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树种内自然群体间的地理变异(geographic variation)在18世纪中叶已被认识，欧洲和北美在20世纪初开展了系统研究，揭示了种内不同原产地种群间在生长与适应性等遗传变异的普遍性，并在树种地理变异规律的研究基础上，通过种子区(seed zone)和育种区(breeding zone)区划规定了各产地种子的安全调拨与利用范围[1]。油松(Pinus tabuliformis)是我国北方分布广泛的重要乡土用材树种。山西省是我国油松分布的中心，属于油松种子区的中部区和北部区[2]，也是周边省区油松人工林培育的重要种源。据调查，京、冀、辽等地自20世纪30年代至80年代营建的油松人工林种子多来自山西省，但具体种源不清。研究显示油松不同地理种源在河北与辽宁的适应性与生长表现均有极显著差异[3-5]，油松的种源选择对于人工林质量十分重要。山西省呈南北走向，天然油松主要分布在太行山、吕梁山、中条山、关帝山和管涔山等山脉，山脉间有平原与农区形成的地理隔离，不同山脉油松地理种群的进化具有相对独立性。对五大山脉天然林分的调查[6]及其子代对比试验结果显示，不同山脉油松地理种群间生长差异十分显著，而在山脉内差异不明显[7]，说明山脉间种群变异是山西省油松变异的主要来源。
从分子水平进一步揭示山西省不同山脉油松地理种群间的遗传差异、遗传结构与地理系统，对该油松核心区种质资源的保育和改良有重要参考价值。研究者分别用RAPD和ISSR标记，以山西5个山脉油松种群各一个林分为样本做了遗传多样性研究，发现山西天然油松种群变异主要在种群内[8]；利用线粒体DNA单倍型对油松全分布区代表性种群分析显示山西油松有3个种群属分布区最广的单倍型组内[9]，对进一步认识山西省油松种群遗传变异提供了有利参考。由于RAPD和ISSR标记存在随机性和非共显性的局限[10-11]，基于测序技术的SSR标记已成为目前生物群体遗传研究更可靠有效的分子检测手段，并且广泛运用于植物群体遗传结构和遗传多样性分析中[12-16]。从引种区油松林分的种源溯源考虑，标记的可靠性是其重要的技术依据。本文借助开发的油松特异SSR标记和群体遗传分析方法，以多林分群体为山脉样本，进一步解析山西五大山脉油松地理种群的(1)分子变异特征和遗传多样性；(2)地理种群的遗传结构；(3)阐明种群间的地理系统；(4)探讨影响种群遗传多样性因素及其与林分生长的可能联系，并为引种区油松人工林种质溯源研究筛选更有效的地理种群鉴别SSR引物，为优良种源选择利用等提供技术依据。
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供试各山脉油松地理种群样本为各山脉2个以上林分群体的混合样本，每个林分随机样本数10个左右。各种群分析所用针叶样品均采自山西天然林分子代对比试验林[7]。代表山脉分别为管涔山(GCS)、中条山(ZTS)、太岳山(TYS)、关帝山(GDS)和太行山(THS)林区。供试林分均为各山脉面积较大的优良天然林，并且为当地人工造林的采种林分。其中GCS和GDS种群样本分别来自6个不同林分，THS种群样本来自3个林分，TYS和ZTS种群样本分别来自2个林分。供试油松山脉种群的地理位置、气候条件和样本数见表 1。
表 1 供试油松山脉种群地理位置、气候条件和样本数
Table 1. Geographical location, climatic conditions and sample number of the Pinus tabuliformis mountain range populations to be tested
山脉
Mountain range经度范围
Longitude range纬度范围
Latitude range年均温
Annual mean temperature/℃1月均温
Average temperature in January/℃7月均温
Average temperature in July/℃年均降雨量
Annual mean precipitation/mm样本数/林分数
Sample number/stand numberGCS 111°15′~112°33′E 38°10′~38°55′N 7.3 -8.7 21.5 447.6 52/6 GDS 110°40′~111°50′E 36°48′~37°42′N 8.4 -7.2 22.0 489.6 66/6 THS 113°24′~113°41′E 35°48′~38°47′N 7.1 -7.6 20.2 509.9 32/3 TYS 112°01′~112°06′E 36°37′~38°36′N 10.5 -5.3 24.2 402.5 20/2 ZTS 111°53′~112°08′E 35°32′~35°55′N 10.5 -3.4 23.2 567.8 18/2 注：GCS代表管涔山，GDS代表关帝山，THS代表太行山，TYS代表太岳山，ZTS代表中条山。下同。Notes: GCS stands for Guancen Mountain, GDS stands for Guandi Mountain, THS stands for Taihang Mountain, TYS stands for Taiyue Mountain, ZTS stands for Zhongtiao Mountain. The same below. -
秋季于山脉种群供试林分子代对比试验林中随机选取样株，各山脉采集样本数和林分数见表 1。采集样株当年生新枝1个(针叶样本50个以上)，分别标记和装袋。取回后放置在低温冰箱(-20℃)内保存备用。
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利用DNA提取试剂盒(艾德莱)分别从每个样株针叶中提取DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和纯度。
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本次引物的筛选是在实验室已有的松属(Pinus)引物的基础上[17]，选出有产物、主带明显的引物，再经反复筛选得到8对稳定扩增且多态性高的引物(表 2)。
表 2 油松PCR检测SSR引物
Table 2. SSR primers for PCR detection of P. tabuliformis
引物名称
Primer name前引物序列
Forward primer sequence(5′→3′)后引物序列
Back primer sequence(5′→3′)荧光修饰
Fluorescent modification片段长度
Fragment length/bpJ9 GTTTGCAGTGAAAGCATGAAAG GCACCAATTCCTTCTCAAATTC HEX 244~250 J10 GTCGACACTCCAGGGTAGATTC ATATCATCAGCTAATTGTGCGG TAMRA 254~257 J12 TATGCATGTAACGGTAGCCTTG GCAATTGTTCTATGGTCAGGGT ROX 471~477 J20 CACCTCCGTAGTTTGATGTTCC CGATGTATCGTGTACACAGCCT FAM 150~171 J29 AGTCCGAATGTCTTCTTTCTGC TATGGAACGAATCAGAGATGACG FAM 191~200 J42 AACCTGTCATCCAGTTCCTGTT TTGTCAAATTCCAATTCAGCAC TAMRA 251~269 J48 GAAGAGGAAGACGAAATGGATG CTTTACATTTACCGCCTCTGCT ROX 262~268 J50 TCATCCATTTCAATAGCACGAC GTAGCTGCTTGGCCTGATTATC HEX 235~244 -
