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榛子正常发育与败育子房差异蛋白谱对比分析

程云清 齐名 赵永斌 邢继洋 刘剑锋

程云清, 齐名, 赵永斌, 邢继洋, 刘剑锋. 榛子正常发育与败育子房差异蛋白谱对比分析[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(3): 13-25. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170352
引用本文: 程云清, 齐名, 赵永斌, 邢继洋, 刘剑锋. 榛子正常发育与败育子房差异蛋白谱对比分析[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(3): 13-25. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170352
Cheng Yunqing, Qi Ming, Zhao Yongbin, Xing Jiyang, Liu Jianfeng. Comparative studies on differently expressed proteomes of developing and abortive ovary in hazelnut[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(3): 13-25. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170352
Citation: Cheng Yunqing, Qi Ming, Zhao Yongbin, Xing Jiyang, Liu Jianfeng. Comparative studies on differently expressed proteomes of developing and abortive ovary in hazelnut[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(3): 13-25. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170352

榛子正常发育与败育子房差异蛋白谱对比分析

doi: 10.13332/j.1000-1522.20170352
基金项目: 

国家自然科学基金项目 31670681

国家自然科学基金项目 31770723

国家自然科学基金项目 31370683

详细信息
    作者简介:

    程云清,博士,教授。主要研究方向:植物生物技术。Email:Chengyunqing1977@163.com 地址:136000吉林省四平市铁西区海丰大街1301号吉林师范大学生命科学学院

    通讯作者:

    刘剑锋,博士,教授。主要研究方向:植物生物技术。Email:jianfengliu1976@163.com 地址:同上

  • 中图分类号: S722.3+7; Q943.1

Comparative studies on differently expressed proteomes of developing and abortive ovary in hazelnut

  • 摘要: 目的筛选参与调控榛子子房败育的候选蛋白,为榛子遗传改良研究提供科学依据。方法以平欧杂交榛‘达维’的正常发育与败育子房为材料,进行蛋白样品的同位素标记相对和绝对定量iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantification)技术分析。对鉴定到的所有蛋白进行COG(Cluster of orthologous groups of proteins)功能分类,预测鉴定蛋白的功能。随后依据蛋白定量结果,筛选差异表达蛋白,进而开展GO(Gene ontology)功能富集与KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)代谢路径富集分析以明确其分子功能和重要生物代谢路径。最后,主要从显著性富集路径中筛选可能参与子房败育调控的差异表达蛋白。结果蛋白鉴定共获得317068个二级谱图,特有多肽14267条,蛋白3538个。R、O、J、G和C类中的蛋白数量为最多,分别占有COG功能注释的蛋白总数的19.36%、9.97%、7.80%、7.67%和6.76%。共鉴定到249个差异表达蛋白,其中上调、下调表达蛋白分别为180和69个。GO富集分析结果表明,差异表达蛋白主要执行结合与催化分子功能。KEGG富集分析共找到11个显著性富集路径,最为显著的路径包括:苯丙素生物合成(ko00940),光合作用(ko00195),代谢路径(ko01100),光合作用-天线蛋白(ko00196),次生代谢产物生物合成(ko01110)。初步筛选获得可能参与调控榛子子房败育的候选蛋白37个。结论榛子败育子房的形成与光合作用、碳水化合物运输与代谢、能量合成与转换、花粉管生长与DNA甲基化等相关,本研究为深入解析榛子子房败育的分子机制提供了科学依据。
  • 图  1  蛋白鉴定结果汇总

    横坐标1、2、3、4、5、6分别代表总二级谱图、谱图、特有谱图、多肽、特有多肽、蛋白。

    Figure  1.  Protein identification overview

    1 to 6 in x-axis represent total spectra, spectra, unique spectra, peptide, unique peptide and protein, respectively.

    图  2  特异性谱图数目分布

    特异性肽段对应的谱图即为特异性谱图,x轴为特异性谱图数目,y轴为相应蛋白数目。

    Figure  2.  Unique spectrum number distribution

    Unique spectrum means spectrumof unique peptide. x-axis: unique spectrum number, y-axis: number of the corresponding proteins.

    图  3  特有多肽数量分布

    一个蛋白鉴定到的特异性肽段越多,相应蛋白可信度越高,x轴为特异性肽段数目,y轴为相应蛋白数目。

    Figure  3.  Unique peptide number distribution

    The more unique peptides identified in a protein implies its higher credibility. The x-axis: the unique peptide number of each protein, y-axis: the corresponding protein number.

    图  4  蛋白质分子量分布

    该图显示所有鉴定到蛋白质分子量分布情况,x轴为分子量,y轴为相应蛋白数目。

    Figure  4.  Protein molecular mass distribution

    Molecular weight distribution of all identified protein, x-axis: unique spectrum number, y-axis: number of the corresponding protein.

    图  5  鉴定蛋白的COG功能分布统计

    A.RNA加工与修饰;B.染色质的结构与动力学;C.能量产生与转换;D.细胞周期调控,细胞分裂,染色体分配;E.氨基酸运输与代谢;F.核酸运输与代谢;G.碳水化合物运输与代谢;H.辅酶运输与代谢;I.脂类运输与代谢;J.翻译、核糖体结构与生物合成;K.转录;L.复制、重组与修复;M.细胞壁/膜/包膜生物合成;N.细胞运动;O.翻译后修饰,蛋白质周转,伴侣;P.无机离子转运与代谢;Q.次级代谢产物的生物合成、运输和分解代谢;R.一般功能预测;S.功能未知;T.信号转导机制;U.胞内运输、分泌和囊泡运输;V.防御机制;Y.核结构;Z.细胞骨架。

    Figure  5.  COG functional histogram of all identified proteins

    A, RNA processing and modification; B, chromatin structure and dynamics; C, energy production and conversion; D, cell cycle control, cell division, chromosome partitioning; E, amino acid transport and metabolism; F, nucleotide transport and metabolism; G, carbohydrate transport and metabolism; H, coenzyme transport and metabolism; I, lipid transport and metabolism; J, translation, ribosomal structure and biogenesis; K, transcription; L, replication, recombination and repair; M, cell wall/membrane/envelope biogenesis; N, cell motility; O, posttranslational modification, protein turnover, chaperones; P, inorganic ion transport and metabolism; Q, secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism; R, general function prediction only; S, function unknown; T, signal transduction mechanisms; U, intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport; V, defense mechanisms; Y, nuclear structure; Z, cytoskeleton.

    图  6  正常与败育子房中蛋白表达差异倍数的对数分布

    TL=Log21.5=0.5849,TR= Log2(1/1.5)=-0.5849。红色、绿色与灰色三角分别表示上调、下调与非差异表达蛋白。

    Figure  6.  Logarithmic distribution plot of protein change folds of developing and abortive ovary

    Red, green and gray triangles represent up regulation, down regulation, and not differentially expressed proteins, respectively.

    图  7  差异表达蛋白的GO功能富集分析

    A.细胞; B.细胞组分; C.膜; D.膜外区域; E.大分子复合物; F.细胞器内部区域; G.细胞器; H.细胞器组分; I.抗氧化; J.结合; K.催化; L.电子载体; M.分子传感器; N.营养库; O.结构分子; P.翻译调节; Q.转运子; R.解剖结构形成; S.生物调控; T.细胞成分的生物合成; U.细胞成分的组织; V.细胞过程; W.死亡; X.发育过程; Y.定位建成; Z.生长; AA.免疫系统过程; AB.定位; AC.代谢过程; AD.多组织过程; AE.多细胞组织过程; AF.色素沉着; AG.生殖; AH.生殖过程; AI.刺激响应。

    Figure  7.  GO functional enrichment analysis of differently expressed proteins

    A, cell; B, cell part; C, envelope; D, extracellular region; E, macromolecular complex; F, membrane-enclosed lumen; G, organelle; H, organelle part; I, antioxidant; J, binding; K, catalytic; L, electron carrier; M, molecular transducer; N, nutrient reservoir; O, structural molecule; P, translation regulator; Q, transporter; R, anatomical structure formation; S, biological regulation; T, cellular component biogenesis; U, cellular component organization; V, cellular process; W, death; X, developmental process; Y, establishment of localization; Z, growth; AA, immune system process; AB, localization; AC, metabolic process; AD, multi\-organism process; AE, multicellular organismal process; AF, pigmentation; AG, reproduction; AH, reproductive process; AI, response to stimulus.

    表  1  差异表达蛋白的KEGG代谢通路富集分析

    Table  1.   KEGG pathway enrichment analysis of differently expressed proteins (DEPs)

    编号
    No.
    路径
    Pathway
    有路径注释的DEPs数量(比例
    )DEPs amount with pathway annotation (ratio)
    有路径注释的所有表达蛋白数量(比例)
    All expressed proteins with pathway annotation (ratio)
    P
    P-value
    路径号
    Pathway ID
    1 苯丙素生物合成Phenylpropanoid biosynthesis 23 (11.06%) 83 (2.76%) 2.82×10-9 ko00940
    2 光合作用Photosynthesis 10 (4.81%) 18 (0.6%) 5.37×10-8 ko00195
    3 代谢路径Metabolic pathways 86 (41.35%) 871 (28.92%) 4.73×10-5 ko01100
    4 光合作用-天线蛋白Photosynthesis-antenna proteins 4 (1.92%) 6 (0.2%) 2.97×10-4 ko00196
    5 次生代谢产物生物合成Biosynthesis of secondary metabolites 58 (27.88%) 555 (18.43%) 3.41×10-4 ko01110
    6 氮代谢Nitrogen metabolism 5 (2.4%) 13 (0.43%) 1.22×10-3 ko00910
    7 类黄酮生物合成Flavonoid biosynthesis 7 (3.37%) 28 (0.93%) 2.30×10-3 ko00941
    8 苯并恶嗪酮类物质生物合成Benzoxazinoid biosynthesis 2 (0.96%) 2 (0.07%) 4.75×10-3 ko00402
    9 植物MAPK信号转导通路MAPK signaling pathway-plant 8 (3.85%) 47 (1.56%) 1.37×10-2 ko04016
    10 同源重组Homologous recombination 4 (1.92%) 16 (0.53%) 2.08×10-2 ko03440
    11 DNA复制DNA replication 4 (1.92%) 16 (0.53%) 2.08×10-2 ko03030
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    表  2  可能参与子房败育调控的差异表达蛋白

