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拟南芥叶绿体分裂突变体x17-3和pd50的基因鉴定与分析

李劲宇 高原 张琴 刘小敏 高宏波

李劲宇, 高原, 张琴, 刘小敏, 高宏波. 拟南芥叶绿体分裂突变体x17-3和pd50的基因鉴定与分析[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(4): 86-95. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170433
引用本文: 李劲宇, 高原, 张琴, 刘小敏, 高宏波. 拟南芥叶绿体分裂突变体x17-3和pd50的基因鉴定与分析[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(4): 86-95. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170433
Li Jinyu, Gao Yuan, Zhang Qin, Liu Xiaomin, Gao Hongbo. Genetic identification and analysis of chloroplast division mutants x17-3 and pd50 in Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(4): 86-95. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170433
Citation: Li Jinyu, Gao Yuan, Zhang Qin, Liu Xiaomin, Gao Hongbo. Genetic identification and analysis of chloroplast division mutants x17-3 and pd50 in Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(4): 86-95. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170433

拟南芥叶绿体分裂突变体x17-3和pd50的基因鉴定与分析

doi: 10.13332/j.1000-1522.20170433
基金项目: 

国家自然科学基金项目 31501090

详细信息
    作者简介:

    李劲宇,博士生。主要研究方向:植物分子生物学。Email:lijinyu2009@hotmail.com 地址:100083北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院

    通讯作者:

    刘小敏,讲师。主要研究方向:植物分子生物学。Email: liuxiaomin@bjfu.edu.cn 地址:同上

    高宏波,教授,博士生导师。主要研究方向:植物分子生物学。Email:gaobjfu@yahoo.com 地址:同上

  • 中图分类号: Q943.2

Genetic identification and analysis of chloroplast division mutants x17-3 and pd50 in Arabidopsis thaliana

  • 摘要: 目的叶绿体起源于内共生的蓝细菌,它通过与细菌类似的分裂方式进行增殖以维持遗传稳定。叶绿体分裂需要起源于原核和真核细胞的蛋白高度协调。拟南芥是研究叶绿体分裂的模式植物。在过去的20年中,人们对拟南芥叶绿体分裂蛋白复合体进行了初步的研究。然而, CRL基因在叶绿体分裂中的功能还不清楚。方法本研究通过突变体筛选和图位克隆鉴定得到2个新的crl突变体,分别为x17-3和pd50。通过显微观察和分子生物学方法分析了x17-3和pd50中叶绿体分裂表型、CRL基因剪接方式和mRNA含量以及叶绿素含量。最后通过转化互补和RNA干扰(RNAi)技术进一步确认了基因功能。结果x17-3和pd50的叶绿体形态与野生型相比有较大差异,表现为叶绿体体积增大,细胞中叶绿体数量减少。x17-3叶绿体数量为野生型的40%,而pd50叶绿体减少到只有1~4个,植物生长也受到明显抑制。通过粗定位及测序分析发现x17-3和pd50的CRL基因存在突变,突变位点在内含子并且影响mRNA剪接,最终导致阅读框移码突变。通过实时荧光定量PCR分析发现,pd50中CRL mRNA含量比野生型和x17-3明显降低。遗传互补实验进一步验证了x17-3和pd50中叶绿体分裂和植物生长抑制表型是CRL基因突变导致的。应用RNAi技术抑制CRL基因表达也能产生明显的叶绿体分裂异常表型。此外,pd50和x17-3的叶绿素含量比野生型明显降低。结论本项工作为进一步揭示CRL基因的功能提供新的研究材料和实验依据。
  • 图  1  x17-3和pd50突变体的叶绿体分裂和植物生长表型分析

    A.生长4周的拟南芥叶肉细胞叶绿体的形态,标尺为10 μm;B.每个叶肉细胞叶绿体数量与叶肉细胞平面面积之间的关系;C.生长4周的拟南芥植物形态,标尺为1 cm。

    Figure  1.  Phenotype analysis of the chloroplast division and plant growth in x17-3 and pd50 mutant

    A, morphology of chloroplasts from true leaf of four-week-old Arabidopsis thaliana plants, scale bar is 10 μm; B, relationship between chloroplast number per mesophyll cell and mesophyll cell plan area of four-week-old plants; C, plant morphology of four-week-old plants, scale bar is 1 cm.

