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胡杨miR1444b在拟南芥中正调控植物抗旱性

李双 苏艳艳 王厚领 李惠广 刘超 夏新莉 尹伟伦

李双, 苏艳艳, 王厚领, 李惠广, 刘超, 夏新莉, 尹伟伦. 胡杨miR1444b在拟南芥中正调控植物抗旱性[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(4): 1-9. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180043
引用本文: 李双, 苏艳艳, 王厚领, 李惠广, 刘超, 夏新莉, 尹伟伦. 胡杨miR1444b在拟南芥中正调控植物抗旱性[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(4): 1-9. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180043
Li Shuang, Su Yanyan, Wang Houling, Li Huiguang, Liu Chao, Xia Xinli, Yin Weilun. Populus euphratica miR1444b positively regulates plants response to drought stress in Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(4): 1-9. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180043
Citation: Li Shuang, Su Yanyan, Wang Houling, Li Huiguang, Liu Chao, Xia Xinli, Yin Weilun. Populus euphratica miR1444b positively regulates plants response to drought stress in Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(4): 1-9. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180043

胡杨miR1444b在拟南芥中正调控植物抗旱性

doi: 10.13332/j.1000-1522.20180043
基金项目: 

国家自然科学基金项目 31600484

转基因生物新品种培育重大专项 2018ZX08021001

国家自然科学基金项目 31570308

国家自然科学基金项目 31770649

详细信息
    作者简介:

    李双。主要研究方向:植物抗逆分子生物学。Email:shuang_LI@bjfu.edu.cn 地址:100083北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院

    通讯作者:

    夏新莉,教授,博士生导师。主要研究方向:植物抗逆分子生物学。Email:xiaxl@bjfu.edu.cn 地址:同上

    尹伟伦,教授,博士生导师。主要研究方向:植物生理与生物技术。Email:yinwl@bjfu.edu.cn 地址:同上

  • 中图分类号: S718.43;S792.119;Q943.2

Populus euphratica miR1444b positively regulates plants response to drought stress in Arabidopsis thaliana

  • 摘要: 目的miR1444b是木本植物特异miR1444家族中的一员,能够参与植物对金属胁迫的响应,但在干旱胁迫响应中的功能尚不明确。方法本实验克隆得到了胡杨MIR1444b基因(peu-MIR1444b)及其启动子(pro-peu-MIR1444b),将peu-MIR1444b基因在模式植株拟南芥中过表达,对转基因植株进行正常浇水、甘露醇模拟干旱和自然干旱条件处理,研究peu-MIR1444b的功能。结果克隆得到的pro-peu-MIR1444bpeu-MIR1444b与Phytozome数据库收录的毛果杨基因组序列相似性分别为99.61%和98.82%。利用PlantCARE数据库分析发现,pro-peu-MIR1444b序列中包含逆境相关的TC-rich repeats元件和受干旱诱导的MYB结合位点MBS。实时荧光定量PCR分析显示miR1444b在转基因拟南芥中表达量显著高于野生型,预测的靶基因葡聚糖合成酶Ⅳ(AT3G14570.2)表达量明显下调,初步确定葡聚糖合成酶Ⅳ在拟南芥中被peu-miR1444b负调控。在250 mmol/L甘露醇模拟的干旱胁迫条件下,转基因拟南芥株系TG-2和TG-5萌发率分别显著高于野生型20.83%和26.67%,根长分别显著高于野生型56.83%和52.60%(P < 0.05)。土壤自然干旱8 d测得转基因拟南芥的光合速率、气孔导度、叶片水分利用效率、PSⅡ最大光化学效率和过氧化物酶(POD)活性均显著高于野生型(P < 0.05)。结论胡杨miR1444b可以促进根系生长增加植物的吸水能力,负调控葡聚糖合成酶Ⅳ提高植物的渗透调节能力,维持植物在水分亏缺条件下的光合效率,保证植株正常生长,在拟南芥中正调控植物抗旱性。
  • 图  1  胡杨MIR1444b前体与phytozome上预测的ptr-MIR1444b序列比对

    Figure  1.  Comparison of P. euphratica MIR1444b precursor with that of P. trichocarpa

    图  2  预测的miR1444b靶基因AT3G14570.2相对表达量分析

    Col-0为野生型,TG-1、TG-2和TG-5分别为转基因株系1、2和5号。每个实验设置3个重复,每个数值均为3组实验数据的平均值,误差线代表标准差。不同小写字母表示P < 0.05水平差异显著。下同。

    Figure  2.  Analysis of relative gene expression of predicted miR1444b target gene AT3G14570.2

    Col-0 is wild type, TG-1, TG-2 and TG-5 are transgenic lines 1, 2 and 5, respectively. Three replicates were set up for each independent experiment, each of which was an average of three experimental sets of data and error bars representing standard deviation. Different lowercase letters indicate significant difference at P < 0.05 level. The same below.

