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胶孢炭疽菌侵染杨树叶片的组织病理学研究

张晓林 张俊娥 贺璞慧中 王笑连 田呈明

张晓林, 张俊娥, 贺璞慧中, 王笑连, 田呈明. 胶孢炭疽菌侵染杨树叶片的组织病理学研究[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(3): 101-109. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170385
引用本文: 张晓林, 张俊娥, 贺璞慧中, 王笑连, 田呈明. 胶孢炭疽菌侵染杨树叶片的组织病理学研究[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(3): 101-109. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170385
Zhang Xiaolin, Zhang Jun'e, He PuHuizhong, Wang Xiaolian, Tian Chengming. Histopathology study of poplar leaves infected by Colletotrichum gloeosporioides[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(3): 101-109. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170385
Citation: Zhang Xiaolin, Zhang Jun'e, He PuHuizhong, Wang Xiaolian, Tian Chengming. Histopathology study of poplar leaves infected by Colletotrichum gloeosporioides[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(3): 101-109. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170385

胶孢炭疽菌侵染杨树叶片的组织病理学研究

doi: 10.13332/j.1000-1522.20170385
基金项目: 

北京市支持中央高校共建项目 2050205

国家自然科学基金项目 31470647

详细信息
    作者简介:

    张晓林。主要研究方向:林木病理学。Email: 1312215724@ qq.com地址: 100083北京市海淀区清华东路35号北京林业大学林学院

    通讯作者:

    田呈明,教授,博士生导师。主要研究方向:林木病理学。Email: chengmt@bjfu.edu.cn 地址:同上

  • 中图分类号: S763.15

Histopathology study of poplar leaves infected by Colletotrichum gloeosporioides

  • 摘要: 目的明确胶孢炭疽菌在杨树叶片上的侵染过程,为进一步从分子水平研究该菌的致病机制和杨树抗病分子育种奠定基础。方法用绿色荧光蛋白标记的胶孢炭疽菌菌株BH12-2的分生孢子悬浮液接种健康杨树叶片,采用光学显微镜和电子显微镜观察病原菌的侵染过程和杨树叶片的防卫反应。结果接种4h后,孢子开始萌发产生芽管;8h时芽管顶端形成附着胞;12h时成熟的附着胞中央形成侵染钉;24h时,孢子另一端萌发形成芽管和附着胞;48h后芽管不断分枝异化成菌丝并产生次级分生孢子;接种3d时,附着胞基部的侵染钉穿透寄主角质层和表皮细胞壁膨大形成侵染泡囊,侵染泡囊初始生长在寄主细胞壁和细胞膜之间,不穿透寄主的原生质体,随后产生初生菌丝和次生菌丝的分化;接种4~5d后,次生菌丝在寄主表皮和叶肉组织内大量扩展;第6d时,菌丝聚集在角质层下形成子座组织,并产生分生孢子梗和分生孢子。随着菌丝的扩展,叶片组织发生一系列的病理变化,在侵入点周围的叶肉细胞壁附近产生胼胝质,细胞壁向内凹陷并发生溶解,细胞质消解,叶绿体等细胞器解体以及寄主细胞坏死塌陷,最终在叶表面产生典型的褐色坏死病斑。结论胶孢炭疽菌在侵染过程中,一个分生孢子可萌发形成多个芽管和附着胞,提高其成功侵染的几率;胶孢炭疽菌对杨树叶片的侵染类型为细胞内半活体营养侵染型。
  • 图  1  接种后不同时间叶片症状

    a~c分别为接种后3、4、5d的叶片;d~f为接种后6d的叶片。

    Figure  1.  Leaf symptoms of different time after inoculation

    a-c, disease symptoms of leaves 3 to 5 days after inoculation; d-f, disease symptoms of leaves 6 days after inoculation.

