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基于Cas9/gRNA创制毛果杨COBRA3基因突变体

崔永耀 程玉祥

崔永耀, 程玉祥. 基于Cas9/gRNA创制毛果杨COBRA3基因突变体[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(4): 10-15. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170421
引用本文: 崔永耀, 程玉祥. 基于Cas9/gRNA创制毛果杨COBRA3基因突变体[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(4): 10-15. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170421
Cui Yongyao, Cheng Yuxiang. Cas9/gRNA-mediated COBRA3 gene mutation in Populus trichocarpa[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(4): 10-15. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170421
Citation: Cui Yongyao, Cheng Yuxiang. Cas9/gRNA-mediated COBRA3 gene mutation in Populus trichocarpa[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(4): 10-15. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170421

基于Cas9/gRNA创制毛果杨COBRA3基因突变体

doi: 10.13332/j.1000-1522.20170421
基金项目: 

国家自然科学基金项目 31770637

国家自然科学基金项目 31570580

详细信息
    作者简介:

    崔永耀。主要研究方向:林木遗传育种。Email:1102799243@qq.com 地址:150040黑龙江省哈尔滨市香坊区和兴路26号东北林业大学林学院

    通讯作者:

    程玉祥, 教授, 博士生导师。主要研究方向:杨树分子遗传学。Email:chengyuxiang@nefu.edu.cn 地址:同上

  • 中图分类号: S718.46; S792.119

Cas9/gRNA-mediated COBRA3 gene mutation in Populus trichocarpa

  • 摘要: 目的COBRA对植物生长发育具有重要作用,已有的研究表明,植物COBRA基因与其次生生长有关。为探究树木COBRA基因信息及部分基因功能,我们对毛果杨PtrCOBRA基因家族展开识别和分析性研究。方法分析PtrCOBRA家族成员关系时运用系统进化树,确定毛果杨PtrCOBRA家族基因的各组织转录表达时采用半定量RT-PCR,创制PtrCOBRA3基因突变体时使用Cas9/gRNA基因编辑策略,毛果杨遗传转化采用农杆菌介导组培幼苗茎段浸染法。结果我们识别毛果杨基因组上存在14个PtrCOBRA基因成员,进化树显示PtrCOBRA家族分成两个分支。半定量RT-PCR表明,PtrCOBRA3和PtrCOBRA11在毛果杨木质部高丰度、特异地转录表达,在木质化茎节中其转录水平也较高。基于Cas9/gRNA技术我们敲除了毛果杨PtrCOBRA3,获得4株ptrcobra3敲除突变体。ptrcobra3突变体植株表型:植株矮小,叶片细长且卷曲,茎干略有弯曲。结论PtrCOBRA3和PtrCOBRA11是PtrCOBRA家族中与毛果杨次生生长相关的主要成员;基因敲除遗传证据显示PtrCOBRA3基因参与毛果杨茎干次生生长,PtrCOBRA11与它存在功能的冗余。
  • 图  1  COBRA基因家族进化关系及基因结构图

    A. COBRA基因家族进化树;B. COBRA基因结构图。

    Figure  1.  Phylogenetic relationships and gene structure in the COBRA gene family

    A, phylogenetic tree of COBRA gene family; B, COBRA gene structures.

    图  2  PtrCOBRA3和PtrCOBRA11在不同组织内的转录表达分析

    Xy为木质部;Ph为韧皮部;Rt为根;Ap为顶芽;Pe为叶柄;YL为幼叶;ML为老叶;IN1~10为第1~10茎节;cyc.循环;A. PtrCOBRA3和PtrCOBRA11在不同组织内的表达特征;B. PtrCOBRA3和PtrCOBRA11在不同木质化程度茎节内的表达。

    Figure  2.  Analysis of PtrCOBRA3 and PtrCOBRA11gene expression in Populus trichocarpa tissues

    Xy, xylem; Ph, phloem; Rt, root; Ap, apical bud; Pe, petiole; YL, young leaf; ML, mature leaf; IN1-10, inode1-10; cyc, cycles; A, expression of PtrCOBRA3 and PtrCOBRA11 in different tissues; B, expression of PtrCOBRA3 and PtrCOBRA11 in different lignified stems.