    Table  2.   Differently expressed proteins which may be involved in the regulation

    蛋白路径
    Protein pathway
    蛋白质点编号
    Protein point No.
    蛋白编号
    Protein ID
    差异表达倍数
    Fold change
    分子量
    Molecular mass
    特有肽段数量
    Uniquepeptide number
    序列覆盖率
    Proteincoverage/%
    注释
    Annotation
    光合作用
    Photosynthesis
    2 213 Unigene25049_All 1.50 23 118 2 16.1 ATP合成酶β亚基ATP synthase beta subunit
    778 Unigene29018_All 1.62 20 944 2 13.6 ATP合成酶β亚基ATP synthase beta subunit
    456 Unigene41031_All 1.53 20 843 7 52.1 细胞色素f Cytochrome f
    462 Unigene20320_All 1.59 23 112 10 27.0 光系统Ⅰ反应中心亚基Ⅱ Photosystem Ⅰ reaction center subunit Ⅱ
    2 631 Unigene25432_All 1.71 49 003 9 23.2 光系统Ⅱ CP43叶绿素蛋白Photosystem Ⅱ CP43 chlorophyll apoprotein
    2 648 Unigene25729_All 2.73 18 844 1 14.9 光系统Ⅰ反应中心亚基PSI Photosystem Ⅰ reaction center subunit PSI
    892 CL10922.Contig2_All 2.14 13 964 1 26.7 细胞色素b6-f复合体铁硫蛋白亚基Cytochrome b6-f complex iron-sulfur subunit
    992 Unigene20387_All 1.85 28 922 7 25.5 光系统Ⅱ 22 kDa蛋白Photosystem Ⅱ 22 kDa protein
    1 033 Unigene20647_All 2.51 24 449 4 23.9 光系统Ⅰ反应中心亚基Ⅲ Photosystem Ⅰ reaction center subunit Ⅲ
    3 423 CL4056.Contig2_All 1.69 15 197 2 25.2 光系统Ⅰ反应中心亚基Ⅲ PSI reaction center subunit Ⅲ
    碳水化合物运输与代谢
    Carbohydrate transport and metabolism
    2 270 CL10718.Contig2_All 2.22 41 148 4 12.2 糖苷水解酶Glycoside hydrolase
    1 568 CL5678.Contig4_All 1.93 32 465 4 17.7 酸性几丁质内切酶Acidic endochitinase
    91 Unigene17825_All 1.90 59 673 6 11.9 α-L-呋喃糖苷酶1前体Alpha-L-arabinofuranosidase 1 precursor
    2 521 CL2311.Contig8_All 1.89 30 216 4 21.7 水通道蛋白PIP2 Aquaporin PIP2
    1 448 CL10219.Contig1_All 1.65 42 253 8 23.8 庚糖二磷酸酶Sedoheptulose-bisphosphatase
    2 360 CL9110.Contig3_All 1.64 30 890 5 29.9 水通道蛋白PIP1 Aquaporin PIP1
    3 324 Unigene27924_All 1.51 53 260 15 34.0 核酮糖1, 5 -二磷酸羧化酶/氧化酶大亚基(RbcL)Ribulose 1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit
    1 281 Unigene9913_All 0.67 61 085 14 27.1 焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸转移酶β亚基(PFP)Pyrophosphate-fructose 6-phosphate 1-phosphotransferase subunit beta, PFP
    1 612 Unigene19879_All 0.65 53 563 1 12.2 丙酮酸激酶Pyruvate kinase
    3 253 CL1716.Contig1_All 1.55 22 841 3 18.3 类萌发素蛋白Germin-like protein
    能量合成与转换
    Energy production and conversion
    1 753 CL969.Contig2_All 2.13 20 122 9 51.1 Rubisco小亚基(RbcS)Rubisco small subunit
    2 852 Unigene20099_All 1.79 64 976 13 33.7 NADP-苹果酸酶(NADP-ME)NADP-dependent malic enzyme
    2 857 CL5660.Contig3_All 1.64 40 430 11 34.1 醛缩酶型TIM-barrel类家族蛋白亚型1 Aldolase-type TIM barrel family protein isoform 1
    160 Unigene17079_All 1.63 38 192 4 21.9 Perakine还原酶(PR)Perakinereductase-like
    3 133 CL5532.Contig7_All 1.59 53 235 5 11.0 醛脱氢酶(ALDH)Aldehyde dehydrogenase
    2 495 Unigene26012_All 2.14 41 113 10 32.7 线粒体甲酸脱氢酶(FDH) Formate dehydrogenase, mitochondrial
    967 Unigene15321_All 1.62 42 317 8 26.9 磷酸甘油酸脱氢酶(PGDH)Phosphoglycerate dehydrogenase
    2 807 CL6456.Contig2_All 1.66 33 779 4 58.0 2-亚甲基-呋喃-3-1还原酶2-methylene-furan-3-one reductase OS=Solanumlycoper-sicum
    1 138 CL3539.Contig1_All 1.52 32 347 7 30.0 NAD(P)H:醌氧化还原酶(NQO)NAD(P)H:quinoneoxidoreductase
    花粉管生长与DNA甲基化
    Pollen tube growth and DNA methylation
    2 248 CL7865.Contig2_All 4.09 15 766 2 23.0 花粉过敏原和伸展蛋白家族蛋白Ole e 1Pollen Ole e 1 allergen and extensin family protein
    1 218 Unigene909_All 1.77 17 902 3 25.3 主要花粉过敏原Bet v 1-A Major pollen allergen Bet v 1-A
    1 377 CL3839.Contig1_All 0.51 20 815 2 15.9 花粉特异蛋白SF3 Pollen-specific protein SF3
    1 129 Unigene5763_All 1.58 18 315 10 1.9 钙调素(CaM)Calmodulin
    571 CL2565.Contig2_All 1.88 40 363 6 19.4 咖啡酸-3-O-甲基转移酶(COMT)Caffeic acid 3-O-methyltransferase
    1 513 CL2173.Contig3_All 1.51 39 545 6 23.0 COMT
    1 624 CL4896.Contig1_All 0.56 55 950 7 33.3 磷酸乙醇胺N-甲基转移酶(PEAMT)Phosphoethanolamine N-methyltransferase
    2 474 CL10334.Contig1_All 0.63 38 914 6 22.8 甾醇C-24甲基转移酶(SMT)24-sterol C-methyltransferase
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  • [1] 刘剑锋, 颜堃, 程云清, 等.榛子花粉生活力和柱头可授性与结实特征研究[J].北京林业大学学报, 2012, 34(3): 58-63. http://j.bjfu.edu.cn/article/id/9752

    Liu J F, Yan K, Cheng Y Q, et al. Pollen viability stigma receptivity and fruiting characteristics of hazelnut[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2012, 34(3): 58-63. http://j.bjfu.edu.cn/article/id/9752
    [2] Liu J F, Zhang H D, Cheng Y Q, et al. Comparison of ultrastructure, pollen tube growth pattern and starch content in developing and abortive ovaries during the progamic phase in hazel[J]. Frontiers in Plant Science, 2014, 5(5): 528. http://cn.bing.com/academic/profile?id=7a61f3d88a5cd611162dd92b682144c5&encoded=0&v=paper_preview&mkt=zh-cn
    [3] 刘剑锋, 张春吉, 程云清, 等.ABA及其合成抑制剂钨酸钠处理对平榛胚珠发育的影响[J].园艺学报, 2013, 40(2): 213-220. http://www.cqvip.com/QK/90024X/201302/44974868.html