    图  2  胶孢炭疽菌在杨树叶片上的发育过程

    a、b、c~d、e、f~j、k~l分别为接种后0、4、8、12、24、48h。a.分生孢子的形态;b.分生孢子产生隔膜和芽管;c~d.一短一长的芽管和附着胞;e.附着胞中央形成侵染钉;f.分生孢子另一端产生芽管和附着胞;g.芽管开始分枝;h.芽管异化成菌丝;i.分枝后的芽管顶端形成附着胞;j.有隔膜菌丝;k.芽管分枝丰富;l.次级分生孢子。C.孢子;S.隔膜;GT.芽管;A.附着胞;IP.侵染钉;H.菌丝;SC.次级分生孢子。

    Figure  2.  Developing process of infection structures in Colletotrichum gleosporidoies on poplar leaves

    a, morphology of conidia; b, the conidium germinating and forming a sepate and a germ tube; c and d, the short and long germ tubes and appressorium; e, infection peg appeared in the middle of an appressorium; f, formation of a germ tube and appressorium at the other top of the germinal conidium; g, germ tube began to branch; h, germ tubes differentiated into hyphae; i, formation of appressorium at the top of branched germ tubes; j, septal hyphae; k, abundant branches of germ tubes; l, secondary conidia. C, conidium; S, septate; GT, germ tube; A, appressorium; IP, infection peg; H, hyphae; SC, secondary conidia.

    图  3  胶孢炭疽菌在杨树叶片上的侵入情况

    a.附着胞—侵染钉侵入,附着胞周围分泌胞外基质(箭头处);b.芽管从气孔侵入;c.菌丝从气孔侵入;d.菌丝越过气孔上方。GT.芽管;H.菌丝;S.气孔。

    Figure  3.  Infection model of the pathogen on the poplar leaves

    a, pathogen penetrating with infection peg and extracellular matrix around the appressorium (arrow); b, penetration with germ tube from stomata; c, penetration with hyphae from stomata; d, mycelium passed over the stomata. GT, germ tube; H, hyphae; S, stomata.

    图  4  病原菌侵入和扩展过程的透射电镜观察

    a.附着胞结构;b.附着胞—侵染钉直接穿透角质层和表皮细胞壁;c.附着胞—侵染钉从细胞间隙侵入;d.侵染泡囊分化成初生菌丝向相邻表皮细胞扩展;e.初生菌丝分化成次生菌丝向相邻叶肉细胞扩展;f.次生菌丝从胞内向胞间扩展;g.次生菌丝从胞间向胞内扩展;h.次生菌丝靠近顶端处产生隔膜,顶端变窄,细胞壁变厚;i.次生菌丝穿透寄主细胞壁时,菌丝收缩。A.附着胞;1.附着胞外层壁;2.附着胞内层壁;ECM.附着胞胞外基质;CL.围领;CO.附着胞锥;PP.穿透孔;IP.侵染钉;IV.侵染泡囊;C.角质层;CW.细胞壁;CM.细胞膜;EC.表皮细胞;MC.叶肉细胞;IH.侵染菌丝;PH.初生菌丝;SH.次生菌丝。

    Figure  4.  Transmission electron micrographs of the pathogen penetration and development progress

    a, ultrastructure of appressorium; b, appressorium with infection peg penetrated cuticle and epidermal cell mall; c, appressorium with infection peg penetrated from intercellular spaces; d, infection vesicle produced primary hyphae; e, primary hyphae developed into secondary hyphae invading adjacent mesophyll cell; f, secondary hyphae extended from intracellular to intercellular; g, secondary hyphae extended from intercellular to intracellular; h, secondary hypha produced septum near its top and top cell wall thickened; i, the secondary hypha constricted as it passed through cell wall. A, appressorium; 1, outer wall layer of the appressorium; 2, inner wall layer of the appressorium; ECM, extracellular matrix; CL, collar; CO, cone; PP, penetration pore; IP, infection peg; IV, infection vesicle; C, cuticle; CW, cell mall; CM, cell membranes; EC, epidermal cell; MC, mesophyll cell; IH, infection hypha; PH, primary hypha; SH, secondary hypha.

    图  5  分生孢子盘的形成

    a.菌丝在维管组织内扩展;b.菌丝在栅栏组织和海绵组织内扩展;c.菌丝聚集在表皮细胞周围;d.次生菌丝在叶肉细胞内和细胞间扩展;e.分生孢子梗和分生孢子;f.分生孢子盘。SH.次生菌丝;Co.分生孢子梗;C.分生孢子;S.隔膜。

    Figure  5.  Formation of acervulus

    a, mycelium expanded in vascular tissue; b, mycelium expanded in palisade and spongy tissues; c, mycelium accumulated around the epidermal cells; d, secondary hyphae extended in intracellular and intercellular; e, conidiophore and conidium; f, acervulus; SH, secondary hypha; Co, conidiophore; C, conidium; S, septum.