    图  3  拟南芥在甘露醇处理下的萌发率和根长统计分析

    A.1/2MS培养基上种子萌发率;B.1/2MS+250 mmol/L甘露醇培养基上种子萌发率;C.1/2MS培养基上生长8 d的根长;D.1/2MS培养基+250 mmol/L甘露醇培养基上生长8 d的根长。每个实验设置3个重复,每个数值均为3组实验数据的平均值,误差线代表标准差;下同。

    Figure  3.  Analysis of A. thaliana germination rate and root length under mannitol treatment

    A, seed germination rate on 1/2 MS medium; B, seed germination rate on 1/2 MS medium with 250 mmol/L mannitol; C, root length after 8 days of growth on 1/2 MS medium; D, root length after 8 days of growth on 1/2 MS with 250 mmol/L mannitol. Three replicates were set up for each independent experiment, each of which was an average of three experimental sets of data and error bars represented standard deviation; the same below.

    图  4  自然干旱和复水后拟南芥光合指标测定

    A.干旱以及复水之后拟南芥的生长状况;B~D.正常浇水、干旱8 d、复水3 d野生型和转基因拟南芥的光合速率、气孔导度、叶片水分利用效率的变化。

    Figure  4.  Measurement of A. thaliana photosynthesis indexes after natural soil drought and rewatered conditions

    A, Growth status of A. thaliana after drought and rewatered conditions; B-D, measurement of photosynthetic rate, stomatal conductance and water use efficiency of wild-type and transgenic A. thaliana under normal watering, drought for 8 days and rewatered for 3 days.

    图  5  PSⅡ最大光化学效率和POD活性测定

    A.自然干旱和复水后拟南芥PSⅡ最大光化学效率;B.自然干旱和复水后过氧化物酶活性。

    Figure  5.  PSⅡ maximum photochemical efficiency and POD activity determination

    A, PSⅡ maximum photosynthetic efficiency of A. thaliana after natural drought and rewatering; B, peroxidase activity of A. thaliana after natural drought and rewatering.

    表  1  peu-MIR1444b基因启动子顺式作用元件分析

    Table  1.   Cis-acting element analysis of peu-MIR1444b gene promoter

    顺式作用元件
    Sitename
    序列
    Sequence
    功能
    Function
    AE-box AGAAACAT Part of a module for light response
    ATCT-motif AATCTAATCT Part of a conserved DNA module involved in light responsiveness
    CAAT-box CAATT Common cis-acting element in promoter and enhancer regions
    CAT-box GCCACT Cis-acting regulatory element related to meristem expression
    GA-motif ATAGATAA Part of a light responsive element
    MBS CAACTG MYB binding site involved in drought-inducibility
    MRE AACCTAA MYB binding site involved in light responsiveness
    TATA-box TATA Core promoter element around -30 of transcription start
    TC-rich repeats ATTTTCTCCA Cis-acting element involved in defense and stress responsiveness
    TGA-element AACGAC Auxin-responsive element
    ARE TGGTTT Cis-acting regulatory element essential for anaerobic induction
    CGTCA-motif CGTCA Cis-acting regulatory element involved in MeJA-responsiveness
    GAG-motif AGAGAGTCCC Part of a light responsive element
    GATA-motif AAGATAAGATT Part of a light responsive element
    TC-rich repeats GTTTTCTTAC Cis-acting element involved in defense and stress responsiveness
    TCT-motif TCTTAC Part of a light responsive element
    TCATG-motif TGACG Cis-acting regulatory element involved in MeJA-responsiveness
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    表  2  拟南芥中预测的靶基因

    Table  2.   Potential target genes in A. thaliana

    靶基因名称
    Target gene
    互补序列
    Complementary sequence
    期望值
    Expectation
    翻译产物
    Translation product
    AT1G23440.2 GAACGUUGAUAGAGUGUGAU 3 类焦谷氨酰肽酶Ⅰ
    Pyroglutamyl peptidase I-like, ATGSL04
    AT3G14570.2 GAGCUUUGACAGAAUGUGGA 3 葡聚糖合成酶Ⅳ
    Glucan synthase-likeⅣ
    AT1G18830.1 GAUAGUUCACCGAAUGUGAA 3 类WD40重复超家族蛋白
    Transducin/WD40 repeat-like superfamily protein
    下载: 导出CSV
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出版历程
  • 收稿日期:  2018-01-30
  • 修回日期:  2018-03-16
  • 刊出日期:  2018-04-01