PCR反应体系为20μL，包括2μL DNA样本，1μL前引物，3μL后引物，4μL荧光，10μL 2×TaqPCR MasterMix(Biomed)。PCR扩增反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，50~60℃退火30s，72℃延伸30s，循环20次；然后再94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，循环20次；最后72℃延伸5min；4℃保存。扩增产物用电泳仪(ABI370x1)进行电泳检测，获取所有扩增产物的峰型电泳图谱，用于后续分析。
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用Excel 2016软件对群体中等位标记频率差异进行卡方检验；运用POPGENE1.32软件分析遗传多样性参数观测等位标记数(Na)、有效等位标记数(Ne)、Shannon多样性指数(I)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、杂合性基因多样度的比率(FST)、个体相对于总居群的固定指数(FIT)、个体所在居群的固定指数(FIS)、基因流(Nm)，计算Nei氏遗传距离；运用NTSYS-pc2.10s软件生成遗传距离UPGMA聚类图并做Mental检测检验遗传距离与地理距离之间的关系；运用SPSS19.0软件分析遗传多样性参数与气候因子间的Pearson相关性。
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从5个山西省山脉油松种群的等位标记及频率看(表 3)，各位点等位标记数目范围为2~6个，平均单位点等位标记数目为3.375个。除J12位点在ZTS群体中为单态外，其余位点在各群体中均为多态性较高。相同位点的各等位标记频率在群体间有差异，其中低频基因差异较大。稀有等位标记在GDS中出现频率最高，其次为GCS，在ZTS中出现频率最低，这可能与群体林分样本量大小有关。
表 3 山西5山脉油松种群各位点等位标记频率
Table 3. Frequency of the mark in five mountain populations of P. tabliformis in Shanxi Province
标记Marker 群体Population 标记Marker 群体Population 位点
Loci等位标记
AlleleGCS GDS THS TYS ZTS 位点
Loci等位标记
AlleleGCS GDS THS TYS ZTS J9 A 0.144 2 0.242 2 0.218 8 0.150 0 0.166 7 J42 A 0.038 5 0.045 5 0.171 9 0.025 0 0.027 8 B 0.855 8 0.757 8 0.781 2 0.850 0 0.833 3 B 0.211 5 0.303 0 0.390 6 0.225 0 0.222 2 J10 A 0.692 3 0.676 9 0.609 4 0.675 0 0.750 0 C 0.740 4 0.628 8 0.406 2 0.750 0 0.750 0 B 0.307 7 0.323 1 0.390 6 0.325 0 0.250 0 D 0.000 0 0.022 7 0.000 0 0.000 0 0.000 0 J12 A 0.823 5 0.882 8 0.937 5 0.875 0 1.000 0 E 0.009 6 0.000 0 0.015 6 0.000 0 0.000 0 B 0.176 5 0.117 2 0.062 5 0.125 0 0.000 0 F 0.000 0 0.000 0 0.015 6 0.000 0 0.000 0 J20 A 0.040 0 0.072 6 0.048 4 0.075 0 0.093 8 J48 A 0.200 0 0.269 2 0.312 5 0.289 5 0.027 8 B 0.890 0 0.774 2 0.806 5 0.800 0 0.593 8 B 0.750 0 0.723 1 0.687 5 0.684 2 0.972 2 C 0.070 0 0.137 1 0.129 0 0.075 0 0.312 5 C 0.050 0 0.007 7 0.000 0 0.026 3 0.000 0 D 0.000 0 0.016 1 0.016 1 0.050 0 0.000 0 J50 A 0.000 0 0.015 2 0.000 0 0.000 0 0.000 0 J29 A 0.009 6 0.015 2 0.000 0 0.000 0 0.000 0 B 0.125 0 0.159 1 0.187 5 0.175 0 0.166 7 B 0.932 7 0.878 8 0.984 4 0.950 0 0.944 4 C 0.875 0 0.818 2 0.812 5 0.825 0 0.833 3 C 0.048 1 0.098 5 0.000 0 0.050 0 0.055 6 D 0.000 0 0.007 6 0.000 0 0.000 0 0.000 0 D 0.009 6 0.007 6 0.015 6 0.000 0 0.000 0 对5个山脉油松种群等位标记频率差异性进行卡方检测，结果见表 4，J42、J48位点等位标记频率在5个群体之间差异极显著(P < 0.01)；J12、J20位点等位标记频率差异显著(P < 0.05)；J9、J10、J29、J50位点等位标记频率差异不显著(P>0.05)。
表 4 8个位点等位标记频率差异显著性χ2检测表
Table 4. Eight pairs of polymorphic primers for chi-square detection
引物Primer J20 J9 J42 J12 J29 J50 J10 J48 P值P value 0.019* 0.344 0.002** 0.034* 0.452 0.857 0.676 0.007** 注：*代表群体中等位标记频率差异显著(P < 0.05)，**代表群体中等位标记频率差异极显著(P < 0.01)。Notes:* represents allelic frequency in populations is significantly different (P＜0.05),** represents allelic frequency in populations is very significantly different(P < 0.01). 根据Hartl[18]建议，通过卡方检测群体中等位标记频率差异显著水平可以反映群体是否存在遗传分化。故在之后的研究中，分别运用8对引物和4对差异性显著引物进行分析比较。