    图  6  寄主的细胞学变化

    a.角质层结构完整;b.表皮细胞质膜瓦解;c.侵入点周围产生胼胝质;d.被侵染的叶肉细胞;e.叶肉细胞内细胞器降解成残余碎片;f.叶绿体内嗜饿颗粒积累。C.角质层;PH.初生菌丝;SH.次生菌丝;CM.细胞膜;Ch.叶绿体;Og.嗜饿滴。

    Figure  6.  Cytological changes of the host cells infected by Colletotrichum gloeosporioides

    a, the cuticle is intact; b, plasma membrane disrupted in epidermal cell; c, callose gathered around the penetration point; d, infected mesophyll cell; e, fragments of the organelles in mesophyll cells; f, the accumulating osmiphilic globules in chloroplast. C, cuticle; PH, primary hypha; SH, secondary hypha; CM, cell membrane; Ch, chloroplasts; Og, osmiphilic globules.

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出版历程
  • 收稿日期:  2017-10-24
  • 修回日期:  2017-12-21
  • 刊出日期:  2018-03-01

胶孢炭疽菌侵染杨树叶片的组织病理学研究

doi: 10.13332/j.1000-1522.20170385
    基金项目:

    北京市支持中央高校共建项目 2050205

    国家自然科学基金项目 31470647

    作者简介:

    张晓林。主要研究方向:林木病理学。Email: 1312215724@ qq.com地址: 100083北京市海淀区清华东路35号北京林业大学林学院

    通讯作者: 田呈明,教授,博士生导师。主要研究方向:林木病理学。Email: chengmt@bjfu.edu.cn 地址:同上
  • 中图分类号: S763.15

摘要: 目的明确胶孢炭疽菌在杨树叶片上的侵染过程,为进一步从分子水平研究该菌的致病机制和杨树抗病分子育种奠定基础。方法用绿色荧光蛋白标记的胶孢炭疽菌菌株BH12-2的分生孢子悬浮液接种健康杨树叶片,采用光学显微镜和电子显微镜观察病原菌的侵染过程和杨树叶片的防卫反应。结果接种4h后,孢子开始萌发产生芽管;8h时芽管顶端形成附着胞;12h时成熟的附着胞中央形成侵染钉;24h时,孢子另一端萌发形成芽管和附着胞;48h后芽管不断分枝异化成菌丝并产生次级分生孢子;接种3d时,附着胞基部的侵染钉穿透寄主角质层和表皮细胞壁膨大形成侵染泡囊,侵染泡囊初始生长在寄主细胞壁和细胞膜之间,不穿透寄主的原生质体,随后产生初生菌丝和次生菌丝的分化;接种4~5d后,次生菌丝在寄主表皮和叶肉组织内大量扩展;第6d时,菌丝聚集在角质层下形成子座组织,并产生分生孢子梗和分生孢子。随着菌丝的扩展,叶片组织发生一系列的病理变化,在侵入点周围的叶肉细胞壁附近产生胼胝质,细胞壁向内凹陷并发生溶解,细胞质消解,叶绿体等细胞器解体以及寄主细胞坏死塌陷,最终在叶表面产生典型的褐色坏死病斑。结论胶孢炭疽菌在侵染过程中,一个分生孢子可萌发形成多个芽管和附着胞,提高其成功侵染的几率;胶孢炭疽菌对杨树叶片的侵染类型为细胞内半活体营养侵染型。

