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百合转P5CS-F129A基因的遗传稳定性和耐旱性检测

闫笑 魏迟 张冬梅 贾桂霞

闫笑, 魏迟, 张冬梅, 贾桂霞. 百合转P5CS-F129A基因的遗传稳定性和耐旱性检测[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(2): 98-105. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170379
引用本文: 闫笑, 魏迟, 张冬梅, 贾桂霞. 百合转P5CS-F129A基因的遗传稳定性和耐旱性检测[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(2): 98-105. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170379
Yan Xiao, Wei Chi, Zhang Dong-mei, Jia Gui-xia. Inheritance stability and drought stress test for P5CS-F129A transgenic lily[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(2): 98-105. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170379
Citation: Yan Xiao, Wei Chi, Zhang Dong-mei, Jia Gui-xia. Inheritance stability and drought stress test for P5CS-F129A transgenic lily[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(2): 98-105. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170379

百合转P5CS-F129A基因的遗传稳定性和耐旱性检测

doi: 10.13332/j.1000-1522.20170379
基金项目: 

“863”国家高技术研究发展计划项目 2013AA102706

详细信息
    作者简介:

    闫笑。主要研究方向:花卉分子生物学。Email:yanxiao@bjfu.edu.cn 地址:100083北京市海淀区清华东路35号北京林业大学园林学院

    通讯作者:

    张冬梅,教授级高级工程师。主要研究方向:园林植物种质资源选育。Email:418517920@qq.com 地址:200231上海市徐汇区龙吴路899号406室上海市园林科学规划研究院

    贾桂霞,教授,博士生导师。主要研究方向:园林植物种质资源与遗传育种。Email:gxjia@bjfu.edu.cn 地址:同上

  • 中图分类号: S682.2

Inheritance stability and drought stress test for P5CS-F129A transgenic lily

  • 摘要: 目的百合是世界上主要的商品花卉之一,具有很高的观赏价值和经济价值,然而目前的主栽东方百合品种耐旱和耐盐碱性较差,对其进行改良是提高百合价值的关键因素。方法对已获得的含抗逆相关基因P5CS-F129A的东方百合‘索邦’单拷贝转化株系L89和双拷贝株系L31进行了4年的组培继代培养和1年的温室栽培,检测了目的基因的稳定性和干旱胁迫处理下的表型和生理指标的变化。经Southern印迹杂交和cDNA检测显示目的基因能够稳定遗传。结果干旱胁迫处理结果表明:两个转基因株系叶片脯氨酸含量均高于普通‘索邦’,其中株系L31的脯氨酸水平最高;虽然干旱胁迫下两个转基因株系和普通‘索邦’叶片相对电导率均有所升高,但转基因株系叶片的相对电导率低于普通‘索邦’,重新灌水后,转基因株系恢复正常水平,普通‘索邦’未恢复;在表型性状等方面,经过胁迫并复水的株系L89和L31总体长势良好,两株系之间长势无显著差异,而普通‘索邦’叶片黄化严重,生长受阻。结论P5CS-F129A基因植株具有更强的耐旱性和遗传稳定性,对抗逆性百合新品种的培育具有重要意义。
  • 图  1  P5CS-F129A转基因‘索邦’DNA Southern印迹杂交

    1.质粒pBPC-P5CS-F129A阳性对照;2.株系L31;3.株系L89。

    Figure  1.  Southern blot analysis of DNA isolated from P5CS-F129A transgenic lines of 'Sorbonne'

    1, positive control of plasmid DNA pBPC-P5CS-F129A; 2, line L31; 3, line L89.