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对5山脉油松种群进行遗传多样性分析结果如表 5所示。8对引物分析结果显示，每个群体的观测等位标记数和有效等位标记数分别为2.13~3.13和1.42~1.64，平均2.63和1.51，其中观测等位标记数(Na)GDS最高，ZTS最低，有效等位标记数(Ne)THS最高，ZTS最低。观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)在5个群体中的变化范围分别为0.249~0.388和0.260~0.356，平均0.325和0.313，平均Ho稍高于He。Shannon多样性指数(I)变化范围为0.419~0.597，平均为0.518。从Ne、He和I 3个指标来看，GDS变异丰富，ZTS变异较低。4对差异显著引物分析结果与8对引物分析结果相似，且绝大多数参数值高于8对引物。
表 5 山西5山脉油松种群遗传多样性参数
Table 5. Genetic diversity parameters of five mountain populations of P. tabuliformis in Shanxi Province
山脉Mountain range Na Ne I Ho He 8对引物
Eight pair primers4对引物
Four pair primers8对引物
Eight pair primers4对引物
Four pair primers8对引物
Eight pair primers4对引物
Four pair primers8对引物
Eight pair primers4对引物
Four pair primers8对引物
Eight pair primers4对引物
Four pair primersGCS 2.7500 3.0000 1.4367 1.4992 0.5000 0.5733 0.3113 0.3198 0.2918 0.3264 GDS 3.1250 3.2500 1.5825 1.6464 0.5970 0.6485 0.3722 0.3860 0.3559 0.3774 THS 2.6250 3.2500 1.6442 1.8140 0.5536 0.6679 0.3876 0.4002 0.3407 0.3885 TYS 2.5000 3.0000 1.4854 1.5621 0.5209 0.6129 0.3030 0.2809 0.3175 0.3588 ZTS 2.1250 2.2500 1.4193 1.4670 0.4187 0.4178 0.2491 0.1788 0.2597 0.2531 均值Mean 2.6250 2.9500 1.5136 1.5977 0.5180 0.5841 0.3246 0.3131 0.3131 0.3408 注：Na.观测等位标记数；Ne.有效等位标记数；I. Shannon多样性指数；Ho.观测杂合度；He.期望杂合度。下同。Notes: Na, observed allelic marker number；Ne, effective allelic marker number；I, Shannon diversity index；Ho, observational heterozygosity；He, expected heterozygosity. The same below. -
对5山脉油松种群遗传分化分析结果见表 6。8个位点间的油松种群分化系数有一定差异，J48位点的分化程度最大(0.061)，J50位点的分化程度最低(0.0035)，8个位点分析种群间杂合性基因多样度的比率(FST)为0.0328，遗传变异主要在种群内发生(96.7%)。4个位点分析种群间FST为0.0519, 遗传变异也主要发生在种群内(94.8%)。根据Wright等[1]的建议，FST为0~0.05、0.05~0.15、0.15~0.25和大于0.25分别代表群体间的遗传分化很小、中等、较大和很大。按8对引物均值来考虑，种群间存在较低的遗传分化，从4对引物均值来考虑，群体间存在中等遗传分化。基因流(Nm)是衡量群体间基因产生流动的指标, 当Nm＞1时，则可以防止两个群体间由于遗传漂变引起的分化。8个SSR位点在5个种群中的Nm平均为7.381，4个SSR位点在5个群体中的Nm平均为4.570，均远远大于1，说明它们之间的基因流动较大。因此，这5个山脉种群不易因遗传漂变而引起遗传分化。
表 6 各位点在山西5山脉油松种群中的F统计量
Table 6. F-statistic for each locus in the five mountain populations of P. tabuliformis in Shanxi Province
标记Locus FIS FIT FST Nm J20 0.330 8 0.362 8 0.047 8 4.980 7 J9 -0.238 6 -0.226 0 0.010 1 24.383 3 J42 0.100 0 0.146 4 0.051 6 4.590 5 J48 -0.232 3 -0.157 1 0.061 0 3.848 0 J29 0.492 9 0.502 5 0.019 0 12.935 5 J50 0.000 5 0.004 0 0.003 5 70.972 6 J10 -0.482 8 -0.469 0 0.009 3 26.725 3 J12 0.014 5 0.055 6 0.041 6 5.755 2 8个位点平均值Mean value of eight locus -0.056 5 -0.021 9 0.032 8 7.380 8 4个位点平均值Mean value of four locus 0.053 8 0.102 9 0.051 9 4.570 3 注：FST.杂合性基因多样度的比率；FIT.个体相对于总居群的固定指数；FIS.个体所在居群的固定指数；Nm.基因流。Notes: FST, ratio of heterozygosity gene diversity; FIT, fixed index of individual relative to total population; FIS, fixed index of the population in which the individual resides; Nm, gene flow. -
种群间遗传距离分析结果如表 7。8对引物结果显示遗传距离变化范围为0.0032~0.0407，地理距离变化范围为82.30~314.10km。经过Mantel检验，5个山脉种群间地理距离和遗传距离存在显著相关性(r=0.69442，P=0.9448)。4对引物分析结果经过Mantel检验，也显示5个山脉种群间地理距离和遗传距离存在显著相关性(r=0.70447，P=0.9470)。4对引物可以获得与8对引物相似的遗传距离与地理距离关系信息。
表 7 油松种群遗传距离和地理距离
Table 7. Genetic distance and geographic distance among populations of P. tabuliformis in Shanxi Province