English Abstract

张晓林, 张俊娥, 贺璞慧中, 王笑连, 田呈明. 胶孢炭疽菌侵染杨树叶片的组织病理学研究[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(3): 101-109. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170385
引用本文: 张晓林, 张俊娥, 贺璞慧中, 王笑连, 田呈明. 胶孢炭疽菌侵染杨树叶片的组织病理学研究[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(3): 101-109. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170385
Zhang Xiaolin, Zhang Jun'e, He PuHuizhong, Wang Xiaolian, Tian Chengming. Histopathology study of poplar leaves infected by Colletotrichum gloeosporioides[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(3): 101-109. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170385
Citation: Zhang Xiaolin, Zhang Jun'e, He PuHuizhong, Wang Xiaolian, Tian Chengming. Histopathology study of poplar leaves infected by Colletotrichum gloeosporioides[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(3): 101-109. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170385
  • 由胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的杨树炭疽病是杨树(Populus spp.)的重要病害之一[1-2]。病原菌主要侵染枝、叶,导致杨树叶片枯死,悬于枝梢,俗称“黑叶病”。目前,该病广泛分布于北京、河南、陕西、宁夏等地区,以毛白杨(Populus tomentosa)和北京杨(Populus ×beijingensis)受害严重,近年来在各地发病呈上升趋势[3],威胁着杨树林的健康和生产安全,严重影响了杨树生态效益和经济效益的发挥。

    胶孢炭疽菌是炭疽菌属中寄主范围最广、危害最为严重的一种病原菌,其可以侵染板栗(Castanea mollissima)、核桃(Juglans regia)、芒果(Mangifera indica)、橡胶(Hevea brasiliensis)、南方红豆杉(Taxus chinensis var. mairei)等经济林树种,番木瓜(Carica papaya)、番石榴(Psidium guajava)、草莓(Fragaria×ananassa)、辣椒(Capsicum annuum)等瓜果和蔬菜及麦冬(Ophiopogon japonicus)、柱花草(Stylosanthes guianensias)等多种栽培植物[4-7]。根据侵染寄主及部位的不同,胶孢炭疽菌的侵染策略也不相同,包括细胞内半活体营养侵染型和角质层内部营侵染型或者兼有两种侵染类型[8]。在细胞内半活体营养侵染型中,病原菌侵入后形成球形的侵染泡囊。随后,侵染泡囊分化形成菌丝,定殖到其他寄主细胞中[9]。菌丝初始营活体寄生,寄主并不产生症状,但在随后的死体阶段,菌丝导致寄主细胞瓦解并产生病斑[10]。角质层下内部营养侵染型中,病原菌侵入后形成侵染菌丝生长在角质层下和表皮细胞周围的细胞壁中,从而导致寄主细胞壁瓦解[11]。不同的侵染类型涉及不同的侵染过程和侵染机制。关于杨树炭疽病的研究,国内外学者对病原菌种类确定、生物学特性、群体遗传分析、相关基因表达调控、杀菌剂筛选等方面进行了大量报道[12-16], 而关于该病原菌与寄主互作的组织病理学研究至今尚属空白,制约了病原菌与杨树互作的分子机制研究,也影响了对该病的有效控制。因此,本研究采用光学显微镜、扫描和透射电镜技术系统研究了胶孢炭疽菌在杨树叶片上的侵染过程及超微结构特征,明确胶孢炭疽菌对杨树叶片的侵染类型,为进一步研究杨树炭疽病菌的致病机理、寄主植物的抗病机理以及寄主与病原菌互作机制提供理论基础,对于有效挖掘杨树抗病种质资源和杨树炭疽病的可持续控制具有重要的科学和实际意义。

    • 供试杨树为感病品种北京杨,采自北京林业大学校园。

    • 供试菌种为绿色荧光蛋白标记的胶孢炭疽菌菌株BH12-2,由北京林业大学森林病理学实验室提供。

    • 用打孔器打取PDA平板上生长5~7d、直径为5mm的胶孢炭疽菌菌碟,接入水琼脂平板,25℃黑暗培养5d后产生大量分生孢子,用无菌水冲洗培养基表面,使分生孢子能够充分的散落于水中,4层纱布过滤,取滤液,用血球计数板将分生孢子悬浮液的含量调整到1.0×106个/mL备用。

    • 采集北京杨1年生的插条,在温室进行盆栽。待生长8~9周后,选取5~7日龄(初展开叶为0日龄),且生长状态基本一致的健康叶片,带叶柄剪下。用自来水冲洗干净,置于75%酒精30s,NaClO 3min后用无菌水冲洗3次,放置于灭菌的滤纸中晾干,作为接种叶片待用。在备好的灭菌后的托盘里铺上用无菌水润湿的灭菌滤纸。杨树叶片平铺在滤纸上,每叶片的叶柄需包裹沾有无菌水的棉花保湿。取制备好的孢子悬浮液,滴于叶片表面,每片叶片接种6~8滴悬液(10μL孢子悬浮液),同时以接种无菌水的健康叶片作为对照。接种后用保鲜膜将托盘封口放置于25℃恒温培养箱中黑暗保湿培养。

