 19

      图 5为提取量拟合方程的三维图示,结合表 3结果可以看出3个考察因素两两交互作用对生物碱提取量的影响,PBCPABPAC,经计算得出当乙醇含量27.37%,液料比31.72mL/g,温度51.33℃,此工艺条件下,细叶小檗总生物碱的提取量呈现最大值为16.10mg/g。

      图  5  乙醇含量、液料比和温度交互影响细叶小檗总生物碱提取量的响应面

      Figure 5.  Response surface plots for the interactive effects of volume concentration of ethanol, liquid-solid ratio and extraction temperature on the yield of total alkaloids from Berberis poiretii

      同上分析,图 6为抑菌活性方程的三维图,结合表 4结果分析得到PABPACPBC,且当乙醇含量为25.71%,液料比为33.78mL/g,温度为50.87℃时,细叶小檗总生物碱的抑菌圈直径有最大值92.40mm。

      图  6  乙醇含量、液料比和温度交互影响细叶小檗总生物碱抑菌活性的响应面

      Figure 6.  Response surface plots for the interactive effects of volume concentration of ethanol, liquid-solid ratio and extraction temperature on the antibacterial activity of total alkaloids from Berberis poiretii

    • 经软件分析得到影响细叶小檗总生物碱提取量和抑菌活性的最佳工艺为:乙醇含量27.37%、液料比31.72mL/g、温度51.33℃。为产业化操作可行,修正工艺条件为:乙醇含量27%、液料比32mL/g、温度52 ℃,在此条件下细叶小檗果实中总生物碱提取量为(16.24±0.54)mg/g,抑菌圈直径为(91.21±0.37)mm。

    • 本研究采用超声波辅助半仿生法提取细叶小檗总生物碱,同时借助Plackett-Burman试验法、最速上升试验法和Central Composite Design试验法,确定了影响细叶小檗总生物碱提取量和抑菌活性的3个显著性因素的最佳工艺条件:乙醇含量为27%、液料比32mL/g、温度52℃下,细叶小檗总生物碱提取量预测值为(16.10±0.54)mg/g,与实际值(16.24±0.37)mg/g接近;并且在此条件下可以获得较大的抑菌活性,抑菌圈直径为(91.21±0.47)mm。

      在最佳工艺条件下,采用单一超声波辅助法提取细叶小檗中总生物碱,提取量为(12.36±0.32)mg/g,抑菌圈直径为(85.47±0.24)mm。实验结果表明,采用超声波辅助半仿生法比单一采用超声波法对细叶小檗中总生物碱的提取效果更好,提取量提高了1.31倍;抑菌效果提高了1.07倍。相比较国内目前对于小檗属植物小檗碱的平均提取量(16.6±0.6)mg/g相接近[19],在抑菌活性上有明显提高[20]

      综上所述,通过超声波辅助半仿生法提取细叶小檗中的总生物碱,不仅提高了提取效率,也使其抑菌活性得到显著增加,相比较传统的提取方法,该法主要的优点是避免了有效成分损失,降低了成本,缩短了生产周期,降低产业化成本有积极意义。

参考文献 (20)

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