山脉名称Mountain name GCS GDS THS TYS ZTS GCS —— 155.570 3 200.878 1 106.797 6 314.101 4 GDS 0.006 7/0.009 8 —— 203.807 6 82.298 1 182.698 4 THS 0.022 9/0.041 9 0.011 2/0.017 2 —— 134.989 2 221.989 3 TYS 0.003 2/0.005 6 0.004 6/0.005 7 0.018 8/0.036 1 —— 208.215 3 ZTS 0.026 2/0.051 2 0.021 2/0.038 9 0.040 7/0.074 4 0.025 4/0.049 3 —— 注：表格左下方为油松种群遗传距离, 表格右上方为地理距离，km。遗传距离中“/”符号左方数据为8对引物分析结果，右方数据为4对引物分析结果。Notes: the bottom left of the table is the genetic distance of Pinus tabuliformis population. The upper right side of the table is geographic distance/km. The genetic distance data on the left of slash was analyzed by eight primers, and the genetic distance data on the right of slash was analyzed by four primers. 根据Nei氏遗传距离构建种群间UPGMA聚类图(图 1)。8对引物分析聚类结果显示，GCS和TYS先聚为一类，再与GDS聚为一类，之后与THS聚类，最后与ZTS聚类，说明GCS和THS亲缘关系最近，GCS与ZTS亲缘关系最远。4对引物聚类分析结果(图 1右)与8对引物计算遗传距离聚类结果(图 1左)相同，说明用筛选的4对引物可以获得与8对引物同样的种群间遗传差异的检测效果。
图 1 8对引物(左)/4对引物(右)分析油松种群的遗传距离UPGMA聚类图
Figure 1. Eight pairs of primers (left)/four pairs of primers (right) for analyzing genetic distance among populations of P. tabuliformis in Shanxi Province by UPGMA clustering
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对8对引物得出的遗传多样性参数和气象因子做了相关性分析(表 8)。虽然均未达到显著相关水平，但是观测等位标记数(Na)与1月均温相关系数绝对值大于0.7呈现出负相关的趋势，Shannon多样性指数(I)与1月均温相关系数绝对值大于0.6呈现负相关趋势，观测杂合度(Ho)与年均温、1月均温、7月均温相关系数绝对值均大于0.7呈现负相关趋势。
表 8 油松种群的遗传多样性参数与气象因子之间相关分析
Table 8. Correlation analysis on genetic diversity parameters and meteorological factors of P. tabuliformis populations
指标Index Na Ne I Ho He 8对引物
Eight pair of primers4对引物
Four pair of primers8对引物
Eight pair of primers4对引物
Four pair of primers8对引物
Eight pair of primers4对引物
Four pair of primers8对引物
Eight pair of primers4对引物
Four pair of primers8对引物
Eight pair of primers4对引物
Four pair of primers年均温Annual mean temperature -0.598 -0.662 -0.532 -0.565 -0.517 -0.581 -0.727 -0.790 -0.451 -0.532 1月均温Average temperature in January -0.761 -0.801 -0.430 -0.432 -0.644 -0.711 -0.709 -0.822 -0.539 -0.651 7月均温Average temperature in July -0.417 -0.511 -0.623 -0.671 -0.409 -0.457 -0.707 -0.710 -0.394 -0.430 年均降水Annual mean precipitation -0.367 -0.535 0.040 -0.040 -0.392 -0.535 -0.155 -0.277 -0.322 -0.503 年均降水与1月均温比值Ratio of annul mean precipitation and average temperature in January 0.780 0.922 0.470 0.459 0.776 0.875 0.722 0.831 0.693 0.830 年均降水与7月均温比值Ratio of annual mean precipitation and average temperature in July -0.118 -0.180 0.340 0.367 -0.115 -0.194 0.210 0.109 -0.057 -0.178 年均降水与年均温比值Ratio of annual mean precipitation and annual mean temperature 0.280 0.307 0.528 0.573 0.242 0.252 0.570 0.551 0.237 0.230 我们利用年降水量与温度的比值来反映生境水分相对状况。年均降水与1月均温比值和Shannon多样性指数(I)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)的相关性系数均为大于0.69的正相关；年均降水与年均温比值和各种群遗传多样性参数的正相关系数变化在0.23~0.57间，并与有效等位标记数(Ne)和Ho的正相关系数大于0.5，显示了一定的规律性；而年降水与7月均温比值和各种群遗传多样性参数的相关系数除与Ne相关在0.34~0.36外，与其他参数的相关系数多在0.1左右，没有规律性趋势。用4对引物相关性分析结果与用8对引物分析结果相同，并且相关系数绝对值更大，说明选出的4对引物同样能反映油松种群与气象因子的关系。
山西省的5个山脉种群遗传多样性参数与产地水热气象指标的相关分析结果显示：1月份的均温对于遗传多样性参数有较大影响，1月均温越低，种群的遗传多样性越高；而年均降水与1月均温比值越高则种群遗传多样性参数值亦高，其实质是生境水分相对状况对种群遗传多样性有更大影响。
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本研究结果显示了山西省油松种群具有较高的遗传多样性。在5个山脉中GDS油松种群的变异最丰富，ZTS种群变异较低。对各位点等位标记频率分析发现，等位标记频率在各种群间具有一定差异，这与李毳等[8]用RAPD和ISSR标记对山西5个山脉油松天然林分的分析结果相似，说明等位标记分布的差异是山西省山脉油松种群遗传多样性的主要来源。Shannon多样性指数(I)可评价遗传多样性的高低，指数越大，表明种群遗传多样性水平越高。李明等[19]用ISSR标记在对油松分布8省10地区的研究中得出平均I为0.2165。本研究8对引物分析结果和4对引物分析结果平均I分别为0.51804和0.58408，均高于0.2165和0.3085，说明山西油松遗传多样性较高，这与山西是油松分布中心区，具有油松最适宜生存环境有关。从遗传多样性的分析结果来看，5个山脉油松种群中GDS种群变异最丰富，ZTS种群变异较低，这与对华北5个地区油松种群研究得出的GDS种群的遗传多样性最高的结果相一致。GDS林区拥有优越的自然条件，植被类型众多且保存完整，气候条件适宜，对遗传变异的积累和维持有积极作用。