    图  2  x17-3突变体的基因粗定位与测序分析

    A. 30个x17-3 F2单株与4个分子标记的连锁情况,*表示杂合的植物;B. CRL和分子标记在5号染色体上的位置;C.CRL基因结构及x17-3和pd50突变位点,黑色矩形和直线分别代表外显子和内含子,星号表示突变体中CRL基因突变位点。

    Figure  2.  Rough mapping and sequencing analysis of x17-3

    A, 4 molecular markers linked to the CRL locus and used for the identification of recombinants in 30 x17-3 mutant individuals from a F2 mapping population, * indicates heterozygous plants; B, genetic linkage map of CRL gene and the molecular markers on chromosome 5; C, gene structure and the mutation site of CRL gene in x17-3 and pd50, black boxes and straight lines indicate exons and introns, respectively, * represents CRL mutation site of mutant.

    图  3  x17-3和pd50中CRL mRNA剪接分析

    A. WT、x17-3和pd50中CRL基因mRNA PCR扩增产物,M是DNA marker;B. x17-3中CRL mRNA序列分析,x17-3中增加的10 bp内含子导致蛋白质翻译发生移码,蛋白翻译提前终止,矩形和直线分别代表第8个和第9个外显子以及内含子,*代表终止密码子;C. pd50中CRL mRNA序列分析,pd50中CRL基因突变产生2种形式的mRNA,pd50(1)中缺失8 bp碱基,pd50(2)中保留了内含子,都导致蛋白质翻译发生移码,蛋白翻译提前终止,矩形和直线分别代表第1个和第2个外显子以及内含子,*代表终止密码子。

    Figure  3.  Splicing analysis of CRL mRNA in x17-3 and pd50

    A, PCR analysis of CRL mRNA in WT, x17-3 and pd50, M means DNA marke; B, analysis of CRL mRNA presenting in the x17-3 mutan, the extra 10 bp sequence included in x17-3 results in reading frame shift and early translational termination, the boxes and straight lines indicate the 8th, 9th exons and intron, respectively, * represents stop codon; C, analysis of CRL mRNA presenting in the pd50 mutant, the mutation in CRL gene in pd50 results in two isoform of CRL mRNA by alternative splicing, the 8 bp missing in pd50 (1) and intron retention in pd50 (2) result in reading frame shift and early translational termination, the boxes and straight lines indicate the 1st, 2nd exons and intron, respectively, * represents stop codon.

    图  4  x17-3和pd50中CRL mRNA含量的实时荧光定量PCR分析

    平均值±标准差,n=3;**表示在P < 0.01水平上差异显著(t-检验)。

    Figure  4.  Comparison of the mRNA level of CRL gene in x17-3 and pd50 by real-time qRT-PCR analysis

    mean±SD, n=3. ** refers to P < 0.01 by Student's t-test.

    图  5  x17-3和pd50转CRL基因互补表型分析

    A. WT、x17-3、pd50及x17-3、pd50转35S::CRL T2代植物叶绿体表型,标尺为10 μm;B. WT、x17-3、pd50及x17-3、pd50转35S::CRL T2代植物生长表型,标尺为1 cm;C.转基因拟南芥的PCR鉴定,M为DNA Marker,P为质粒对照。

    Figure  5.  Phenotypic analysis of chloroplasts and plant growth of x17-3 and pd50 complemented with a wild-type CRL transgene

    A, morphology of chloroplasts of x17-3 and pd50 complemented with a wild-type CRL transgene, scale bar is 10 μm; B, plant growth phenotypes of x17-3 and pd50 complemented with a wild-type CRL transgene; scale bar is 1 cm; C, PCR identification of x17-3 and pd50 transgenic plants, M means DNA marker, P means plasmid.

    图  6  CRL RNAi植物叶绿体表型和基因表达分析

    A. WT和CRL RNAi T2代植物叶绿体表型,标尺为10 μm;B. WT和CRL RNAi T2代植物生长表型,标尺为1 cm;C. CRL RNAi植物中CRL基因的半定量RT-PCR分析,三角形指示连续4倍梯度稀释cDNA模板的方向,PP2AA3基因为内参。

    Figure  6.  Phenotypic analysis of the chloroplasts and gene expression of CRL RNAi lines

    A, chloroplast morphology of CRL RNAi lines, scale bar is 10 μm; B, plant growth of CRL RNAi lines, scale bar is 1 cm; C, semi-quantitative RT-PCR analyses of CRL mRNA in different RNAi lines, the triangle indicates the four times serial dilution of cDNA template, PP2AA3 gene is used as the internal reference.

    图  7  WT、x17-3和pd50中光合色素含量分析

    平均值±标准差,n=4;**表示在P < 0.01水平上差异显著。

    Figure  7.  Analysis of photosynthetic pigments content of WT, x17-3 and pd50

    mean±SD, n=4. **refers to P < 0.01 by Student's t-test.

