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胡杨PePEX11基因参与调节盐胁迫下拟南芥的抗氧化能力

姚琨 练从龙 王菁菁 王厚领 刘超 尹伟伦 夏新莉

姚琨, 练从龙, 王菁菁, 王厚领, 刘超, 尹伟伦, 夏新莉. 胡杨PePEX11基因参与调节盐胁迫下拟南芥的抗氧化能力[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(5): 19-28. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180086
引用本文: 姚琨, 练从龙, 王菁菁, 王厚领, 刘超, 尹伟伦, 夏新莉. 胡杨PePEX11基因参与调节盐胁迫下拟南芥的抗氧化能力[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(5): 19-28. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180086
Yao Kun, Lian Conglong, Wang Jingjing, Wang Houling, Liu Chao, Yin Weilun, Xia Xinli. PePEX11 functions in regulating antioxidant capacity of Arabidopsis thaliana under salt stress[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(5): 19-28. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180086
Citation: Yao Kun, Lian Conglong, Wang Jingjing, Wang Houling, Liu Chao, Yin Weilun, Xia Xinli. PePEX11 functions in regulating antioxidant capacity of Arabidopsis thaliana under salt stress[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(5): 19-28. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180086

胡杨PePEX11基因参与调节盐胁迫下拟南芥的抗氧化能力

doi: 10.13332/j.1000-1522.20180086
基金项目: 

国家自然科学基金项目 31570308

国家科技支撑计划项目 2015BAD07B01

国家自然科学基金项目 31770649

国家自然科学基金项目 31600484

详细信息
    作者简介:

    姚琨。主要研究方向:植物抗逆分子生物学。Email: kunyao@bjfu.edu.cn   地址: 100083北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院

    通讯作者:

    尹伟伦,教授,博士生导师。主要研究方向:植物生理与生物技术。Email: yinwl@bjfu.edu.cn   地址:同上

    夏新莉,教授,博士生导师。主要研究方向:植物抗逆分子生物学。Email: xiaxl@bjfu.edu.cn   地址:同上

  • 中图分类号: S718.43;S792.119;Q943.2

PePEX11 functions in regulating antioxidant capacity of Arabidopsis thaliana under salt stress

  • 摘要: 目的长期非生物逆境胁迫下,植物会产生过量活性氧并造成氧化损伤,过氧化物酶体能够通过清除活性氧来调节氧化还原平衡。PEX基因参与过氧化物酶体的生物发生和增殖,PEX11基因的过表达可促进过氧化物酶体增殖,对植物的抗氧化能力的提升具有重要意义。胡杨是研究木本植物中抗逆机制优良材料,本文旨在探究胡杨PEX11基因对非生物胁迫的响应。方法本研究首先以胡杨叶片cDNA为模板克隆获得PEX11基因,命名为PePEX11,并对PePEX11蛋白进行生物信息学分析,其次采用实时荧光定量PCR分析PePEX11在胡杨中的表达模式,同时构建植物表达pCAMBIA1301-35S::PePEX11转化拟南芥,最后检测盐胁迫条件下转PePEX11拟南芥的抗氧化能力。结果PePEX11基因cDNA全长543 bp,编码180个氨基酸,PePEX11蛋白具有多个跨膜结构域,在膜上发挥作用。实时荧光定量PCR分析表明,该基因在胡杨体的成熟叶中表达量最高,幼叶次之,茎中最少;胡杨PePEX11基因受盐胁迫上调表达。功能分析显示,在含有100 mmol/L NaCl的培养基上,转PePEX11基因拟南芥株系的根长均显著长于野生型;对盆土中的移栽后12 d的幼苗150 mmol/L NaCl盐处理2周,转基因株系表现为营养生长良好,耐盐性较强。超表达PePEX11基因能显著提高(P<0.05)拟南芥多种抗氧化酶的活性。DAB组织染色结果表明,转基因株系叶片中H2O2的含量明显少于野生型。结论本研究从胡杨中克隆PePEX11基因,并证明PePEX11能够提高拟南芥在盐胁迫下的抗氧化能力,提升耐盐能力。
  • 图  1  PePEX11蛋白生物信息学分析