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对山西省山脉油松种群的遗传分化研究显示遗传变异主要发生在群体内且遗传距离和地理距离之间存在显著相关性。变异在地理上具有渐变性，说明该地区的油松种群变异与分化主要受选择、迁移等系统性遗传过程影响，显示了山西省的油松种群有来自同一基础种群的特征[1]，并说明山西省的油松种群有较宽的群体内遗传变异基础，且较其他地区的种群间遗传分化程度要低[9]，同时显示了利用SSR标记检测的山脉油松种群间遗传差异的客观合理性。用SSR标记分析种群遗传结构得出的遗传变异主要发生在群体内，与张新波等[7]得出的山脉间种群变异是山西省油松变异主要来源的结果不同，是因为生长性状的变异主要受生境综合因素适应性进化与种群的奠基者效应等因素影响，SSR标记的变异除了可能的进化效应外，相对地理隔离状态下的中性变异也占有重要地位，所以出现了与生长适应性不同的变异特点。利用SSR标记可有效揭示油松种群间遗传差异与种群遗传结构特点，并可为油松人工林的种源分析提供主要技术支撑。
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对油松全分布区研究发现温度是影响油松生长的重要因素[20]，而由于山西油松分布区地理大小的局限性，山西油松年均温和降水虽有不同，但是远远超出了天然林生长所需最低条件，气温和降水都不是其分布的限制因子，相反适宜的水热环境条件在维持遗传多样性上起了一定的促进作用[21]。因此，我们用水热比代表生境的相对水分状况，来分析有限地理区域内影响山脉油松地理种群遗传多样性的气象因素。研究发现山脉种群的遗传多样性有随1月均温降低而增加的趋势，但年均降水与1月均温比值和各种群的遗传多样性参数也为中等的正相关，这个结果说明了冬季低温减少了土壤贮存水分的散失，更利于春季天然更新的种子萌发和植株生长，而半湿润地区的春季干旱则恰是影响树木适合度的主要因素。年均降水与年均温比值和各遗传多样性参数的正相关趋势也说明，温度与降水的绝对量并不对种群遗传多样性构成限制条件，而水热的相对比值则是影响该区域油松地理种群遗传多样性的主要因素。山西省油松及河北、辽宁和内蒙古等省(区)油松林分在阴坡、半阴坡普遍比阳坡有更好的适合度与生长表现，这是因为阴坡和半阴坡的温度相对低于阳坡，使得土壤水分蒸发量较少，油松生长发育可有相对较多的水分利用。这对认识山西省内各山脉水热比对油松地理种群遗传多样性影响提供了参考。
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山西省内有丰富的油松种质资源和优质林分，是山西省及相邻省份的主要油松供种来源[7]。Chen等[9]利用叶绿体和线粒体DNA对30个来自油松全分布区的地理种群进行分析发现了种群间的变异与关联，并且提出了在最后一次冰川时期，由于独立的避难所的存在，而使中北部的油松得以保存，这就为山西是油松起源地之一提供了有力的证据。另有资料记载油松其他分布区如京、冀、辽的油松适生区的天然林种质多来自山西省，但是具体种源不清楚。因此，本研究对山西油松遗传结构的解析为油松种群溯源提供了理论基础。
对山西省天然油松林分的生长调查和天然林的子代对比试验结果显示[6-7]，位于GDS的油松种群有最好的林分表现与生长势，是山西省的优良种源，而且通过对各山脉油松地理种群的遗传多样性分析发现GDS种群的遗传多样性也相对较高。对油松无性系群体育种值与遗传多样性进行研究，结果显示高育种值的无性系群体其遗传多样性亦高[22]。虽然地理种群的遗传多样性与生长表现之间的关联缺乏研究报道，但也预示了该种源地油松种群在油松种质资源保育、改良与推广中可有较高的适合度与生产力。
此外，研究中我们分别用8对随机引物和4对差异显著引物分析了各山脉油松种群的遗传多样性与遗传结构，并且得到了两组引物趋势一致的结果，而差异显著引物对于种群遗传分析更有效，说明了Hartl[18]建议的合理性。SSR标记与ISSR、RAPD标记相比，后者或存在随机性和非共显性问题，SSR标记为共显性，变异区段测序更精确性，因此结果较已用标记分析结果更可靠。利用4对差异引物可以更高效分析种群遗传结构与遗传多样性，对进一步的引种地人工林种群溯源研究提供更经济有效的技术参考与支撑。
本研究采用的各山脉多个林分混合样本可以更好的代表山脉种群特点，未用林分进行分析主要是因为林分子代试验显示山脉种源间有显著差异而山脉内林分间没有显著差异，并且进一步人工林溯源分析也要以山脉种源为基础。利用SSR标记显示的山脉种群遗传变异及其与气象因子关系的客观合理性，也反映了该标记较其他完全显性标记更准确与有效。
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本研究发现山西省主要山脉油松地理种群间有相对较小的遗传分化和种群内有丰富的遗传多样性，利用SSR标记可以有效显示各种群的遗传结构特点，而筛选得到的有限差异显著标记能够更有效的用于油松种群的遗传分析。山西省主要山脉油松地理种群间随地理距离而发生遗传渐变，系统性过程为种群变异的主导进化力；生境气象因子的水热相对水平对种群遗传多样性有主导影响，相对较高的水热比利于种群保持较高的遗传多样性。研究显示的山西省主要山脉油松地理种群遗传变异规律与地理系统学关系将为该油松中心分布区的油松种质资源保育与利用提供有益的参考。
Genetic structure and geographic system of geographical population of Pinus tabuliformis mountain range based on SSR in Shanxi Province of northern China
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摘要:
目的分析油松种源区的遗传结构能够为油松起源探索和引种地人工林种群溯源等提供理论依据。 方法本文利用SSR分子标记分析了山西油松5个山脉地理种群的遗传结构和地理系统。试验方法分别用了8对多态性较高引物和4对卡方检测差异显著性引物进行分析。 结果结果显示：关帝山遗传变异最丰富，中条山遗传变异最低；8对引物分析显示5个山脉地理种群分化较小(FST=0.0328)，4对引物分析显示5个山脉种群存在中等程度分化(FST=0.0519)；5个山脉种群遗传距离和地理距离存在显著相关性；遗传多样性参数与1月均温有负相关趋势，年均降水与1月均温比值和遗传多样性参数有正相关趋势。 结论研究发现山西省主要山脉油松地理种群间有相对较小的遗传分化和种群内有丰富的遗传多样性；SSR标记可以有效显示各种群的遗传结构特点，而筛选得到的有限差异显著标记能更有效的用于油松的种群遗传分析；生境气象因子的水热相对水平对种群遗传多样性有主导影响，相对较高的水热比利于种群保持较高的遗传多样性。 