    表  1  本研究所用引物的序列

    Table  1.   Primers used in this study

    名称Name 序列Sequence
    CRL-4 5′- CTA CCA TGG GTA CCG AGT CGG GTT C -3′
    CRL-17 5′- CCT ACG CGT CTA GTC TTG CAA GAT GAG GGA C -3′
    CRL-7 5′- CTC ACT AAA TCC ACC ACT CGT AG -3′
    CRL-5 5′- CTA GTC TTG CAA GAT GAG GGA C -3′
    CRL-8 5′- CTT ACG CGT GTC TTG CAA GAT GAG GGA CC -3′
    CRL-RNAi1 5′- CCT CCA TGG GTA CCG AGT CGG G-3′
    CRL-RNAi2 5′- CTC AGA TCT GCT TGC TCC CTC GTA AAC TTC-3′
    CRL-RNAi3 5′- CCA ACG CGT ATG GGT ACC GAG TCG GG-3′
    CRL-RNAi4 5′- CCT AGA TCT CCG GTG AGA GAA CGA G-3′
    35S1 5′- CTG TCA CTT TAT TGT GAA GAT AGT GG -3′
    PP2AA3-1 5′- CCA AGC GGT TGT GGA GAA C -3′
    PP2AA3-2 5′- GAA CCA AAC ACA ATT CGT TGC TG -3′
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    表  2  突变体x17-3和pd50的遗传分析

    Table  2.   Genetic analysis of x17-3 and pd50

    杂交组合
    Cross combination
    总植株数
    Total plant number
    野生表型数
    WT plant number
    突变表型数
    Mutant plant number
    χ2
    x17-3×Ler 110 80 30 0.194
    pd50×Ler 131 103 28 0.735
    下载: 导出CSV
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出版历程
  • 收稿日期:  2017-12-04
  • 修回日期:  2018-03-20
  • 刊出日期:  2018-04-01

拟南芥叶绿体分裂突变体x17-3和pd50的基因鉴定与分析

doi: 10.13332/j.1000-1522.20170433
    基金项目:

    国家自然科学基金项目 31501090

    作者简介:

    李劲宇,博士生。主要研究方向:植物分子生物学。Email:lijinyu2009@hotmail.com 地址:100083北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院

    通讯作者: 刘小敏,讲师。主要研究方向:植物分子生物学。Email: liuxiaomin@bjfu.edu.cn 地址:同上; 高宏波,教授,博士生导师。主要研究方向:植物分子生物学。Email:gaobjfu@yahoo.com 地址:同上
  • 中图分类号: Q943.2

摘要: 目的叶绿体起源于内共生的蓝细菌,它通过与细菌类似的分裂方式进行增殖以维持遗传稳定。叶绿体分裂需要起源于原核和真核细胞的蛋白高度协调。拟南芥是研究叶绿体分裂的模式植物。在过去的20年中,人们对拟南芥叶绿体分裂蛋白复合体进行了初步的研究。然而, CRL基因在叶绿体分裂中的功能还不清楚。方法本研究通过突变体筛选和图位克隆鉴定得到2个新的crl突变体,分别为x17-3和pd50。通过显微观察和分子生物学方法分析了x17-3和pd50中叶绿体分裂表型、CRL基因剪接方式和mRNA含量以及叶绿素含量。最后通过转化互补和RNA干扰(RNAi)技术进一步确认了基因功能。结果x17-3和pd50的叶绿体形态与野生型相比有较大差异,表现为叶绿体体积增大,细胞中叶绿体数量减少。x17-3叶绿体数量为野生型的40%,而pd50叶绿体减少到只有1~4个,植物生长也受到明显抑制。通过粗定位及测序分析发现x17-3和pd50的CRL基因存在突变,突变位点在内含子并且影响mRNA剪接,最终导致阅读框移码突变。通过实时荧光定量PCR分析发现,pd50中CRL mRNA含量比野生型和x17-3明显降低。遗传互补实验进一步验证了x17-3和pd50中叶绿体分裂和植物生长抑制表型是CRL基因突变导致的。应用RNAi技术抑制CRL基因表达也能产生明显的叶绿体分裂异常表型。此外,pd50和x17-3的叶绿素含量比野生型明显降低。结论本项工作为进一步揭示CRL基因的功能提供新的研究材料和实验依据。