    图  3  pHSE401-PtrCOBRA3(gRNA)表达载体构建

    M.标记DNA;a、b.两个目标片段;A.目标片段电泳检测结果;B. pHSE401-PtrCOBRA3农杆菌菌液PCR鉴定;C. Cas9/gRNA基因编辑示意图。

    Figure  3.  Construction of pHSE401-PtrCOBRA3(gRNA)expression vector

    M, DNA mark; a and b mean two target fragments; A, electrophoresis result of target fragment; B, PCR identification of pHSE401-PtrCOBRA3; C, gene editing of Cas9/gRNA.

    图  4  pHSE401-PtrCOBRA3(gRNA)遗传转化及转基因植株鉴定

    A. pHSE401-PtrCOBRA3(gRNA)载体遗传转化,Bars=3 cm;B.转基因植株鉴定。

    Figure  4.  Transformation of pHSE401-PtrCOBRA3(gRNA) and identification of the transgenic plants

    A, transformation of pHSE401-PtrCOBRA3(gRNA), Bars=3 cm; B, identification of the transgenic plants.

    图  5  转基因植株PtrCOBRA3基因编辑分析

    A. PtrCOBRA3基因靶位点位置; B.转基因植株PtrCOBRA3基因编辑情况; C.编辑后PtrCOBRA3编码推测氨基酸。

    Figure  5.  Analysis of PtrCOBRA3 gene editing in transgenic Populus trichocarpa

    A, the target site of PtrCOBRA3; B, PtrCOBRA3 gene editing in transgenic Populus trichocarpa; C, amino acids are concluded from the edited PtrCOBRA3.

    图  6  毛果杨ptrcobra3突变体表型分析

    WT为野生型;cobra3为突变体;Bars=5 cm;A.野生型与突变体植株比较;B.野生型与突变体叶形比较;C.野生型与突变体不同茎节长度比较。

    Figure  6.  Phenotypic analysis of ptrcobra3 mutants

    WT, wide type; cobra3 is mutant; Bars=5 cm; A, comparison of WT and cobra3 mutant; B, comparison of leaf between WT and cobra3 mutant; C, comparison of inode length between WT and cobra3 mutant.

    表  1  所用引物及序列

    Table  1.   Primer sequences used in this study

    基因名称
    Gene name
    引物用途
    Primer use
    引物序列(5′~3′)
    Primer sequence(5′~3′)
    PtrCOBRA3 半定量RT-PCR
    Semi-quantitative RT-PCR
    GCTCTCTTCTGCAATGCACACAC;GCCCTGCTTCCATTAATACGTCATT
    PtrCOBRA11 半定量RT-PCR
    Semi-quantitative RT-PCR
    CAGGATCCTACAGCTTCAGTCTC;GCACAGGTTGGGCAAGGAGTGAT
    PtrCOBRA3 靶位点gRNA-Ⅰ DT1-BsF:ATATATGGTCTCGATTGTCCATCAATGGTGCTCAAGGTT
    (C3A) DT1-F0:TGTCCATCAATGGTGCTCAAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
    Target site gRNA-Ⅰ DT2-R0:AACTCAGCTGCTGTCTCTCAATCAATCTCTTAGTCGACTCTAC
    (C3A) DT2-BsR:ATTATTGGTCTCTAAACTCAGCTGCTGTCTCTCAATC
    靶位点gRNA-Ⅱ DT1-BsF:ATATATGGTCTCGATTGCTCCTTTCAACCAGCAATTGTT
    (C3B) DT1-F0:TGCTCCTTTCAACCAGCAATTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
    Target site gRNA-Ⅱ DT2-R0:AACAAGAGCTTCACCTTGTTAGCAATCTCTTAGTCGACTCTAC
    (C3B) DT2-BsR:ATTATTGGTCTCTAAACAAGAGCTTCACCTTGTTAGC
    PtrCOBRA3 位点编辑鉴定
    Identifying editing site
    GGGATATTATGTCTTGGACGACAG;GAAAGAGATACACAGCAACTTGGG
    zCas 转基因鉴定
    Transgenic identification
    TGAGAACATCGTCATTGAGATGG;TCAGCTTGTCATTCTCATCGTAC
    PtrActin2 内参基因
    Reference gene
    AACATGGGATTGTTAGCAACTGG;TCCATCACCAGAATCCAGCACA
    下载: 导出CSV

