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外生菌根真菌Paxillus involutus吸收Cd2+及H2O2对Cd2+内流的调控作用

朱智梅 张玉红 撒刚 刘建 马旭君 邓晨 赵瑞 陈少良

朱智梅, 张玉红, 撒刚, 刘建, 马旭君, 邓晨, 赵瑞, 陈少良. 外生菌根真菌Paxillus involutus吸收Cd2+及H2O2对Cd2+内流的调控作用[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(4): 24-32. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170418
引用本文: 朱智梅, 张玉红, 撒刚, 刘建, 马旭君, 邓晨, 赵瑞, 陈少良. 外生菌根真菌Paxillus involutus吸收Cd2+及H2O2对Cd2+内流的调控作用[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(4): 24-32. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170418
Zhu Zhimei, Zhang Yuhong, Sa Gang, Liu Jian, Ma Xujun, Deng Chen, Zhao Rui, Chen Shaoliang. Uptake of Cd2+ by ectomycorrhizal fungus Paxillus involutus and the modulation of H2O2 in Cd2+ influx[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(4): 24-32. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170418
Citation: Zhu Zhimei, Zhang Yuhong, Sa Gang, Liu Jian, Ma Xujun, Deng Chen, Zhao Rui, Chen Shaoliang. Uptake of Cd2+ by ectomycorrhizal fungus Paxillus involutus and the modulation of H2O2 in Cd2+ influx[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(4): 24-32. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170418

外生菌根真菌Paxillus involutus吸收Cd2+及H2O2对Cd2+内流的调控作用

doi: 10.13332/j.1000-1522.20170418
基金项目: 

北京市自然科学基金项目 6182030

高等学校学科创新引智计划项目 111 Project

高等学校学科创新引智计划项目 B13007

国家自然科学基金项目 31770643

教育部科学技术研究(科学技术类)项目 113013A

北京市自然科学基金项目 6172024

国家自然科学基金项目 31570587

详细信息
    作者简介:

    朱智梅。主要研究方向:植物逆境生理。Email: zhimeizhu@163.com 地址: 100083北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院

    通讯作者:

    陈少良,教授,博士生导师。主要研究方向:树木抗逆生理。Email: lschen@bjfu.edu.cn 地址:同上

  • 中图分类号: S718.81; S718.43; Q935

Uptake of Cd2+ by ectomycorrhizal fungus Paxillus involutus and the modulation of H2O2 in Cd2+ influx

  • 摘要: 目的本文研究了外生菌根真菌Paxillus involutus对Cd2+的吸收作用以及H2O2对Cd2+内流的调控作用。方法Paxillus involutus的2种菌株MAJ和NAU为研究材料,利用50 μmol/L CdCl2对材料进行24 h处理,应用非损伤微测技术测定菌丝的Cd2+和Ca2+离子流。结果结果显示,Cd2+处理后,MAJ和NAU菌丝的Cd2+内流增强,同时也显著促进了Ca2+的内流。Ca2+通道抑制剂(Verapamil、GdCl3、TEA)处理后,Cd2+和Ca2+内流强度均明显减弱,表明Cd2+是通过钙通透性离子通道(CaPCs)进入菌丝细胞的。Cd2+处理促进了Cd2+和Ca2+的内流,很可能是Cd2+激活了菌丝质膜的CaPCs。Ca2+和Cd2+的竞争性实验结果显示,高浓度的Ca2+抑制菌株MAJ和NAU的Cd2+内流;反过来,测试液中Cd2+浓度的提高也明显降低了Ca2+的内流强度,这证明Ca2+和Cd2+是竞争性地通过CaPCs进入菌丝细胞的。此外还发现,H2O2(1.0 mmol/L)能增强菌丝的Cd2+和Ca2+内流,而ROS清除剂DMTU却显著抑制了菌株对Ca2+和Cd2+的吸收,表明H2O2在调控菌丝细胞CaPCs介导Cd2+内流的过程中具有重要作用。结论 综上,外生菌根真菌Paxillus involutus对Cd2+具有富集作用并且可以通过H2O2激活CaPCs促进Cd2+内流。
  • 图  1  CdCl2Paxillus involutus菌株MAJ和NAU稳态Cd2+流和Ca2+流的影响