胡杨miR1444b在拟南芥中正调控植物抗旱性

doi: 10.13332/j.1000-1522.20180043
    基金项目:

    国家自然科学基金项目 31600484

    转基因生物新品种培育重大专项 2018ZX08021001

    国家自然科学基金项目 31570308

    国家自然科学基金项目 31770649

    作者简介:

    李双。主要研究方向:植物抗逆分子生物学。Email:shuang_LI@bjfu.edu.cn 地址:100083北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院

    通讯作者: 夏新莉,教授,博士生导师。主要研究方向:植物抗逆分子生物学。Email:xiaxl@bjfu.edu.cn 地址:同上; 尹伟伦,教授,博士生导师。主要研究方向:植物生理与生物技术。Email:yinwl@bjfu.edu.cn 地址:同上
  • 中图分类号: S718.43;S792.119;Q943.2

摘要: 目的miR1444b是木本植物特异miR1444家族中的一员,能够参与植物对金属胁迫的响应,但在干旱胁迫响应中的功能尚不明确。方法本实验克隆得到了胡杨MIR1444b基因(peu-MIR1444b)及其启动子(pro-peu-MIR1444b),将peu-MIR1444b基因在模式植株拟南芥中过表达,对转基因植株进行正常浇水、甘露醇模拟干旱和自然干旱条件处理,研究peu-MIR1444b的功能。结果克隆得到的pro-peu-MIR1444bpeu-MIR1444b与Phytozome数据库收录的毛果杨基因组序列相似性分别为99.61%和98.82%。利用PlantCARE数据库分析发现,pro-peu-MIR1444b序列中包含逆境相关的TC-rich repeats元件和受干旱诱导的MYB结合位点MBS。实时荧光定量PCR分析显示miR1444b在转基因拟南芥中表达量显著高于野生型,预测的靶基因葡聚糖合成酶Ⅳ(AT3G14570.2)表达量明显下调,初步确定葡聚糖合成酶Ⅳ在拟南芥中被peu-miR1444b负调控。在250 mmol/L甘露醇模拟的干旱胁迫条件下,转基因拟南芥株系TG-2和TG-5萌发率分别显著高于野生型20.83%和26.67%,根长分别显著高于野生型56.83%和52.60%(P < 0.05)。土壤自然干旱8 d测得转基因拟南芥的光合速率、气孔导度、叶片水分利用效率、PSⅡ最大光化学效率和过氧化物酶(POD)活性均显著高于野生型(P < 0.05)。结论胡杨miR1444b可以促进根系生长增加植物的吸水能力,负调控葡聚糖合成酶Ⅳ提高植物的渗透调节能力,维持植物在水分亏缺条件下的光合效率,保证植株正常生长,在拟南芥中正调控植物抗旱性。

English Abstract

李双, 苏艳艳, 王厚领, 李惠广, 刘超, 夏新莉, 尹伟伦. 胡杨miR1444b在拟南芥中正调控植物抗旱性[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(4): 1-9. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180043
引用本文: 李双, 苏艳艳, 王厚领, 李惠广, 刘超, 夏新莉, 尹伟伦. 胡杨miR1444b在拟南芥中正调控植物抗旱性[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(4): 1-9. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180043
Li Shuang, Su Yanyan, Wang Houling, Li Huiguang, Liu Chao, Xia Xinli, Yin Weilun. Populus euphratica miR1444b positively regulates plants response to drought stress in Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(4): 1-9. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180043
Citation: Li Shuang, Su Yanyan, Wang Houling, Li Huiguang, Liu Chao, Xia Xinli, Yin Weilun. Populus euphratica miR1444b positively regulates plants response to drought stress in Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(4): 1-9. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180043
  • 干旱是限制农林业生产的重要环境因子,国内外学者从分子、生理、生态等方面揭示植物对水分胁迫响应机制的研究逐步深入。探究植物在干旱胁迫下的响应机制,提高植物的抗旱能力,了解植物对干旱胁迫的应对策略,对于农林业的生产极为重要。

    胡杨(Populus euphratica)作为荒漠河岸林的主要建群种之一,自然分布于新疆南部、柴达木盆地西部、河西走廊等地,对干旱、盐渍化等逆境具有广谱适应性,逆境相关基因资源丰富[1]。已有研究证实,PebHLH35通过调节拟南芥(Arabidopsis thaliana)的气孔发育和光合作用提高植物抗旱性[2]PeCHYR1基因通过介导植物叶片气孔关闭从而提高杨树耐旱性[3];peu-miR473a在拟南芥中异源表达增强其抗脱水能力从而提高抗旱性[4];peu-miR156j和peu-miR169o均响应脱水和高盐逆境胁迫[5],且peu-miR156j在拟南芥中过表达后可以增强植物耐盐性[6]