    图  2  P5CS-F129A转基因‘索邦’逆转录PCR检测

    A.P5CS-F129A检测P5CS-F129A detection;B. bar检测bar detection
    M. DL2000 Marker;1.质粒pBPC-P5CS-F129A阳性对照;2.普通‘索邦’阴性对照;3.dH2O空白对照;4~8.株系L31;9~18.株系L89。

    Figure  2.  RT-PCR detection of P5CS-F129A transgenic lines of 'Sorbonne'

    M, DL2000 Marker; 1, positive control of plasmid DNA pBPC-P5CS-F129A; 2, normal 'Sorbonne' negative control; 3, dH2O blank control; 4-8, line L31; 9-18, line L89.

    图  3  P5CS-F129A转基因‘索邦’各株系移栽成活率

    CK.普通‘索邦’对照组。不同小写字母之间差异显著(P < 0.05)。

    Figure  3.  Survival rates of P5CS-F129A transgenic 'Sorbonne' lines after transplant

    CK, normal 'Sorbonne' control group. Different lowercase letters mean significant difference (P < 0.05).

    图  4  P5CS-F129A转基因‘索邦’各株系移栽后长势

    Figure  4.  Growth of P5CS-F129A transgenic 'Sorbonne' lines after transplanting

    图  5  干旱胁迫下P5CS-F129A转基因‘索邦’叶片相对电导率及土壤水势

    停止浇水24 d后恢复浇水。灌透水后每2 d取样测定。Re1、Re3、Re5、Re7分别为灌透水后的第1天、第3天、第5天、第7天。下同。

    Figure  5.  Relative leaf conductivity of P5CS-F129A transgenic 'Sorbonne' and soil water potential under drought stress

    Rewatering after 24 days of drought stress, sampling inspection per 2 days after water soakage. Re1, Re3, Re5 and Re7 represent the 1st, 3rd, 5th and 7th day after water soakage, respectively. Same as below.

    图  6  干旱胁迫下P5CS-F129A转基因‘索邦’叶片游离脯氨酸含量

    Figure  6.  Free proline content in leaves of P5CS-F129A transgenic 'Sorbonne' under drought stress

    图  7  干旱胁迫后P5CS-F129A转基因‘索邦’长势

    Figure  7.  Growth of P5CS-F129A transgenic 'Sorbonne' after drought stress

    表  1  目的基因检测所用引物

    Table  1.   Primers for test of the target genes

    引物Primer 方向Orientation 序列Array(5′→3′) 产物大小Product size/bp
    P5CS 正向Forward(F)
    反向Reverse(R)
    GTTAGCGGTTGGAAGATT
    CTTGGCGTAGAAACACATTAG
    1 831
    bar 正向Forward(F)
    反向Reverse(R)
    ATGAGCCCAGAACGACGC
    TCAGATCTCGGTGACGGGC
    552
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出版历程
  • 收稿日期:  2017-10-24
  • 修回日期:  2017-12-01
  • 刊出日期:  2018-02-01

百合转P5CS-F129A基因的遗传稳定性和耐旱性检测

doi: 10.13332/j.1000-1522.20170379
    基金项目:

    “863”国家高技术研究发展计划项目 2013AA102706

    作者简介:

    闫笑。主要研究方向:花卉分子生物学。Email:yanxiao@bjfu.edu.cn 地址:100083北京市海淀区清华东路35号北京林业大学园林学院

    通讯作者: 张冬梅,教授级高级工程师。主要研究方向:园林植物种质资源选育。Email:418517920@qq.com 地址:200231上海市徐汇区龙吴路899号406室上海市园林科学规划研究院; 贾桂霞,教授,博士生导师。主要研究方向:园林植物种质资源与遗传育种。Email:gxjia@bjfu.edu.cn 地址:同上
  • 中图分类号: S682.2