    • 分别于接种后4h、8h、12h、24h、48h、3d、4d、5d、6d取样,将样品切成约0.5cm×0.5cm的小片,样品的脱色和透明按修改的张敬泽等[17]的方法处理,然后利用Leica DM2500显微镜进行显微观察和拍照。

    • 分别于接种后12、24、48h取样,并将叶片切成0.5cm×0.5cm的小块,参照姚娟妮等[18]介绍的方法加工处理样品,进行样品制备,在日立S-450型扫描电镜下观察和拍照。

    • 分别于接种后3、4、5、6、7d取样,并将叶片切成(0.1~0.3)cm×0.5cm的小块,样品制备参照姚娟妮等[18]的方法,在日立HT7700透射电镜下进行观察和拍照。

    • 分别于接种后24h、48h、3d、4d、5d、6d、7d使用无菌刀片取样,大小为(0.2~0.3)cm×0.5cm,将样品放入OCT包埋剂中冷冻包埋,用KD-2900冷冻切片机进行冷冻切片,切片厚度为10μm。用小毛笔将完整的切片拉开后快速放在用明胶处理过的载玻片上,在切片上滴1滴清水,放于室温下自然晾干,待切片牢固地黏附在玻片上时,将玻片分别置于10μg/mL PI荧光染料中避光染色5min,用10×磷酸缓冲盐溶液(pH7.4)冲洗3次,每次2min,用40%甘油制片,在Leica DM2500显微镜绿色激发光下观察和拍照。

    • 接种3d,接种部位开始退绿,产生肉眼可见褐色病斑(图 1a)。接种4d,叶片病斑颜色加深(图 1b)。接种5d,病斑开始向周围扩展(图 1c)。接种6d,在接种部位周围产生肉眼可见的白色绒毛状菌丝(图 1d),病斑中央产生黑色子实体(图 1e1f)。

      图  1  接种后不同时间叶片症状

      Figure 1.  Leaf symptoms of different time after inoculation

    • 通过光学显微镜观察发现,胶孢炭疽菌的分生孢子长4.3~13.2μm,宽2.6~3.8μm,呈圆柱形和长椭圆形(图 2a)。在适宜的条件下,接种4h后孢子开始萌发,中央产生隔膜,使分生孢子由单细胞变成双细胞,同时在顶端产生芽管(图 2b)。接种8h后,芽管顶端膨大形成椭圆形的附着胞,此时芽管长度变化很大且不分枝(图 2cd)。附着胞多在寄主表皮细胞间隙或接近间隙处产生,此时附着胞颜色呈淡黄色,尚未黑化,胞质稀疏。接种12h后,附着胞壁逐渐黑色素化,胞质稠密,在中央部位形成一个边缘黑色的圆形亮点,即侵染钉(图 2e)。接种24h后,分生孢子的另一细胞也可萌发产生芽管和附着胞(图 2f)。同时芽管产生分枝(图 2g),伸长形成有隔膜的菌丝,分枝的芽管顶端也可形成附着胞(图 2h~j)。接种48h后,菌丝在寄主叶表面纵横扩展,随机分枝,逐步形成网状分布(图 2k),部分菌丝顶端产生次级分生孢子(图 2l)。

      图  2  胶孢炭疽菌在杨树叶片上的发育过程

      Figure 2.  Developing process of infection structures in Colletotrichum gleosporidoies on poplar leaves

    • 观察发现,胶孢炭疽菌可利用两种方式侵入寄主。一种是以附着胞—侵染钉的形式直接穿透寄主角质层侵入寄主。此时附着胞呈现明显的塌陷,周围分泌有大量胞外基质(图 3a)。另一种方式为孢子萌发的芽管或菌丝从气孔侵入(图 3bc),但部分菌丝越过气孔蔓延生长(图 3d),未观察到菌丝不形成附着胞从叶片表面直接侵入的现象。