    a.PePEX11和PtPEX11氨基酸序列比对;b.PePEX11的亲水/疏水性和跨膜结构域;c.蛋白三维高级结构预测分析;d.PEX11蛋白家族进化树。

    Figure  1.  Bioinformatics information analysis of the PePEX11 protein

    a, amino acid sequence alignment of PePEX11 and PtPEX11; b, predicted hydrophilicity/hydrophobicity(Kyte and Doolittle Model)and transmembrane domains of PePEX11;c, 3D structure of PePEX11 protein by Swiss-model of PePEX11 protein; d, a maximum-likelihood method tree of PEX11 protein sequences. Bootstrap: 1000. (Pe, Populus euphratica; Pt, Populus trichocarpa; At, Arabidopsis thaliana; Os, Oryza sativa).

    图  2  PePEX11基因表达模式分析,表达载体的构建以及转基因株系oxPePEX11的检测

    a.PePEX11基因在胡杨不同组织中的表达;b.盐处理8 d内PePEX11基因在胡杨叶片中的表达;c.干旱处理30 d后PePEX11基因在胡杨叶片中的表达;d.pCAMBIA1301-35S::PePEX11植物表达载体;e.oxPePEX11拟南芥株系PCR鉴定结果;f.oxPePEX11拟南芥qRT-PCR鉴定结果。不同小写字母表示在P < 0.05水平上差异显著。

    Figure  2.  Expression patterns of PePEX11, construction of pCAMBIA1301-35S:: PePEX11 expression vector, PCR and qRT-PCR assay of oxPePEX11

    a, expression analysis of PePEX11 in various tissues of P.euphratica; b, expression analysis of PePEX11 in P.euphratica leaf under 8-day salt treatment; c, expression analysis of PePEX11 in P.euphratica leaf under 30-day drought treatment(different letters mean significant difference at P < 0.05 level); d, construction of pCAMBIA1301-35S:: PePEX11 expression vector; e, PCR assay of oxPePEX11;f, qRT-PCR assay of PePEX11 in each line of oxPePEX11. Three replicates were set up for each independent experiment, each of which was an average of three experimental sets of data and error bars represent standard deviation. Different lowercase letters indicate significant difference at P < 0.05 level.

    图  3  盐胁迫处理的拟南芥的生长状况

    a.转PePEX11拟南芥在100 mmol/L NaCl培养基中根的伸长情况;b.各株系根长比较;c.150 mmol/L NaCl盐胁迫处理2周后各株系生长状况。每个实验设置4个重复;** P < 0.01。

    Figure  3.  Phenotypes of Arabidopsis thaliana under NaCl stress

    a, root elongation of oxPePEX11 plants in media with 100 mmol/L NaCl; b, comparison in root length of four lines; c, growth status of each line after being treated with 150 mmol/L NaCl for 14 days. n=4, **means P < 0.01.

    图  4  盐胁迫下转PePEX11拟南芥的SOD、POD、CAT活性以及MDA、可溶性蛋白含量

    每个实验设置3个重复;* P<0.05;** P<0.01。

    Figure  4.  CAT activity, SOD activity, POD activity, MDA content and soluble protein content of oxPePEX11 plants under salt stress

    3 repetitions were set for each experiment, * means P < 0.05;** means P < 0.01.

    图  5  离体叶片盐处理(100 mmol/L)及外源H2O2处理(100 mmol/L)30 min后组织化学染色检测活性氧

    Figure  5.  Histochemical staining assay detection of H2O2 and O2 accumulation with diaminobenzidin followed by NaCl treatment (100 mmol/L)and H2O2 treatment (100 mmol/L)for 30 min

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出版历程
  • 收稿日期:  2018-03-20
  • 修回日期:  2018-04-09
  • 刊出日期:  2018-05-01

胡杨PePEX11基因参与调节盐胁迫下拟南芥的抗氧化能力

doi: 10.13332/j.1000-1522.20180086
    基金项目:

    国家自然科学基金项目 31570308

    国家科技支撑计划项目 2015BAD07B01

    国家自然科学基金项目 31770649

    国家自然科学基金项目 31600484

    作者简介:

    姚琨。主要研究方向:植物抗逆分子生物学。Email: kunyao@bjfu.edu.cn   地址: 100083北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院