    表  2  毛果杨COBRA基因

    Table  2.   COBRA genes in Populus trichocarpa

    基因名称
    Gene name
    基因座位
    Gene locus
    氨基酸数目
    Amino acid
    信号肽
    Signal peptide
    PtrCOBRA1 Potri.001G419000 664 1-31
    PtrCOBRA2 Potri.004G117100 453 1-33
    PtrCOBRA3 Potri.004G117200 433 1-21
    PtrCOBRA4 Potri.004G167100 454 1-24
    PtrCOBRA5 Potri.004G219200 431 1-23
    PtrCOBRA6 Potri.010G001100 650 1-22
    PtrCOBRA7 Potri.011G135200 647
    PtrCOBRA8 Potri.012G062200 384
    PtrCOBRA9 Potri.014G125300 640 1-22
    PtrCOBRA10 Potri.015G060000 457 1-36
    PtrCOBRA11 Potri.015G060100 404
    PtrCOBRA12 Potri.015G060200 439 1-25
    PtrCOBRA13 Potri.017G098600 412 1-25
    PtrCOBRA14 Potri.017G098700 414 1-25
    下载: 导出CSV
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出版历程
  • 收稿日期:  2017-11-27
  • 修回日期:  2018-01-15
  • 刊出日期:  2018-04-01

基于Cas9/gRNA创制毛果杨COBRA3基因突变体

doi: 10.13332/j.1000-1522.20170421
    基金项目:

    国家自然科学基金项目 31770637

    国家自然科学基金项目 31570580

    作者简介:

    崔永耀。主要研究方向:林木遗传育种。Email:1102799243@qq.com 地址:150040黑龙江省哈尔滨市香坊区和兴路26号东北林业大学林学院

    通讯作者: 程玉祥, 教授, 博士生导师。主要研究方向:杨树分子遗传学。Email:chengyuxiang@nefu.edu.cn 地址:同上
  • 中图分类号: S718.46; S792.119

摘要: 目的COBRA对植物生长发育具有重要作用,已有的研究表明,植物COBRA基因与其次生生长有关。为探究树木COBRA基因信息及部分基因功能,我们对毛果杨PtrCOBRA基因家族展开识别和分析性研究。方法分析PtrCOBRA家族成员关系时运用系统进化树,确定毛果杨PtrCOBRA家族基因的各组织转录表达时采用半定量RT-PCR,创制PtrCOBRA3基因突变体时使用Cas9/gRNA基因编辑策略,毛果杨遗传转化采用农杆菌介导组培幼苗茎段浸染法。结果我们识别毛果杨基因组上存在14个PtrCOBRA基因成员,进化树显示PtrCOBRA家族分成两个分支。半定量RT-PCR表明,PtrCOBRA3和PtrCOBRA11在毛果杨木质部高丰度、特异地转录表达,在木质化茎节中其转录水平也较高。基于Cas9/gRNA技术我们敲除了毛果杨PtrCOBRA3,获得4株ptrcobra3敲除突变体。ptrcobra3突变体植株表型:植株矮小,叶片细长且卷曲,茎干略有弯曲。结论PtrCOBRA3和PtrCOBRA11是PtrCOBRA家族中与毛果杨次生生长相关的主要成员;基因敲除遗传证据显示PtrCOBRA3基因参与毛果杨茎干次生生长,PtrCOBRA11与它存在功能的冗余。

English Abstract

崔永耀, 程玉祥. 基于Cas9/gRNA创制毛果杨COBRA3基因突变体[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(4): 10-15. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170421
引用本文: 崔永耀, 程玉祥. 基于Cas9/gRNA创制毛果杨COBRA3基因突变体[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(4): 10-15. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170421
Cui Yongyao, Cheng Yuxiang. Cas9/gRNA-mediated COBRA3 gene mutation in Populus trichocarpa[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(4): 10-15. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170421
Citation: Cui Yongyao, Cheng Yuxiang. Cas9/gRNA-mediated COBRA3 gene mutation in Populus trichocarpa[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(4): 10-15. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170421
  • COBRA编码一种植物特有的GPI锚定蛋白,含有N端信号肽、碳水化合物结合域、中心富含半胱氨酸结构域以及疏水C端结构[1]COBRA是一个多基因家族,在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)和棉花(Gossypium raimondii)分别存在12、11、9和19个成员[1-4]。现有研究报道:AtCOBL4参与次生细胞壁纤维素合成[5-6]AtCOBL9与根毛发育有关[7-8];而水稻和玉米COBL基因突变,导致植物组织机械强度和次生细胞壁合成的改变[3, 9-10]。然而,在次生组织特别发达的树木中,COBRA基因信息和功能还未见报道。