摘要: 目的百合是世界上主要的商品花卉之一,具有很高的观赏价值和经济价值,然而目前的主栽东方百合品种耐旱和耐盐碱性较差,对其进行改良是提高百合价值的关键因素。方法对已获得的含抗逆相关基因P5CS-F129A的东方百合‘索邦’单拷贝转化株系L89和双拷贝株系L31进行了4年的组培继代培养和1年的温室栽培,检测了目的基因的稳定性和干旱胁迫处理下的表型和生理指标的变化。经Southern印迹杂交和cDNA检测显示目的基因能够稳定遗传。结果干旱胁迫处理结果表明:两个转基因株系叶片脯氨酸含量均高于普通‘索邦’,其中株系L31的脯氨酸水平最高;虽然干旱胁迫下两个转基因株系和普通‘索邦’叶片相对电导率均有所升高,但转基因株系叶片的相对电导率低于普通‘索邦’,重新灌水后,转基因株系恢复正常水平,普通‘索邦’未恢复;在表型性状等方面,经过胁迫并复水的株系L89和L31总体长势良好,两株系之间长势无显著差异,而普通‘索邦’叶片黄化严重,生长受阻。结论P5CS-F129A基因植株具有更强的耐旱性和遗传稳定性,对抗逆性百合新品种的培育具有重要意义。

English Abstract

闫笑, 魏迟, 张冬梅, 贾桂霞. 百合转P5CS-F129A基因的遗传稳定性和耐旱性检测[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(2): 98-105. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170379
引用本文: 闫笑, 魏迟, 张冬梅, 贾桂霞. 百合转P5CS-F129A基因的遗传稳定性和耐旱性检测[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(2): 98-105. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170379
Yan Xiao, Wei Chi, Zhang Dong-mei, Jia Gui-xia. Inheritance stability and drought stress test for P5CS-F129A transgenic lily[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(2): 98-105. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170379
Citation: Yan Xiao, Wei Chi, Zhang Dong-mei, Jia Gui-xia. Inheritance stability and drought stress test for P5CS-F129A transgenic lily[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(2): 98-105. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170379
  • 百合(Lilium spp.)是百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)球根植物的总称。其种类繁多,花朵硕大且色彩丰富,既能作盆花和切花,又能应用于园林绿地,还可以食用和药用,深受人们喜爱[1-2]。目前市场上最受欢迎的品种之一为东方百合的‘索邦’(Lilium Oriental hybrid‘Sorbonne’),由于百合性喜温暖湿润,而忌干旱或过湿、酷暑[3],北方百合生产受到土地盐渍化、季节性干旱的影响,限制了其在北方地区的露地栽培,而在设施条件下进行栽培需要进行土壤改良或用基质栽培。因此,迫切需要抗旱和抗盐碱等抗逆性强的百合新品种来满足市场的需求。

    在盐胁迫和干旱胁迫条件下,植物细胞会发生水分亏缺情况,即渗透胁迫[4-5],在一定范围内,植物会积累一些小分子物质来调节细胞内的渗透势。脯氨酸是植物体内分布最广的渗透调节物质之一,具有降低渗透胁迫所造成的氧伤害作用,在植物细胞适应过程中起重要作用[6]。脯氨酸在植物体内合成的途径有两条,一条是谷氨酸合成途径,另一条是鸟氨酸合成途径,而谷氨酸合成途径在渗透胁迫中是主要途径[7-8],占据主要地位[9]。Δ1-二氢吡咯啉-5-羧酸合成酶(Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase,P5CS)是植物体内合成脯氨酸的关键酶,P5CS是一个重要的与抗逆相关的基因,在植物受到逆境胁迫时,脯氨酸的积累与P5CS基因的诱导表达呈现正相关性[10-11],越来越多的研究表明P5CS在植物抗渗透胁迫中具有积极作用[12],且不同生物的P5CS有较高的同源性。在植物中,P5CS受到脯氨酸的变构调节[9, 13],而Hong等[14]发现,除去反馈抑制的P5CS-F129A与P5CS转基因植物相比,无论是在胁迫条件还是正常条件,其产生的脯氨酸都增加了两倍。目前,P5CS基因的遗传转化在烟草(Nicotiana tabacum)、水稻(Oryza sativa)、胡萝卜(Daucus carota var. sativa)、柑桔(Citrus reticulata)、马铃薯(Solanum tuberosum)、高羊茅(Festuca elata)和黑麦草(Lolium perenne)等植物中均取得了一定的成果。