    对菌株MAJ和NAU进行短期(ST, 24 h)CdCl2(50 μmol/L)处理,对照菌株在不含CdCl2的营养液中培养。NMT微电极沿菌丝的球状边缘记录Cd2+流变化10 min。图中每个数据点均为4~5个菌丝体的平均值,误差线为4~5独立重复的标准差,柱状图为菌株的Ca2+流和Cd2+流在不同处理下的平均值,不同字母表示各处理之间差异显著(P < 0.05)(图 2~5, 7同此)。

    Figure  1.  Effects of CdCl2 on steady Cd2+ and Ca2+ fluxes in Paxillus involutus strains MAJ and NAU

    Paxillus involutus isolates were subjected to short-term (ST, 24 hours) exposure to 50 μmol/L CdCl2, control axenic mycelia was well fertilized but treated without CdCl2. Cd2+ fluxes of Paxillus involutus isolates MAJ and NAU were measured along the surface of pelleted hyphae over a recording period of 30 min. Each point was the mean of four to five axenic EM cultures (pelleted hyphae), and bars represented the standard error of the mean. Inserted sections showed the mean flux rates and different letters indicated significant difference at P < 0.05 level between treatments (Fig. 2-5, 7 are the same as here).

    图  2  Verapamil对Paxillus involutus菌株MAJ和NAU稳态Ca2+流和Cd2+流的影响

    对菌株MAJ和NAU进行短期(24 h)CdCl2(0或50 μmol/L)处理,同时添加verapamil(0或20 μmol/L)。

    Figure  2.  Effects of verapamil on steady Ca2+ and Cd2+ fluxes in Paxillus involutus strains MAJ and NAU

    Paxillus involutus isolates MAJ and NAU were subjected to 0 or 50 μmol/L CdCl2 for 24 hours in the presence and absence of 20 μmol/L verapamil.

    图  3  GdCl3Paxillus involutus菌株MAJ和NAU稳态Ca2+流和Cd2+流的影响

    对菌株MAJ和NAU进行短期(24 h)CdCl2(0或50 μmol/L)处理,同时添加GdCl3(0或500 μmol/L)。

    Figure  3.  Effects of GdCl3 on steady Ca2+ and Cd2+ fluxes in strains MAJ and NAU

    Paxillus involutus isolates MAJ and NAU were subjected to 0 or 50 μmol/L CdCl2 for 24 hours in the presence and absence of 500 μmol/L GdCl3.

    图  4  TEA对Paxillus involutus菌株MAJ和NAU稳态Ca2+流和Cd2+流的影响

    对菌株MAJ和NAU进行短期(24 h)CdCl2(0或50 μmol/L)处理,同时添加TEA(0或50 μmol/L)。

    Figure  4.  Effects of TEA on steady Ca2+ and Cd2+ fluxes in Paxillus involutus strains MAJ and NAU

    Paxillus involutus isolates MAJ and NAU were subjected to 0 or 50 μmol/L CdCl2 for 24 hours in the presence and absence of 50 μmol/L TEA (Tetrae-thylammonium).

    图  5  不同浓度Cd2+和Ca2+Paxillus involutus菌株MAJ和NAU稳态Ca2+流或Cd2+流的影响

    对菌株MAJ和NAU进行短期(24 h)CdCl2(50 μmol/L)处理。在相应测试液中加入不同浓度CdCl2(0或50 μmol/L;Ca2+:Cd2+比例分别为4:0和4:1)或CaCl2(25、50或100 μmol/L;Ca2+:Cd2+比例分别为1:2、1:1和2:1)后进行Ca2+流和Cd2+流的测定。

