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湿地生态系统作为陆地生态系统和水生生态系统之间的过渡地带，具有保持物种多样性、控制物质能量交换、净化水质等多重生态服务功能[1]。作为湿地土壤生态系统重要组成部分的土壤微生物，是土壤中最活跃的部分，与土壤结构、通气性、水分和养分状况等有密切关系[2]。特别对湿地生态系统中物质转化与能量流动起着重要作用，制约着湿地类型的分异和演替[3]。
高原湿地是世界上独特的湿地类型，占我国湿地总面积的50%左右，具有典型的闭合半闭合地理环境特征，生物多样性丰富，功能显著，具有无可替代的环境、生态及社会作用[4]。随着社会经济发展，人口不断增长及农牧活动增加，大部分高原湿地的面积、植被和土壤水分条件均发生了明显变化[5]。高原上最主要的湿地类型沼泽湿地面积锐减，草甸和耕地面积增加，土壤环境改变，进而影响整个湿地生态系统的结构和功能[6]。湿地退化演替进程中不同阶段土壤微生物群落结构有何特征？其与土壤理化因子有何关系？阐明这些问题对深入理解高原湿地生态系统的物质和能量循环具有重要意义。真菌作为重要的土壤微生物，对土壤系统的物质循环及能量流动起着至关重要的作用，并直接或间接地影响着土壤一系列的生物化学过程[7]，土壤理化性质的改变会对土壤真菌产生影响[8-9]。目前对纳帕海高原湿地土壤真菌的研究仅见于采用传统方法[10-11]，而以分子生物学技术对不同退化阶段土壤真菌群落结构的研究鲜见报道。
选择横断山区典型退化高原湿地纳帕海为研究对象，以沼泽湿地为参照，采用Illumina高通量测序技术，探究湿地退化演替进程中不同退化阶段(沼泽化草甸、草甸和垦后湿地)土壤真菌群落结构多样性特征，探讨土壤真菌群落结构对湿地退化的响应规律，以期为高原湿地的保护与恢复提供数据及理论支持。
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位于青藏高原东南缘横断山区香格里拉县境内的纳帕海湿地(图 1)是区域较具代表性的退化湿地，地理坐标27°49′~27°55′N，99°37′~99°43′E，海拔3260m，为石灰岩上发育而成的喀斯特型季节性高原湖泊湿地，动植物种类丰富，生物多样性高[4]。该湿地地处青藏高原与亚热带季风气候区和中南半岛热带季风区的结合部，具有高寒、积温低、霜期长、降水量少、干湿季节分明以及冬春季干旱突出等特点，年均温5.4℃，最冷月平均温度-3.8℃，最热月平均温度13.2℃[25]。湿地水量补给主要依靠降水，年均降水量619.9mm，其中雨季495.92mm(5—10月)，约占全年的80%，干季123.98mm(11月至次年4月)，约占全年的20%。土壤类型主要为沼泽土、沼泽化草甸土和草甸土[12]。近年来，旅游开发、农业耕作等持续人为活动使得湿地水位降低，湿地由沼泽湿地向沼泽化草甸，以及草甸和垦后湿地演替变化，水平空间上呈现出沿湖心至湖岸依次分布湖盆水体、沼泽湿地、沼泽化草甸湿地、草甸和垦后湿地几种沼泽体。本研究分别在沼泽湿地、沼泽化草甸湿地、草甸和垦后湿地设置研究样带，每个样带内分别随机布设3个采样点，样地主要特征见表 1，采样点位置示意图见图 1。
表 1 样地基本情况
Table 1. Basic information of the sample plots
退化阶段
Degradation stage样点编号
Sample No.经度
Longitude纬度
Latitude海拔
Elevation/m优势植物
Dominant plant土壤类型
Soil type沼泽湿地Swamp wetland(Y) Y1 99°38′02″E 27°53′38″N 3260 杉叶藻Hippuris vulgaris、狐尾藻Mytiophyllum verticiatum、蓖齿眼子菜Potamogeton pectinatus 沼泽土
Marsh muckY2 99°38′19″E 27°53′21″N Y3 99°38′25″E 27°53′06″N 沼泽化草甸
Swamp meadow(Z)Z1 99°38′09″E 27°53′41″N 3262 矮地榆Sanguisorba filiformis、发草Deschampsia caespitosa、无翅苔草Carex pleistoguna、斑唇马先蒿Pedicularis longiflora var. tubiformis 沼泽化草甸土
Swamp soilZ2 99°38′27″E 27°53′26″N Z3 99°38′36″E 27°53′08″N 草甸Meadow(C) C1 99°38′16″E 27°53′43″N 3266 大狼毒Euphorbia jolkinii、剪股颖Agrostis matsumurae 草甸土
Meadow soilC2 99°38′36″E 27°53′35″N C3 99°38′58″E 27°53′10″N 垦后湿地
Reclaimed wetland(G)G1 99°38′29″E 27°53′47″N 3279 青稞Hordeum vulgare var. nudum 耕作土
Cultivated soilG2 99°38′41″E 27°53′39″N G3 99°38′21″E 27°53′16″N 
图 1 采样点示意图
Figure 1. Sketch map of sampling sites
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于2015年1月采集土壤样品。运用5点混合取样法采集土壤，即：在不同退化阶段样地中分别布设3个采样方(10m×10m)(图 1)，每个样方中利用对角线法选取5个取样点(四个角+中心点)。首先去除地表约2cm厚的地表植被和覆盖物，再用土钻钻取0~20cm深的土壤样品，剔除石砾和植物残根等杂物后将5个采集点的土壤混合(沼泽湿地因常年淹水，直接用特制采样器[4]采集0~20cm层土样)，用四分法取适量土壤装入无菌自封袋中，置于冰盒中尽快带回实验室，共采集12个土壤样品。将上述土样进行如下处理：一部分(约100克)用于测定土壤含水量；一部分(约1000g)室内自然风干、磨细过筛，用于土壤的基本性质测定[13]；一部分(约200g)置于-70℃下冷冻保存，用于土壤DNA提取和高通量测序。
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含水量采用烘干称量法((105±2)℃, 24h)；有机质采用重铬酸钾氧化-外加热法测定；全氮采用硫酸-高氯酸消化开氏定氮法测定；pH值按土:水=1:2.5水浸提，电位法测定；速效磷采用0.5mol/L的NaHCO3浸提紫外分光光度法测定；速效钾采用1mol/L的醋酸铵浸提，火焰光度法测定；水解性氮采用碱解扩散法测定[13]。所有指标每份土样至少测定3个平行。