English Abstract

李劲宇, 高原, 张琴, 刘小敏, 高宏波. 拟南芥叶绿体分裂突变体x17-3和pd50的基因鉴定与分析[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(4): 86-95. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170433
引用本文: 李劲宇, 高原, 张琴, 刘小敏, 高宏波. 拟南芥叶绿体分裂突变体x17-3和pd50的基因鉴定与分析[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(4): 86-95. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170433
Li Jinyu, Gao Yuan, Zhang Qin, Liu Xiaomin, Gao Hongbo. Genetic identification and analysis of chloroplast division mutants x17-3 and pd50 in Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(4): 86-95. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170433
Citation: Li Jinyu, Gao Yuan, Zhang Qin, Liu Xiaomin, Gao Hongbo. Genetic identification and analysis of chloroplast division mutants x17-3 and pd50 in Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(4): 86-95. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170433
  • 叶绿体是植物细胞特有的细胞器,具有多种重要功能,广泛参与植物的生长发育过程。光合作用是叶绿体中进行的最重要的化学反应,为植物、动物和整个生物圈提供有机物和氧气。此外,叶绿体还参与脂肪酸、氨基酸、维生素等重要生物大分子的合成。叶绿体在10亿年前通过内共生的方式起源于原始的蓝细菌,并且与其具有相似的增殖方式[1-2]。叶绿体在植物体内通过二分裂的方式进行增殖,在这个过程中受到原核起源和真核细胞起源的多种蛋白质精细调控[3]。根据现有研究,叶绿体分裂时由原核起源的蛋白FtsZ1(Filamenting temperature-sensitive Z1)、FtsZ2、ARC6(ACCUMULATION AND REPLICATION OF CHLOROPLAST 6)、MinD和MinE等以及真核起源的蛋白PDV1(PLASTID DIVISION 1)、PDV2和ARC5等组成分裂复合体,介导叶绿体完成分裂[3]

    叶绿体在植物细胞内参与多种生物途径,其中有些途径可能参与叶绿体分裂的调控。外源添加细胞分裂素或超表达细胞分裂素下游转录因子基因CRF2、GRF5、GNCCGA1均促进叶绿体分裂[4-6]。转录因子CPD25/FRS4和CPD45/FHY3以异源二聚体的形式结合到ARC5基因启动子的特定区域并启动其表达[7]。因此,植物激素和一些环境条件通过调控叶绿体分裂基因表达影响叶绿体分裂。MSL2和MSL3是植物中2个同源的机械敏感性离子通道蛋白。msl2 msl3双突变体含有增大的叶绿体和非绿质体,这些增大的质体可以被高渗透压环境恢复[8-9]CDT1a编码一个细胞周期蛋白依赖的蛋白激酶,它同时定位于叶绿体和细胞核,参与细胞周期调控和叶绿体分裂[10]。脂肪酸合成途径中酮脂酰-酰基载体蛋白合酶Ⅰ(KASI)可能通过影响Min系统和FtsZ环定位影响叶绿体分裂[11]。抑制极长链脂肪酸(VLCFA)合成也影响叶绿体分裂[12]。脂质从内质网向叶绿体运输以及脂肪酸的去饱和可能影响叶绿体分裂[13-15]。磷脂PI4P可能通过PDV1来调节结合于叶绿体外膜的ARC5蛋白数量来调控叶绿体的分裂[16]

    此外,还有一些基因的突变体具有明显的叶绿体分裂异常表型,但其参与叶绿体分裂的分子机制还不是很清楚,如CRL[17]CRL基因功能最早是通过研究crl突变体了解的。第1个crl突变体是T-DNA插入突变体,表现为植株生长矮小,茎尖、根尖分生组织和胚细胞分裂异常;每个叶肉细胞中叶绿体数量减少到1~2个,甚至有些表皮细胞不含质体,叶绿体可以生长但不能正常完成分裂,因此体积增大[18]。通过荧光蛋白标记和蛋白酶保护实验发现,CRL蛋白定位于叶绿体外膜[18]。由上述实验结果推测CRL蛋白参与叶绿体分裂。后来在筛选1O2响应基因突变体实验中,CRL等位突变体caa33表现出活性氧胁迫响应基因持续高表达,并能增强病原菌抗性,因此推测CRL可能参与植物氧化胁迫响应[19]。最近的研究发现,crl突变体细胞周期调控出现异常,分生细胞提前分化,从而导致植物叶片变小[20]。转录组研究表明,crl突变体中大量胁迫响应基因被激活[20]CRL的同源基因广泛存在于植物基因组中。小立碗藓(Physcomitrella patens)中存在CRL的2个同源基因,分别为PpCRL1和PpCRL2。PpCRL1和PpCRL2存在功能冗余,双突变体中叶绿体数量减少,体积增大,同时植物生长受到抑制,说明苔藓植物中CRL具有和拟南芥CRL类似的功能[21]。虽然CRL的功能已有多方面的研究,但其参与叶绿体分裂的分子机制还不清楚。