    MicroRNAs(miRNAs)是一类由20~25个核苷酸组成的非编码小分子RNA,广泛存在于真核生物体内,通过与靶mRNA相结合从而发挥剪切或沉默靶mRNA的作用,进而在转录后水平调控基因功能。至2017年6月,miRBase数据库中(http://www.miRbase.org/Rlease21)已收录来自动物、植物和病毒的28 645条miRNA,这些miRNA可以在植物的生长发育各个阶段以及植物响应逆境胁迫过程中发挥重要作用,尤其是干旱胁迫方面[7-13]

    已有研究证实,毛果杨(Populus trichocarpa)在过量铜胁迫下,miR1444表达量下调,而靶基因表达量上调;铜缺失情况下,miR1444家族成员表达量均上调,其靶基因下调,同时植物体内锌元素含量明显上升[14];miR1444a通过下调靶基因多酚氧化酶的表达从而参与植物对逆境胁迫的响应[15];miR1444a可能存在Cu-Zn传感模式参与毛果杨对锌胁迫的响应。本文研究的miR1444b和miR1444a均属于miR1444家族,但成熟体序列不同,预测基因启动子区顺式作用元件不相重合。为探究胡杨miR1444b的抗旱机能,本研究克隆得到peu-MIR1444b基因启动子序列,对测序结果进行顺式作用元件分析;克隆peu-MIR1444b基因,转化哥伦比亚野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana, Col-0),通过相关生理指标测定初步探究干旱胁迫下植物miR1444b发挥的功能,为深入探讨miR1444b基因提高植物抗旱性的分子机制奠定基础,同时为研究miR1444a基因功能提供参考。

    • 实验中用于基因克隆的胡杨材料为源自中国新疆地区,栽种于北京林业大学苗圃的1年生胡杨苗。拟南芥Col-0种子在超净台中用1%次氯酸钠消毒10 min后,无菌水冲洗5次,点播于1/2MS固体培养基(含有30 g/L蔗糖和6 g/L琼脂)上,4 ℃暗培养2 d后,置于22 ℃,16 h光照、8 h黑暗的环境中生长。将生长7 d的幼苗移栽于培养基质(营养土:草炭土:蛭石=2:2:1)中,于22 ℃,16 h光照、8 h黑暗,55%~65%的相对湿度的温室中生长。

      引物合成和DNA测序均在生工生物工程(上海)股份有限公司完成,DNA提取试剂盒、RNA提取试剂盒和TOPO-Blunt Simple连接试剂盒均购自北京艾德莱生物科技有限公司;大肠杆菌感受态TOP10和农杆菌感受态GV3101购自北京博迈德生物技术有限公司;cDNA第1链合成试剂盒(KR201)、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、荧光定量PCR试剂盒和DNA marker连接试剂盒均购自天根生化科技有限公司;T4-DNA连接酶、限制性核酸内切酶BamHI和Sac I、Taq酶均购自宝生物工程有限公司(大连);植物转化表达载体pCAMBIA1301保存于北京林业大学国家工程实验室。其他化学试剂均为国产分析纯,购置于北京蓝弋化工产品有限责任公司和北京中科瑞普生物化工科技有限公司。

    • 在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中选取毛果杨MIR1444b基因前约2 000 bp的非编码序列,利用DNAMAN软件设计一对扩增引物,上游引物:5′-CTCATGAGGGTTCTTGTGCTC-3′,下游引物:5′-GTCAAGCCAGCCAATCAATG-3′。用DNA提取试剂盒提取胡杨叶片总DNA,以此为模板在57 ℃的退火温度下进行克隆。回收扩增产物,与载体pCAMBIA1301连接后测序。其结果利用在线软件plantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/web-tools/plantcare/html/)分析。

    • 从miRBase数据库(www.mirbase.org)中下载MIR1444b茎环前体序列,利用DNAMAN软件设计一对扩增引物,同时在上下游引物的5′端分别加上BamHI(GGATCC)和Sac I(GAGCTC)酶切位点。上游引物为:5′-GGATCCACACTCCAGCTGGG-3′,下游引物为5′-GAGCTCAACTGGTGTCGTGGA-3′。以提取得到的胡杨叶片总DNA为模板,在60 ℃退火温度下克隆得到85 bp的前体片段,记作pre-peu-MIR1444b。连接零背景TOPO-Blunt Simple载体,将双酶切后含有粘性末端的表达载体片段和目的基因片段用T4-DNA连接酶连接,转化测序。