    Figure  5.  Effects of external Cd2+ or Ca2+ on steady Ca2+ or Cd2+ fluxes in Paxillus involutus strains MAJ and NAU

    Paxillus involutus strains MAJ and NAU were subjected to 50 μmol/L CdCl2 for 24 hours prior to Cd2+ and Ca2+ fluxes recordings. Ca2+ and Cd2+ fluxes were measured in the presence of CdCl2 (0 or 50 μmol/L; the ratio of Ca2+:Cd2+ was 4:0 and 4:1) or CaCl2 (25, 50, or 100 μmol/L; the ratio of Ca2+:Cd2+ was 1:2, 1:1 and 2:1).

    图  6  CdCl2和H2O2Paxillus involutus菌株MAJ和NAU瞬时Cd2+流和Ca2+流的影响

    在进行CdCl2瞬时处理之前,对菌株MAJ和NAU进行10~20 min的稳态Cd2+流和Ca2+流测试。加入50 μmol/L CdCl2后,NMT微电极记录Cd2+流和Ca2+流的瞬时变化20~30 min。加入1.0 mmol/L H2O2后继续记录菌株MAJ和NAU的Cd2+流和Ca2+流瞬时变化20 min。每个数据点均是4~5个菌丝团的平均值,误差线为4~5次独立重复的标准差。

    Figure  6.  Effects of CdCl2 and H2O2 on transient kinetics of Cd2+ and Ca2+ in Paxillus involutus strains MAJ and NAU

    Prior to the CdCl2 shock, steady-state fluxes of Cd2+ and Ca2+ in Paxillus involutus strains MAJ and NAU were monitored for approximately 10-20 min. Transient kinetics of Cd2+ and Ca2+ were recorded after the required amount of 50 μmol/L CdCl2 was introduced into the measuring solution. After 20-30 min continuous recording of Cd2+ and Ca2+ fluxes, Cd2+ and Ca2+ kinetics were recorded for 20 min after 1.0 mmol/L H2O2 was introduced into the measuring solution. Each point was the mean of four to five axenic EM cultures and bars represented the standard error of the mean.

    图  7  DMTU对Paxillus involutus菌株MAJ和NAU稳态Ca2+流和Cd2+流的影响

    对菌株MAJ和NAU进行短期(24 h)CdCl2(0或50 μmol/L)处理,同时添加DMTU(0或5 mmol/L)。

    Figure  7.  Effects of DMTU on steady Ca2+ and Cd2+ fluxes in Paxillus involutus strains MAJ and NAU

    Paxillus involutus isolates MAJ and NAU were subjected to 0 or 50 μmol/L CdCl2 for 24 hours in the presence and absence of 5 mmol/L DMTU (N, N′-Dimethylthiourea).

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出版历程
  • 收稿日期:  2017-11-27
  • 修回日期:  2018-01-31
  • 刊出日期:  2018-04-01

外生菌根真菌Paxillus involutus吸收Cd2+及H2O2对Cd2+内流的调控作用

doi: 10.13332/j.1000-1522.20170418
    基金项目:

    北京市自然科学基金项目 6182030

    高等学校学科创新引智计划项目 111 Project

    高等学校学科创新引智计划项目 B13007

    国家自然科学基金项目 31770643

    教育部科学技术研究(科学技术类)项目 113013A

    北京市自然科学基金项目 6172024

    国家自然科学基金项目 31570587

    作者简介:

    朱智梅。主要研究方向:植物逆境生理。Email: zhimeizhu@163.com 地址: 100083北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院

    通讯作者: 陈少良,教授,博士生导师。主要研究方向:树木抗逆生理。Email: lschen@bjfu.edu.cn 地址:同上
  • 中图分类号: S718.81; S718.43; Q935