    本研究通过甲基磺酸乙酯(EMS)诱变筛选到2个新的CRL基因等位突变体,并对它们的表型进行深入分析。pd50与已发表的crl突变体表型类似,x17-3突变表型程度较弱。通过对其mRNA剪接和含量分析探讨其表型差异的可能原因,并通过遗传互补和RNAi技术验证。本研究对x17-3和pd50突变体的鉴定与分析为深入研究CRL基因功能提供了新的材料。

    • 本研究所用拟南芥(Arabidopsis thaliana)为Columbia(Col)和Landsberg erecta(Ler)生态型。x17-3和pd50是经EMS诱变Col背景的突变体。拟南芥种子经75%乙醇消毒后播种在1/2 MS培养基上,4 ℃冰箱中放置3 d后放入人工气候室生长,7~10 d后移入培养土(草炭土、蛭石、珍珠岩体积比1:1:1)继续生长。培养条件为:21~22 ℃,光暗周期为16 h/8 h每天,光照强度为90~100 μmol/(m2·s)。

    • 叶绿体表型通过光学显微镜(OLYMPUS-CX21)观察。为了获得较好的观察效果,可以将叶片在3.5%的戊二醛溶液中固定1 h,0.1 mol/L Na2EDTA(pH=9.0)溶液中55 ℃水浴2 h后观察。取生长4周的拟南芥第3、4片真叶进行叶绿体数量统计分析,随机挑选30个叶肉细胞,用显微镜偶联的数码相机(北京睿智公司,MJ300C)拍照,用图像分析软件Image Analysis System 11.0采集并分析叶绿体表型信息。

    • 为了分析x17-3和pd50叶绿体分裂表型的遗传特性,将x17-3和pd50作为母本分别与Ler生态型的拟南芥进行杂交,观察F1代植物叶绿体表型以确定其显隐性。F1代植物自交得到F2代植物,观察其叶绿体分裂情况并进行统计分析。应用卡方检验,取显著水平P=0.05,χ(P=0.05)2=3.841,判断是否为单基因控制的孟德尔遗传。

      突变表型为隐性单基因控制时,选取30株F2代中的突变体,单株提取基因组DNA。等量混合后作为模板,用均匀分布于拟南芥5条染色体上且在Col和Ler之间具有明显多态性的23个分子标记进行PCR扩增。根据x17-3的粗定位结果,在5号染色体上CH5-18.07和CH5-23.08之间,开发2个分子标记CH5-19.13和CH5-21.30,分析30个单株的遗传背景。

    • 为了分析x17-3和pd50中CRL mRNA剪接情况,取生长4周的拟南芥植物叶片,采用RNApure高纯总RNA快速提取试剂盒(艾德莱)提取总RNA,然后用First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Fisher,#K1612)反转录合成cDNA第1链,以WT、x17-3和pd50 cDNA为模板,利用引物CRL-4和CRL-17经PCR扩增CRL基因编码区全长序列。PCR反应体系为:2×TSINGKE Master Mix 10 μL、引物1(5 μmol/L)2 μL、引物2(5 μmol/L)2 μL、cDNA 1 μL,加去离子水至20 μL。反应条件为:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,54 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,35个循环;72 ℃ 5 min。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测,目的条带切胶纯化后进行测序分析。

      为了检测x17-3和pd50中CRL基因mRNA含量,用实时荧光定量PCR对其表达量进行检测。利用拟南芥HTA9基因(AT1G52740)作为内参,使用UltraSYBR Mixture(康为世纪)试剂盒进行实时荧光定量PCR。PCR反应体系为:2×SYBR Green Ⅰ Mix 10 μL、CRL-7(5 μmol/L)1 μL、CRL-5(5 μmol/L)1 μL、cDNA 1 μL,加去离子水至20 μL。反应条件为:95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,采集信号,40个循环;熔解曲线分析如下:95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s。实时荧光定量PCR仪器为Prism 7500 FAST Real-time PCR System (Applied Biosystems)。所有实验均进行3次重复。Ct值采用相对定量2-Δ(ΔCt) 法分析,对结果进行t-检验分析。PCR引物序列见表 1