      将经过测序验证的pre-peu-MIR1444b连接到含CaMV35S的过表达载体pCAMBIA1301上,转化拟南芥[16]。种子置于含有30 mg/L潮霉素的1/2MS筛选培养基中筛选得到T3代转基因株系(Transgenic lines, TG),进行后续生理指标测定实验。

    • 取生长20 d的野生型和转基因拟南芥叶片液氮研磨,利用RNA提取试剂盒提取总RNA,并采用miRcute miRNA cDNA第1链合成试剂盒和FastKing RT Kit(With gDNase)逆转录试剂盒将RNA分别逆转录为与miRNA和mRNA互补的cDNA第1链。调节cDNA终浓度为80 ng/μL,进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR),在RNA水平鉴定miR1444b的相对表达量。

      利用软件psRNATarget(http://miRtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php)预测peu-miR1444b在拟南芥数据库(TAIR10)中的靶基因。根据预测得到的靶基因序列设计上下游引物,通过qRT-PCR对其靶向关系进行验证。

    • 将野生型(Col-0)和过表达的转基因拟南芥种子同时点播于甘露醇浓度为0或250 mmol/L的1/2MS固体培养基上,每个处理做3个重复,每个重复中每个株系点播56粒种子。暗培养2 d后置于光照16 h,黑暗8 h,22 ℃的恒温培养箱中培养,每12 h记录1次萌发率,连续记录4 d。同时选取在1/2MS固体培养基中萌发3 d的幼苗,在超净台中移栽到分别含有0或250 mmol/L甘露醇的1/2MS固体培养基上,测定拟南芥初始根长,竖直培养8 d再次测量根长[17]。同时将1/2MS固体培养基上生长8 d的拟南芥幼苗移栽到培养基质中,覆膜3 d后,于温室中正常培养。

    • 选取在同等条件下生长20 d、状况良好且一致的野生型和转基因株系进行自然干旱处理,浇足水后当天做为干旱第1天,设置9个重复。分别在正常浇水、干旱8 d、复水3 d时,利用Licor-6400便携式光合仪测量野生型和转基因株系的光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)和气孔导度,并根据PnTr计算植物叶片水分利用效率(WUE),其中WUE=Pn/Tr

    • 选取经过暗适应30 min后的拟南芥叶片,利用双通道PAM-100测量系统Dual-PAM-100测定正常浇水、干旱8 d、复水3 d条件下的PSⅡ最大光化学效率。

      以叶片为材料选用愈创木酚法测定正常浇水、干旱8 d和复水3 d时的过氧化物酶(POD)活性[18]。分别称取0.05 g野生型和peu-MIR1444b过表达植株的新鲜叶片,在预冷的研钵中加入0.5 mL预冷的磷酸缓冲液(PBS缓冲液pH7.8,50 mmol/L)冰浴研磨成匀浆,用0.5 mL相同的PBS冲洗研钵2次后转入2 mL离心管中。4 ℃、12 000 g下离心20 min,上清液即为酶粗提取液。在烧杯中加入50 mL PBS(pH6.0,0.2 mol/L)缓冲液和28 μL愈创木酚(2-甲氧基酚),加热搅拌至愈创木酚完全溶解,冷却后加入19 μL 30%的H2O2,混匀后即为反应混合液。取3 mL反应混合液加入40 μL酶粗提取液后立即在光吸收全波长酶标仪TECAN infinite M200中测定OD470值在40 s内的变化。以每分钟OD值变化(升高)0.01为1个酶活性单位(U),POD活性=(ΔA470·Vt)/(0.01WVst),单位为U/g。式中:ΔA470为反应时间内吸光度的变化,W为样品鲜质量(g),t为反应时间(min),Vt为提取酶液总体积(mL),Vs为测定时取用酶液体积(mL)。

    • 本文所有数据均使用SigmaPlot12.5和Excel软件统一处理,且利用SPSS17.0软件进行单因素方差分析(One Way ANOVA)。

    • 以胡杨基因组为模板,利用PCR克隆得到1 886 bp胡杨MIR1444b基因启动子序列(pro-peu-MIR1444b)后送测,并通过plantCARE网站对测序结果进行比对分析,相似性达到99.61%。pro-peu-MIR1444b中不仅含有TATA-box和CAAT-box等核心元件,还有大量的光响应元件(AE-box, ATCT-motif, GA-motif, GAG-motif, GATA-motif, TCT-motif)和胁迫响应元件(MBS, MRE, TC-rich repeats),这表明miR1444b的表达可能与植物的生长发育、逆境响应以及激素调节等有关(表 1)。