    通讯作者: 尹伟伦,教授,博士生导师。主要研究方向:植物生理与生物技术。Email: yinwl@bjfu.edu.cn   地址:同上; 夏新莉,教授,博士生导师。主要研究方向:植物抗逆分子生物学。Email: xiaxl@bjfu.edu.cn   地址:同上
  • 中图分类号: S718.43;S792.119;Q943.2

摘要: 目的长期非生物逆境胁迫下,植物会产生过量活性氧并造成氧化损伤,过氧化物酶体能够通过清除活性氧来调节氧化还原平衡。PEX基因参与过氧化物酶体的生物发生和增殖,PEX11基因的过表达可促进过氧化物酶体增殖,对植物的抗氧化能力的提升具有重要意义。胡杨是研究木本植物中抗逆机制优良材料,本文旨在探究胡杨PEX11基因对非生物胁迫的响应。方法本研究首先以胡杨叶片cDNA为模板克隆获得PEX11基因,命名为PePEX11,并对PePEX11蛋白进行生物信息学分析,其次采用实时荧光定量PCR分析PePEX11在胡杨中的表达模式,同时构建植物表达pCAMBIA1301-35S::PePEX11转化拟南芥,最后检测盐胁迫条件下转PePEX11拟南芥的抗氧化能力。结果PePEX11基因cDNA全长543 bp,编码180个氨基酸,PePEX11蛋白具有多个跨膜结构域,在膜上发挥作用。实时荧光定量PCR分析表明,该基因在胡杨体的成熟叶中表达量最高,幼叶次之,茎中最少;胡杨PePEX11基因受盐胁迫上调表达。功能分析显示,在含有100 mmol/L NaCl的培养基上,转PePEX11基因拟南芥株系的根长均显著长于野生型;对盆土中的移栽后12 d的幼苗150 mmol/L NaCl盐处理2周,转基因株系表现为营养生长良好,耐盐性较强。超表达PePEX11基因能显著提高(P<0.05)拟南芥多种抗氧化酶的活性。DAB组织染色结果表明,转基因株系叶片中H2O2的含量明显少于野生型。结论本研究从胡杨中克隆PePEX11基因,并证明PePEX11能够提高拟南芥在盐胁迫下的抗氧化能力,提升耐盐能力。

English Abstract

姚琨, 练从龙, 王菁菁, 王厚领, 刘超, 尹伟伦, 夏新莉. 胡杨PePEX11基因参与调节盐胁迫下拟南芥的抗氧化能力[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(5): 19-28. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180086
引用本文: 姚琨, 练从龙, 王菁菁, 王厚领, 刘超, 尹伟伦, 夏新莉. 胡杨PePEX11基因参与调节盐胁迫下拟南芥的抗氧化能力[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(5): 19-28. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180086
Yao Kun, Lian Conglong, Wang Jingjing, Wang Houling, Liu Chao, Yin Weilun, Xia Xinli. PePEX11 functions in regulating antioxidant capacity of Arabidopsis thaliana under salt stress[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(5): 19-28. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180086
Citation: Yao Kun, Lian Conglong, Wang Jingjing, Wang Houling, Liu Chao, Yin Weilun, Xia Xinli. PePEX11 functions in regulating antioxidant capacity of Arabidopsis thaliana under salt stress[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(5): 19-28. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180086
  • 植物遭受长期胁迫时会产生过量的活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS),引起氧化胁迫。过氧化物酶体是真核生物中普遍存在的一种细胞器,能清除ROS,调节细胞的氧化还原平衡,从而降低ROS的毒害,在植物的生命过程中必不可少。其在植物中的主要功能是催化脂肪酸发生β氧化、激素的合成、参与光呼吸、以及维持活性氧稳态等关键过程[1]。植物过氧化物酶体不仅能参与代谢反应,还能响应盐和光照,在植物对生物和非生物胁迫的反应中起关键作用[1-3]。对过氧化物酶的主要研究工作集中在过氧化物酶体形成的机制及其功能研究[4]。过氧化物酶体的生物发生方式包括分裂增殖和由内质网以出芽的方式释放前体的从头合成[5-6]。在特定的环境条件下,过氧化物酶体通过液泡介导的吞噬过程降解,维持细胞内稳态[7]。过氧化物酶是过氧化物酶体发生和分裂过程中所需的蛋白质(peroxin,PEX蛋白),是一种氧化还原酶[8]。所有过氧化物酶蛋白都由核基因PEX编码,主要通过2种靶向信号靶向过氧化物酶体:C-末端过氧化物酶体靶向信号类型1(PTS1)和N-末端过氧化物酶体靶向信号类型2(PTS2)[9]。PEX11蛋白在过氧化物酶体增殖和复制增殖中发挥重要作用,它在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中有5个亚型(A~E),超表达拟南芥PEX11基因可促进过氧化物酶体增殖,而RNAi植株则会减少氧化物酶体数量[10]。缺失PEX11基因会降低了过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的表达[11]