    Liu J F, Zhang C J, Cheng Y Q, et al. Effects of ABA and its synthesis inhibitor sodium tungstate treatments on ovule development of Corylus heterophylla[J]. Acta Horticulturae Sinica, 2013, 40(2): 213-220. http://www.cqvip.com/QK/90024X/201302/44974868.html
    [4] Sogo A, Tobe H. Delayed fertilization and pollen- tube growth in pistils of Fagus japonica (Fagaceae)[J]. American Journal of Botany, 2006, 93(12): 1748-1756. doi:  10.3732/ajb.93.12.1748
    [5] Sogo A, Tobe H. Intermittent pollen-tube growth in pistils of alders (Alnus)[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2005, 102(24):8770-8775. doi:  10.1073/pnas.0503081102
    [6] Sogo A, Tobe H. Mode of pollen-tube growth in pistils of Myricarubra (Myricaceae): acomparison with related families[J]. Annals of Botany, 2006, 97(1):71. doi:  10.1093/aob/mcj015
    [7] Liu J F, Zhang H D, Cheng Y Q, et al. Pistillate flower development and pollen-tube growth mode during the delayed fertilization stage in Corylus heterophylla Fisch[J]. Plant Reproduction, 2014, 27(3): 145-152. doi:  10.1007/s00497-014-0248-9
    [8] Beyhan N, Marangoz D. An investigation of the relationship between reproductive growth and yield loss in hazelnut[J]. Scientia Horticulturae, 2007, 113(2):208-215. doi:  10.1016/j.scienta.2007.02.007
    [9] Cheng Y Q, Wang J, Liu J F, et al. Analysis of ovary DNA methylation during delayed fertilization in hazel using the methylation-sensitive amplification technique[J]. Acta Physi-ologiae Plantarum, 2015, 37(11):231. doi:  10.1007/s11738-015-1984-7
    [10] Isaacson T, Damasceno C M, Saravanan R S, et al.Sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of plant tissues[J]. Nature Protocols, 2006, 1(2):769-774. doi:  10.1038/nprot.2006.102
    [11] Hammond J, Kruger N. The bradford method for protein quantitation[J]. Methods in Molecular Biology, 1994, 32(32):9. http://cn.bing.com/academic/profile?id=95256c7e3a6691803d617b77889d2e00&encoded=0&v=paper_preview&mkt=zh-cn
    [12] Wang X, Shan X, Wu Y, et al. iTRAQ-based quantitative proteomics analysis reveals new metabolic pathways responding to chilling stress in maize seedlings[J]. Journal of Proteomics, 2016, 146:14-24. doi:  10.1016/j.jprot.2016.06.007
    [13] Wen B, Zhou R, Feng Q, et al. IQuant: an automated pipeline for quantitative proteomics based upon isobaric tags[J].Proteomics, 2014, 14(20):2280-2285. doi:  10.1002/pmic.201300361
    [14] Maksup S, Roytrakul S, Supaibulwatana K. Physiological and comparative proteomic analyses of Thai jasmine rice and two check cultivars in response to drought stress[J]. Journal of Plant Interactions, 2014, 9(1):43-55. doi:  10.1080/17429145.2012.752042
    [15] Li B, Dewey C N. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome[J]. BMC Bioinformatics, 2011, 12(1):323. doi:  10.1186/1471-2105-12-323
    [16] Kanazawa A, Ostendorf E, Kohzuma K, et al. Chloroplast ATP synthase modulation of the thylakoid proton motive force: implications for photosystem I and photosystem Ⅱ photoprotection[J]. Frontiers in Plant Science, 2017, 8(8): 719. http://cn.bing.com/academic/profile?id=2048a6e26c0a2a6505b9f5316f24455c&encoded=0&v=paper_preview&mkt=zh-cn
    [17] Allahverdiyeva Y, Suorsa M, Tikkanen M, et al. Photoprotection of photosystems in fluctuating light intensities[J]. Journal of Experimental Botany, 2015, 66(9):2427. doi:  10.1093/jxb/eru463
    [18] Stover E, Fargione M, Risio R, et al. Prebloom foliar boron, zinc, and urea applications enhance cropping of some 'Empire' and 'McIntosh' apple orchards in New York[J]. Hortscience A Publication of the American Society for Horticultural Science, 1999, 34(2):210-214. http://www.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=perio&id=212eda579b19e961f60737d9a7fe5099
    [19] Liu J, Cheng Y, Liu C, et al. Temporal changes of disodium fluorescein transport in hazelnut during fruit development stage[J]. Scientia Horticulturae, 2013, 150(2):348-353. http://www.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=perio&id=3d536e6c26dd6ab4c4f9ecfa56ba22b8
    [20] Postaire O, Tournaireroux C, Grondin A, et al. A PIP1 aquaporin contributes to hydrostatic pressure-induced water transport in both the root and rosette of Arabidopsis[J]. Plant Physiology, 2010, 152(3):1418. doi:  10.1104/pp.109.145326
    [21] Mahdieh M, Mostajeran A, Horie T, et al. Drought stress alters water relations and expression of PIP-Type aquaporin genes in Nicotiana tabacum plants[J]. Plant & Cell Physiology, 2008, 49(5):801. http://www.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=perio&id=HighWire000001932104
    [22] Fulton L M, Cobbett C S. Two alpha-L-arabinofuranosidase genes in Arabidopsis thaliana are differentially expressed during vegetative growth and flower development[J]. Journal of Experimental Botany, 2003, 54(392):2467. doi:  10.1093/jxb/erg269
    [23] Eckardt N A, Portis A R, Ogren W L, et al. Growth and photosynthesis under high and low irradiance of Arabidopsis thaliana antisense mutants with reduced ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenaseactivase content[J]. Plant Physiology, 1997, 113(2):575-586. doi:  10.1104/pp.113.2.575
    [24] Hahn D, Kaltenbach C, Kück U. The Calvin cycle enzyme sedoheptulose-1, 7-bisphosphatase is encoded by a light-regulated gene in Chlamydomonas reinhardtii[J]. Plant Molecular Biology, 1998, 36(6):929-934. doi:  10.1023/A:1005911022601
    [25] Yuan C Z. Genetic transformation and biological function analysis of the sedoheptulose-1, 7-bisphosphatase gene from mulberry[J]. Science of Sericulture, 2013, 39(3):413-419. http://cn.bing.com/academic/profile?id=a1c9ce082e60d577b3c387fb3ad08d34&encoded=0&v=paper_preview&mkt=zh-cn
    [26] Groenewald J H, Botha F C. Down-regulation of pyrophosphate: fructose 6-phosphate 1-phosphotransferase (PFP) activity in sugarcane enhances sucrose accumulation in immature internodes[J]. Transgenic Research, 2008, 17(1):85-92. doi:  10.1007/s11248-007-9079-x
    [27] Banasiak A, Ibatullin F M, Brumer H, et al. Glycoside hydrolase activities in cell walls of sclerenchyma cells in the inflorescence stems of Arabidopsis thaliana visualized in situ[J]. Plants, 2014, 3(4):513-525. doi:  10.3390/plants3040513
    [28] Andre C, Benning C. Arabidopsis seedlings deficient in a plastidic pyruvate kinase are unable to utilize seed storage compounds for germination and establishment[J]. Plant Physiology, 2007, 145(4):1670. doi:  10.1104/pp.107.108340
    [29] 赵艳, 沙伟, 金忠民, 等.大豆class Ⅲ酸性内切几丁质酶基因及其启动子表达方式[J].中国油料作物学报, 2013, 35(2): 221-224. http://www.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=perio&id=zgylzwxb201302019