      表 1  peu-MIR1444b基因启动子顺式作用元件分析

      Table 1.  Cis-acting element analysis of peu-MIR1444b gene promoter

      顺式作用元件
      Sitename
      序列
      Sequence
      功能
      Function
      AE-box AGAAACAT Part of a module for light response
      ATCT-motif AATCTAATCT Part of a conserved DNA module involved in light responsiveness
      CAAT-box CAATT Common cis-acting element in promoter and enhancer regions
      CAT-box GCCACT Cis-acting regulatory element related to meristem expression
      GA-motif ATAGATAA Part of a light responsive element
      MBS CAACTG MYB binding site involved in drought-inducibility
      MRE AACCTAA MYB binding site involved in light responsiveness
      TATA-box TATA Core promoter element around -30 of transcription start
      TC-rich repeats ATTTTCTCCA Cis-acting element involved in defense and stress responsiveness
      TGA-element AACGAC Auxin-responsive element
      ARE TGGTTT Cis-acting regulatory element essential for anaerobic induction
      CGTCA-motif CGTCA Cis-acting regulatory element involved in MeJA-responsiveness
      GAG-motif AGAGAGTCCC Part of a light responsive element
      GATA-motif AAGATAAGATT Part of a light responsive element
      TC-rich repeats GTTTTCTTAC Cis-acting element involved in defense and stress responsiveness
      TCT-motif TCTTAC Part of a light responsive element
      TCATG-motif TGACG Cis-acting regulatory element involved in MeJA-responsiveness
    • 以胡杨基因组DNA为模板克隆得到的peu-MIR1444b基因前体长85 bp,经过多次扩增测序后与毛果杨数据库中的MIR1444b基因进行比对分析,同源性达到98.82%(图 1),存在一个单核苷酸多态性(SNP)位点,MIR1444b在胡杨和毛果杨中保守。转化拟南芥后经DNA初步检测得到转基因株系。

      图  1  胡杨MIR1444b前体与phytozome上预测的ptr-MIR1444b序列比对

      Figure 1.  Comparison of P. euphratica MIR1444b precursor with that of P. trichocarpa

    • 利用RNA提取试剂盒提取野生型和转基因株系RNA,加PolyA尾后进行反转录得到cDNA序列,利用miR1444b成熟体作为上游引物进行qRT-PCR[19]。结果表明,整合到拟南芥基因组中的peu-MIR1444b基因在转基因株系TG-1、TG-2、TG-5中表达水平最高,选取TG-1、TG-2、TG-5株系进行后续研究。

    • 在软件psRNATarget中预测peu-miR1444b存在于拟南芥数据库中的靶基因(表 2),并通过qRT-PCR进行初步鉴定。结果显示,转基因株系中AT3G14570.2表达量显著下降(图 2),而AT1G23440.2和AT1G18830.1的表达量在转基因株系中没有出现明显的下降趋势。这初步表明葡聚糖合成酶Ⅳ基因(AT3G14570.2)作为miR1444b在拟南芥中的靶基因,受到peu-miR1444的负调控,而AT1G23440.2和AT1G18830.1的靶向关系有待进一步验证。

      表 2  拟南芥中预测的靶基因

      Table 2.  Potential target genes in A. thaliana

      靶基因名称
      Target gene
      互补序列
      Complementary sequence
      期望值
      Expectation
      翻译产物
      Translation product
      AT1G23440.2 GAACGUUGAUAGAGUGUGAU 3 类焦谷氨酰肽酶Ⅰ
      Pyroglutamyl peptidase I-like, ATGSL04
      AT3G14570.2 GAGCUUUGACAGAAUGUGGA 3 葡聚糖合成酶Ⅳ
      Glucan synthase-likeⅣ
      AT1G18830.1 GAUAGUUCACCGAAUGUGAA 3 类WD40重复超家族蛋白
      Transducin/WD40 repeat-like superfamily protein

      图  2  预测的miR1444b靶基因AT3G14570.2相对表达量分析

      Figure 2.  Analysis of relative gene expression of predicted miR1444b target gene AT3G14570.2