      图  3  胶孢炭疽菌在杨树叶片上的侵入情况

      Figure 3.  Infection model of the pathogen on the poplar leaves

    • 接种48h后,通过透射电镜观察侵染结构发现,附着胞直径5~7μm,胞壁由2层独立结构组成,外层壁较薄,内壁层稍厚。附着胞被胞外黏性基质包围,使附着胞紧密地附着在寄主角质上。在附着胞基部,附着胞内层壁向内部延伸形成围领结构,在围领结构之间形成漏斗形的附着胞锥。(图 4a)。接种3d后,附着胞锥通过基部穿透孔连接侵染钉细胞壁,直接穿透寄主角质层和表皮细胞壁侵入或者沿着细胞间隙侵入,表明病原菌在3d内即可完成侵入过程。侵染钉穿透寄主细胞壁后顶端膨大形成不规则的侵染泡囊,侵染泡囊生长在细胞壁和原生质膜之间,不穿透寄主原生质体(图 4b)。侵染钉在沿着细胞间隙侵入时,分化成直径1.5~2μm的侵染菌丝,向相邻表皮细胞侵入时膨大形成类似球形的侵染泡囊(图 4c)。伴随寄主细胞膜的瓦解,侵染泡囊产生分隔并分化,形成直径2.5~4μm初生菌丝(图 4d)。初生菌丝向相邻的表皮细胞或叶肉细胞扩展时,分化成直径1~2μm的次生菌丝(图 4e)。接种4d后,次生菌丝开始由胞内向胞外扩展,也可以由胞外扩展进入胞内,并产生分枝(图 4f4g),次生菌丝在向相邻叶肉细胞内侵入时,靠近顶端部产生隔膜,顶端变窄,菌丝壁变厚(图 4h)。穿透寄主细胞壁时,菌丝明显收缩(图 4i)。

      图  4  病原菌侵入和扩展过程的透射电镜观察

      Figure 4.  Transmission electron micrographs of the pathogen penetration and development progress

      接种5d后,在荧光显微镜下观察到,菌丝在寄主维管束组织、栅栏组织和海绵组织中不断生长繁殖(图 5ab)。接种6d后,菌丝扩展至整个组织,表皮细胞周围聚集大量菌丝体(图 5c)。在透射电镜下显示叶肉细胞内和细胞间布满了次生菌丝(图 5d),大量短而粗大菌丝形成子座组织聚集在角质层下,其间还夹杂着寄主表皮组织的残体。分生孢子梗柱形,有分隔,其上面产生长椭圆形分生孢子(图 5e),在光学显微镜下观察到分生孢子盘内部聚集大量分生孢子梗和分生孢子(5f)。

      图  5  分生孢子盘的形成

      Figure 5.  Formation of acervulus

    • 接种3d后,初生菌丝侵入到角质层下,角质层结构完整,表皮细胞壁明显向内凹陷并部分发生溶解,内部细胞器基本消解(6a)。次生菌丝侵入到表皮细胞后,表皮细胞质膜被降解成碎片,围绕在表皮细胞内壁周围(图 6b)。当次生菌丝从一个细胞扩展到相邻细胞时,寄主在侵入点周围产生大量胼胝质(6c)。接种5d后,被次生菌丝侵染的叶肉细胞,细胞器已基本全部消解,仅保留叶绿体唯一细胞器(图 6d),菌丝周围充满了细胞器降解成的残余碎片(图 6e),叶绿体双层膜破裂、基粒片层瓦解、嗜饿滴大量积累,并出现了许多颗粒状物。

      图  6  寄主的细胞学变化

      Figure 6.  Cytological changes of the host cells infected by Colletotrichum gloeosporioides