    虽然很多植物的转基因研究取得了很大进展,但百合转基因育种还处于较为初级的阶段。目前,关于百合基因工程的报道多为遗传转化体系的建立和完善,以及遗传转化后的初步鉴定,而关于百合转化后长期的跟踪观察和目的基因在受体植物中的遗传和表达稳定性的相关研究还未见报道。而且,对转基因技术的应用而言,目的基因在植物有性或无性繁殖过程中的稳定表达是至关重要的,但不少报道显示转基因植物中的外源基因常有不稳定现象出现[15-16]。因此,有必要对已得到的转基因植物的长期遗传稳定性进行跟踪评价,以确保其目的性状得以维持。因此,本课题组以东方百合‘索邦’无菌苗小鳞片基部作为受体材料,通过基因枪法获得了百合安全、抗盐碱的转基因植株[17]。本研究对转基因植株进行4年的组培继代培养和1年的温室栽培,并检测目的基因的遗传稳定性,之后进行干旱胁迫处理试验和相关指标测定,以检验所得转基因株系的实用价值,为进一步获得抗旱、耐盐碱的东方百合优良新品种奠定基础。

    • 含有经突变降低反馈抑制作用的乌头叶豇豆(Vigna aconitifolius)和P5CS-F129A的东方百合‘索邦’两个独立转基因株系[17],分别为单拷贝株系L89和双拷贝株系L31。经继代4年后,待转基因试管鳞茎直径达到10~15 mm时进行移栽,同时选择规格一致、数量相同的普通‘索邦’组培苗作为对照移栽。

    • 转基因试管鳞茎在4 ℃冷藏60 d后移栽于直径150 mm的营养钵中,每钵种植2~3株,基质配比为V(草炭):V(蛭石):V(珍珠岩)=3:1:1。幼苗生长于北京林业大学林业科技股份有限公司温室,期间光周期约为10 h光/14 h暗,温度周期约为25 ℃昼/18 ℃夜,通风良好,每7 d使用霍格兰氏液浇灌。使用同等规格普通‘索邦’组培苗作为对照,按上述同样方法栽种。移栽共计3次,15 d后统计各株系成活率,数据以平均值±标准差表示。

      将各株系分为常规组和补光组两组,补光组使用白炽灯在夜间补光,使光周期达到约16 h光/8 h暗。在栽种20、50、90、140、200 d时统计各株系及各组长势,对已抽莛植株长势按株高计,未抽莛植株长势按其基生叶之最长叶长计。数据以平均值±标准差表示。

    • 基因组DNA进行PCR鉴定后,随机选取L89、L31株系各10株进行Southern印迹杂交分析。使用TIANGEN(天根公司)植物基因组DNA提取试剂盒提取叶片基因组DNA。因导入的外源基因P5CS-F129A未改变酶切位点,之后选择使用限制性内切酶Hind III-HF(R3104,NEB,美国)将各植株15 μg基因组DNA酶切过夜,操作方法详见说明书。次日经0.8%琼脂糖凝胶电泳后,将DNA转膜至尼龙膜(P36007,Millipore,美国),操作方法参见产品说明书。用以上P5CS引物扩增质粒pBPC-P5CS-F129A,使用DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I(Roche Diagnostics,瑞士)制备杂交探针。使用高SDS杂交缓冲液(7%SDS、50%去离子甲酰胺、5×SSC、50 mmol/L磷酸钠、0.1%N-月桂酰肌氨酸、2%封阻液,pH7.0)进行预杂交和杂交,洗脱后免疫检测,操作方法参见试剂盒说明书。