摘要: 目的本文研究了外生菌根真菌Paxillus involutus对Cd2+的吸收作用以及H2O2对Cd2+内流的调控作用。方法Paxillus involutus的2种菌株MAJ和NAU为研究材料,利用50 μmol/L CdCl2对材料进行24 h处理,应用非损伤微测技术测定菌丝的Cd2+和Ca2+离子流。结果结果显示,Cd2+处理后,MAJ和NAU菌丝的Cd2+内流增强,同时也显著促进了Ca2+的内流。Ca2+通道抑制剂(Verapamil、GdCl3、TEA)处理后,Cd2+和Ca2+内流强度均明显减弱,表明Cd2+是通过钙通透性离子通道(CaPCs)进入菌丝细胞的。Cd2+处理促进了Cd2+和Ca2+的内流,很可能是Cd2+激活了菌丝质膜的CaPCs。Ca2+和Cd2+的竞争性实验结果显示,高浓度的Ca2+抑制菌株MAJ和NAU的Cd2+内流;反过来,测试液中Cd2+浓度的提高也明显降低了Ca2+的内流强度,这证明Ca2+和Cd2+是竞争性地通过CaPCs进入菌丝细胞的。此外还发现,H2O2(1.0 mmol/L)能增强菌丝的Cd2+和Ca2+内流,而ROS清除剂DMTU却显著抑制了菌株对Ca2+和Cd2+的吸收,表明H2O2在调控菌丝细胞CaPCs介导Cd2+内流的过程中具有重要作用。结论 综上,外生菌根真菌Paxillus involutus对Cd2+具有富集作用并且可以通过H2O2激活CaPCs促进Cd2+内流。

English Abstract

朱智梅, 张玉红, 撒刚, 刘建, 马旭君, 邓晨, 赵瑞, 陈少良. 外生菌根真菌Paxillus involutus吸收Cd2+及H2O2对Cd2+内流的调控作用[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(4): 24-32. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170418
引用本文: 朱智梅, 张玉红, 撒刚, 刘建, 马旭君, 邓晨, 赵瑞, 陈少良. 外生菌根真菌Paxillus involutus吸收Cd2+及H2O2对Cd2+内流的调控作用[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(4): 24-32. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170418
Zhu Zhimei, Zhang Yuhong, Sa Gang, Liu Jian, Ma Xujun, Deng Chen, Zhao Rui, Chen Shaoliang. Uptake of Cd2+ by ectomycorrhizal fungus Paxillus involutus and the modulation of H2O2 in Cd2+ influx[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(4): 24-32. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170418
Citation: Zhu Zhimei, Zhang Yuhong, Sa Gang, Liu Jian, Ma Xujun, Deng Chen, Zhao Rui, Chen Shaoliang. Uptake of Cd2+ by ectomycorrhizal fungus Paxillus involutus and the modulation of H2O2 in Cd2+ influx[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(4): 24-32. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170418
  • 随着重金属在工农业生产过程中的过度使用和不合理排放,导致土壤镉(Cd2+)污染越来越严重[1]。2014年4月发布的《全国土壤污染状况调查公报》显示,我国镉超标率高达7%,居无机污染物第1位。Cd2+等重金属离子不具有任何生物学功能,还会对生物有机体产生多种毒害作用[2-4],Cd2+在人体内的积累会引起骨骼发育异常和肺癌等多种疾病[5]。近年来,我国镉中毒事件频发,对镉污染土壤的修复治理迫在眉睫。对土壤重金属污染的治理主要通过物理、化学和生物修复技术进行,其中生物修复技术因具有安全、经济、对土壤结构干扰小、不会造成二次污染等特点,受到人们的极大关注,并得到广泛应用和推广[6]。而在生物修复重金属污染方面,植物和真菌形成的菌根共生体已显示出巨大的应用潜力。因此,研究菌根真菌在菌根共生体系适应逆境胁迫中的作用机制,会进一步促进植物和微生物在生物修复中的高效利用[7]