    Zhao Y, Sha W, Jin Z M, et al. Expression pattern of soybean class Ⅲ acidic endochitinase gene and promoter[J]. Chinese Journal of Oil Crop Sciences, 2013, 35(2): 221-224. http://www.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=perio&id=zgylzwxb201302019
    [30] Knecht K, Seyffarth M, Desel C, et al. Expression of BvGLP-1 encoding a germin-like protein from sugar beet in Arabidopsis thaliana leads to resistance against phytopathogenic fungi[J]. Molecular Plant-microbe Interactions: MPMI, 2010, 23(4):446. doi:  10.1094/MPMI-23-4-0446
    [31] Takeuchi Y, Akagi H, Kamasawa N, et al. Aberrant chloroplasts in transgenic rice plants expressing a high level of maize NADP-dependent malic enzyme[J]. Planta, 2000, 211(2):265-274. doi:  10.1007/s004250000282
    [32] Kotchoni S O, Kuhns C A, Ditzer A, et al. Over-expression of different aldehyde dehydrogenase genes in Arabidopsis thaliana confers tolerance to abiotic stress and protects plants against lipid peroxidation and oxidative stress[J]. Plant Cell & Environment, 2006, 29(6):1033-1048. http://www.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=perio&id=828bf0a5f3600f73c6a0e8fbd186aa6a
    [33] Herman P L, Ramberg H, Baack R D, et al. Formate dehydrogenase in Arabidopsis thaliana: overexpression and subcellular localization in leaves[J]. Plant Science, 2002, 163(6):1137-1145. doi:  10.1016/S0168-9452(02)00326-6
    [34] Bannatyne R M, Stringel G, Simpson J S. Arabidopsis phosphoglycerate dehydrogenase1 of the phosphoserine pathway is essential for development and required for ammonium assimilation and tryptophan biosynthesis[J]. Plant Cell, 2013, 25(12):5011-5029. doi:  10.1105/tpc.113.118992
    [35] Hu B, Liu B, Liu L, et al. Epigenetic control of Pollen Ole e 1 allergen and extensin family gene expression in Arabidopsis thaliana [J]. Acta Physiologiae Plantarum, 2014, 36(8):2203-2209. doi:  10.1007/s11738-014-1597-6
    [36] Swoboda I, Dang T C H, Heberle-bors E, et al. Expression of Bet v 1, the major birch pollen allergen, during anther development[J]. Protoplasma, 1995, 187(1):103-110. http://www.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=perio&id=6c00be41d559fd369b94cc2ebb1d38d0
    [37] Chen T, Lin J.Combined proteomic and cytological analysis of Ca2+-calmodulinregulation in Picea meyeripollen tube growth[J]. Plant Physiology, 2008, 149 (2): 1111-1126. doi:  10.1104/pp.108.127514
    [38] Baltz R, Domon C, Pillay D T, et al. Characterization of a pollen-specific cDNA from sunflower encoding a zinc finger protein[J]. Plant Journal for Cell & Molecular Biology, 1992, 2 (5): 713-721. http://cn.bing.com/academic/profile?id=1a151c9f269cba536cba6af7dbed8f8f&encoded=0&v=paper_preview&mkt=zh-cn
    [39] Baltz R, Evrard J L, Domon C, et al. A LIM motif is present in a pollen-specific protein[J]. Plant Cell, 1992, 4 (12): 1465-1466. doi:  10.1105/tpc.4.12.1465
    [40] Pazhamala L T, Purohit S, Saxena R K, et al. Gene expression atlas of pigeonpea and its application to gain insights into genes associated with pollen fertility implicated in seed formation[J]. Journal of Experimental Botany, 2017, 68(8): 2037-2054. doi:  10.1093/jxb/erx010
    [41] Guo D, Chen F, Inoue K, et al. Downregulation of caffeic acid 3-O-methyltransferase and caffeoyl CoA 3-O-methyltransferase in transgenic alfalfa: impacts on lignin structure and implications for the biosynthesis of G and S lignin[J]. Plant Cell, 2001, 13(1):73-88. doi:  10.1105/tpc.13.1.73
    [42] Wu S, Yu Z, Wang F, et al. Cloning, characterization, and transformation of the phosphoethanolamine N-methyltransferase gene (ZmPEAMT1) in maize (Zea mays L.)[J]. Molecular Biotechnology, 2007, 36(2):102-112. doi:  10.1007/s12033-007-0009-1
    [43] Luo M, Tan K, Xiao Z, et al. Cloning and expression of two sterol C-24 methyltransferase genes from upland cotton (Gossypium hirsuturm L.)[J]. Journal of Genetics and Genomics, 2008, 35(6):357-363. doi:  10.1016/S1673-8527(08)60052-1
  • [1] 杨锐霞, 尹鹏, 刘晓, 王艳, 刘家福, 徐吉臣.  旱柳扩展蛋白基因家族与基因组分化 . 北京林业大学学报, 2020, (): 1-12. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200216
    [2] 朴美玲, 贾桂霞, 张冬梅.  短生育期‘骄阳’百合的育性分析及2n配子诱导 . 北京林业大学学报, 2020, 42(7): 106-112. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190425
    [3] 朱济友, 于强, 刘亚培, 覃国铭, 李金航, 徐程扬, 何韦均.  植物功能性状及其叶经济谱对城市热环境的响应 . 北京林业大学学报, 2018, 40(9): 72-81. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180132
    [4] 张永卓, 刘雅琳, 陆海, 李慧.  转录组分析组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA对毛白杨悬浮细胞表达谱的影响 . 北京林业大学学报, 2018, 40(9): 1-14. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180158
    [5] 索慧英, 刘静, 曲冠证, 郑密, 李莹.  NaHCO3胁迫下刚毛柽柳叶片蛋白质差异表达谱的建立 . 北京林业大学学报, 2018, 40(9): 15-24. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180200
    [6] 胡晓晴, 陈智鑫, 邓王姝颖, 王晟宇, 张淇, 张正一, 刘雪梅.  白桦雄花发育异常突变体的成熟花药及花粉特征 . 北京林业大学学报, 2018, 40(5): 29-36. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170282
    [7] 王溢, 邱彤, 韩强, 康向阳.  不同2n雌配子来源的青杨杂种三倍体与其亲本蛋白质组差异研究 . 北京林业大学学报, 2018, 40(5): 1-9. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170425
    [8] 王午豪, 齐芪, 李赟, 盖颖.  用毛细管电泳-质谱(CE-MS)内标法检测杜仲中绿原酸 . 北京林业大学学报, 2017, 39(4): 115-119. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160030
    [9] 赵玉红, 翟亚楠, 许耀鹏, 张立钢, 王振宇.  樟子松多酚和蛋白质的复合反应及产物性质 . 北京林业大学学报, 2016, 38(9): 102-107. doi: 10.13332/j.1000-1522.20150323
    [10] 仲召亮, 王文杰, 张文天, 王琼.  不同林分及农田土壤中球囊霉素蛋白组成特征差异研究 . 北京林业大学学报, 2016, 38(4): 107-115. doi: 10.13332/j.1000-1522.20150399
    [11] 韩东涛, 刘晋浩.  基于工作小臂的履带式林木采育机越障能力分析与研究 . 北京林业大学学报, 2016, 38(7): 105-111. doi: 10.13332/j.1000-1522.20150367
    [12] 刘小丹, 张克斌, 王黎黎, 杨晓晖.  封育对半干旱区沙化草地群落特征的影响 . 北京林业大学学报, 2015, 37(2): 48-54. doi: 10.13332/j.cnki.jbfu.2015.02.010
    [13] 曹媛, 康向阳, 张志毅, 荆艳萍.  毛白杨花粉败育过程中Ca2+ATPase的异常变化 . 北京林业大学学报, 2012, 34(4): 10-17.
    [14] 陈燕, 陈进勇, 刘燕, 赵世伟.  红丁香引种栽培条件下种子败育的解剖学研究 . 北京林业大学学报, 2012, 34(6): 107-114.
    [15] 刘剑锋, 颜堃, 程云清, 王占武, 邹振峰.  榛子花粉生活力和柱头可授性与结实特征研究 . 北京林业大学学报, 2012, 34(3): 58-63.
    [16] 徐筱, 徐倩, 张kai, 徐吉臣.  植物扩展蛋白基因的研究进展 . 北京林业大学学报, 2010, 32(5): 154-162.
    [17] 庞琪伟, 贾黎明, 郑士光.  基于多谱辐射仪的柠条地上干生物量估算模型研究 . 北京林业大学学报, 2010, 32(4): 81-85.
    [18] 鲁绍伟, 王雄宾, 余新晓, 鲁少波, 李金海, 武军, .  封育对人工针叶林林下植物多样性恢复的影响 . 北京林业大学学报, 2008, 30(supp.2): 121-126.
    [19] 李艳华, 李在留, 刘美芹, 石娟, 孙青, 贺窑青, 段旭良, 李莉, 胡晓丹, 王莉, 熊丹, 雷庆哲, 隋金玲, 程堂仁, 郝晨, 张玲, 孙月琴, 胡海英, 刘丽, 陈佳, 欧阳杰, 乔海莉, 范丙友, 曲红, 姚娜, 王丰俊, 金莹, 周章义, 郑彩霞, 骆有庆, 李凤兰, 康向阳, 张艳霞, 王建中, 陈发菊, 阎伟, 张香, 路端正, 张德权, 尹伟伦, 武彦文, 尹伟伦, 陆海, 骆有庆, 冯秀兰, 李云, 续九如, 张志毅, 冯菁, 沈昕, 田呈明, 赵亚美, 郭锐, 周燕, 陈晓阳, 孙爱东, 卢存福, 郝俊, 王晓东, 吴晓成, 沈繁宜, 郑永唐, 王华芳, 王百田, 赵蕾, 蒋湘宁, 史玲玲, 梁宏伟, 胡德夫, 骆有庆, 武海卫, 孙爱东, 阎晓磊, 胡晓丹, 安新民, 李忠秋, 骆有庆, 梁华军, 马钦彦, 姜金仲, 高述民, 王冬梅, 崔彬彬
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    [20] 余雁, 江泽慧, 王戈, 覃道春, 许忠允.  采谱方式对竹材气干密度近红外预测模型精度的影响 . 北京林业大学学报, 2007, 29(4): 80-83.
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出版历程
  • 收稿日期:  2017-10-23
  • 修回日期:  2018-01-23
  • 刊出日期:  2018-03-01

榛子正常发育与败育子房差异蛋白谱对比分析

doi: 10.13332/j.1000-1522.20170352
    基金项目:

    国家自然科学基金项目 31670681

    国家自然科学基金项目 31770723

    国家自然科学基金项目 31370683

    作者简介:

    程云清,博士,教授。主要研究方向:植物生物技术。Email:Chengyunqing1977@163.com 地址:136000吉林省四平市铁西区海丰大街1301号吉林师范大学生命科学学院

    通讯作者: 刘剑锋,博士,教授。主要研究方向:植物生物技术。Email:jianfengliu1976@163.com 地址:同上
  • 中图分类号: S722.3+7; Q943.1

摘要: 目的筛选参与调控榛子子房败育的候选蛋白,为榛子遗传改良研究提供科学依据。方法以平欧杂交榛‘达维’的正常发育与败育子房为材料,进行蛋白样品的同位素标记相对和绝对定量iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantification)技术分析。对鉴定到的所有蛋白进行COG(Cluster of orthologous groups of proteins)功能分类,预测鉴定蛋白的功能。随后依据蛋白定量结果,筛选差异表达蛋白,进而开展GO(Gene ontology)功能富集与KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)代谢路径富集分析以明确其分子功能和重要生物代谢路径。最后,主要从显著性富集路径中筛选可能参与子房败育调控的差异表达蛋白。结果蛋白鉴定共获得317068个二级谱图,特有多肽14267条,蛋白3538个。R、O、J、G和C类中的蛋白数量为最多,分别占有COG功能注释的蛋白总数的19.36%、9.97%、7.80%、7.67%和6.76%。共鉴定到249个差异表达蛋白,其中上调、下调表达蛋白分别为180和69个。GO富集分析结果表明,差异表达蛋白主要执行结合与催化分子功能。KEGG富集分析共找到11个显著性富集路径,最为显著的路径包括:苯丙素生物合成(ko00940),光合作用(ko00195),代谢路径(ko01100),光合作用-天线蛋白(ko00196),次生代谢产物生物合成(ko01110)。初步筛选获得可能参与调控榛子子房败育的候选蛋白37个。结论榛子败育子房的形成与光合作用、碳水化合物运输与代谢、能量合成与转换、花粉管生长与DNA甲基化等相关,本研究为深入解析榛子子房败育的分子机制提供了科学依据。