      表 1  本研究所用引物的序列

      Table 1.  Primers used in this study

      名称Name 序列Sequence
      CRL-4 5′- CTA CCA TGG GTA CCG AGT CGG GTT C -3′
      CRL-17 5′- CCT ACG CGT CTA GTC TTG CAA GAT GAG GGA C -3′
      CRL-7 5′- CTC ACT AAA TCC ACC ACT CGT AG -3′
      CRL-5 5′- CTA GTC TTG CAA GAT GAG GGA C -3′
      CRL-8 5′- CTT ACG CGT GTC TTG CAA GAT GAG GGA CC -3′
      CRL-RNAi1 5′- CCT CCA TGG GTA CCG AGT CGG G-3′
      CRL-RNAi2 5′- CTC AGA TCT GCT TGC TCC CTC GTA AAC TTC-3′
      CRL-RNAi3 5′- CCA ACG CGT ATG GGT ACC GAG TCG GG-3′
      CRL-RNAi4 5′- CCT AGA TCT CCG GTG AGA GAA CGA G-3′
      35S1 5′- CTG TCA CTT TAT TGT GAA GAT AGT GG -3′
      PP2AA3-1 5′- CCA AGC GGT TGT GGA GAA C -3′
      PP2AA3-2 5′- GAA CCA AAC ACA ATT CGT TGC TG -3′
    • 为了进一步验证x17-3和pd50突变体是CRL基因突变导致的,构建了p3302Y2-35S::CRL植物表达载体进行转基因遗传互补分析。首先用引物CRL-4和CRL-8,以WT-Col cDNA为模板扩增CRL基因编码区序列。PCR产物经NcoI和MluI酶切后与植物双元表达载体p3302Y2进行连接,构建p3302Y2-35S::CRL,然后用农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥x17-3和pd50突变体。T0代种子在含60 mg/L草铵膦(glufosinate-ammonium)的培养土中进行筛选,获得的T1代植株通过PCR鉴定后进行表型观察,PCR引物为35S1和CRL-8,单株收种后观察T2代植株表型及分离情况。

    • 应用RNAi技术抑制CRL基因表达,进而分析植物表型。RNAi载体构建过程如下:引物CRL-RNAi1和CRL-RNAi2扩增基因组DNA获得的PCR产物1用NcoI和BglⅡ酶切,引物CRL-RNAi3和CRL-RNAi4扩增基因组DNA获得的PCR产物2用MluI和BglⅡ酶切。PCR产物1和2与MluI和BglⅡ酶切的p3302Y2连接以构建p3302Y2-CRL-RNAi。然后通过农杆菌介导的花序浸染法转化Col生态型拟南芥并筛选转基因植物。

      为了分析CRL RNAi转基因株系中CRL mRNA含量,用1.4中的方法提取WT和转基因T2代植物叶片的总RNA并进行反转录合成cDNA,将此cDNA进行5次4倍梯度稀释作为模板,PCR扩增引物为CRL-7和CRL-5,反应体系和条件同1.4。以持家基因PP2AA3(AT1G13320)为内参,同时进行扩增,PCR反应为30个循环。

    • 称量生长4周的WT、x17-3和pd50叶片100 mg,每组样品取4个重复,液氮中研磨,然后加入1 mL无水甲醇,12 000 r/min离心10 min,取上清定容至2 mL。分光光度计测定A665A652A470,根据叶绿素浓度计算公式算出叶绿素a(Chl a)、叶绿素b(Chl b)、类胡萝卜素(Car)及总叶绿素(Chls(a+b))的浓度(μg/mL)。叶绿素浓度计算公式为[22-23]:Chl a=16.29A665-8.54A652,Chl b=30.66A652-13.58A665,Chls(a+b)=22.12A652+2.71A665,Car=(1 000A470-1.63Chl a -104.96Chl b)/221。根据叶片质量和溶液体积算出叶绿素含量,然后进行t-检验分析。

    • x17-3和pd50是通过EMS诱变,在M2代中筛选得到的2个叶绿体分裂异常突变体。叶绿体数量分析发现,野生型(WT)叶绿体大小均匀,呈椭球形,平均每个细胞中含有102个叶绿体。x17-3平均每个细胞中含有42个叶绿体,叶绿体数量约为WT的40%,在多数细胞中可见形状不规则、体积较大的叶绿体(图 1A)。pd50中的叶绿体数量明显减少,每个细胞中只有1~4个叶绿体(图 1A)。进一步统计分析发现,在WT中叶绿体数量和细胞面积呈正相关;x17-3叶绿体数量和细胞面积也能维持正相关,但叶绿体数量较WT明显减少;而pd50叶绿体数量和细胞面积没有相关性(图 1B)。由此可见,x17-3和pd50突变体叶绿体分裂出现异常,导致叶绿体数量显著减少。