    • 分别将野生型和转基因拟南芥种子点播到甘露醇浓度为0和250 mmol/L的1/2MS固体培养基中,统计种子萌发率和根的生长情况。结果表明,1/2MS培养基生长的野生型和转基因拟南芥萌发速率和根长均无明显差异(图 3A3C),且种子在48 h内全部萌发。在甘露醇浓度为250 mmol/L的1/2 MS固体培养基中,野生型拟南芥在36和48 h萌发率显著高于转基因拟南芥。最终野生型拟南芥萌发率为71.43%,而转基因株系TG-1、TG-2和TG-5最终萌发率分别为81.55%、86.31%和90.48%。其中TG-2和TG-5均显著高于野生型植株20.83%和26.67%,TG-1萌发率高于野生型14.17%,差异不显著(图 3B)。在甘露醇模拟的干旱环境中,转基因拟南芥TG-1、TG-2和TG-5根长分别高于野生型43.30%、56.83%、52.60%,达到极显著水平(图 3D)。

      图  3  拟南芥在甘露醇处理下的萌发率和根长统计分析

      Figure 3.  Analysis of A. thaliana germination rate and root length under mannitol treatment

    • 将温室正常培养20 d的拟南芥幼苗(Col-0、TG-1、TG-2、TG-5)做自然干旱处理,浇足水后当天作为干旱第1天,利用Li-6400便携式光合仪分别检测正常浇水、干旱8 d和复水3 d后的植株光合速率并拍照。结果表明,干旱8 d后的转基因植株长势优于野生型,复水后转基因植株恢复能力更强(图 4A)。

      图  4  自然干旱和复水后拟南芥光合指标测定

      Figure 4.  Measurement of A. thaliana photosynthesis indexes after natural soil drought and rewatered conditions

      Licor-6400便携式光合仪测定结果表明,正常浇水条件下,转基因植株较野生型光合能力更强,其中TG-5的光合速率和气孔导度分别显著高于野生型8.51%、48.01%。转基因株系TG-1、TG-2和TG-5在干旱8 d时,光合速率分别高于野生型17.13%、28.80%和74.26%,复水3 d后,光合速率分别高于野生型77.47%、69.32%和118.73%,均存在显著差异(图 4B)。TG-1、TG-2和TG-5干旱8 d时气孔导度与Col-0差异不显著,但复水3 d后,气孔导度分别显著高于野生型63.98%、39.93%和90.29%,差异达到显著水平(图 4C)。

      正常浇水条件下,TG-2和TG-5叶片水分利用效率极显著高于野生型91.91%、63.66%,TG-1与Col-0差异不显著。干旱8 d和复水3 d时,TG-2和TG-5叶片水分利用效率均显著高于Col-0,差异显著。TG-1在干旱8 d时叶片水分利用效率显著高于野生型48.66%,复水3 d时与野生型差异不显著。这些数据进一步说明,转基因株系在正常浇水、干旱8 d和复水3 d条件下具有更高的光合速率。

    • 利用双通道PAM-100测量系统Dual-PAM-100测定野生型和转基因拟南芥在正常浇水、干旱8 d、复水3 d时的PSⅡ最大光化学效率。结果显示,正常浇水情况下,PSⅡ最大光化学效率在野生型和转基因拟南芥中无明显差异。转基因拟南芥在干旱处理8 d和复水3 d后PSⅡ最大光化学效率均显著高于野生型(图 5A)。

      图  5  PSⅡ最大光化学效率和POD活性测定

      Figure 5.  PSⅡ maximum photochemical efficiency and POD activity determination

      方差分析显示,TG-2和TG-5在复水3 d后与正常浇水条件相比,PSⅡ最大光化学效率无显著差异。这表明转基因拟南芥具有较强的适应短期干旱能力。

    • 过氧化物酶(Peroxidase,POD)是植物体响应干旱胁迫时产生的活性氧代谢清除系统成员之一,表征植物在逆境胁迫下的抗氧化能力。从图 5B可以看出,正常情况下野生型和转基因株系的POD活性差异不显著。干旱8 d后,Col-0、TG-1、TG-2和TG-5的POD活性增加百分比分别为180.89%、484.51%、462.74%和385.12%,转基因株系的POD活性增加百分比显著高于野生型。复水3 d后,转基因株系TG-1、TG-2和TG-5较干旱8 d时的POD活性下降百分比分别为28.29%、9.42%和29.56%,而野生型POD活性继续上升。结果表明, 转基因拟南芥可以在干旱胁迫条件下快速产生过氧化物酶,清除体内过量的活性氧,保护植株免受干旱胁迫的损害,而野生型拟南芥响应较慢。

    • miR1444是木本植物特异基因家族的一员,首先发现于毛果杨基因组中。随后在胡杨、北京杨(Populus×beijngensis)、川杨(P.szechwanica)、旱柳(Salix matsudana)等杨柳科(Salicaceae)植物中经过高通量测序也检测到miR1444的存在[11, 20-22]。miR1444基因家族的研究主要集中在逆境胁迫对其表达量的影响方面,尤其是铜、锌等金属胁迫,在干旱、盐等非生物胁迫中研究甚少。研究表明,胡杨脱水4~6 h后,miR1444a明显上调。ptr-miR1444b与ptr-miR1444a存在序列分歧,在毛果杨中分别调控不同的多酚氧化酶基因[23]。因此本文从胡杨基因组中克隆得到MIR1444b基因并转化模式植物拟南芥,研究其在拟南芥中的抗旱生理效应。