    菌根真菌可以通过菌丝细胞外螯合、细胞壁束缚及液泡区隔化等多种方式提高宿主植物对重金属的耐受性,在缓解植物受重金属毒害方面具有重要作用[8-10]Paxillus involutus不仅能与耐镉植物灰杨(Populus tremula×P. alba)形成外生菌根提高灰杨对Cd2+的吸收和耐受能力[11],其本身也具有较强的Cd2+富集能力[2]。镉胁迫时,可将Cd2+束缚在菌丝细胞壁、细胞质或区隔在液泡中[12-15]Paxillus involutus菌丝经Cd2+(0.05 mmol/L)处理30 min后,菌丝细胞中积累的Cd2+多集中在细胞壁(50%)、细胞质(30%)以及液泡(20%)中,并且随着处理时间的延长,Cd2+基本平均分布在上述菌丝细胞的部位[12]。对Cd2+处理的Paxillus involutus菌丝进行X射线微量分析发现,Paxillus involutus菌丝细胞的液泡中有大量的Cd2+富集。但目前还不清楚Paxillus involutus是如何富集Cd2+的,Cd2+的吸收和跨膜机制亟待研究。

    已有研究表明,植物细胞质膜(Plasma Membrane, PM)上高亲和性的二价阳离子转运体,如Cu2+、Co2+、Fe2+、Ca2+、Mn2+及Zn2+转运体,参与了植物对Cd2+的吸收[16-21]。此外,电生理学的研究发现,Cd2+能够通过质膜Ca2+通透性离子通道(Ca2+ permeable channels, CaPCs)进入植物根细胞[22]。全细胞膜片钳技术证实,拟南芥(Arabidopsis thaliana)保卫细胞的质膜Ca2+离子通道具有Cd2+透性,Cd2+能够通过保卫细胞的质膜Ca2+通道进入拟南芥体内[22-24]。碱蓬(Suaeda salsa)、胡杨(Populus euphratica)及灰杨细胞的Cd2+内流均可被Ca2+通道的抑制剂LaCl3和Verapamil有效抑制,表明环境中的部分Cd2+是通过CaPCs进入植物细胞的[25-27]。但Paxillus involutus菌丝中的CaPCs是否也介导Cd2+内流,还有待研究。

    H2O2能激活胡杨细胞的质膜CaPCs,促进Ca2+内流[28]。此外,在Cd2+胁迫时,H2O2对胡杨细胞的Cd2+内流也具有明显的促进作用,并且该现象可被LaCl3显著抑制[20, 27]。施加H2O2清除剂CAT(Catalase)后,胡杨细胞对Cd2+的吸收显著减弱[20]。Cd2+胁迫诱导胡杨愈伤细胞[20, 27]和灰杨根[21, 29]产生H2O2,促进CaPCs介导的Cd2+内流[30]。那么Cd2+胁迫诱导菌丝产生的H2O2是否也参与调控菌丝的Cd2+内流,值得深入研究。

    本文以Paxillus involutus的2种菌株MAJ和NAU为实验材料,利用50 μmol/L CdCl2进行24 h胁迫处理,使用非损伤微测技术(Non-invasive Micro-test Technique, NMT)来检测Paxillus involutus中的Cd2+流和Ca2+流的变化,并利用3种Ca2+通道抑制剂来验证Cd2+内流是否受CaPCs介导。在此基础上,通过设定不同的Ca2+:Cd2+比例来验证Cd2+和Ca2+通过CaPCs进入菌丝细胞的过程是否存在竞争性。此外,为了探究H2O2是否参与了CaPCs介导的Cd2+内流,本文还检测了外源H2O2和ROS清除剂对菌丝MAJ和NAU的Cd2+和Ca2+流的影响。