English Abstract

程云清, 齐名, 赵永斌, 邢继洋, 刘剑锋. 榛子正常发育与败育子房差异蛋白谱对比分析[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(3): 13-25. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170352
引用本文: 程云清, 齐名, 赵永斌, 邢继洋, 刘剑锋. 榛子正常发育与败育子房差异蛋白谱对比分析[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(3): 13-25. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170352
Cheng Yunqing, Qi Ming, Zhao Yongbin, Xing Jiyang, Liu Jianfeng. Comparative studies on differently expressed proteomes of developing and abortive ovary in hazelnut[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(3): 13-25. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170352
Citation: Cheng Yunqing, Qi Ming, Zhao Yongbin, Xing Jiyang, Liu Jianfeng. Comparative studies on differently expressed proteomes of developing and abortive ovary in hazelnut[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(3): 13-25. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170352
  • 正常的授粉与受精是果实形成的生理基础[1],然而,在榛子栽培生产中,授粉子房因子房败育不能发育形成果实的现象相当普遍。平欧杂交榛(Corylus heterophylla × C. avellana)一个雌花序中常含雌花7~8朵,一般只有2~3朵雌花有机会发育形成果实,其他雌花/子房在授粉后很快败育,导致产量损失[2];果簇中果实的数量与产量呈正相关关系[2],因此,挖掘调控榛子子房败育的蛋白,对于解析榛子子房败育机理、研发调控子房败育的栽培技术手段有重要意义。榛子是壳斗目(Fagales)桦木科(Betulaceae)榛属植物,是世界4大坚果之一,富含不饱和脂肪酸、蛋白质及P、Ca、K、Fe等矿质元素,具有很高的营养价值,有“坚果之王”的美誉[3]。壳斗目植物常有延迟受精的生物学习性,木麻黄(Casuarina equisetifolia)[4]、桤木(Alnus cremastogyne)[5]、杨梅(Myrica rubra)[6]授粉与受精之间间隔了1个月以上,花粉在柱头附着时,花柱组织与子房内的胚囊均未成熟。作为壳斗目植物,榛子也具有与之类似的延迟受精生物学习性,其子房在授粉50余天后胚珠中的胚囊才发育成熟,受精过程耗时60d左右[7]。土耳其榛子品种‘Tombul’和我国的平欧杂交榛品种‘达维’授粉后花果脱落率分别约为50%和63%,剩余花序/果簇中均仅有30%左右的子房有机会发育至果实成熟,最终,分别只有约15%和10%的子房可形成果实[2, 8]。在平欧杂交榛中,败育子房发生在受精以前(约在授粉后30d),人工授粉并不能降低榛子败育子房比例。由于榛子子房在授粉后才开始启动发育,败育子房胚珠发育停滞,缺乏成熟胚囊,花粉管不能进入胚珠并完成受精作用;此外,败育子房中淀粉含量极低,营养供给不足可能与子房败育密切相关[2]。榛子幼果发育过程中,基因组甲基化水平发生明显的变化,因此,其子房的发育应当也是一个与表观遗传调控相关的生物学过程[9]。尽管榛子败育子房形成的形态解剖基础研究取得了重要进展,但具体是哪些蛋白参与调控败育子房的形成仍不清楚。本研究以平欧杂交榛‘达维’的正常发育与败育子房为材料,利用同位素标记相对和绝对定量iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantification)技术建立两者的差异蛋白表达谱,依据蛋白鉴定与定量分析结果筛选差异表达蛋白,进而开展GO(Gene ontology)功能富集与KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)代谢路径富集分析,主要从显著性富集路径中筛选可能参与子房败育调控的差异表达蛋白。本研究为深入解析榛子子房败育的分子机制提供了科学依据。

    • 实验榛园位于吉林省四平市叶赫满族镇。2015年,以8年生平欧杂交榛品种‘达维’为实验试材。在同年3月20日,剪取平欧杂交榛品种‘平欧21号’‘玉坠’‘辽榛7号’雄花枝及‘达维’雌花枝,带回实验室进行催花处理,收集雄花枝的散落花粉,并进行等量混合,检测混合花粉在‘达维’柱头的萌发率为87%,方法如文献所述[2]。选取树势大小较为一致的‘达维’榛子树60株(树高约3.5m),于4月8日随机套袋雌花序1500个左右,待雌花于4月15日开放时用毛刷进行人工授粉并挂牌标记。于授粉后30d左右败育子房开始形成时(5月15日),随机采集前期套袋并人工授粉的雌花序/果簇约1500个。每个雌花序平均有正常发育子房3枚,败育子房5枚。败育子房在其生长周期直径小于2mm,远小于正常发育子房[2],据此将两者进行逐一分离。采集的生物样品人工分成正常发育与败育子房两个处理,每个处理的样品进一步均分成3次生物学重复,每个重复约有子房1500~2000枚。获得的子房样品迅速转置液氮中进行保存备用。

    • 6个生物样品的蛋白抽提及定量分析操作参考文献[10-11]进行。样品的iTRAQ分析委托深圳华大基因(深圳)完成。

      蛋白消化程序如下:蛋白:胰蛋白酶=20:1,温度37℃,消化4h;然后,用胰蛋白酶再消化8h[12]。消化后的多肽真空冻干,置0.5mol/L TEAB溶解,使用iTRAQ试剂盒(iTRAQReagent 8-plex Kit, AB Sciex, Framing- ham, MA, USA)进行iTRAQ标记,操作参考产品说明书进行。不同同位素标记的多肽样品在室温下(20±2)℃孵育2h,用强阳离子交换柱进行多肽的纯化。

      强阳离子交换层析:用岛津LC-20AB高效液相色谱仪进行强阳离子交换层析,色谱柱为Ultremex强阳离子色谱柱(4.6×250mm, 5μm, Phenomenex, USA),消化的肽段用缓冲液A(25mmol/L NaH2PO4,25%乙腈配制,pH2.7)进行重组,梯度洗脱,缓冲液A洗脱10min,流速1mL/min;5%~35%缓冲液B(25mmol/L NaH2PO4,1.0mol/L KCl,25%乙腈配制,pH2.7)洗脱11min,35%~80%缓冲液B洗脱1min。下次进样前,80%缓冲液B冲洗3min,缓冲液A平衡10min。通过观察214nm吸光度变化来监测洗脱过程,每1分钟收集分离的组分。每20个组分混合成1份,用固相萃取C18柱(Strata X,Phenomenex,USA)进行脱盐,并进行真空干燥。

      液相色谱高分辨串联质谱分析:每个组分在缓冲液A (5%乙腈,0.1%甲酸)中进行再悬浮,多肽终浓度约为0.5mg/mL。20000g离心10min,取10μL上清液,上样于岛津LC-20AD型液相色谱仪。色谱条件参照文献进行设置[12]。使用TripleTOF 5600型高分辨质谱系统(AB SCIEX,Concord,ON)进行数据采集,分析技术参数参照文献进行设置[12]

    • 原始MS/MS数据用软件MSConvert tool (ProteoWizard, version 3.0.5245)转换为MGF格式,输出的MGF文件用蛋白鉴定软件Mascot version 2.3.02 (Matrix Sciences, London, UK)比对到此前已经建立的平欧杂交榛转录组数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SRA,accessionsNumber:SRP105309),软件参数设置参照文献[12]进行。仅Q值小于0.01的多肽才进行进一步的分析。用IQuant来对同位素标记的多肽进行定量[13]

    • 进行蛋白相邻类的聚簇(Cluster of Orthologous Groups of proteins, COG)分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG),预测鉴定到的所有蛋白的生物学功能。将败育子房用作对照组,将正常发育子房用作比较组,将变化倍数大于1.50或小于0.67,且Q值小于0.05的蛋白定义为差异表达蛋白[14]。进行差异表达蛋白的GO(Gene ontology)功能分类与KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)代谢路径富集分析[15]P≤0.05用作判定蛋白GO和KEGG显著富集的阈值。

    • 对6个子房蛋白样品进行了iTRAQ定量分析(图 1),共识别到317068个二级谱图,其中,有49671个谱图能与已知谱图匹配,有42805个谱图与特异性多肽谱图匹配。共鉴定到多肽16435条,其中,14267条为特有多肽。共鉴定到蛋白3538个。每个鉴定到的蛋白平均有特异性多肽谱图 12.1个,最少1个,最多349个。随着特异性谱图数量的增加,鉴定到的蛋白数量呈逐渐下降趋势(图 2)。其中,85.01%的鉴定蛋白对应的特异性谱图数量为1~20个。每个鉴定到的蛋白平均有特异性多肽4.03条,最少1条,最多36条。随着特异性多肽数量的增加,蛋白数量呈逐渐下降趋势(图 3)。其中,97.60%的鉴定蛋白对应的特异性谱图数量为1~15个。鉴定到的蛋白分子量在0.34~471kd之间,平均47.88kd。其中,分子量10~60kd的蛋白数量较多(图 4),共占鉴定蛋白总数的74.64%。榛子子房蛋白质的鉴定为后续的iTRAQ定量及差异表达蛋白的筛选奠定了基础。

      图  1  蛋白鉴定结果汇总

      Figure 1.  Protein identification overview

      图  2  特异性谱图数目分布

      Figure 2.  Unique spectrum number distribution

      图  3  特有多肽数量分布

      Figure 3.  Unique peptide number distribution

      图  4  蛋白质分子量分布

      Figure 4.  Protein molecular mass distribution

    • 为深入理解鉴定蛋白的生物学功能,将鉴定到的所有蛋白BLAST比对到COG数据库,得到相应的COG注释结果(图 5)。共有3078个蛋白获得COG功能注释,共分为24个类别。其中,R、O、J、G和C类中的蛋白数量为最多,分别占有COG功能注释的蛋白总数的19.36%、9.97%、7.80%、7.67%和6.76%,这5个类别的蛋白数量共占有COG功能注释的蛋白总数的51.56%。因此,鉴定蛋白执行的功能包括:碳水化合物运输与代谢、能量产生与转换、翻译、核糖体结构、翻译后修饰,蛋白质周转等,这与子房发育过程中旺盛的代谢特征相一致。

      图  5  鉴定蛋白的COG功能分布统计

      Figure 5.  COG functional histogram of all identified proteins

    • 以败育子房为对照,发育子房为处理,计算每个鉴定蛋白的Log2(变化倍数)值,大于Log21.5的为上调表达蛋白,小于Log2(1/1.5)的为下调表达蛋白。共计鉴定到249个差异表达蛋白,其中,上调表达蛋白180个,下调表达蛋白69个(图 6)。差异表达蛋白的鉴定为寻找败育子房发育调控相关蛋白提供了重要依据。

      图  6  正常与败育子房中蛋白表达差异倍数的对数分布

      Figure 6.  Logarithmic distribution plot of protein change folds of developing and abortive ovary