    • 取生长于温室的各株系叶片100 mg,使用EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒(RN38,艾德莱生物,北京)提取植物总RNA(操作方法详见说明书),并测定所得RNA浓度与纯度。使用1 μg总RNA通过ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(FSQ-301,Toyobo,日本)进行第一链cDNA合成。使用Veriti 96-Well Thermal Cycler进行逆转录PCR(RT-PCR),所用检测引物如表 1所示。PCR扩增体系为20 μL,含0.4 μL模板cDNA、0.3 μmol/L各引物、0.1 μL GoTaq DNA Polymerase(M3001,Promega,美国)、0.4 μL PCR Nucleotide Mix,扩增程序为:95 ℃、2 min;随后95 ℃、0.5 min,65 ℃、2 min(P5CS)或1 min(bar)共35个循环,最后延伸5 min。以质粒pBPC-P5CS-F129A为模板的为阳性对照,普通‘索邦’cDNA为阴性对照,ddH2O为空白对照。PCR扩增结束后经1.0%琼脂糖凝胶电泳,在GelDoc XR凝胶成像系统下观察结果。

      表 1  目的基因检测所用引物

      Table 1.  Primers for test of the target genes

      引物Primer 方向Orientation 序列Array(5′→3′) 产物大小Product size/bp
      P5CS 正向Forward(F)
      反向Reverse(R)
      GTTAGCGGTTGGAAGATT
      CTTGGCGTAGAAACACATTAG
      1 831
      bar 正向Forward(F)
      反向Reverse(R)
      ATGAGCCCAGAACGACGC
      TCAGATCTCGGTGACGGGC
      552
    • 待生长于温室的各株系及对照组地上部分枯萎后,收取鳞茎于4 ℃冷库冷藏90 d,之后按上述方法重新栽植,70 d后选取各株系及对照组普通‘索邦’中规格一致、生长良好的植株进行干旱胁迫实验,两个转基因株系和普通‘索邦’分别设置正常管理组和干旱胁迫组共6个处理,每个处理20株。将各植株置于人工光照培养箱中,光周期为16 h光/8 h暗,温度周期为25 ℃昼/18 ℃夜,空气相对湿度为30%。干旱胁迫处理组对各植株一次性灌透水之后停止供水,自第0天起每3 d由顶端第3片叶开始摘取叶片进行相对电导率与脯氨酸含量检测,同时使用Psypro Water Potential System监测土壤水势(ψw)。停止浇水24 d后恢复浇水,灌透水之后每2 d按上述同样方法进行叶片采样和土壤水势测定。正常管理组各株系正常灌水,作为无胁迫对照处理。实验处理结束后观察各处理下各株系外观表型的差异。

    • 叶片相对电导率按照陈建勋等[18]的方法测定。各株系及对照组均取3株独立植株作为生物学重复,并且均以重复测定3次作为试验重复,数据以平均值±标准差表示。

    • 叶片游离脯氨酸含量基本按照Bates等[19]方法测定(有细微改动),具体方法为:分别配制1、2、3、4、5和6 μg/mL L-脯氨酸溶液;取6支试管,分别吸取2 mL上述溶液,再分别加入酸性茚三酮溶液与乙酸各2 mL,沸水浴加热30 min。冷却后加入3 mL甲苯,涡旋振荡后静置30 min,取上层清液2 mL于比色皿,以甲苯为空白对照,用分光光度计测量520 nm处吸光度。以此求出吸光度值依脯氨酸浓度而变的回归方程式,并绘制标准曲线。

      将样品各100 mg置于试管中,加入4 mL 3%磺基水杨酸,沸水浴提取10 min,并不时摇动。冷却后吸取2 mL上清液,按上述方法处理后测520 nm处吸光度。根据标准曲线求得各样品浓度,并计算4 mL磺基水杨酸溶液中脯氨酸总含量,由此根据样品鲜质量(100 mg)计算各样品脯氨酸含量水平(μmol/g鲜质量(FW))。各处理均取3株独立植株作为生物学重复,并且均以重复测定3次作为试验重复,数据以平均值±标准差表示。