    毛果杨(Populus trichocarpa)作为首个基因组测序树种[11],完善的基因组信息为功能基因组学研究提供便利。然而,树木异交,遗传杂合度高等特点导致功能基因突变体制备非常困难,制约了树木基因功能的研究。Cas9/gRNA基因编辑技术的出现[12],使得这种窘境有望被改变。该技术体系包括gRNA和Cas9蛋白两个部分[13],在拟南芥、水稻和玉米等植物上已被成功应用[14-16]。最近的一个研究报道,在毛白杨(Populus tomentosa)上尝试了Cas9/gRNA技术[17],然而这个技术在基因组信息已公开的毛果杨中尚未见报道。

    在本研究中我们识别毛果杨PtrCOBRA基因家族,分析PtrCOBRA基因组织转录表达水平。基于Cas9/gRNA技术对PtrCOBRA3基因进行定点编辑,获得4株PtrCOBRA3基因敲除突变体材料,并进一步分析了ptrcobra3的表型。

    • 取温室栽培4个月(株高约1.5 m)的毛果杨幼树第1~10茎节、木质部、韧皮部、幼叶、老叶、叶柄、顶芽和根组织,用于基因转录表达分析。1个月的毛果杨组培幼苗材料用于转基因实验。

    • 用拟南芥COBRA家族成员氨基酸序列,在毛果杨基因组数据库Phytozome 12.0中进行同源性检索,去除重复基因后对所有潜在的PtrCOBRA进行COBRA结构域(PF04833)分析[18]。用MEGA[19]软件构建进化树,用Gene Structure Display Server 2.0绘制基因结构示意图。

    • 采用pBIOZOL Reagent(Bioflux公司)提取植物总RNA,用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA eraser(Takara公司)合成cDNA,采用植物基因组DNA一步法(Bioteke公司)快速提取植物基因组DNA。

    • PtrActin2内参基因对各组织总cDNA定量后,进行PtrCOBRA3和PtrCOBRA11基因半定量RT-PCR。PCR扩增反应,反应体系20 μL,退火温度60 ℃,延伸时间30 s,DNA聚合酶用EX Taq (TaKaRa公司)。

    • 用KOD-plus(Toyobo公司)扩增PtrCOBRA3靶位点gRNA片段, 片段从胶内回收后, 在核酸内切酶BsaI和高浓度T4DNA连接酶作用下,连接到pHSE401植物基因编辑载体[20]。连接产物转化DH5α大肠杆菌,Kana抗性筛选得到含pHSE401-gRNA质粒菌液,DNA测序确认的重组质粒转入GV3101农杆菌,用于毛果杨遗传转化实验。

    • 取30 d左右生长良好的组培幼苗作为被转化受体,采用农杆菌介导法进行毛果杨转基因[21]。取转基因植株少量叶片,提取基因组DNA作模板,分别以DT1-F0/ DT2-R0和zCas基因引物进行PCR扩增,鉴定是否转入gRNA和Cas9基因。

    • 取转基因植株基因组DNA作模板,以PtrCOBRA3基因引物,进行覆盖靶位点片段的PCR扩增。片段从胶内回收后连接到pMD18-T载体,连接产物转化DH5α,氨苄抗性筛选获得的阳性菌液进行插入DNA的测序。测序结果对比野生型的,统计靶基因位点编辑情况。