    逆境胁迫对植物的效应之一就是氧化胁迫。当植物生存的土壤中存在大量可溶性盐时会发生盐胁迫,对植物造成多重伤害,会造成渗透效应和离子毒性,还会由于ROS的增加导致氧化应激[12-13]。研究表明,盐胁迫等非生物胁迫处理会诱导拟南芥产生大量H2O2,同时检测到CAT基因表达量升高[11, 14]。ROS就像一把双刃剑,一方面植物体内自稳态水平的ROS可以作为第二信使,可参与到细胞程序性死亡、生长发生、激素信号转导等各种胁迫的响应过程中;另一方面过量的ROS会破坏生物膜系统,降解生物大分子,破坏生理活性物质和遗传物质,损伤植物细胞[15],主要通过破坏核酸、氧化蛋白和引起脂质过氧化作用对许多细胞功能产生影响[16],因此ROS积累是造成全球作物生产力损失的主要原因。植物具有高效的清除活性氧的系统,以保护它们免受破坏性的氧化反应,包括非酶抗氧化剂和抗氧化酶类。抗氧化酶类包括过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、多酚氧化酶(PPO)等[17]

    胡杨(Populus euphratica)是荒漠地区特有的高大乔木树种,生长于干旱、土壤盐渍化严重的沙漠中,是珍贵的森林资源,更是研究木本植物非生物胁迫的理想模式材料[18-21]。在酵母(Saccharomyces cerevisiae)和拟南芥中的PEX蛋白参与过氧化物酶体的增殖[10, 22-23],但在木本植物中的研究鲜有报道,作用也依然未知。因此为解析胡杨PEX11基因的功能,本文从胡杨中克隆了PEX11基因,对其编码的蛋白进行生物信息学分析,进一步构建植物表达载体转化拟南芥,研究盐胁迫条件下转PePEX11拟南芥的抗氧化能力。

    • 胡杨采自新疆巴音郭勒蒙古自治州库尔勒市尉犁县地区,培育于北京林业大学苗圃。选取生长状态一致的胡杨栽种于容量为5 L的花盆中,放置于托盘上,每3 d浇水1次,2个月后对胡杨进行长期干旱和盐处理[24],用作后续RNA提取。

      对照组:在处理前,收集胡杨根、茎、幼叶、成熟叶(老叶)材料在液氮速冻后保存于-80 ℃超低温冰箱中备用。每组3个重复。

      干旱处理:使用FieldScoutTM TDR 300土壤湿度计(Spectrum Technologies)测量土壤相对含水量(RSWC),通过控制每天浇水的量来保持土壤相对含水量。设置4种干旱梯度,A组对照:70%~75% RSWC;B组轻度干旱:50%~55% RSWC;C组中度干旱:35%~40% RSWC;D组重度干旱:15%~20% RSWC。保持在相应含水量下30 d,收集胡杨成熟叶片在液氮速冻后保存于-80 ℃超低温冰箱中备用,每组3个重复。

      盐处理:每盆胡杨浇300 mmol/L的NaCl溶液1 L,之后每天补浇一定量的水以维持适当的土壤湿度。分别在盐处理后第0(CK)、1、2、4、8天收集胡杨成熟叶片在液氮速冻后保存于-80 ℃超低温冰箱中备用,每组3个重复。

    • 取上面收集到的胡杨组织材料,分别用EASYspin Plus Plant RNA Kit (AidLab)试剂盒提取总RNA,用第1链合成试剂盒(Promega,Madison,WI,USA)合成cDNA第1链。克隆载体pMD-18T购自TaKaRa公司、大肠杆菌(Escherichiacoli)Top10感受态、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101菌株、植物表达载体pCAMBIA1301,由北京林业大学林木育种国家工程实验室提供。