    • 为确认外源DNA片段在转基因‘索邦’基因组的遗传稳定性,并检验其基因组拷贝数,随机选择L89和L31株系各10株植物进行Southern印迹杂交分析,结果见图 1。由图 1可知:L89和L31株系均呈现有杂交条带。根据杂交条带数量可知,L89为单拷贝转基因株系,L31为双拷贝株系,验证结果与本课题组前期检测的结果一致[17]

      图  1  P5CS-F129A转基因‘索邦’DNA Southern印迹杂交

      Figure 1.  Southern blot analysis of DNA isolated from P5CS-F129A transgenic lines of 'Sorbonne'

      对继代4年并移栽至温室的P5CS-F129A‘索邦’转基因植株提取总RNA,并进行逆转录PCR扩增检测,凝胶电泳结果见图 2。由图 2可知,参与检测的L89和L31株系所有植株样品均呈现阳性条带,包括目的基因P5CS-F129A条带(1 831 bp)和抗除草剂选择基因bar条带(552 bp),说明经过长期继代并改变其生长环境后,P5CS-F129A‘索邦’转基因植株的外源DNA片段依旧稳定遗传并可表达。

      图  2  P5CS-F129A转基因‘索邦’逆转录PCR检测

      Figure 2.  RT-PCR detection of P5CS-F129A transgenic lines of 'Sorbonne'

    • 将经4年继代的P5CS-F129A转基因‘索邦’各株系及对照组的组培苗分3批移栽入温室,并统计其最终成活率(图 3)。由图 3可知:对照组与不同转基因株系的移栽成活率均存在显著性差异;L89株系经3批移栽共成活307株,成活率为51.51%;L31株系共成活170株,成活率为39.53%;普通‘索邦’对照组株系共成活84株,成活率为29.47%。由此可见,P5CS-F129A转基因苗两个株系的移栽成活率均高于普通‘索邦’。但值得注意的是,L31作为双拷贝株系,与单拷贝株系L89相比,其在成活率上并未表现出优势,反而劣于单拷贝株系L89。

      图  3  P5CS-F129A转基因‘索邦’各株系移栽成活率

      Figure 3.  Survival rates of P5CS-F129A transgenic 'Sorbonne' lines after transplant

      进一步对移栽成活的P5CS-F129A转基因‘索邦’各株系进行不同光周期处理,并测定其长势。在不作补充光照的情况下,转基因株系L89、L31与普通‘索邦’对照组之间在移栽初期存在较明显的长势差异,两个转基因株系长势均优于对照组,双拷贝转基因株系L31长势优于单拷贝株系L89;在移栽后50 d及其后,三者间无显著性差异,对照组长势仅略弱于转基因株系;双拷贝株系L31从移栽后140 d开始长势趋弱,至移栽后200 d时与对照组基本接近,而单拷贝株系L89则在生长后期长势较强,移栽后200 d时长势显著优于前二者(图 4A)。

      图  4  P5CS-F129A转基因‘索邦’各株系移栽后长势

      Figure 4.  Growth of P5CS-F129A transgenic 'Sorbonne' lines after transplanting

      在补光条件下,各株系的长势均明显优于对照组,说明补光对于所有株系而言均有帮助作用;双拷贝转基因株系L31的长势几乎全程显著强于单拷贝株系L89和普通‘索邦’对照组;单拷贝株系L89的长势在补光下则与对照组无显著性差异,仅在移栽后200 d时趋强,达到与株系L31相近的水平,此时长势明显优于对照组(图 4B)。