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各样地的土壤样品分别称取0.5g，各3次重复，首先参照李靖宇等所述方法去除腐殖酸[14]，之后用美国OMEGA公司的Soil DNA KIT试剂盒提取土壤总DNA，详细步骤参考试剂盒说明书。利用1.2%的琼脂糖凝胶电泳分离，最后将提取的DNA样品送上海生工生物科技有限公司进行高通量测序。在对真菌ITS区进行测序时进行两轮PCR，第一轮PCR扩增所采用引物为已经融合了Miseq测序平台的定制引物R_ITS1(CCTACACGACGCTCTT CCGATCTCG(Barcode)CTTGGTCATTTAGAGGAAG TAA)和F_5.8S (CTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGA ATTCCAAGCGCTGCGTTCTTCATCG)[15]，PCR反应体系如下，50μL：10×PCR buffer缓冲液5μL，dNTP(10mmol/L each)0.5μL，DNA模板10ng，Bar-PCR引物F(50μmol/L)0.5μL，引物R(50μmol/L)0.5μL，Plantium Taq(5U/μL)0.5μL，补充ddH2O至50μL。PCR扩增反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s、45℃退火20s、65℃延伸30s，5个循环；94℃变性20s、55℃退火20s、72℃延伸30s，20个循环；最后于72℃延伸5min；温度降至10℃左右，第1轮PCR结束。第2轮扩增时引入Illumina桥式PCR兼容引物，反应体系也是50μL：10×PCR buffer 5μL，dNTP(10mmol/L each)0.5μL，DNA 20ng，引物F(50μmol/L)0.5μL，引物R(50μmol/L)0.5μL，Plantium Taq(5U/μL)0.5μL，补充ddH2O至50μL。PCR扩增反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸30s，5个循环；最后于72℃延伸5min。PCR扩增结束后，将纯化质检合格的扩增产物1:1等量混合，利用Miseq台式测序仪2×300bp双端测序(paired-end)。
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理化数据使用SPSS17.0软件和Excel 2013软件进行分析，显著性水平设为P < 0.05。各样地变量之间的显著性差异均采用单因素方差分析(one-way analysis)。土壤理化性质和真菌群落结构之间的相关性采用Pearson相关性分析。利用Mothur软件将相似性大于97%的序列归为同一种可操作分类单元(OTU)，并计算Alpha多样性指数：丰富度指数(Richness)、香农指数(Shannon)、赵氏指数(Chao1)、艾斯指数(Ace)、覆盖率(Coverage)。采用RDA(Canoco for Windows 4.5)分析理化性质对微生物群落结构的影响，其中土壤理化数据作为环境变量，微生物群落门和纲水平的相对丰度作为物种数据。
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研究结果显示(表 2)土壤pH值在4个不同退化阶段差异显著(P < 0.05)，草甸土壤呈酸性(5.92)，沼泽化草甸呈中性(6.97)，原始沼泽(7.92)和垦后湿地(7.99)偏碱性。土壤含水量介于19.99%~106.15%之间，沼泽湿地与其它退化阶段间差异显著(P < 0.05)，沼泽化草甸、草甸和垦后湿地间无显著性差异。土壤有机质和全氮在不同退化阶段呈沼泽湿地 > 沼泽化草甸 > 垦后湿地 > 草甸的变化趋势，其中，沼泽湿地与其他3种退化阶段差异显著(P < 0.05)，沼泽化草甸与草甸和垦后湿地也有显著差异(P < 0.05)，并且随着退化程度的加剧，土壤碳氮的释放逐渐增加。沼泽化草甸、垦后湿地和草甸的有机质含量分别比沼泽湿地下降56.89、87.4和89.57g/kg，全氮分别下降4.29、7.48和8.05g/kg，说明湿地退化导致土壤碳氮含量的衰减。C/N比表现为草甸 > 垦后湿地 > 沼泽化草甸 > 沼泽湿地的变化趋势。土壤速效氮表现为沼泽湿地 > 沼泽化草甸 > 草甸 > 垦后湿地。垦后湿地土壤速效磷和速效钾含量最大，草甸最小，呈垦后湿地 > 沼泽化草甸>沼泽湿地 > 草甸。
表 2 纳帕海高原湿地不同退化阶段土壤理化性质
Table 2. Soil physiochemical properties at different degraded stages of Napahai Plateau Wetland
项目Item 沼泽湿地
Swamp wetland沼泽化草甸
Swamp meadow草甸
Meadow垦后湿地
Reclaimed wetlandpH(1:2.5土水比Soil to water ratio) 7.92±0.01a 6.97±0.04b 5.92±0.12c 7.99±0.05a 含水量Moisture content/% 106.15±0.47a 23.60±1.52b 20.24±1.52b 19.99±0.25b 有机质Organic matter/(g·kg-1) 138.20±4.29a 81.31±1.45b 48.63±6.60c 50.80±3.24c 全氮Total nitrogen/(g·kg-1) 9.22±0.20a 4.93±0.31b 1.17±0.75c 1.74±0.03c C/N Carbon nitrogen ratio 8.75±0.37c 9.81±0.47c 24.22±3.29a 16.88±0.93b 速效磷Available phosphorus/(mg·kg-1) 6.78±0.16b 7.82±0.51b 3.87±0.14c 38.63±0.51a 速效钾Available potassium/(mg·kg-1) 176.76±0.90c 225.16±1.29b 104.35±1.44d 432.45±4.57a 速效氮Available nitrogen/(mg·kg-1) 627.75±2.29a 414.84±1.36b 308.92±1.36c 253.99±1.43d 注：同行不同小写字母表示不同退化阶段差异显著(P < 0.05)。下同。notes: the superscripts of different letters indicate significant difference(P < 0.05).the same below. -