      为深入了解差异表达蛋白的生物学功能,对差异表达蛋白进行了GO功能显著性富集分析(P≤0.05),结果如图 7所示。在249个差异表达蛋白中,有161个能找到匹配的GO注释,共有GO注释733条。GO功能注释包含3个类别:细胞组分(Cell Component)、分子功能(Molecular Function)和生物学过程(Biological Process)。在细胞组分类别中,共分8个亚类,其中,细胞(Cell)(49个,占44.5%)和细胞组分(Cell Part)(49个,占44.5%)亚类的百分比为最高,其次为细胞器(Organelle)(35个,31.8%)、细胞器组分(Organelle Part)(17个,15.5%)和大分子复合物(Macromolecular Complex)(10个,9.1%)。分子功能类别共分9个亚类,其中,结合(Binding)(48个,43.6%)、催化(Catalytic)(41个,37.3%)亚类的百分比为最高。生物学过程共分为18个亚类,代谢过程(Metabolic Process)(57个,51.8%)、细胞过程(Cellular Process)(41个,37.3%)和刺激反应(Response To Stimulus)(24个,21.8%)的百分比为最高。以上结果表明,代谢过程的差异与败育子房的形成密切相关。

      图  7  差异表达蛋白的GO功能富集分析

      Figure 7.  GO functional enrichment analysis of differently expressed proteins

      为深入了解差异表达蛋白涉及的代谢路径,对差异表达蛋白进行了KEGG显著性富集分析(P≤0.05)(表 1)。在鉴定到的3 538个蛋白中,有3 012个蛋白有对应的KEGG注释,共涉及134条KEGG代谢路径。在249个差异表达蛋白中,有208个有对应的KEGG注释,共涉及95条KEGG代谢路径。按P值从小到大的顺序进行了排序,共找到显著性富集的KEGG路径11条(P≤0.05)。其中,最显著富集的5条路径包括:ko00940(苯丙素生物合成),ko00195(光合作用),ko01100(代谢路径),ko00196(光合作用—天线蛋白),ko01110(次生代谢产物生物合成)。可见,榛子子房败育涉及复杂的代谢调控过程,苯丙素生物合成、光合作用、代谢、次生代谢产物生物合成等代谢路径可能参与子房败育调控过程。

      表 1  差异表达蛋白的KEGG代谢通路富集分析

      Table 1.  KEGG pathway enrichment analysis of differently expressed proteins (DEPs)

      编号
      No.
      路径
      Pathway
      有路径注释的DEPs数量(比例
      )DEPs amount with pathway annotation (ratio)
      有路径注释的所有表达蛋白数量(比例)
      All expressed proteins with pathway annotation (ratio)
      P
      P-value
      路径号
      Pathway ID
      1 苯丙素生物合成Phenylpropanoid biosynthesis 23 (11.06%) 83 (2.76%) 2.82×10-9 ko00940
      2 光合作用Photosynthesis 10 (4.81%) 18 (0.6%) 5.37×10-8 ko00195
      3 代谢路径Metabolic pathways 86 (41.35%) 871 (28.92%) 4.73×10-5 ko01100
      4 光合作用-天线蛋白Photosynthesis-antenna proteins 4 (1.92%) 6 (0.2%) 2.97×10-4 ko00196
      5 次生代谢产物生物合成Biosynthesis of secondary metabolites 58 (27.88%) 555 (18.43%) 3.41×10-4 ko01110
      6 氮代谢Nitrogen metabolism 5 (2.4%) 13 (0.43%) 1.22×10-3 ko00910
      7 类黄酮生物合成Flavonoid biosynthesis 7 (3.37%) 28 (0.93%) 2.30×10-3 ko00941
      8 苯并恶嗪酮类物质生物合成Benzoxazinoid biosynthesis 2 (0.96%) 2 (0.07%) 4.75×10-3 ko00402
      9 植物MAPK信号转导通路MAPK signaling pathway-plant 8 (3.85%) 47 (1.56%) 1.37×10-2 ko04016
      10 同源重组Homologous recombination 4 (1.92%) 16 (0.53%) 2.08×10-2 ko03440
      11 DNA复制DNA replication 4 (1.92%) 16 (0.53%) 2.08×10-2 ko03030
    • 综合鉴定蛋白COG功能、差异蛋白的GO功能和KEGG代谢路径富集分析结果,从所有差异蛋白中找到一组功能已知、并可能参与榛子子房败育调控相关的蛋白(表 2)。这些功能蛋白共分为4个类别,包括:光合作用调控相关蛋白、碳水化合物运输与代谢相关蛋白、能量合成与转换相关蛋白、花粉管生长与DNA甲基化相关蛋白。

      表 2  可能参与子房败育调控的差异表达蛋白

      Table 2.  Differently expressed proteins which may be involved in the regulation

      蛋白路径
      Protein pathway
      蛋白质点编号
      Protein point No.
      蛋白编号
      Protein ID
      差异表达倍数
      Fold change
      分子量
      Molecular mass
      特有肽段数量
      Uniquepeptide number
      序列覆盖率
      Proteincoverage/%
      注释
      Annotation
      光合作用
      Photosynthesis
      2 213 Unigene25049_All 1.50 23 118 2 16.1 ATP合成酶β亚基ATP synthase beta subunit
      778 Unigene29018_All 1.62 20 944 2 13.6 ATP合成酶β亚基ATP synthase beta subunit
      456 Unigene41031_All 1.53 20 843 7 52.1 细胞色素f Cytochrome f
      462 Unigene20320_All 1.59 23 112 10 27.0 光系统Ⅰ反应中心亚基Ⅱ Photosystem Ⅰ reaction center subunit Ⅱ
      2 631 Unigene25432_All 1.71 49 003 9 23.2 光系统Ⅱ CP43叶绿素蛋白Photosystem Ⅱ CP43 chlorophyll apoprotein
      2 648 Unigene25729_All 2.73 18 844 1 14.9 光系统Ⅰ反应中心亚基PSI Photosystem Ⅰ reaction center subunit PSI
      892 CL10922.Contig2_All 2.14 13 964 1 26.7 细胞色素b6-f复合体铁硫蛋白亚基Cytochrome b6-f complex iron-sulfur subunit
      992 Unigene20387_All 1.85 28 922 7 25.5 光系统Ⅱ 22 kDa蛋白Photosystem Ⅱ 22 kDa protein
      1 033 Unigene20647_All 2.51 24 449 4 23.9 光系统Ⅰ反应中心亚基Ⅲ Photosystem Ⅰ reaction center subunit Ⅲ
      3 423 CL4056.Contig2_All 1.69 15 197 2 25.2 光系统Ⅰ反应中心亚基Ⅲ PSI reaction center subunit Ⅲ
      碳水化合物运输与代谢
      Carbohydrate transport and metabolism
      2 270 CL10718.Contig2_All 2.22 41 148 4 12.2 糖苷水解酶Glycoside hydrolase
      1 568 CL5678.Contig4_All 1.93 32 465 4 17.7 酸性几丁质内切酶Acidic endochitinase
      91 Unigene17825_All 1.90 59 673 6 11.9 α-L-呋喃糖苷酶1前体Alpha-L-arabinofuranosidase 1 precursor
      2 521 CL2311.Contig8_All 1.89 30 216 4 21.7 水通道蛋白PIP2 Aquaporin PIP2
      1 448 CL10219.Contig1_All 1.65 42 253 8 23.8 庚糖二磷酸酶Sedoheptulose-bisphosphatase
      2 360 CL9110.Contig3_All 1.64 30 890 5 29.9 水通道蛋白PIP1 Aquaporin PIP1
      3 324 Unigene27924_All 1.51 53 260 15 34.0 核酮糖1, 5 -二磷酸羧化酶/氧化酶大亚基(RbcL)Ribulose 1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit
      1 281 Unigene9913_All 0.67 61 085 14 27.1 焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸转移酶β亚基(PFP)Pyrophosphate-fructose 6-phosphate 1-phosphotransferase subunit beta, PFP
      1 612 Unigene19879_All 0.65 53 563 1 12.2 丙酮酸激酶Pyruvate kinase
      3 253 CL1716.Contig1_All 1.55 22 841 3 18.3 类萌发素蛋白Germin-like protein
      能量合成与转换
      Energy production and conversion
      1 753 CL969.Contig2_All 2.13 20 122 9 51.1 Rubisco小亚基(RbcS)Rubisco small subunit
      2 852 Unigene20099_All 1.79 64 976 13 33.7 NADP-苹果酸酶(NADP-ME)NADP-dependent malic enzyme
      2 857 CL5660.Contig3_All 1.64 40 430 11 34.1 醛缩酶型TIM-barrel类家族蛋白亚型1 Aldolase-type TIM barrel family protein isoform 1
      160 Unigene17079_All 1.63 38 192 4 21.9 Perakine还原酶(PR)Perakinereductase-like
      3 133 CL5532.Contig7_All 1.59 53 235 5 11.0 醛脱氢酶(ALDH)Aldehyde dehydrogenase
      2 495 Unigene26012_All 2.14 41 113 10 32.7 线粒体甲酸脱氢酶(FDH) Formate dehydrogenase, mitochondrial
      967 Unigene15321_All 1.62 42 317 8 26.9 磷酸甘油酸脱氢酶(PGDH)Phosphoglycerate dehydrogenase
      2 807 CL6456.Contig2_All 1.66 33 779 4 58.0 2-亚甲基-呋喃-3-1还原酶2-methylene-furan-3-one reductase OS=Solanumlycoper-sicum
      1 138 CL3539.Contig1_All 1.52 32 347 7 30.0 NAD(P)H:醌氧化还原酶(NQO)NAD(P)H:quinoneoxidoreductase
      花粉管生长与DNA甲基化
      Pollen tube growth and DNA methylation
      2 248 CL7865.Contig2_All 4.09 15 766 2 23.0 花粉过敏原和伸展蛋白家族蛋白Ole e 1Pollen Ole e 1 allergen and extensin family protein
      1 218 Unigene909_All 1.77 17 902 3 25.3 主要花粉过敏原Bet v 1-A Major pollen allergen Bet v 1-A
      1 377 CL3839.Contig1_All 0.51 20 815 2 15.9 花粉特异蛋白SF3 Pollen-specific protein SF3
      1 129 Unigene5763_All 1.58 18 315 10 1.9 钙调素(CaM)Calmodulin
      571 CL2565.Contig2_All 1.88 40 363 6 19.4 咖啡酸-3-O-甲基转移酶(COMT)Caffeic acid 3-O-methyltransferase
      1 513 CL2173.Contig3_All 1.51 39 545 6 23.0 COMT
      1 624 CL4896.Contig1_All 0.56 55 950 7 33.3 磷酸乙醇胺N-甲基转移酶(PEAMT)Phosphoethanolamine N-methyltransferase
      2 474 CL10334.Contig1_All 0.63 38 914 6 22.8 甾醇C-24甲基转移酶(SMT)24-sterol C-methyltransferase