    • 本研究所使用的菌根真菌Paxillus involutus来自德国哥廷根大学森林植物与树木生理实验室。使用改良的MMN(Modified Melin Norkrans)培养基进行Paxillus involutus固体培养,MMN培养基成分如下(g/L):KH2PO4 0.5,(NH2)2SO4 0.25,MgSO4·7H2O 0.15,CaCl2·2H2O 0.05,NaCl 0.025,FeCl3·6H2O 0.01,维生素B1 0.000 1,葡萄糖10.0,麦芽提取物3.0,pH 5.2[31-32],培养基置于直径为90 mm的一次性培养皿中。选取长势良好的菌盘,在无菌环境下切成1.0 cm×1.0 cm大小的菌块,将有菌面置于MMN固体培养基上,用Paraflim将培养皿密封。在恒温23 ℃的人工气候箱中进行暗培养,24 h后倒置培养。待菌根真菌Paxillus involutus长势良好时,参照Li等[32]的方法进行液体菌的培养。将菌株MAJ和NAU切成细小的菌块,放入装有MMN培养液(pH 4.8,不加琼脂)的100 mL三角瓶中,置于150 r/min、23 ℃的恒温摇床上进行暗培养,2周后生长形成紧凑的球状菌丝体,选长势一致的菌丝体进行实验处理。

    • 选取长势一致的菌丝体置于含有0或50 μmol/L CdCl2的MMN培养液中,150 r/min、23 ℃进行24 h预处理。

    • 在0或50 μmol/L CdCl2存在条件下,分别向MMN培养液中添加0或20 μmol/L Verapamil、0或500 μmol/L GdCl3、0或50 μmol/L TEA (Tetraethyla-mmonium)对菌丝进行24 h预处理后,检测MAJ和NAU菌丝的Cd2+和Ca2+流变化。

    • 使用50 μmol/L CdCl2对MAJ和NAU菌丝进行24 h预处理后,将Cd2+测试液中的Ca2+:Cd2+比例分别调至1:2、1:1和2:1,测定菌丝MAJ和NAU的Cd2+流变化;将Ca2+测试液中的Ca2+:Cd2+比例分别调整至4:0和4:1,测定MAJ和NAU的Ca2+流变化。

    • 用50 μmol/L CdCl2分别对菌株MAJ和NAU进行瞬时处理后,测定菌丝的Cd2+和Ca2+流变化;在此基础上,向测试液中加入1.0 mmol/L H2O2,继续测定菌丝的Cd2+和Ca2+流变化。此外,对菌株MAJ和NAU进行CdCl2(0或50 μmol/L)短期(24 h)处理的同时添加0或5 mmol/L DMTU(N, N′-Dimethylthiourea)。测定Cd2+流和Ca2+流变化。

    • 使用非损伤微测技术(NMT系统:BIO-001A, Youger USA Sci.&Tech. Corp., USA)测定菌丝表面Cd2+、Ca2+流变化情况。具体测试方法参照Zhang等[30]的方法。

    • 使用旭月(中国北京)科技公司JCal V3.3.2 Excel表格对测试所得的离子流数据进行分析。使用SPSS 17.0对实验数据进行方差分析,本文均使用P < 0.05表示差异显著。

    • 图 1显示,CdCl2(50 μmol/L)处理24 h后,菌丝MAJ和NAU均表现出显著的Cd2+内流,其中菌丝MAJ的Cd2+流速约为18~21 pmol/(cm2·s),菌丝NAU为12~17 pmol/(cm2·s)。在Ca2+流方面,镉胁迫时,2种菌丝的Ca2+内流强度也比对照显著增强,其中MAJ由120提高到200 pmol/(cm2·s),NAU由120提升至260 pmol/(cm2·s),2种菌丝在CdCl2处理下菌丝的Ca2+内流增高0.8~1.2倍。

      图  1  CdCl2Paxillus involutus菌株MAJ和NAU稳态Cd2+流和Ca2+流的影响

      Figure 1.  Effects of CdCl2 on steady Cd2+ and Ca2+ fluxes in Paxillus involutus strains MAJ and NAU

      图  2  Verapamil对Paxillus involutus菌株MAJ和NAU稳态Ca2+流和Cd2+流的影响

      Figure 2.  Effects of verapamil on steady Ca2+ and Cd2+ fluxes in Paxillus involutus strains MAJ and NAU