测序结果经过低质量序列过滤后，沼泽湿地获平均有效序列18240条、沼泽化草甸32084条、草甸27124条、垦后湿地32981条。在97%相似度下将其聚类为用于物种分类的OTU，共产生1910个OTU，统计结果如表 3所示。不同退化阶段土壤样品真菌覆盖率为99.4%~99.8%，表明本次测序深度合理，能够反映样品菌群的基本情况。利用测序获得的序列进行随机抽样，将抽到的序列数所代表的OTU数目构建稀释性曲线(图 2)，稀释性曲线均趋于平缓，表明测序数据合理，测序深度可以反映土壤真菌群落的真实情况。
表 3 纳帕海高原湿地不同退化阶段土壤真菌多样性指数(相似度为97%)
Table 3. Diversity indices of soil fungi at different degraded stages of Napahai Plateau Wetland (similarity is 97%)
退化阶段
Degradation stage序列数
Sequence number相似度0.97% Similarity is 97% OTU数目
OTU number艾斯指数
Ace index赵氏指数
Chaol index香农指数
Shannon index辛普森指数
Simpson index覆盖率
Coverage/%沼泽湿地
Swamp wetland18 240±120 364±30c 380.56±12.67c 379.17±15.65c 3.12±0.09c 0.107±0.025a 99.91±0.01 沼泽化草甸
Swamp meadow32 084±280 380±32c 391.37±18.45c 387.80±20.36c 3.48±0.12c 0.092±0.007a 99.94±0.02 草甸Meadow 27 124±160 513±81b 534.22±25.66b 522.25±30.12b 3.58±0.14b 0.081±0.003b 99.45±0.07 垦后湿地
Reclaimed wetland32 981±270 653±90a 685.84±27.32a 671.43±25.64a 3.93±0.17a 0.079±0.005b 99.75±0.08 
图 2 土壤样品稀释性曲线(相似度为97%)
Figure 2. Rarefaction curves of each soil sample at cutoff level of 3%
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表 3为不同退化阶段湿地土壤真菌丰度和多样性的相关指数。不同退化阶段Chao1指数、Ace指数和Shannon指数的差异性为：垦后湿地与草甸、沼泽化草甸和沼泽湿地差异显著(P < 0.05)，草甸与沼泽化草甸和沼泽湿地差异显著(P < 0.05)，沼泽化草甸和沼泽湿地差异不显著，同时呈现：垦后湿地(671.43、685.84、3.93) > 草甸(522.25、534.22、3.58) > 沼泽化草甸(387.80、391.37、3.48) > 沼泽湿地(379.17、380.56、3.12)的趋势，其中垦后湿地最大，沼泽湿地最小。不同退化阶段Simpson指数的差异性为：垦后湿地、草甸与沼泽化草甸、沼泽湿地差异显著(P < 0.05)，垦后湿地与草甸以及沼泽化草甸与沼泽湿地差异不显著。呈现垦后湿地(0.079) < 草甸(0.081) < 沼泽化草甸(0.092) < 沼泽湿地(0.107)的趋势，其中沼泽湿地最大，垦后湿地最小。可见，退化程度最严重的垦后湿地真菌群落丰富度和多样性最高，其次为草甸和沼泽化草甸，沼泽最低，表明土壤真菌群落结构和丰富度对湿地退化演替响应明显。
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不同退化阶段土壤样品中的1910个OTU分属于5门26纲52目。主要真菌门类有：子囊菌门(Ascomycota，71.11%~9.9%)，分类地位不确定真菌(fungi-unclassified，85.26%~5.63%)，担子菌门(Basidiomycota，26.8%~2.63%)，接合菌门(Zygomycota，39.34%~1.39%)，其余平均相对丰度小于1%的还包括壶菌门(Chytridiomycota)。子囊菌门、分类地位不确定真菌和担子菌门是占主导地位的微生物，约占所有微生物总数的20.63%~85.26%。
如图 3所示，在门分类水平上，不同退化阶段湿地土壤真菌群落组成不同。沼泽湿地土壤优势种群为分类地位不确定真菌(相对丰度平均值为85.26%)，次优势种群为子囊菌门(9.9%)，其余菌门相对丰度较低；沼泽化草甸土壤优势种群与沼泽湿地一样同为分类地位不确定真菌，但相对丰度大幅下降，仅为36.43%，次优势种群为子囊菌门(33.41%)和担子菌门(26.8%)；草甸土壤优势种群为子囊菌门(71.11%)，次优势种群为担子菌门(20.63%)，其余相对丰度大于1%的还包括分类地位不确定真菌(5.63%)和接合菌门(2.4%)；垦后湿地土壤优势种群为接合菌门(39.34%)，次优势种群为子囊菌门(34.53%)和担子菌门(15.33%)其余相对丰度大于1%的还包括分类地位不确定真菌(10.36%)。同时，从沼泽湿地至垦后湿地，土壤真菌门相对丰度存在不同的变化趋势。子囊菌门相对丰度先增加后减小，在草甸中最大；分类地位不确定真菌从沼泽湿地至草甸相对丰度急剧减小，后在垦后湿地中有小幅增加，在沼泽湿地中最大；担子菌门相对丰度先增加后有小幅降低，在沼泽化草甸中最大；接合菌门不断增加，在垦后湿地最大；壶菌门在不同退化阶段间没有明显差异。
图 3 纳帕海高原湿地不同退化阶段土壤优势真菌群落组成(门分类水平)
Figure 3. Relative richness of dominant fungal community at phylum level of degraded stages in Napahai Plateau Wetland