      在KEGG代谢路径富集分析中,差异表达蛋白在光合作用路径(ko00195)发生显著性富集。在10个光合作用相关的差异表达蛋白中,有2个蛋白编码ATP合成酶β亚基(Unigene25049_All,1.50;Unigene29018_All,1.62);有4个蛋白编码光系统Ⅰ反应中心的亚基Ⅱ、亚基Ⅲ和亚基PSI(Unigene20320_All,1.59;Unigene25729_All,2.73;Unigene20647_All,2.51;CL4056.Contig2_All,1.69);有2个蛋白编码光系统Ⅱ中的CP43叶绿素蛋白和22 kDa蛋白(Unigene25432_All,1.71;Unigene20387_All,1.85);有2个蛋白分别编码细胞色素f(Unigene41031_All,1.53)和细胞色素b6-f复合体铁硫蛋白亚基(CL10922.Contig2_All,2.14)。所有的光合作用相关的差异表达蛋白均为显著上调表达,这表明这些光合作用相关蛋白的差异表达有利于子房的发育,而不利于败育子房的形成。

      在KEGG代谢路径富集分析中,差异表达蛋白在代谢途径(ko01100)中发生显著性富集,在此路径中,进一步找到10个碳水化合物运输与代谢相关的差异表达蛋白。其中,有8个蛋白发生上调表达,2个蛋白下调表达。上调蛋白包括:糖苷水解酶(CL10718.Contig2_All,2.22),酸性几丁质内切酶(CL5678.Contig4_All,1.93),α-N-呋喃糖苷酶1前体(Unigene17825_All,1.90),水通道蛋白PIP2(CL2311.Contig8_All,1.89)和PIP1(CL9110.Contig3_All,1.64),庚糖二磷酸酶(CL10219.Contig1_All,1.65),核酮糖1, 5 -二磷酸羧化酶/氧化酶大亚基(RbcL)(Unigene27924_All,1.51),类萌发素蛋白(CL1716.Contig1_All,1.55);下调蛋白包括有焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸转移酶β亚基(PFP)(Unigene9913_All,0.67),丙酮酸激酶(Unigene19879_All,0.65)。以上结果表明,活跃的碳水化合物运输与代谢有利于正常发育子房的生长,而不利于败育子房的形成。

      通过差异蛋白的COG功能注释,找到9个与能量合成与转换相关的蛋白,所有蛋白上调表达,包括:Rubisco小亚基(RbcS)(CL969.Contig2_All,2.13),NADP-苹果酸酶(NADP-ME)(Unigene20099_All,1.79),醛缩酶型TIM-barrel类家族蛋白亚型1(CL5660.Contig3_All,1.64),Perakine还原酶(PR)(Unigene17079_All,1.63),醛脱氢酶(ALDH)(CL5532.Contig7_All,1.59),线粒体甲酸脱氢酶(FDH)(Unigene26012_All,2.14),磷酸甘油酸脱氢酶(PGDH)(Unigene15321_All,1.62),2-亚甲基-呋喃-3-1还原酶(CL6456.Contig2_All,1.66),NAD(P)H:醌氧化还原酶(NQO)(CL3539.Contig1_All,1.52)。这些蛋白主要参与光呼吸、联系糖酵解途径和柠檬酸循环、胞内的氧化还原发应,胞内脱氢还原等,对子房正常能量合成与转换可能起到重要作用。

      鉴定到4个可能涉及花粉管生长的蛋白,包括3个上调表达蛋白和1个下调表达蛋白:花粉过敏原和伸展蛋白家族蛋白Ole e 1(CL7865.Contig2_All,4.09)、主要花粉过敏原Bet v 1-A(Unigene909_All,1.77)、花粉特异蛋白SF3(CL3839.Contig1_All,0.51)和钙调素(Unigene5763_All,1.58);同时,鉴定到4个编码甲基转移酶的蛋白,其中,2个蛋白表达上调,均编码咖啡酸-3-O-甲基转移酶(COMT)(CL2565.Contig2_All,1.88;CL2173.Contig3_All,1.51);2个蛋白下调,分别编码磷酸乙醇胺N-甲基转移酶(PEAMT)(CL4896.Contig1_All,0.56;)和甾醇C-24甲基转移酶(SMT)(CL10334.Contig1_All,0.63)。推测这些蛋白通过调控花粉管的生长、DNA甲基化状态变化来调控子房的发育。

    • 植物可利用太阳能固定空气中的CO2,合成有机光合产物,为植物生长发育提供物质保障。众所周知,在光合作用过程中,光能被植物的光合系统Ⅱ的捕光色素复合物捕获以后,产生的电子依次传递给细胞色素b6/f复合物等电子载体,形成跨膜质子梯度,驱动ATP合酶生成能量物质ATP;传递至细胞色素b6/f复合物等电子载体的电子也可进一步传递至光合系统Ⅰ,驱动还原动力NADPH的生成;合成的NADPH可用于CO2的同化,合成光合产物[16-17]。因此,在整个光合作用系统中,光合系统Ⅱ、细胞色素b6/f复合物、光合系统Ⅰ及ATP合酶等蛋白多聚复合物之间彼此配合,依次产生作用,形成的有机光合产物及ATP能量物质构成了植物生长发育和能量来源基础。在本研究中,与败育子房相比,发育子房10个蛋白发生上调表达,包括:光合系统Ⅱ中的CP43叶绿素蛋白和22kDa蛋白;细胞色素b6/f复合物中的细胞色素f和铁硫蛋白亚基;ATP合成酶复合物中的β亚基;光合系统Ⅰ中的亚基Ⅱ、亚基Ⅲ、亚基PSI。可见,这些差异表达蛋白的上调表达,有利于整个光合系统效率的提高。研究表明,榛子发育子房中含有更高的叶绿素含量,早期子房更活跃的光合作用应当有利于榛子早期幼果的发育,而不利于败育果实的形成,花期尿素等营养物质的施用,对于提高植物的光合效率有利[18],是否能在败育子房形成之前,通过叶面追施尿素等化学肥料来提高早期子房光合效率,减少子房败育发生比例,提高每簇果实中的果实数量还有待深入研究。

    • 作为代谢库,有机、无机营养及水分向子房的正常输入对其正常发育及充实应当具有十分重要的作用。榛子存在普遍的果实空壳现象,有研究利用荧光素二钠在果实发育期研究运输障碍对胚珠充实的影响,结果表明,在败育的胚珠中,胚珠与胚柄连接处的运输障碍与胚珠败育密切相关[19]。可见,物质的运输也应与子房败育密切相关。水通道蛋白对于水分的跨膜运输至关重要,能显著增加细胞膜水分的通透性,参与水分的分泌、吸收及细胞内外水的平衡[20-21]。糖基水解酶是植物生长发育过程中细胞壁修饰的重要调节因子,AtASD1编码拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的α-L-呋喃糖苷酶,该酶在细胞增殖区、维管组织、发育花组织等区域大量表达[22],推测AtASD1有利于维管的发育。在同一果簇中,只有少数子房有机会发育形成正常可食用的果实,多数在授粉后迅速败育。在本研究中,水通道蛋白PIP2、PIP1和α-L-呋喃糖苷酶显著上调表达,这似乎意味着在发育果实与败育果实竞争水分及养分过程中,发育果实具明显竞争优势,而败育子房则呈明显的失水特征。可见,这3种蛋白的上调表达有利于发育子房的水分运输及维管发育,不利于败育子房的形成。

      核酮糖1, 5 -二磷酸羧化酶/氧化酶(Rubisco)、庚糖二磷酸酶(SBP)、焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸转移酶(PFP)、糖苷水解酶和丙酮酸激酶(PK)在CO2固定、糖运输、细胞壁修饰及油类、蔗糖的利用方面等起重要的调节作用。在低光照(200mμ/(mol·m2·s))与高光照(600mμ/(mol·m2·s))条件下,拟南芥的Rubisco反义抑制转基因植株光合作用与野生型相比显著下降,仅相当于后者的30%~40%,叶面积也远小于后者,转基因植株地上生物量相当于野生型的80%;在高光照条件下,生物量仅相当于野生型的65%[23]。SBP调控植物光合作用中卡尔文循环的碳输入与再生,其表达受光调节,在基础碳固定途径中起重要作用[24]。有研究者克隆了桑树(Morus alba)中的庚糖-1, 7-二磷酸酶,并将其转入拟南芥中进行表达。结果表明,转基因植株中叶片的庚糖-1, 7-二磷酸酶酶活、净光合速率显著升高,淀粉、可溶性糖及干物质含量明显高于野生型。因此,庚糖-1, 7-二磷酸酶有利于提高CO2固定能力和植物光合能力[25]。在甘蔗(Saccharum officinarum)中,PFP的β亚基经反义RNA抑制后,幼苗茎中酶活下降了70%,转基因幼苗节间蔗糖含量显著增加并发生积累,这表明PFP对糖酵解中间产物流向有调节作用[26]。有研究对糖苷水解酶在拟南芥中花序梗中的分布进行了组织化学定位,结果表明:糖苷水解酶中的β-1, 4-葡糖苷酶、β-1, 4-葡聚糖酶、β-1, 4-半乳糖苷酶活性与次生壁的沉积密切相关[27]。在拟南芥中,丙酮酸激酶突变体pkp1的种子不能利用储藏的油类,在暗条件下也不能利用培养基中的蔗糖用于子叶的伸长生长[28]。在本研究中,Rubisco、SBP和糖苷水解酶显著上调表达,这表明正常发育子房具备更强的碳固定能力及净光合速率,其生物量也远大于败育子房,这与前述早期子房更活跃的光合作用有利于榛子早期幼果的发育,而不利于败育果实形成的结论相一致;PFP与PK均呈显著下调表达,这表明正常发育子房中可能出现蔗糖的积累,这也可能会有利于子房的早期发育与分化。