Abstract:ObjectiveAnalysis of genetic structure of Pinus tabuliformis provenance can provide a theoretical basis for the exploration of the origin and trace to the source of Pinus tabuliformis artificial forest. MethodIn this paper, SSR molecular markers were used to analyze the genetic structure and geographic system of the five Pinus tabuliformis populations in Shanxi Province of northern China. The test methods were analyzed with eight pairs of polymorphic primers and four differentially significant primers for chi-square detection. ResultGenetic variation in Guandi Mountain was the most abundant, and that in Zhongtiao Mountain was the lowest. Eight pairs of primer analysis showed that the differentiation of five mountains was smaller(FST=0.032 8)and four pairs of primers analysis showed that there was a moderate degree of differentiation in five mountain populations(FST=0.051 9). There was a significant correlation between the genetic distance and geographical distance of the five mountain populations; the genetic diversity parameters had a negative correlation trend with temperature in January. The ratio of annual mean precipitation and temperature in January had a positive correlation trend with genetic diversity parameters. ConclusionThe study reveals that there are relatively small genetic differentiation and rich genetic diversity among the geographical populations of Pinus tabuliformis in the main mountains of Shanxi Province. SSR markers can effectively display the genetic structure characteristics of various populations, and the limited difference marked markers can be more effectively applied to the population genetic analysis of Pinus tabuliformis. The relative level of water and heat of habitat meteorological factors has a dominant influence on the genetic diversity of population, and a relatively high ratio of water and heat is conducive to maintaining a higher genetic diversity of population. -
Key words:
- Pinus tabuliformis /
- geographic population /
- SSR marker /
- genetic structure /
- genetic diversity /
- geographic system
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图 1 8对引物(左)/4对引物(右)分析油松种群的遗传距离UPGMA聚类图
Figure 1. Eight pairs of primers (left)/four pairs of primers (right) for analyzing genetic distance among populations of P. tabuliformis in Shanxi Province by UPGMA clustering
表 1 供试油松山脉种群地理位置、气候条件和样本数
Table 1. Geographical location, climatic conditions and sample number of the Pinus tabuliformis mountain range populations to be tested
山脉
Mountain range经度范围
Longitude range纬度范围
Latitude range年均温
Annual mean temperature/℃1月均温
Average temperature in January/℃7月均温
Average temperature in July/℃年均降雨量
Annual mean precipitation/mm样本数/林分数
Sample number/stand numberGCS 111°15′~112°33′E 38°10′~38°55′N 7.3 -8.7 21.5 447.6 52/6 GDS 110°40′~111°50′E 36°48′~37°42′N 8.4 -7.2 22.0 489.6 66/6 THS 113°24′~113°41′E 35°48′~38°47′N 7.1 -7.6 20.2 509.9 32/3 TYS 112°01′~112°06′E 36°37′~38°36′N 10.5 -5.3 24.2 402.5 20/2 ZTS 111°53′~112°08′E 35°32′~35°55′N 10.5 -3.4 23.2 567.8 18/2 注：GCS代表管涔山，GDS代表关帝山，THS代表太行山，TYS代表太岳山，ZTS代表中条山。下同。Notes: GCS stands for Guancen Mountain, GDS stands for Guandi Mountain, THS stands for Taihang Mountain, TYS stands for Taiyue Mountain, ZTS stands for Zhongtiao Mountain. The same below. 