如图 4所示，在纲分类水平上沼泽湿地、沼泽化草甸、草甸和垦后湿地土壤真菌群落组成中丰度大于5%的纲共有8个，分别是粪壳菌纲(Sordariomycetes)(2.11%、6.47%、6.58%、22.36%)、担子菌纲(Basidiomycetes)(0.03%、1.67%、16.65%、0.09%)、散囊菌纲(Eurotiomycetes)(3.52%、11.73%、24.96%、3.14%)、伞菌纲(Agaricomycetes)(0.9%、3.9%、2.84%、11.79%)、座囊菌纲(Dothideomycetes)(1.88%、3.18%、5.56%、4.04%)、银耳纲(Tremellomycetes)(0.55%、17.29%、0.31%、2.97%)、子囊菌纲(Ascomycetes)(0.95%、6.69%、3.24%、1.6%)以及古菌根菌纲(Archaeorhizomycetes)(0.13%、1.46%、28.47%、0)。其中古菌根菌纲(28.47%)、散囊菌纲(24.96%)和担子菌纲(16.65%)在草甸中占优势；银耳纲(17.29%)和散囊菌纲(11.73%)在沼泽化草甸中占优势；粪壳菌纲(22.36%)和伞菌纲(11.7%)在垦后湿地中占优势。从沼泽湿地至垦后湿地，土壤真菌纲相对丰度也存在不同的变化趋势。座囊菌纲、担子菌纲、散囊菌纲和古菌根菌纲相对丰度先增加后减小，在草甸中最大；分类地位不确定真菌相对丰度急剧减小，在垦后湿地有小幅增加；粪壳菌纲、伞菌纲大致呈不断增加的趋势，在垦后湿地达到最大；银耳纲、子囊菌纲和锤舌菌纲相对丰度先增加后有小幅降低，在沼泽化草甸中最大。
图 4 纳帕海高原湿地不同退化阶段湿地优势真菌群落组成(纲分类水平)
Figure 4. Relative richness of dominant fungal community at class level of degraded stages in Napahai Plateau Wetland
在门分类水平上对样品及其样品所含菌种类进行聚类(图 5)，可以看出沼泽化草甸和沼泽湿地之间菌群组成最相似，两者相对丰度最高的都是分类地位不确定真菌，分别为85.26%和36.43%，除分类地位不确定真菌外，前者相对丰度较高的为担子菌门(26.80%)和子囊菌门(33.41%)。草甸与垦后湿地菌群组成相似，草甸相对丰度最高的是子囊菌门(71.11%)，其次为担子菌门(20.63%)；垦后湿地相对丰度最高的为接合菌门(39.34%)，其次依次为子囊菌门(34.53%)、担子菌门(15.33%)和分类地位不确定真菌(10.36%)。
图 5 纳帕海高原湿地不同退化阶段土壤优势真菌样本聚类图(门分类水平)
Figure 5. Cluster diagram of dominant fungal community at phylum level of degraded stages in Napahai Plateau Wetland
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分别对优势真菌门和纲相对丰度与土壤主要理化因子进行冗余分析(图 6)，结果显示第1轴和第2轴的累计解释率分别达97.1%和94.6%，说明土壤主要理化因子对真菌群落结构有显著影响。在门分类水平上(图 6A)，土壤含水量(MC，r=0.9252)、有机质(OM，r=0.9867)、全氮(TN，r=0.9827)、碳氮比(C/N，r=-0.8497)、速效氮(AN，r=0.953)与轴1的相关性较大，第1轴解释率达到79.8%。在纲分类水平上(图 6B)，MC(r=0.9305)、OM(r=0.9974)、TN(r=0.9876)、C/N(r=-0.8148)、AN(r=0.9852)与轴1的相关性较大，pH值(r=0.7115)、AP(r=0.8858)、AK(r=0.9566)与轴2的相关性较大，轴1解释率达到70.8%，轴2解释率达94.6%。担子菌纲、座囊菌纲和散囊菌纲与C/N比呈正相关，与pH值呈负相关；粪壳菌纲和伞菌纲与AP和AK呈正相关。
图 6 优势真菌门(A)和优势真菌纲(B)与土壤主要理化因子冗余分析
Figure 6. Redundancy analysis (RDA) on soil dominant fungal phyla(A)and soil dominant fungal class(B)constrained by soil variables
对优势真菌门和土壤主要理化因子进行Pearson相关性分析，结果如表 4所示。分类地位不确定真菌与MC、TN、OM和AN呈极显著正相关，相关系数分别为0.942(P < 0.01)、0.989(P < 0.01)、0.996(P < 0.01)和0.982(P < 0.01)，与C/N比呈极显著负相关，相关系数为0.813(P < 0.01)；子囊菌门与C/N比呈极显著正相关，相关系数为0.915(P < 0.01)，与pH值、MC、TN、OM和AN呈极显著负相关，相关系数分别为-0.872(P < 0.01)、-0.733(P < 0.01)、-0.842(P < 0.01)、-0.815(P < 0.01)和-0.717(P < 0.01)；担子菌门与C/N比呈极显著正相关，相关系数为0.832(P < 0.01)，与pH值、MC、TN、OM和AN呈显著负相关，相关系数分别为-0.620(P < 0.05)、-0.873(P < 0.05)、-0.630(P < 0.05)、-0.691(P < 0.05)和-0.631(P < 0.05)；壶菌门与C/N比呈极显著负相关，相关系数为-0.824(P < 0.01)，与pH值、MC、TN、OM和AN呈正相关，相关系数分别为0.830(P < 0.01)、0.850(P < 0.01)、0.741(P < 0.01)、0.709(P < 0.01)和0.646(P < 0.05)；接合菌门与AP和AK呈显著正相关，相关系数为分别为0.995(P < 0.01)和0.939(P < 0.01)，与AN呈负相关，相关系数为-0.617(P < 0.05)。
表 4 优势真菌类群与土壤主要理化因子相关性分析
Table 4. Correlation coefficients between dominant fungal groups and available factors
优势真菌类群
Dominant fungal groupMC OM TN C/N AP AK AN pH(1:2.5土水比Soil water ratio) 门Phylum 子囊菌门Ascomycota -0.733** -0.815** -0.842** 0.915** — — -0.717** -0.872** 分类地位不确定真菌Fungi-unclassified 0.942** 0.989** 0.996** -0.813** — — 0.982** — 担子菌门Basidiomycota -0.873** -0.691* -0.630* 0.832**— — — -0.631* -0.620* 接合菌门Zygomycota — — — — 0.995** 0.939** -0.617* — 壶菌门Chytridiomycota 0.850** 0.741** 0.709* -0.824** — — 0.646* 0.830** 纲Class 分类地位不确定真菌Fungi-unclassified 0.942** 0.989** 0.996** -0.813** — — 0.982** — 未确定分类Incertae-sedis — — — — 