      图  1  x17-3和pd50突变体的叶绿体分裂和植物生长表型分析

      Figure 1.  Phenotype analysis of the chloroplast division and plant growth in x17-3 and pd50 mutant

      观察x17-3和pd50植物生长情况发现,与WT相比,x17-3生长受到轻微影响,而pd50植物生长受到严重抑制(图 1C),说明这2个突变体植物生长也出现异常。

    • 为了分析x17-3和pd50叶绿体突变表型的遗传情况,将其分别与Ler生态型拟南芥进行杂交。F1代叶绿体分裂和植物生长表现为野生型表型,F2代植物叶绿体分裂表型统计见表 2,通过卡方检验,x17-3和pd50叶绿体分裂表型符合孟德尔遗传。所以这2个突变体是单基因控制的隐性遗传。

      表 2  突变体x17-3和pd50的遗传分析

      Table 2.  Genetic analysis of x17-3 and pd50

      杂交组合
      Cross combination
      总植株数
      Total plant number
      野生表型数
      WT plant number
      突变表型数
      Mutant plant number
      χ2
      x17-3×Ler 110 80 30 0.194
      pd50×Ler 131 103 28 0.735

      为了鉴定x17-3的突变基因,在F2代群体中找到30株突变表型的植物,提取DNA后混合,进行粗定位分析。结果显示,突变基因与CH5-18.07和CH5-23.08分子标记紧密连锁。接着用这2个分子标记附近的4个分子标记分析30个F2单株的遗传背景。结果如图 2A所示,CH5-18.07处有5株为杂合,CH5-19.13处有1株为杂合,CH5-23.08处有5株为杂合,CH5-21.30处有1株为杂合。由此可见突变基因位于CH5-19.13和CH5-21.30之间(图 2B)。在此区间已知的与叶绿体分裂相关的基因为CRL,因此对x17-3中CRL基因进行了测序分析。结果发现在CRL基因编码区产生g—a突变(图 2C)。该突变位于CRL基因最后1个内含子中,可能影响基因mRNA剪接。

      图  2  x17-3突变体的基因粗定位与测序分析

      Figure 2.  Rough mapping and sequencing analysis of x17-3

      鉴于pd50突变体表现出明显的植物生长抑制和叶绿体分裂异常表型,我们推测可能是由CRL基因突变导致的。对CRL基因测序结果显示,在第1个内含子的最后1个碱基产生g—a突变(图 2C),该突变可能影响基因mRNA剪接。

    • 为了进一步分析CRL基因内含子突变对mRNA剪接的影响,我们分析了x17-3和pd50中CRL基因的mRNA序列。RT-PCR结果显示,x17-3能扩增出与WT大小类似的条带(图 3A),测序结果显示mRNA多了10 bp内含子序列,最终导致移码突变(图 3B)。pd50中mRNA出现2条条带,说明mRNA主要有2种剪接方式,分别命名为pd50(1)和pd50(2)(图 3A)。测序结果显示,pd50(1)mRNA缺少突变位点后8 bp的外显子,导致移码突变(图 3C)。pd50(2)中突变位点所在的内含子未被剪掉,存在于成熟mRNA中,最终导致移码突变(图 3C)。通过PCR产物条带亮度比较,pd50(1)为pd50突变体中CRL mRNA存在的主要形式(图 3A)。

      图  3  x17-3和pd50中CRL mRNA剪接分析

      Figure 3.  Splicing analysis of CRL mRNA in x17-3 and pd50

      移码突变后产生异常蛋白,mRNA可能被降解[24]。利用实时荧光定量PCR的方法分析x17-3和pd50中CRL mRNA含量,结果如图 4所示,x17-3中CRL基因表达没有降低,而pd50中基因表达明显降低,只有WT的15%。

      图  4  x17-3和pd50中CRL mRNA含量的实时荧光定量PCR分析

      Figure 4.  Comparison of the mRNA level of CRL gene in x17-3 and pd50 by real-time qRT-PCR analysis