    • 将‘索邦’P5CS-F129A各转基因株系及对照组施以干旱胁迫,期间其叶片相对电导率及土壤水势如图 5所示。由图 5可知:在停止灌水期间,土壤水势由0 MPa开始持续走低,而‘索邦’叶片相对电导率则逐步升高,相较之下,对照组普通‘索邦’叶片相对电导率上升幅度更大,于9 d后开始大幅提升,并在21 d达到最高值。转基因株系L89和L31升高幅度较小,其中又以双拷贝株系L31峰值较低,且出现较晚;二者在胁迫前期并无明显差异,但随着胁迫时间持续,L89相对电导率幅度高于L31。重新灌水后,土壤水势再度回复至高位,转基因株系L89和L31的叶片相对电导率逐步下降至胁迫开始时的正常水平,而对照组的叶片相对电导率虽然亦有降低,但仍高于胁迫开始时水平。

      图  5  干旱胁迫下P5CS-F129A转基因‘索邦’叶片相对电导率及土壤水势

      Figure 5.  Relative leaf conductivity of P5CS-F129A transgenic 'Sorbonne' and soil water potential under drought stress

      对干旱胁迫期间的叶片游离脯氨酸含量加以测定,结果如图 6所示。由图 6可知:‘索邦’各株系在干旱下脯氨酸含量均有明显升高,而在灌水恢复后开始逐渐下降。其中,以双拷贝株系L31的叶片脯氨酸水平最高,在试验全程均高于株系L89;对照组普通‘索邦’的脯氨酸含量自试验开始时(即非胁迫状态下)便低于两个P5CS-F129A转基因株系,干旱胁迫期间的含量最高值亦显著低于后者。

      图  6  干旱胁迫下P5CS-F129A转基因‘索邦’叶片游离脯氨酸含量

      Figure 6.  Free proline content in leaves of P5CS-F129A transgenic 'Sorbonne' under drought stress

      干旱胁迫处理过程中,同时观察比较胁迫组和未经胁迫的‘索邦’各株系之间的长势差异,未经胁迫的‘索邦’各转基因株系均生长良好,而经过胁迫并复水的株系L89和L31叶片先端均出现轻微黄化,显示其生长仍受到干旱胁迫的影响,但总体长势良好,两株系之间长势则无显著差异;相比之下,作为对照组的普通‘索邦’在无胁迫条件下同样生长良好,而受到胁迫后叶片黄化严重,即使在试验后期恢复浇水,状况仍无显著改善,说明干旱胁迫对其生长造成了严重影响。由此可见,与对照组的普通‘索邦’相比,P5CS-F129A转基因株系L89和L31具有更强的耐旱性(图 7)。

      图  7  干旱胁迫后P5CS-F129A转基因‘索邦’长势

      Figure 7.  Growth of P5CS-F129A transgenic 'Sorbonne' after drought stress

    • 外源基因的遗传稳定性直接影响转基因植物的推广和应用。无性繁殖阶段,外源基因进入受体细胞后,经过愈伤组织诱导、不定芽和不定根的分化生成以及后续的田间栽培等过程,其遗传稳定性都有可能受到影响。另外有报道显示,植物中的外源基因可能会由各种宿主防卫响应引发的转录水平沉默(Transcriptional gene silencing)或转录后水平沉默(Post transcriptional gene silencing)而沉默或失活,这可能在转基因后立即发生,也可能会经过一段时间或不同世代后才发生[20]。此外,不少研究显示转基因植物的目的性状会受到外界条件影响,环境胁迫可能会诱导转基因失活[21-22]。外源基因的大小、整合位点、重复序列、拷贝数、甲基化、共抑制和反式失活等均可能影响外源基因的遗传稳定性,因此转化后外源基因的稳定性研究尤为重要。但是,也有研究表明外源基因在转基因植物中具有一定的稳定性。郝曜山等[23]将双价抗虫基因BmkIT-Chitinase分别导入不同基因型玉米系中,对其连续4代进行跟踪检测,结果证明其抗虫基因在转基因玉米中逐代稳定遗传,T1~T4代均产生显著抗虫性。本试验结果也表明,经过4年继代培养的两个转基因株系中的VaP5CS基因遗传稳定,且具有更强的抗旱性。