    • 所用引物及序列详见表 1

      表 1  所用引物及序列

      Table 1.  Primer sequences used in this study

      基因名称
      Gene name
      引物用途
      Primer use
      引物序列(5′~3′)
      Primer sequence(5′~3′)
      PtrCOBRA3 半定量RT-PCR
      Semi-quantitative RT-PCR
      GCTCTCTTCTGCAATGCACACAC;GCCCTGCTTCCATTAATACGTCATT
      PtrCOBRA11 半定量RT-PCR
      Semi-quantitative RT-PCR
      CAGGATCCTACAGCTTCAGTCTC;GCACAGGTTGGGCAAGGAGTGAT
      PtrCOBRA3 靶位点gRNA-Ⅰ DT1-BsF:ATATATGGTCTCGATTGTCCATCAATGGTGCTCAAGGTT
      (C3A) DT1-F0:TGTCCATCAATGGTGCTCAAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
      Target site gRNA-Ⅰ DT2-R0:AACTCAGCTGCTGTCTCTCAATCAATCTCTTAGTCGACTCTAC
      (C3A) DT2-BsR:ATTATTGGTCTCTAAACTCAGCTGCTGTCTCTCAATC
      靶位点gRNA-Ⅱ DT1-BsF:ATATATGGTCTCGATTGCTCCTTTCAACCAGCAATTGTT
      (C3B) DT1-F0:TGCTCCTTTCAACCAGCAATTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
      Target site gRNA-Ⅱ DT2-R0:AACAAGAGCTTCACCTTGTTAGCAATCTCTTAGTCGACTCTAC
      (C3B) DT2-BsR:ATTATTGGTCTCTAAACAAGAGCTTCACCTTGTTAGC
      PtrCOBRA3 位点编辑鉴定
      Identifying editing site
      GGGATATTATGTCTTGGACGACAG;GAAAGAGATACACAGCAACTTGGG
      zCas 转基因鉴定
      Transgenic identification
      TGAGAACATCGTCATTGAGATGG;TCAGCTTGTCATTCTCATCGTAC
      PtrActin2 内参基因
      Reference gene
      AACATGGGATTGTTAGCAACTGG;TCCATCACCAGAATCCAGCACA
    • 经生物信息学分析,我们从毛果杨基因组上共识别了14个PtrCOBRA基因(表 2),这些成员均含有碳水化合物结合域、中心富含半胱氨酸和疏水C端的COBRA蛋白基本特征。为了解毛果杨各成员之间的亲源关系,构建了系统发育进化树(图 1A)。进化树显示毛果杨COBRA基因家族被分为两个亚支,该分类与其基因结构特征是一致的(图 1B),第二亚支的成员基因只含有单个内含子。

      表 2  毛果杨COBRA基因

      Table 2.  COBRA genes in Populus trichocarpa

      基因名称
      Gene name
      基因座位
      Gene locus
      氨基酸数目
      Amino acid
      信号肽
      Signal peptide
      PtrCOBRA1 Potri.001G419000 664 1-31
      PtrCOBRA2 Potri.004G117100 453 1-33
      PtrCOBRA3 Potri.004G117200 433 1-21
      PtrCOBRA4 Potri.004G167100 454 1-24
      PtrCOBRA5 Potri.004G219200 431 1-23
      PtrCOBRA6 Potri.010G001100 650 1-22
      PtrCOBRA7 Potri.011G135200 647
      PtrCOBRA8 Potri.012G062200 384
      PtrCOBRA9 Potri.014G125300 640 1-22
      PtrCOBRA10 Potri.015G060000 457 1-36
      PtrCOBRA11 Potri.015G060100 404
      PtrCOBRA12 Potri.015G060200 439 1-25
      PtrCOBRA13 Potri.017G098600 412 1-25
      PtrCOBRA14 Potri.017G098700 414 1-25

      图  1  COBRA基因家族进化关系及基因结构图

      Figure 1.  Phylogenetic relationships and gene structure in the COBRA gene family

    • 半定量RT-PCR显示,PtrCOBRA3和PtrCOBRA11在毛果杨木质部高丰度转录表达,在韧皮部内转录水平很低,在其他组织几乎检测不到转录表达(图 2A);在第1~10节逐渐木质化的茎节中,PtrCOBRA3和PtrCOBRA11转录表达逐渐升高,且转录水平较高(图 2B)。这表明PtrCOBRA3和PtrCOBRA11在木质化组织内高丰度表达,暗示这两个基因很可能与茎次生细胞壁形成相关。

      图  2  PtrCOBRA3和PtrCOBRA11在不同组织内的转录表达分析

      Figure 2.  Analysis of PtrCOBRA3 and PtrCOBRA11gene expression in Populus trichocarpa tissues

    • PCR扩增出PtrCOBRA3靶位点的2个gRNA-Ⅰ和Ⅱ片段(图 3A),经琼脂糖凝胶电泳、DNA回收后,BsaI酶切后连接到pHSE401载体(Cas9/gRNA载体,图 3C)。连接产物转化、抗性筛选并结合DNA测序,选出含2个gRNA目标片段阳性克隆。提取目标菌株的质粒,将之转化GV3101农杆菌,菌液PCR均扩增出目的条带(图 3B),表明pHSE401-PtrCOBRA3(gRNA)转入到农杆菌,该工程菌用于毛果杨转基因实验。