    • 为了进一步验证x17-3和pd50中叶绿体分裂异常是由CRL基因突变引起的,我们进行了遗传互补分析。已有研究表明35S::CRL-GFP转基因可以恢复crl突变体的多种表型[18],因此构建了植物表达载体p3302Y-35S::CRL并分别转化x17-3和pd50。观察T1代和T2代转基因植物,野生型的CRL基因能恢复x17-3和pd50叶绿体分裂和植物生长异常表型(图 5)。通过PCR鉴定,互补转基因植物中均有外源CRL片段的转入(图 5C)。以上结果进一步证明x17-3和pd50出现的叶绿体分裂和植物生长异常的表型是由CRL基因突变导致的。

      图  5  x17-3和pd50转CRL基因互补表型分析

      Figure 5.  Phenotypic analysis of chloroplasts and plant growth of x17-3 and pd50 complemented with a wild-type CRL transgene

    • RNAi技术广泛应用于基因功能分析,因此构建了CRL RNAi转基因植物,分析抑制CRL基因表达对叶绿体分裂的影响。通过对3个独立转基因植物株系叶绿体表型分析发现,CRL基因表达降低可以明显抑制叶绿体分裂,叶绿体数量明显减少(图 6A)。与pd50相比,RNAi植物生长接近野生型水平(图 6B),说明CRL基因表达并没有完全被抑制。半定量RT-PCR分析CRL基因表达发现,不同转基因株系CRL基因表达呈现出不同程度降低,基本与叶绿体数量呈正相关(图 6C)。

      图  6  CRL RNAi植物叶绿体表型和基因表达分析

      Figure 6.  Phenotypic analysis of the chloroplasts and gene expression of CRL RNAi lines

    • 已有研究发现crl突变体中叶绿素含量会降低[18],因此我们测了x17-3和pd50叶片的叶绿素和类胡萝卜素含量。结果显示,与WT相比,pd50中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量明显下降,x17-3中叶绿素a和叶绿素b均有下降,但处于WT和pd50之间(图 7)。

      图  7  WT、x17-3和pd50中光合色素含量分析

      Figure 7.  Analysis of photosynthetic pigments content of WT, x17-3 and pd50

    • 高等植物叶绿体通过分裂的方式进行增殖。叶绿体分裂突变体是叶绿体分裂研究的重要实验材料。本研究鉴定了2个叶绿体分裂突变体x17-3和pd50,通过基因定位和测序分析发现它们均为CRL基因突变,并通过遗传互补和RNAi分析得到验证。

      与已发表的crlcaa33和crl-3等crl突变体相比,pd50具有类似的突变表型,表现为严重的叶绿体分裂异常和植物生长发育抑制[18-19, 25]x17-3具有较弱的突变表型,表现为叶绿体数量、植物生长和叶绿素含量都介于WT和pd50之间。x17-3的这些表型与其他crl突变体具有明显的程度差异,这为深入研究CRL的基因功能提供了新的材料。与pd50相比,x17-3突变位点在最后1个内含子,突变位点位于基因3′端,并且mRNA含量没有降低,可能还有部分功能。通过RNAi技术抑制CRL基因表达,可以不同程度抑制叶绿体分裂,但不影响植物生长,说明部分降低CRL基因表达与x17-3的叶绿体分裂表型类似。因此,与pd50和其他表型严重的crl突变体相比,x17-3和RNAi转基因植物可以作为新的材料研究CRL基因的功能。

      高等生物编码基因多存在内含子,mRNA前体通过剪接形成不含内含子的成熟mRNA,这个过程还可能存在选择性剪接,为生物体蛋白质提供了多样性[26]x17-3和pd50中CRL基因的突变均发生在内含子,因此推测突变可能影响mRNA剪接。通过RT-PCR分析mRNA序列发现,x17-3的突变位点变成新的内含子边界,使得成熟mRNA中保留了10 bp内含子,进而引起移码突变。为什么新形成的ag位点具有更高的剪接活性是值得深入研究的问题。pd50突变体中CRL突变基因主要存在2种形式的mRNA,即存在选择性剪接,其中应用下一个AG作为剪接位点为主要形式。外显子、内含子的确定以及选择性剪接都是生命体中广泛存在的重要现象,相关分子机制了解还十分有限。因此本研究可为mRNA成熟过程中的剪接机制研究提供素材。

      CRL基因广泛存在于高等植物基因组中,小立碗藓和拟南芥中的研究说明CRL在高等植物中功能保守。大多数叶绿体分裂突变体的植物生长发育均无明显异常。crl突变体同时影响叶绿体分裂和植物生长,因此推测CRL与其他叶绿体分裂蛋白功能不同,至于其分子机制还需要进一步研究。本项工作筛选并鉴定了2个新的拟南芥crl突变体,这为进一步揭示CRL基因的功能提供了新的研究材料和实验依据。

参考文献 (26)

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