      很多研究表明P5CS转基因能够提高受体植物体内的脯氨酸含量和相关抗逆性,而P5CS的反馈调节在控制植物脯氨酸水平上扮演着重要的角色。徐春波[24]通过对转入P5CS-F129A基因的阳性冰草(Agropyron gaertn)植株和阴性植株进行研究和比较发现,转基因植株的脯氨酸含量明显高于阴性植株。Zhu[25]等同时将野生型P5CS基因和突变型P5CS(P5CS-F129A)基因转入烟草,发现后者脯氨酸含量是前者的两倍多。Dibax等[26]成功得到P5CS-F129A的转基因桉树(Eucalyptus saligna),之后检测其叶片及根部的脯氨酸含量提高了4倍。本研究的干旱胁迫试验中,两个转基因株系叶片内脯氨酸含量均大于普通‘索邦’,而双拷贝株系L31的叶片脯氨酸含量高于单拷贝株系L89,这可能说明P5CS-F129A在植物基因组的拷贝数与其抗旱耐盐性存在一定正相关关系。不过,这可能是由于外源P5CS-F129A在转基因百合中均由组成型强启动子驱动,加之所使用P5CS-F129A已去除反馈抑制[9],因此增加的P5CS-F129A拷贝数作用仍然较为有限,两个株系在干旱胁迫下表型性状并未出现明显差异。另外,植物体内脯氨酸积累是否会对其正常生长产生影响,这一点至今仍存在争议[27]。同时,也有研究表明,脯氨酸的积累量与植株的抗逆性提高不一定存在正相关关系,可能是由于脯氨酸代谢的改变导致了植株体内其他的变化,从而导致了植株抗逆性的改变[28-29]。因此,有必要对转P5CS-F129A基因植株做进一步的研究,探讨外源P5CS基因调控植物抗逆的生理生化机理,同时探讨转基因植株体内目的基因的拷贝数与其表达量和表型性状的关系,并研究其与生长发育和营养器官生成的联系,进而为培育出高效、实用、抗逆性强的转基因植物品种奠定基础。

      本研究在温室生长观测过程中,单拷贝株系L89成活率高于双拷贝株系L31,推测是因为基因拷贝数不同,表达量的差异影响了植株的成活率,这一点还需进一步研究。对于植物而言,由培养基移栽进入基质同样可视为渗透胁迫,因此植物体内适当的高水平脯氨酸可能有助于提高其成活率,所以两个转基因株系的成活率均高于对照组植株。由于移栽时正值冬季,光照时数较少,各株系长势在短期内差异不大;如果加以补光,转基因株系L31则能显示出一定优势,可能是由于基质环境存在轻微渗透胁迫作用,因此P5CS-F129A转基因‘索邦’在脯氨酸积累量提高的同时,其生长并未产生负面效应,甚至有一定促进作用。而两个转基因株系长势的差异,可能是由于拷贝数不同进而导致目的基因表达量不同造成的,但其具体原因还需要进一步的研究。另外,目前P5CS转基因植株后代抗逆性研究未进入大田应用阶段,还没有真正培育出符合实际生产要求的高品质转基因百合品种,这些均有待于进一步研究。

    • 经过多年组织培养和容器移栽试验,P5CS-F129A转基因‘索邦’单拷贝转化株系L89和双拷贝株系L31的外来基因在基因组插入稳定,抗逆基因P5CS-F129A表达正常。P5CS-F129A转基因‘索邦’在脯氨酸积累量提高的同时,其生长并未产生负面效应,甚至在某些情况下有一定促进作用。在土壤干旱胁迫下,P5CS-F129A转基因株系L89和L31在脯氨酸含量、相对电导率和外观性状等方面与对照组的普通‘索邦’相比,均显示出更强的耐旱性,对进一步的研究和应用具有重要的价值。

参考文献 (29)

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