      图  3  GdCl3Paxillus involutus菌株MAJ和NAU稳态Ca2+流和Cd2+流的影响

      Figure 3.  Effects of GdCl3 on steady Ca2+ and Cd2+ fluxes in strains MAJ and NAU

      图  4  TEA对Paxillus involutus菌株MAJ和NAU稳态Ca2+流和Cd2+流的影响

      Figure 4.  Effects of TEA on steady Ca2+ and Cd2+ fluxes in Paxillus involutus strains MAJ and NAU

      图  5  不同浓度Cd2+和Ca2+Paxillus involutus菌株MAJ和NAU稳态Ca2+流或Cd2+流的影响

      Figure 5.  Effects of external Cd2+ or Ca2+ on steady Ca2+ or Cd2+ fluxes in Paxillus involutus strains MAJ and NAU

      图  6  CdCl2和H2O2Paxillus involutus菌株MAJ和NAU瞬时Cd2+流和Ca2+流的影响

      Figure 6.  Effects of CdCl2 and H2O2 on transient kinetics of Cd2+ and Ca2+ in Paxillus involutus strains MAJ and NAU

      图  7  DMTU对Paxillus involutus菌株MAJ和NAU稳态Ca2+流和Cd2+流的影响

      Figure 7.  Effects of DMTU on steady Ca2+ and Cd2+ fluxes in Paxillus involutus strains MAJ and NAU

    • 为了探讨Cd2+是否经由质膜Ca2+通道进入菌丝,本文检测了3种Ca2+通道抑制剂对Ca2+和Cd2+离子流的影响。结果显示,无论Cd2+存在与否,质膜Ca2+通道抑制剂Verapamil均能够显著抑制菌株MAJ和NAU的Ca2+内流,并且对二者的抑制程度相近(图 2)。Cd2+离子流的结果显示:Verapamil也显著抑制了菌株MAJ和NAU的Cd2+内流,并且对菌株MAJ的抑制作用更强,使其由内流转变为外流(图 2)。GdCl3与Verapamil类似,其对菌株MAJ和NAU的Ca2+和Cd2+内流也具有明显的抑制作用,并且GdCl3对菌株MAJ中Ca2+流和Cd2+流的抑制作用强于菌株NAU(图 3)。Ca2+通道抑制剂TEA(也是K+通道抑制剂)显著抑制了菌株MAJ和NAU的Ca2+和Cd2+内流,并且对2种菌株的抑制强度相似(图 4)。

    • 为了证明Ca2+和Cd2+离子竞争性地进入菌丝,本文检测了不同浓度的Ca2+对Cd2+流的影响。如图 5所示,不同离子浓度的Ca2+会显著影响菌株MAJ和NAU的Cd2+内流。与高Cd2+(Ca2+:Cd2+=1:2)测试液相比,高Ca2+处理(Ca2+:Cd2+=2:1时)菌株MAJ和NAU的Cd2+内流均减弱,降幅高达65.8%(MAJ)和58.8%(NAU)。同样,Cd2+也会显著影响菌株MAJ和NAU的Ca2+内流。当测试液中的Ca2+:Cd2+比例由4:0调整至4:1时,菌株MAJ和NAU的Ca2+内流也分别下降25.5%(MAJ)和40.6%(NAU)。以上这些结果表明,菌株MAJ和NAU对Cd2+和Ca2+的吸收是由质膜上的Ca2+通透性离子通道(CaPCs)所介导,并产生竞争性抑制。

    • 菌丝侵染杨树根系会促进H2O2的产生[31]。前期的研究表明,H2O2能够促进拟南芥保卫细胞Ca2+离子通道对Ca2+的吸收[33]。由于Cd2+能通过质膜上的Ca2+通透性离子通道进入菌丝,本文研究了H2O2是否影响菌丝CaPCs对Cd2+的吸收。对菌株MAJ和NAU进行CdCl2(50 μmol/L)瞬时处理后,2种菌株的Cd2+和Ca2+内流均增强,随着处理时间的延长,Cd2+流和Ca2+流强度均逐渐减弱并趋于平稳。在CdCl2处理之后进行H2O2(1.0 mmol/L)处理,菌丝MAJ和NAU的Cd2+和Ca2+的瞬时内流均有表现出不同程度的增强,表明H2O2能够促进菌丝CaPCs对Cd2+和Ca2+的吸收(图 6)。