0.985** 0.924** -0.680* — 粪壳菌纲Sordariomycetes -0.562* -0.644* -0.629* — 0.960** 0.899** -0.758** — 担子菌纲Basidiomycotetes — — — 0.843** — -0.637* — -0.919** 散囊菌纲Eurotiomycetes — — — 0.713** — -0.683* — -0.995** 伞菌纲Agaricomycetes — -0.619* -0.594* 0.713* 0.683* — 0.995** 座囊菌纲Dothideomycetes -0.788** -0.905** -0.934** 0.958** — — -0.839** -0.733** 锤舌菌纲Leotiomycetes -0.977** -0.857** -0.801** — — — -0.840** — 古菌根菌纲Archaeorhizomycetes — — — 0.852** — -0.631* — -0.899** 银耳纲Tremellomycetes — — — — — — — — 未分类子囊菌纲
Unclassified-Ascomycotetes— — — — — — — — 注：*表示显著相关(P < 0.05)；**表示极显著相关(P < 0.01)；—表示相关性不显著。Notes:* means significant correlation at P < 0.05 level; ** means very significant correlation at P < 0.01 level; — means correlation is not significant. 在纲分类水平上，粪壳菌纲与MC、TN、OM和AN呈显著负相关，相关系数分别为-0.562(P < 0.05)、-0.644(P < 0.05)、-0.629(P < 0.01)和-0.758(P < 0.01)，与AP和AK比呈极显著正相关，相关系数分别为0.960(P < 0.01)和0.899(P < 0.01)；担子菌纲和散囊菌纲分别与C/N比呈极显著正相关，相关系数分别为0.843(P < 0.01)和0.713(P < 0.01)，与AK和pH值呈显著与极显著负相关，相关系数分别为-0.637(P < 0.05)、-0.683(P < 0.05)、-0.919(P < 0.01)和-0.995(P < 0.01)；伞菌纲与OM、TN呈显著负相关，相关系数分别为-0.619(P < 0.05)和-0.594(P < 0.05)，与AP、AK、pH值呈正相关，相关系数为0.713(P < 0.01)、0.683(P < 0.05)和0.995(P < 0.01)；座囊菌纲与MC、OM、TN、AN和pH值呈极显著负相关，相关系数分别为-0.788(P < 0.01)、-0.905(P < 0.01)、-0.934(P < 0.01)、-0.839(P < 0.01)和-0.733(P < 0.01)，与C/N比呈极显著正相关，相关系数为0.958(P < 0.01)；锤舌菌纲与MC、OM、TN和AN呈极显著负相关，相关系数分别为-0.977(P < 0.01)、-0.857(P < 0.01)、-0.801(P < 0.01)和-0.840(P < 0.01)；古菌根菌纲与C/N比呈极显著正相关，相关系数为0.852(P < 0.01)，与AK、pH值呈显著负相关，相关系数分别为-0.631(P < 0.05)和-0.899(P < 0.01)。
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物种多样性是维持湿地生态系统正常功能的前提条件[16]。真菌是湿地土壤生态系统的重要组成部分，它与分解有机质[17]、改善土壤结构、改良土壤肥力等[18]密切相关。研究土壤真菌α多样性时发现，湿地退化和垦殖导致湿地土壤真菌多样性和丰富度显著增加，呈现垦后湿地 > 草甸 > 沼泽化草甸 > 沼泽湿地的变化趋势，这与陈会海等[19]利用DGGE技术对三江平原不同退化程度小叶章湿地真菌多样性的研究结果相似。曹萍麟等[11]采用稀释平板法结合ITS测序研究不同人为干扰强度下纳帕海湿地土壤可培养真菌多样性时也得到相似的结论。垦后湿地退化程度最高，其土壤真菌群落多样性指数也最高，这是因为人为排干湿地开垦为耕地，频繁地人为耕作使土壤疏松，改善了土壤通气性，使土壤与空气热交换快，故真菌大量繁殖。徐飞等[20]研究也发现垦殖湿地显著增加土壤微生物的多样性，土壤微生物群落多样性的变化是适应耕作干扰的直接表现，人为对土壤的翻动、扰动和施肥大大促进微生物的生长繁殖。草甸土壤含水量较小，通气条件较好，为土壤真菌创造了一个良好的微环境，所以形成较高的生物多样性，但放牧和无序旅游的践踏导致土壤紧实板结，对真菌同时产生负面影响，因此多样性较垦后湿地要低。沼泽湿地常年淹水，通气性最差，丰富的碳氮含量虽然能够为真菌提供丰富的底物，但高含水量仍然抑制了真菌的多样性。
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研究发现沼泽湿地和沼泽化草甸的优势门、纲均为分类地位不确定真菌，草甸的为子囊菌门和古菌根菌纲、散囊菌纲、担子菌纲，垦后湿地的为接合菌门和粪壳菌纲、伞菌纲。说明不同退化阶段湿地土壤真菌群落结构变异较大，优势群落并不相同。同时，分类地位不确定真菌从沼泽湿地→沼泽化草甸→草甸→垦后湿地均呈减少趋势，而总的已知分类真菌则呈增加趋势，以子囊菌、担子菌和接合菌为主。造成真菌优势菌群发生变化的原因可能为：一方面，不同真菌种类对土壤氧气有不同的生理需求。沼泽湿地常年积水，土壤通气性差，养分含量高，存在大量的分类地位不确定真菌，说明这些真菌耐氧胁迫作用强。沼泽化草甸和草甸土壤含水量降低，通气性得到改善，适应子囊菌和担子菌的繁殖。有研究发现，子囊菌和担子菌喜欢通气性较好的土壤条件[21]。子囊菌和担子菌均是陆生的高等菌物，是土壤中主要的真菌分解者[22]。子囊菌门大多数为腐生菌，可以分解难降解性有机质，在养分循环中起着重要作用[23]。担子菌门腐生或寄生，在潮湿的土壤中，分解木质纤维素。另一方面，不同淹水时间是导致湿地土壤微生物群落改变的主要原因[24]。随着土壤含水量减少沼泽化草甸和草甸的土壤环境发生改变，植物类型由湿生向中生和旱生植被转变[25]，种类增加且土壤通气性改善，凋落物种类增多且分解迅速，陆生型的子囊菌和担子菌大量繁殖[26]。垦后湿地表现出与其它湿地类型不相同的菌群组成，以接合菌门为优势菌群，这与耕作特别是施肥会增加土壤中接合菌门的含量有关。王轶等[8]认为施肥可以增加土壤速效磷、速效钾的含量，为土壤真菌提供更多底物，提高土壤真菌多样性，改变其群落结构组成。