      图  3  pHSE401-PtrCOBRA3(gRNA)表达载体构建

      Figure 3.  Construction of pHSE401-PtrCOBRA3(gRNA)expression vector

    • 经过毛果杨转化、选择培养、抗性芽分化和生根(图 4A),实验得到4棵抗性转化植株。对这4株进行基因组DNAPCR扩增,结果表明zCas基因、gRNA-Ⅰ或Ⅱ基因转入到毛果杨野生型(图 4B)。对这4株转基因植株体内PtrCOBRA3基因靶位点测序,并与野生型(图 5A)的比对,靶位点碱基编辑情况如图 5B所示。除了C3A-3#转基因植株,其他3株体内PtrCOBRA3基因编辑均是等位编辑,编辑产生的碱基缺失或插入导致了PtrCOBRA3基因终止子提前产生(图 5C),进而形成了PtrCOBRA3功能敲除的突变体。

      图  4  pHSE401-PtrCOBRA3(gRNA)遗传转化及转基因植株鉴定

      Figure 4.  Transformation of pHSE401-PtrCOBRA3(gRNA) and identification of the transgenic plants

      图  5  转基因植株PtrCOBRA3基因编辑分析

      Figure 5.  Analysis of PtrCOBRA3 gene editing in transgenic Populus trichocarpa

    • 选取生长一致的ptrcobra3突变体和野生型组培幼苗,栽种到温室中,随着生长时间推移,突变体比野生型植株稍矮,茎干略有弯曲(图 6A)。ptrcobra3突变体叶片较窄且稍向下卷曲,呈细长状态(图 6B)。此外,突变体主茎茎节长度较野生型稍短(图 6C),主茎较野生型的稍细,发育的茎节数目与同期野生型的无显著差异。这些结果表明,敲除PtrCOBRA3基因影响了毛果杨生长发育。

      图  6  毛果杨ptrcobra3突变体表型分析

      Figure 6.  Phenotypic analysis of ptrcobra3 mutants

    • 本研究识别毛果杨COBRA基因家族存在14个成员(表 2),与拟南芥、水稻、玉米COBRA家族[2-4]相比,成员数量无明显差异。进化分析表明毛果杨COBRA家族成员被分为2个分支(图 1A),与拟南芥COBRA分类[2]相同。此外,毛果杨COBRA家族基因的结构特征也支持了这种分类(图 1B)。然而,第1分支成员(10个)占到进化树的三分之二,推测这个聚类的COBRA可能与毛果杨某种生长过程相关。

      我们的实验确定PtrCOBRA3和PtrCOBRA11在毛果杨次生生长发达的茎节、木质部高丰度表达(图 2)。文献报道柳树(Salix spp.)SxCOBL4基因在木质部也高丰度、特异表达[22],这表明该类成员参与木材的生长和发育。此外,PtrCOBRA3和PtrCOBRA11组织转录表达模式类似,且在进化树上二者处在同一分支内,这些信息预示PtrCOBRA3和PtrCOBRA11基因功能存在冗余。

      基于Cas9/gRNA技术,我们实现了对模式树种毛果杨PtrCOBRA3基因编辑(图 5),编辑后该基因终止子被提前,从而产生该基因被敲除。我们的研究证明,用Cas9/gRNA技术制备毛果杨基因敲除突变体是切实可行的,并且还是高效率的。这使得林木功能基因突变体匮乏的窘境有望被改变,也使林木重要基因功能的鉴定变得简单、快速。

      ptrcobra3突变体稍矮、主茎稍细等特征,表明PtrCOBRA3参与茎的次生生长。然而,它具体的作用方式还需要对ptrcobra3茎木材形态学的扫描电镜观察,以及细胞壁组分变化的分析来阐明。另外,ptrcobra3突变体缺陷表型并不十分严重,推测可能是与PtrCOBRA11能补充PtrCOBRA3敲除相关。接下来,我们将创制杨树PtrCOBRA3/11基因双突变体,进一步确定它们在木材生长中的作用。

参考文献 (22)

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