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表 2 油松PCR检测SSR引物
Table 2. SSR primers for PCR detection of P. tabuliformis
引物名称
Primer name前引物序列
Forward primer sequence(5′→3′)后引物序列
Back primer sequence(5′→3′)荧光修饰
Fluorescent modification片段长度
Fragment length/bpJ9 GTTTGCAGTGAAAGCATGAAAG GCACCAATTCCTTCTCAAATTC HEX 244~250 J10 GTCGACACTCCAGGGTAGATTC ATATCATCAGCTAATTGTGCGG TAMRA 254~257 J12 TATGCATGTAACGGTAGCCTTG GCAATTGTTCTATGGTCAGGGT ROX 471~477 J20 CACCTCCGTAGTTTGATGTTCC CGATGTATCGTGTACACAGCCT FAM 150~171 J29 AGTCCGAATGTCTTCTTTCTGC TATGGAACGAATCAGAGATGACG FAM 191~200 J42 AACCTGTCATCCAGTTCCTGTT TTGTCAAATTCCAATTCAGCAC TAMRA 251~269 J48 GAAGAGGAAGACGAAATGGATG CTTTACATTTACCGCCTCTGCT ROX 262~268 J50 TCATCCATTTCAATAGCACGAC GTAGCTGCTTGGCCTGATTATC HEX 235~244
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表 3 山西5山脉油松种群各位点等位标记频率
Table 3. Frequency of the mark in five mountain populations of P. tabliformis in Shanxi Province
标记Marker 群体Population 标记Marker 群体Population 位点
Loci等位标记
AlleleGCS GDS THS TYS ZTS 位点
Loci等位标记
AlleleGCS GDS THS TYS ZTS J9 A 0.144 2 0.242 2 0.218 8 0.150 0 0.166 7 J42 A 0.038 5 0.045 5 0.171 9 0.025 0 0.027 8 B 0.855 8 0.757 8 0.781 2 0.850 0 0.833 3 B 0.211 5 0.303 0 0.390 6 0.225 0 0.222 2 J10 A 0.692 3 0.676 9 0.609 4 0.675 0 0.750 0 C 0.740 4 0.628 8 0.406 2 0.750 0 0.750 0 B 0.307 7 0.323 1 0.390 6 0.325 0 0.250 0 D 0.000 0 0.022 7 0.000 0 0.000 0 0.000 0 J12 A 0.823 5 0.882 8 0.937 5 0.875 0 1.000 0 E 0.009 6 0.000 0 0.015 6 0.000 0 0.000 0 B 0.176 5 0.117 2 0.062 5 0.125 0 0.000 0 F 0.000 0 0.000 0 0.015 6 0.000 0 0.000 0 J20 A 0.040 0 0.072 6 0.048 4 0.075 0 0.093 8 J48 A 0.200 0 0.269 2 0.312 5 0.289 5 0.027 8 B 0.890 0 0.774 2 0.806 5 0.800 0 0.593 8 B 0.750 0 0.723 1 0.687 5 0.684 2 0.972 2 C 0.070 0 0.137 1 0.129 0 0.075 0 0.312 5 C 0.050 0 0.007 7 0.000 0 0.026 3 0.000 0 D 0.000 0 0.016 1 0.016 1 0.050 0 0.000 0 J50 A 0.000 0 0.015 2 0.000 0 0.000 0 0.000 0 J29 A 0.009 6 0.015 2 0.000 0 0.000 0 0.000 0 B 0.125 0 0.159 1 0.187 5 0.175 0 0.166 7 B 0.932 7 0.878 8 0.984 4 0.950 0 0.944 4 C 0.875 0 0.818 2 0.812 5 0.825 0 0.833 3 C 0.048 1 0.098 5 0.000 0 0.050 0 0.055 6 D 0.000 0 0.007 6 0.000 0 0.000 0 0.000 0 D 0.009 6 0.007 6 0.015 6 0.000 0 0.000 0
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表 4 8个位点等位标记频率差异显著性χ2检测表
Table 4. Eight pairs of polymorphic primers for chi-square detection
引物Primer J20 J9 J42 J12 J29 J50 J10 J48 P值P value 0.019* 0.344 0.002** 0.034* 0.452 0.857 0.676 0.007** 注：*代表群体中等位标记频率差异显著(P < 0.05)，**代表群体中等位标记频率差异极显著(P < 0.01)。Notes:* represents allelic frequency in populations is significantly different (P＜0.05),** represents allelic frequency in populations is very significantly different(P < 0.01).