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湿地土壤微生物群落结构和多样性会受多种因素的影响，外因主要包括植被类型[20]、气候变化[27]、土壤类型和人为活动[28-30]等，内因主要是受与土壤微生物生长密切相关的土壤化学组成等土壤环境因子[31]的影响，并且各种土壤性质影响土壤微生物群落的时空尺度可能存在差异[32]。研究发现土壤含水量、有机质、全氮、碳氮比、速效氮、pH与真菌群落结构存在极显著的相关关系，且不同退化阶段同一理化因子对不同菌群的促进或抑制作用各不相同。土壤含水量、有机质、全氮和速效氮是影响沼泽湿地和沼泽化草甸群落结构组成的重要理化因子，均对分类地位不确定真菌具有促进作用；碳氮比对担子菌门、子囊菌门、座囊菌纲、担子菌纲、散囊菌纲具有促进作用，对壶菌门具抑制作用；速效磷、速效钾对接合菌门、粪壳菌纲和伞菌纲具有促进作用(图 6)。土壤基质的性质是真菌群落结构组成及多样性的主要驱动因子，其中水分是影响真菌群落多样性的重要因素[33]，真菌群落对土壤含水量的变化也非常敏感，高含水量形成好气厌氧环境，改变需氧真菌的数量，从而导致土壤真菌群落结构及多样性发生显著变化[21]。土壤有机质的增减也能改变土壤真菌的数量和组成[32]。有机质和全氮是真菌重要的碳源和氮源，但本研究显示，有机质和全氮含量较高的沼泽湿地，其真菌的多样性却最少，群落结构组成也较单一，这可能与水、肥条件的共同作用有关，沼泽湿地常年积水，高水分含量使得土壤通气性差，好氧的真菌生长繁殖受限，从而影响土壤真菌群落结构及多样性。土壤C/N是影响土壤微生物群落结构变化的重要因子之一，适宜的C/N能促进真菌的生长。有研究表明，与细菌相比，真菌对有机底物的利用率更高，相同底物数量时，真菌比细菌能够形成更多的生物量，因此，在偏酸性、养分有效性低、难分解底物和C/N较高的土壤中，真菌生长更加旺盛[34]。在本研究中草甸土壤C/N为24.22, 显著影响着草甸土壤的微生物群落结构。土壤pH对腐生性真菌影响最大[35]，且土壤真菌在偏酸性土壤中占据优势地位，真菌在酸性环境中能够提高对水分的利用，从而促进自身生长，使其数量增殖[36]，本研究发现在低pH值、高C/N的草甸土壤中担子菌门和子囊菌门多样性较高，而壶菌门则较喜欢在碱性环境繁衍。
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土壤真菌群落多样性在不同退化阶段间均有显著差异，呈现垦后湿地>草甸>沼泽化草甸>沼泽湿地的变化趋势，整体表现为随着湿地退化加剧，真菌多样性增加。
湿地从沼泽向草甸和垦后湿地退化后，主要优势菌群发生变化，土壤真菌群落结构组成由未确定分类地位真菌转变为子囊菌、担子菌和接合菌。
RDA及相关分析表明，土壤含水量、有机质、全氮、碳氮比、速效氮和pH显著影响着不同退化阶段湿地土壤真菌群落结构与多样性。
Characteristics of soil fungal community structure at different degraded stages in Napahai Plateau Wetland of northwestern China
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摘要:
目的为探讨纳帕海高原湿地不同退化阶段土壤真菌多样性及群落结构特征，揭示土壤真菌对湿地退化演替的响应规律。 方法采用Illumina高通量测序技术，以沼泽湿地为对照，研究纳帕海高原退化湿地不同退化阶段土壤真菌群落组成、结构及Alpha多样性特征及其与土壤理化性质的相关性。 结果(1) 不同退化阶段土壤真菌类群组成及结构存在差异，包括子囊菌门、担子菌门、分类地位不确定真菌、壶菌门和接合菌门5个真菌门，其中子囊菌门在草甸中最多(71.11%)，分类地位不确定真菌在沼泽湿地中最多(85.26%)，担子菌门在沼泽化草甸中最多(26.8%)，接合菌门在垦后湿地中最多(39.34%)。经聚类分析显示，沼泽化草甸和沼泽湿地真菌群落结构和组成较接近，草甸和垦后湿地真菌群落结构和组成与沼泽差异较大。湿地从沼泽湿地向沼泽化草甸、草甸和垦后湿地退化后，主要优势菌群发生变化，由分类地位不确定菌群转变为子囊菌、担子菌和接合菌；(2)土壤真菌Alpha多样性在不同退化阶段间存在差异(P < 0.05)，且随着湿地退化加剧而增加，多样性指数(Chao1、Ace、Shannon)呈垦后湿地(671.43、685.84、3.93) > 草甸(522.25、534.22、3.58) > 沼泽化草甸(387.80、391.37、3.48) > 沼泽湿地(379.17、380.56、3.12)的变化趋势。Simpson指数呈垦后湿地(0.079) < 草甸(0.081) < 沼泽化草甸(0.092) < 沼泽湿地(0.107)的变化趋势；(3)RDA分析与Pearson相关性分析表明，土壤含水量、有机质、全氮、碳氮比、速效氮和pH显著影响着不同退化阶段湿地土壤真菌群落结构与多样性。 结论不同退化阶段湿地土壤真菌群落结构和物种多样性具有显著差异，土壤含水量、有机质等理化因子对真菌多样性与群落结构影响较大，研究结果能为退化高原湿地保护与恢复提供数据及理论支持。 Abstract:ObjectiveThis study aims to explore the diversity and community structure of soil fungi in different stages of Napahai Plateau Wetland of northwestern China, and reveal the response rule of soil fungi to wetland degradation. MethodWe analyzed composition, structure and Alpha diversity of soil fungal community, and relationships between fungal community structure and soil physical and chemical factors at different degradation stages in Napahai Plateau Wetland, by using Illumina high-throughput sequencing techniques and primary swamp as control. Result(1) The composition and structure of soil fungal community were different among varied degradation stages. Soil fungi belonged to five fungal