      启动子中包含的顺式作用元件通过调控相关基因的表达,使植物适应不同的逆境胁迫。顺式作用元件ARE在厌氧诱导过程中起重要作用[24];ABA应答因子(ABRE)为干旱响应元件[25];ABF2和ABF3响应盐胁迫[26]。本文从胡杨基因组中克隆得到胡杨MIR1444b启动子序列,测序后利用plantCARE在线软件分析其顺式作用元件。分析结果显示,启动子区除包含光响应元件外,还含有受干旱诱导的MYB结合位点MBS,防卫和胁迫相关的TC-rich repeats元件。初步猜测peu-miR1444b的表达受干旱胁迫诱导,为MIR1444b基因功能研究奠定了理论基础。

      利用生物信息学方法预测miR1444b在拟南芥中的靶基因并对其进行初步验证。验证结果说明, 编码葡聚糖合成酶Ⅳ的AT3G14570.2基因是miR1444b在拟南芥中的靶基因。葡聚糖合成酶Ⅳ具有葡聚糖合成酶活性,可催化尿苷二磷酸葡萄糖(uridine diphosphate glucose,UDPG)合成葡聚糖[27]。蔗糖合成酶可催化可逆反应:蔗糖+UDP$ \rightleftharpoons$果糖+UDPG,催化活性偏向于蔗糖裂解反应[28]。因此植物体内UDPG可以在由UDP焦磷酸化酶催化UTP和葡萄糖-1-磷酸合成,也可以来源于蔗糖分解。转基因株系中MIR1444b基因的过表达,降低了其靶基因葡聚糖合成酶Ⅳ的表达水平,葡聚糖合成被抑制。故推测miR1444b对葡聚糖合成酶Ⅳ的负调控,可能导致植物积累UDPG,蔗糖合成酶水解活性被抑制,植物渗透调节能力增加,peu-MIR1444b过表达株系耐旱性提高。但其对干旱环境的响应机制仍需进一步验证。

      本研究将胡杨基因组中克隆得到的peu-MIR1444b基因转化到拟南芥基因组中。在甘露醇模拟的干旱条件下,转基因植株虽萌发时间较晚,但最终萌发率和根长均显著高于野生型。这说明转基因植株可以较快响应干旱胁迫,通过减缓萌发速度适应干旱环境,萌发后为了维持自身正常生命活动,增加根长,增加植株的吸水能力,从而维持植株在逆境下的生长。

      土壤干旱条件下,peu-MIR1444b过表达株系与野生型株系气孔导度差异不显著,但前者叶片水分利用效率、光合速率和PSⅡ最大光化学效率均显著高于野生型,因此peu-MIR1444b的过表达可以通过提高植物叶片水分利用效率从而提高植物的光合速率和PSⅡ最大光化学效率。复水3 d后,TG-1叶片水分利用效率与Col-0差异不显著,但气孔导度显著高于Col-0,TG-1通过提高气孔导度,进而提高了植物的光合速率和PSⅡ最大光化学效率。复水3 d后的TG-2和TG-5通过提高气孔导度和叶片水分利用效率从而提高植物的光合速率和PSⅡ最大光化学效率。综上所述,转基因株系通过提高气孔导度和叶片水分利用效率,从而提高植株对干旱环境的适应能力。

      POD作用具有双重性,一方面在逆境初期表达,清除H2O2,表现为保护效应;另一方面在逆境后期表达,通过参与ROS的生成引发膜脂过氧化作用,表现为伤害效应[29]。POD活性的测定结果表明,peu-MIR1444b过表达株系能够在干旱环境中,快速产生较多的过氧化物酶,清除植物体内多余的H2O2,保护生物膜的功能进而维持自身较高的光合速率。复水后,转基因株系的POD活性开始下降,而野生型株系的POD活性继续上升,对自身产生伤害效应,故复水后野生型光合相关指标恢复能力显著弱于转基因株系。

      综上所述,胡杨miR1444b在水分亏缺条件下通过促进根系生长增加植株的吸水能力,负调控葡聚糖合成酶Ⅳ提高植物渗透调节能力来维持植物光合效率,进而维持植株正常生长,在拟南芥中正调控植物抗旱性。

参考文献 (29)

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