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表 5 山西5山脉油松种群遗传多样性参数
Table 5. Genetic diversity parameters of five mountain populations of P. tabuliformis in Shanxi Province
山脉Mountain range Na Ne I Ho He 8对引物
Eight pair primers4对引物
Four pair primers8对引物
Eight pair primers4对引物
Four pair primers8对引物
Eight pair primers4对引物
Four pair primers8对引物
Eight pair primers4对引物
Four pair primers8对引物
Eight pair primers4对引物
Four pair primersGCS 2.7500 3.0000 1.4367 1.4992 0.5000 0.5733 0.3113 0.3198 0.2918 0.3264 GDS 3.1250 3.2500 1.5825 1.6464 0.5970 0.6485 0.3722 0.3860 0.3559 0.3774 THS 2.6250 3.2500 1.6442 1.8140 0.5536 0.6679 0.3876 0.4002 0.3407 0.3885 TYS 2.5000 3.0000 1.4854 1.5621 0.5209 0.6129 0.3030 0.2809 0.3175 0.3588 ZTS 2.1250 2.2500 1.4193 1.4670 0.4187 0.4178 0.2491 0.1788 0.2597 0.2531 均值Mean 2.6250 2.9500 1.5136 1.5977 0.5180 0.5841 0.3246 0.3131 0.3131 0.3408 注：Na.观测等位标记数；Ne.有效等位标记数；I. Shannon多样性指数；Ho.观测杂合度；He.期望杂合度。下同。Notes: Na, observed allelic marker number；Ne, effective allelic marker number；I, Shannon diversity index；Ho, observational heterozygosity；He, expected heterozygosity. The same below.
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表 6 各位点在山西5山脉油松种群中的F统计量
Table 6. F-statistic for each locus in the five mountain populations of P. tabuliformis in Shanxi Province
标记Locus FIS FIT FST Nm J20 0.330 8 0.362 8 0.047 8 4.980 7 J9 -0.238 6 -0.226 0 0.010 1 24.383 3 J42 0.100 0 0.146 4 0.051 6 4.590 5 J48 -0.232 3 -0.157 1 0.061 0 3.848 0 J29 0.492 9 0.502 5 0.019 0 12.935 5 J50 0.000 5 0.004 0 0.003 5 70.972 6 J10 -0.482 8 -0.469 0 0.009 3 26.725 3 J12 0.014 5 0.055 6 0.041 6 5.755 2 8个位点平均值Mean value of eight locus -0.056 5 -0.021 9 0.032 8 7.380 8 4个位点平均值Mean value of four locus 0.053 8 0.102 9 0.051 9 4.570 3 注：FST.杂合性基因多样度的比率；FIT.个体相对于总居群的固定指数；FIS.个体所在居群的固定指数；Nm.基因流。Notes: FST, ratio of heterozygosity gene diversity; FIT, fixed index of individual relative to total population; FIS, fixed index of the population in which the individual resides; Nm, gene flow.
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表 7 油松种群遗传距离和地理距离
Table 7. Genetic distance and geographic distance among populations of P. tabuliformis in Shanxi Province
山脉名称Mountain name GCS GDS THS TYS ZTS GCS —— 155.570 3 200.878 1 106.797 6 314.101 4 GDS 0.006 7/0.009 8 —— 203.807 6 82.298 1 182.698 4 THS 0.022 9/0.041 9 0.011 2/0.017 2 —— 134.989 2 221.989 3 TYS 0.003 2/0.005 6 0.004 6/0.005 7 0.018 8/0.036 1 —— 208.215 3 ZTS 0.026 2/0.051 2 0.021 2/0.038 9 0.040 7/0.074 4 0.025 4/0.049 3 —— 注：表格左下方为油松种群遗传距离, 表格右上方为地理距离，km。遗传距离中“/”符号左方数据为8对引物分析结果，右方数据为4对引物分析结果。Notes: the bottom left of the table is the genetic distance of Pinus tabuliformis population. The upper right side of the table is geographic distance/km. The genetic distance data on the left of slash was analyzed by eight primers, and the genetic distance data on the right of slash was analyzed by four primers.
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表 8 油松种群的遗传多样性参数与气象因子之间相关分析
Table 8. Correlation analysis on genetic diversity parameters and meteorological factors of P. tabuliformis populations
指标Index Na Ne I Ho He 8对引物
Eight pair of primers4对引物
Four pair of primers8对引物
Eight pair of primers4对引物
Four pair of primers8对引物
Eight pair of primers4对引物
Four pair of primers8对引物
Eight pair of primers4对引物
Four pair of primers8对引物
Eight pair of primers4对引物
Four pair of primers年均温Annual mean temperature -0.598 -0.662 -0.532 -0.565 -0.517 -0.581 -0.727 -0.790 -0.451 -0.532 1月均温Average temperature in January -0.761 -0.801 -0.430 -0.432 -0.644 -0.711 -0.709 -0.822 -0.539 -0.651 7月均温Average temperature in July -0.417 -0.511 -0.623 -0.671 -0.409 -0.457 -0.707 -0.710 -0.394 -0.430 年均降水Annual mean precipitation -0.367 -0.535 0.040 -0.040 -0.392 -0.535 -0.155 -0.277 -0.322 -0.503 年均降水与1月均温比值Ratio of annul mean precipitation and average temperature in January 0.780 0.922 0.470 0.459 0.776 0.875 0.722 0.831 0.693 0.830 年均降水与7月均温比值Ratio of annual mean precipitation and average temperature in July -0.118 -0.180 0.340 0.367 -0.115 -0.194 0.210 0.109 -0.057 -0.178 年均降水与年均温比值Ratio of annual mean precipitation and annual mean temperature 0.280 0.307 0.528 0.573 0.242 0.252 0.570 0.551 0.237 0.230
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