      植物中的几丁质酶多被认为与抗性相关,在大豆(Glycine max)的花与种子中,可检测到酸性内切几丁质酶基因的大量表达[29]。有研究者从抗线虫(Heterodera schachtii)甜菜(Beta vulgaris)中克隆了一个类萌发素蛋白基因BvGLP-1,将其转至拟南芥中进行表达后,激活了系列防御相关基因的表达,包括:PR-1至PR-4,PDF1.2等[30]。因此,酸性内切几丁质酶及类萌发素蛋白有利于植物建立其防御反应,而逆境协迫易引起防御反应相关基因的表达已有诸多报道。在本研究中,同一果簇中的多个正常发育与败育子房存在明显的营养及水分竞争关系,如:与水运输相关的水通道蛋白PIP2在正常发育子房中显著上调表达,这有利于水分向发育子房的输入;正常发育子房中的PFP与PK均呈显著下调表达,这有利于蔗糖的积累。因此,正常发育子房中酸性内切几丁质酶和类萌发素蛋白可能是一种竞争协迫反应,而不是导致子房败育的诱因。

    • 果实的分化与发育需要能量的输入。在本研究中,鉴定到一批与能量代谢密切相关的差异表达蛋白,这些蛋白定位于叶绿体、线粒体等与能量代谢密切相关的细胞器中,主要参与调控胞内的氧化还原反应,涉及能量的合成与转换,它们绝大多数在发育子房中上调表达,推测与子房败育的发生密切相关。

      Rubisco小亚基(RbcS)的前体在胞质中合成,经跨膜进入叶绿体中,在分子伴侣协助下与大亚基组装成全酶,参与植物的光呼吸反应。NADP-苹果酸酶(NADP-ME)是C4植物中的主要脱羧酶。玉米(Zea mays)中的叶绿体NADP-ME转入水稻(Oryza sativa)后,转基因植株叶片中的NADP-ME酶活力提高了30~70倍,叶绿体发育呈明显异常,推测NADP-ME参与叶绿体的发育调控[31]。在逆境协迫条件下,醛脱氢酶(ALDH)在植物产醛过程中起解毒作用,因而有利于植物提高对逆境的适应能力。ALDH在拟南芥中的过表达可减少在逆境条件下过氧化氢及丙二醛的含量,因而有利于清除活性氧,抑制脂质过氧化相关酶类活性,提高转基因植株对协迫条件的适应能力[32]。在甲酸协迫条件下,拟南芥野生型的种子、幼苗的萌发及幼苗生长及根系明显受到抑制,甲酸脱氢酶(FDH)过表达的转基因植株及其种子则表现出良好的特异耐受性,这表明FDH可能有利于植株对逆境协迫的耐受能力[33]。在本研究中,RbcS、NADP-ME、ALDH、FDH等蛋白在发育子房中显著上调表达,这意味着发育子房的光呼吸、叶绿体发育过程可能得到明显的促进,细胞中活性氧的清除能力、营养竞争协迫耐受能力得到提高,因而有利于发育子房的进一步分化。磷酸甘油酸脱氢酶(PGDH)是拟南芥磷酸丝氨酸途径中的重要成员,定位于质体,该酶的突变体pgdh1出现胚致死及生长受抑制等表型[34]。发育子房中PGDH的上调表达,意味着败育子房中的PGDH保持较低水平,易导致败育子房生长受阻,进而发生死亡,因而,PGDH可能在调控败育子房形成过程中起到十分重要的作用。

    • 榛子败育子房中,花粉管不能进入胚珠完成受精作用[2],推测花粉管正常生长对子房发育起重要的激发作用。在榛子子房分化过程中,存在频繁的DNA甲基化与去甲基化过程,因此,榛子早期子房的发育也是一个受表观遗传调控的生物学过程[9]。在过去,花粉过敏原和伸展蛋白家族蛋白Ole e 1作为一种导致花粉过敏的蛋白而被人们所熟知,近年来,一些研究认为该蛋白在植物的不同组织中均有分布,参与调控细胞的伸长生长,是一种发育调节蛋白,而其表达可能受表观遗传调控[35]。主要花粉过敏原Bet v 1-A是一类在白桦(Betula platyphylla)中表达的花粉过敏源,在成熟花粉中表达,其生物学功能是在花粉萌发过程中,保护雌花组织免受致病菌的侵染[36]。Ca2+-CaM信号转导对于花粉管的生长具有十分重要的作用。Ca2+-CaM信号转导的抑制会迅速引起胞外Ca2+内流,引起胞内胞浓度瞬时升高,肌动蛋白丝发生去极化,内吞与外排受阻,胞壁发生重塑,阻碍花粉管的伸长生长[37]。在本研究中,发育子房中的Ole e 1、花粉过敏原Bet v 1-A和CaM均显著上调表达,推测它们将有利于雌蕊细胞、花粉管的伸长生长,提高雌蕊对致病菌的抗性。

      花粉特异蛋白SF3是一种在植物发育过程中表达的转录因子,在芽、雌蕊、雄蕊、花瓣、花萼等区域高度特异表达,在拟南芥中调控晚期花粉的发育、花粉管生长、及受精进程[38-39]。在木豆(Cajanus cajan)中,SF3在雄蕊与雌蕊中表达量高,与蔗糖-质子转运体一起共同调控种子形成,并处于基因表达调控网络的核心位置[40]。榛子在雌蕊受粉以后才逐渐开始子房分化发育,花粉管的生长信号在此过程中起重要的激发作用[2, 7]。在本研究中,SF3在发育子房中表达下调,而此时其花粉管生长长度、子房尺寸、子房成熟程度均显著大于败育子房,因此,推测SF3是榛子受精前的特定时期花粉管生长及子房发育的负调控因子,通过调控下游基因的表达来调控子房发育进程,因而在子房败育调控中可能起到十分重要的作用。

      榛子雌花/子房基因组DNA的总甲基化率保持较高水平,可达到44.61%~48.68%,远高于多数被子植物。与授粉前相比,榛子授粉以后DNA甲基化水平下降了约4%。在子房发育的不同阶段,基因组DNA甲基化程度发生明显变化。因此,榛子子房发育也是一个受表观遗传调控的生物学过程[9]。本研究结果表明,4个编码甲基转移酶的蛋白出现了显著差异表达,这应当与榛子子房发育过程中频繁的甲基化变化相关。咖啡酸-3-O-甲基转移酶(COMT)在转基因苜蓿(Medicago arborea)中的下调表达导致木质素含量下降[41]。本研究共鉴定到2个编码COMT的差异表达蛋白,均在发育子房中上调表达,这意味着发育子房细胞壁中木质素的合成倾向活跃,因而有利于子房发育。玉米中磷酸乙醇胺N-甲基转移酶ZmPEAMT1在盐胁迫条件下增强表达[42]。油菜素甾醇是一种植物甾醇类激素,在许多生理学过程中均有广泛的调控作用,包括细胞的伸长生长,纤维素生物合成与积累。陆地棉(Gossypium hirsutum)中的GhSMT2-1和GhSMT2-2与甾醇C-24甲基转移酶高度同源,在调控纤维素生长方面可能起到重要作用[43]。在发育子房中,PEAMT和SMT表达下调,推测它们在发育子房的营养竞争协迫适应及细胞生长发育调控方面起调控作用。

    • 通过正常发育与败育子房蛋白样品的iTRAQ对比分析,找到一批可能参与败育子房发育调控的蛋白,推测这些蛋白可能通过如下路径调控败育子房的形成。授粉以后,败育子房中的钙调素和SF3分别下调与上调表达,抑制了花粉管的生长,Ca2+-CaM将该信号传递至胞内,引起咖啡酸-3-O-甲基转移酶(COMT)等甲基转移酶的下调表达,使败育子房的甲基化水平高于正常发育子房,因而木质素合成受阻,细胞分裂趋缓。进一步,由于基因组的高甲基化水平,光合系统Ⅰ中的亚基Ⅱ、亚基Ⅲ、亚基PSI,光合系统Ⅱ中的CP43叶绿素蛋白和22kDa蛋白、细胞色素f和铁硫蛋白、ATP合成酶复合物以及Rubisco、SBP和糖苷水解酶等在败育子房中下调表达,导致整个光合系统效率降低,光合产物合成和能量输入受阻,故不利于水通道蛋白的形成及维管发育,在与正常发育子房竞争水分与营养时处于劣势,导致败育子房失水和失绿。最后,低水平表达的磷酸甘油酸脱氢酶(PGDH)等重要蛋白诱导了败育子房的死亡。

    • 建立了榛子正常发育和败育子房的差异表达蛋白谱,共鉴定到蛋白3538个,其中,差异表达蛋白249个。差异表达蛋白主要参与代谢过程、细胞过程和刺激反应等生物学过程,并在苯丙素生物合成、光合作用,代谢路径等11个KEGG代谢通路上发生显著性富集。这些差异表达蛋白共可分为4个类别,包括:光合作用、碳水化合物运输与代谢、能量合成与转换、花粉管生长与DNA甲基化,败育子房中,这4个方面均趋向于抑制,不利于花粉管的生长、光合同化、水分运输、维管发育和能量合成,最后导致子房败育的发生。

参考文献 (43)

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