groups, including Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, fungi-unclassified and Zygomycota. Among them, Ascomycota had the highest relative abundance in the meadow wetland (71.11%), unclassified fungi had the highest relative abundance in primary swamp (85.26%), Basidiomycota had the highest relative abundance in swamp meadow (26.8%), Zygomycota had the highest relative abundance in the reclaimed wetland (39.34%). The cluster analysis showed that the fungi community structure and composition between the swamp meadow and the primary swamp were similar to each other, while the ones between meadow and reclaimed wetland were significantly different. The main dominant fungal groups changed from fungi-unclassified to Ascomycetes, Basidiomycetes and Zygomycota as degradation changed from primary swamp to swamp meadow, meadow and reclaimed wetland. (2) There were significant differences (P < 0.05) in soil fungal Alpha diversity among different degraded stages, and showing an increasing trend in diversity as degradation aggravated. The order of diversity indices (Chao1, Ace, Shannon) was reclaimed wetland (671.43, 685.84, 3.93) > meadow(522.25, 534.22, 3.58) > swampy meadow(387.80, 391.37, 3.48) > primary swamp(379.17, 380.56, 3.12). The Simpson index presented the trend of reclaimed wetland (0.079) < meadow (0.081) < swampy meadow (0.092) < primary swamp (0.107). (3) RDA and Pearson correlation analyses showed that soil water content, organic matter, total nitrogen, C/N ratio, available nitrogen and pH significantly affected the structure and diversity of soil fungi community at different degradation stages. ConclusionThere are significant differences in soil fungal community structure and species diversity in different degradation stages. Physical and chemical factors such as soil water content and organic matter have great influence on the diversity and community structure of fungi. The results can provide data and theoretical support for wetland protection and restoration in degraded plateau. -
图 2 土壤样品稀释性曲线(相似度为97%)
Figure 2. Rarefaction curves of each soil sample at cutoff level of 3%
图 3 纳帕海高原湿地不同退化阶段土壤优势真菌群落组成(门分类水平)
Figure 3. Relative richness of dominant fungal community at phylum level of degraded stages in Napahai Plateau Wetland
图 4 纳帕海高原湿地不同退化阶段湿地优势真菌群落组成(纲分类水平)
Figure 4. Relative richness of dominant fungal community at class level of degraded stages in Napahai Plateau Wetland
图 5 纳帕海高原湿地不同退化阶段土壤优势真菌样本聚类图(门分类水平)
Figure 5. Cluster diagram of dominant fungal community at phylum level of degraded stages in Napahai Plateau Wetland
图 6 优势真菌门(A)和优势真菌纲(B)与土壤主要理化因子冗余分析
AP.速效磷；AK.速效钾；AN.速效氮；TN.全氮；MC.含水量；OM.有机质；C/N.碳氮比。下同。
Figure 6. Redundancy analysis (RDA) on soil dominant fungal phyla(A)and soil dominant fungal class(B)constrained by soil variables
AP, available P; AK, available K; AN, available N; TN, total N; MC, moisture content; OM, organic matter; C/N, C:N ratio. The same below.