    • 使用ROS清除剂DMTU进一步验证了H2O2对CaPCs的调控作用(图 7)。对菌丝进行DMTU处理24 h,可显著抑制菌株MAJ和NAU的Ca2+和Cd2+内流,并且DMTU对菌株NAU中Ca2+流的抑制作用相对更强。而对于Cd2+内流,DMTU对菌株MAJ的抑制作用更为显著。以上实验结果表明,H2O2参与调控了菌丝CaPCs对Ca2+和Cd2+的吸收过程(图 7)。

    • 在Cd2+胁迫下,菌株MAJ和NAU均表现出较强的Cd2+内流,并且菌株MAJ对Cd2+的富集能力强于NAU(图 1)。与此同时,CdCl2处理菌丝的Ca2+内流强度也显著增加(图 1),表明菌丝富集Cd2+的同时其对Ca2+吸收也有所增强,这可能是Cd2+胁迫激活了菌丝的质膜CaPCs,在增强Ca2+内流的同时,也促使Cd2+通过CaPCs进入了菌丝细胞。这一推论得到抑制剂和竞争性实验结果的支持。

      (1) Ca2+通道抑制剂。3种Ca2+通道抑制剂(Verapamil、GdCl3和TEA)均能显著抑制菌株MAJ和NAU的Ca2+和Cd2+内流(图 2~4),表明Ca2+和Cd2+是同时通过CaPCs进入菌丝细胞的。但3种Ca2+通道抑制剂均不能将菌株MAJ和NAU的Cd2+内流完全抑制(图 2~4),表明菌丝细胞的质膜上可能还存在其他具有Cd2+透性的离子通道或转运体,允许Cd2+通过,进入菌丝细胞。

      (2) 竞争性抑制。Cd2+与Ca2+如果同时通过质膜上的CaPCs进入菌丝细胞,二者进入菌丝细胞的过程应存在竞争性。调整测试液中Ca2+:Cd2+的比例后,发现当测试液中的Cd2+浓度升高时,菌株MAJ和NAU的Ca2+内流均减弱(图 5)。与之相应,提高测试液中的Ca2+比例时,2种菌丝的Cd2+内流强度也随之下降(图 5)。以上研究结果表明,Cd2+与Ca2+通过CaPCs进入菌丝细胞的过程存在竞争性,从而进一步证明Cd2+是通过质膜上的CaPCs进入菌丝体内的。

      进一步的研究发现,H2O2能调控菌丝质膜CaPCs介导的Cd2+内流。CdCl2瞬时处理后,菌株MAJ和NAU的Cd2+和Ca2+内流均瞬时增强,并且随着处理时间的延长,Cd2+流和Ca2+流强度逐渐减弱后趋于平稳。而H2O2的加入使Cd2+和Ca2+内流均表现出不同程度的增强(图 6),表明H2O2可能参与调控了菌丝对Cd2+和Ca2+的吸收过程。通过施加ROS清除剂DMTU去除Cd胁迫诱导产生的H2O2,发现菌株MAJ和NAU中的Ca2+和Cd2+内流均受到明显抑制(图 7),从而进一步表明H2O2在调控菌丝质膜CaPCs介导Cd2+内流的过程中具有重要作用。

      综上所述,镉胁迫时,Cd2+和Ca2+可竞争性地通过质膜CaPCs进入菌株MAJ和NAU细胞体内,而H2O2调控这一过程,即H2O2促进了菌丝对Cd2+和Ca2+的吸收。但菌丝在镉胁迫时Cd2+内流及调控机制可能存在其他途径,这有待进一步深入研究。

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