    • 胶孢炭疽菌在杨树叶片上的发育及侵入过程虽然与其他炭疽菌在其他寄主上的侵染过程非常相似,但也存在许多差异。一方面,引起杨树炭疽病的胶孢炭疽菌的孢子在萌发形成芽管前总会产生隔膜进行双胞化,双胞化后的2个细胞萌发产生芽管和附着胞,且有些孢子可产生多个芽管分枝和附着胞。这分别与C. gloeosporioides侵染番石榴果实和C. dematium侵染豇豆(Vigna unguiculata)茎干的过程相似[19-20]。但炭疽菌在侵染番石榴和豇豆的过程中却很少产生多个芽管和附着胞,而芽管和附着胞数量的增多可以提高其成功侵染的几率,这种现象的产生可能与病原菌的致病力强弱有关[21]。另一方面,部分芽管顶端也可形成与原分生孢子相同的次级分生孢子,但是却没有发现次级分生孢子萌发形成芽管和附着胞的现象,它的产生可能由于病原菌缺乏营养以抑制菌丝生长[22-23]。炭疽菌分生孢子侵染途径有两种,一是通过自然孔口(气孔、皮孔)或伤口入侵;另一种是必须依赖于病原菌独特的侵染结构—附着胞的直接侵入[24]。本研究中,胶孢炭疽菌侵入包括以上两种方式,也可见芽管越过气孔上方并未侵入而是向较远的气孔伸展,这可能与芽管对不同气孔的识别有关[25]。胶孢炭疽菌萌发过程特异性及侵入途径的多样性,一方面反映了该菌具有很强的寄生及适应能力,另一方面也反映了该菌侵入机制的复杂性[26]

    • 胶孢炭疽菌对杨树叶片的侵染发病进程要比已有报道发病更迟,持续更长时间。炭疽菌的分生孢子萌发时间从3~48h不等,侵染锦葵草叶片、苜蓿叶片48h后产生初生菌丝[27-28],侵染柿树枝条90h后形成分生孢子盘和分生孢子,完成一个侵染循环。而本研究中接种72h产生初生菌丝,接种第6天才观察到成熟的分生孢子盘、分生孢子梗和分生孢子。侵染发病进程的差异受寄主植物的抗病性、病原菌致病性等很多因素影响,也与接种菌量和培养条件(如温度、湿度和光照强度等)、接种方式和接种点器官结构等有关[29]

      除了侵染时间不同之外,初始侵染现象和之前许多报道相似但也有不同之处。在一些炭疽菌种中,如C. sublineolumC. destrctivumC. graminicola[30-34], 有一层增厚的物质围绕基部穿透孔沉积在原先形成的壁上形成孔环,使小孔与寄主表面紧密接触,造成密闭状态。而在本研究中,围绕基部穿透孔在内壁层上形成一个漏斗形附着胞锥[35-38], 这种侵染结构的差异可能反映了炭疽菌不同的穿透机制。侵染钉穿透寄主角质层和表皮细胞后,膨大形成侵染泡囊。侵染泡囊初始生长在寄主细胞壁和细胞膜之间,随后产生分隔并分化形成初生菌丝,初生菌丝向相邻的表皮细胞或者叶肉细胞侵入时分化成次生菌丝。次生菌丝的出现表明病原菌从活体营养转向死体营养阶段。次生菌丝在细胞间和细胞内蔓延,使得寄主植物组织发生降解,为其进一步生长发育获取营养来源,引起叶片产生典型的炭疽病褐色病斑。因此,胶孢炭疽菌对侵染杨树叶片的侵染类型为细胞内半活体营养型。在侵染后期,寄主细胞空泡化,内部细胞器基本消解,仅保留叶绿体唯一细胞器。寄主细胞的这些病理变化可能与病原菌在侵染过程中产生的细胞壁降解酶、毒素及寄主的抗病反应密切相关[39-41]

    • 本文采用微分干涉显微镜、扫描和透射电镜技术,较系统地研究了胶孢炭疽菌在杨树叶片上的侵染特征,根据观察结果可将胶孢炭疽菌侵染杨树叶片的完整过程概括为:分生孢子萌发形成芽管和附着胞,附着胞成熟后形成侵染钉,侵染钉穿透角质层和表皮细胞壁后膨大形成侵染泡囊,侵染泡囊产生分隔并分化成初生菌丝在表皮细胞内生长,在向相邻的表皮或者叶肉细胞侵入时分化成次生菌丝。次生菌丝在寄主表皮和叶肉细胞内扩展,后期大量菌丝聚集在表皮细胞内形成子座组织,产生分生孢子梗和分生孢子,确认了胶孢炭疽菌对杨树叶片的侵染类型为细胞内半活体营养侵染型,而如何从分子水平上控制病原菌的发育和侵染过程从而控制该病害的发生还有待深入研究。

参考文献 (41)

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