表 1 样地基本情况
Table 1. Basic information of the sample plots
退化阶段
Degradation stage样点编号
Sample No.经度
Longitude纬度
Latitude海拔
Elevation/m优势植物
Dominant plant土壤类型
Soil type沼泽湿地Swamp wetland(Y) Y1 99°38′02″E 27°53′38″N 3260 杉叶藻Hippuris vulgaris、狐尾藻Mytiophyllum verticiatum、蓖齿眼子菜Potamogeton pectinatus 沼泽土
Marsh muckY2 99°38′19″E 27°53′21″N Y3 99°38′25″E 27°53′06″N 沼泽化草甸
Swamp meadow(Z)Z1 99°38′09″E 27°53′41″N 3262 矮地榆Sanguisorba filiformis、发草Deschampsia caespitosa、无翅苔草Carex pleistoguna、斑唇马先蒿Pedicularis longiflora var. tubiformis 沼泽化草甸土
Swamp soilZ2 99°38′27″E 27°53′26″N Z3 99°38′36″E 27°53′08″N 草甸Meadow(C) C1 99°38′16″E 27°53′43″N 3266 大狼毒Euphorbia jolkinii、剪股颖Agrostis matsumurae 草甸土
Meadow soilC2 99°38′36″E 27°53′35″N C3 99°38′58″E 27°53′10″N 垦后湿地
Reclaimed wetland(G)G1 99°38′29″E 27°53′47″N 3279 青稞Hordeum vulgare var. nudum 耕作土
Cultivated soilG2 99°38′41″E 27°53′39″N G3 99°38′21″E 27°53′16″N 
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表 2 纳帕海高原湿地不同退化阶段土壤理化性质
Table 2. Soil physiochemical properties at different degraded stages of Napahai Plateau Wetland
项目Item 沼泽湿地
Swamp wetland沼泽化草甸
Swamp meadow草甸
Meadow垦后湿地
Reclaimed wetlandpH(1:2.5土水比Soil to water ratio) 7.92±0.01a 6.97±0.04b 5.92±0.12c 7.99±0.05a 含水量Moisture content/% 106.15±0.47a 23.60±1.52b 20.24±1.52b 19.99±0.25b 有机质Organic matter/(g·kg-1) 138.20±4.29a 81.31±1.45b 48.63±6.60c 50.80±3.24c 全氮Total nitrogen/(g·kg-1) 9.22±0.20a 4.93±0.31b 1.17±0.75c 1.74±0.03c C/N Carbon nitrogen ratio 8.75±0.37c 9.81±0.47c 24.22±3.29a 16.88±0.93b 速效磷Available phosphorus/(mg·kg-1) 6.78±0.16b 7.82±0.51b 3.87±0.14c 38.63±0.51a 速效钾Available potassium/(mg·kg-1) 176.76±0.90c 225.16±1.29b 104.35±1.44d 432.45±4.57a 速效氮Available nitrogen/(mg·kg-1) 627.75±2.29a 414.84±1.36b 308.92±1.36c 253.99±1.43d 注：同行不同小写字母表示不同退化阶段差异显著(P < 0.05)。下同。notes: the superscripts of different letters indicate significant difference(P < 0.05).the same below.
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表 3 纳帕海高原湿地不同退化阶段土壤真菌多样性指数(相似度为97%)
Table 3. Diversity indices of soil fungi at different degraded stages of Napahai Plateau Wetland (similarity is 97%)
退化阶段
Degradation stage序列数
Sequence number相似度0.97% Similarity is 97% OTU数目
OTU number艾斯指数
Ace index赵氏指数
Chaol index香农指数
Shannon index辛普森指数
Simpson index覆盖率
Coverage/%沼泽湿地
Swamp wetland18 240±120 364±30c 380.56±12.67c 379.17±15.65c 3.12±0.09c 0.107±0.025a 99.91±0.01 沼泽化草甸
Swamp meadow32 084±280 380±32c 391.37±18.45c 387.80±20.36c 3.48±0.12c 0.092±0.007a 99.94±0.02 草甸Meadow 27 124±160 513±81b 534.22±25.66b 522.25±30.12b 3.58±0.14b 0.081±0.003b 99.45±0.07 垦后湿地
Reclaimed wetland32 981±270 653±90a 685.84±27.32a 671.43±25.64a 3.93±0.17a 0.079±0.005b 99.75±0.08
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表 4 优势真菌类群与土壤主要理化因子相关性分析
Table 4. Correlation coefficients between dominant fungal groups and available factors
优势真菌类群
Dominant fungal groupMC OM TN C/N AP AK AN pH(1:2.5土水比Soil water ratio) 门Phylum 子囊菌门Ascomycota -0.733** -0.815** -0.842** 0.915** — — -0.717** -0.872** 分类地位不确定真菌Fungi-unclassified 0.942** 0.989** 0.996** -0.813** — — 0.982** — 担子菌门Basidiomycota -0.873** -0.691* -0.630* 0.832**— — — -0.631* -0.620* 接合菌门Zygomycota — — — — 0.995** 0.939** -0.617* — 壶菌门Chytridiomycota 0.850** 0.741** 0.709* -0.824** — — 0.646* 0.830** 纲Class 分类地位不确定真菌Fungi-unclassified 0.942** 0.989** 0.996** -0.813** — — 0.982** — 未确定分类Incertae-sedis — — — — 0.985** 0.924** -0.680* — 粪壳菌纲Sordariomycetes -0.562* -0.644* -0.629* — 0.960** 0.899** -0.758** — 担子菌纲Basidiomycotetes — — — 0.843** — -0.637* — -0.919** 散囊菌纲Eurotiomycetes — — — 0.713** — -0.683* — -0.995** 伞菌纲Agaricomycetes — -0.619* -0.594* 0.713* 0.683* — 0.995** 座囊菌纲Dothideomycetes -0.788** -0.905** -0.934** 0.958** — — -0.839** -0.733** 锤舌菌纲Leotiomycetes -0.977** -0.857** -0.801** — — — -0.840** — 古菌根菌纲Archaeorhizomycetes — — — 0.852** — -0.631* — -0.899** 银耳纲Tremellomycetes — — — — — — — — 未分类子囊菌纲
Unclassified-Ascomycotetes— — — — — — — — 注：*表示显著相关(P < 0.05)；**表示极显著相关(P < 0.01)；—表示相关性不显著。Notes:* means significant correlation at P < 0.05 level; ** means very significant correlation at P < 0.01 level; — means correlation is not significant.
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