      根据毛果杨(Populus trichocarpa)中的同源基因PtPEX11(Potri.002G153800.9)序列,使用Primer 5.0设计引物。扩增引物为:P1F,5′-AAGGACCT ACATTTGGCAGTG-3′;P1R,5′-CACCAACACGGGT TTATCAC-3′。PCR条件为:94 ℃预变性3 min;94 ℃变性1 min;58 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35个循环;最后再72 ℃延伸5 min。回收PCR产物,将目的片段与pMDTM18-T载体连接后转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,选择阳性克隆送至上海生工生物公司进行测序。采用DNAMAN对测序结果与测序拼接结果进行比对,最终确定基因的全长序列,命名为PePEX11。

      将该基因构建到pCAMBIA1301表达载体上,导入农杆菌感受态,采用花序侵染法转化拟南芥哥伦比亚野生型(Col-0,WT),单株收种后将种子播种在含有25 mg/L潮霉素的1/2MS固体筛选培养基上,4 ℃春化2 d后置于培养箱中,发芽10 d后移入土中,取拟南芥植株的少量叶片用于检测,鉴定转基因阳性株系oxPePEX11,逐代筛选至T3代纯合体,用于后续的研究。

    • 通过在线分析软件ProtParam对PePEX11基因编码的氨基酸序列进行评估。利用ProtScale软件的Kyte and Doolittle算法对PePEX11蛋白进行亲水/疏水性预测和跨膜结构域预测(https://embnet.vital-it.ch/cgi-bin/TMPRED_form_parser),其中正值越大表示越疏水,负值越大表示越亲水,介于+0.5到-0.5之间的主要为两性氨基酸。利用Swiss-Model服务器对PePEX11蛋白的三级结构的同源建模,并运用结构仿真模拟(ProModⅡ程序)和能量最小化分析(GROMOS96程序) (https://www.swissmodel.expasy.org/interactive/hFxLcb/models/)。

      毛果杨PtPEX11同源基因的功能预测使用Pop GenIE网站,对PtPEX11和PePEX11二者序列和编码蛋白用DNAMAN进行对比分析。从NCBI(National Center for Biology Information)上获得了来自拟南芥和水稻(Oryza sativa)的PEX11蛋白的氨基酸序列。使用MEGA6.0软件基于最大似然法(Maximum-Likelihood Method,ML)构建系统发育进化树,bootstrap校验设为1 000(bootstrap replication:1 000)。

    • PePEX11基因进行实时荧光定量PCR(qRT- PCR)的验证。以1.1中处理的胡杨材料为样品,每个反应进行3次重复。总RNA的提取和反转录方法同1.2,qRT-PCR实验过程中,使用胡杨UBQ作为内参基因[25],相对定量值用2-△△Ct法计算[26]。不同字母表示在P<0.05水平上差异显著。qRT-PCR使用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)试剂盒(TIANGEN公司,FP205),在StepOne Plus PCR系统(Applied Biosystems,USA)上进行。PePEX11基因的qRT-PCR引物为:上游引物,5′-CCGGGCAATTCAATATGGTTCA-3′;下游引物,5′-GGGGTCCCTTGAGAAACTGG-3′;UBQ基因的qRT-PCR引物为:上游引物5′-AGACCTACACCAAGCCC AAGAAGAT-3′;下游引物5′-CCAGCACCGCACTC AGCATTAG-3′。

      qRT-PCR反应条件设置如下:

      (1) 95 ℃预变性15 min;

      (2) 94 ℃变性10 s,60 ℃退火/延伸30 s,循环数为40次;

      (3) 熔解曲线分析(Melting/Dissociation Curve Stage)。

    • 为探究转PePEX11基因拟南芥对盐胁迫的响应,将经春化后的转基因株系L1、L2、L4和WT拟南芥种子播种于1/2MS固体培养基上,萌发后,分别移植于1/2MS固体培养基和1/2MS+100 mmol/L NaCl固体培养基上培养9 d观察不同株系之间的根长差异。

      对拟南芥野生型WT和转基因株系L1、L2、L4苗进行盐胁迫处理。待移入土中的拟南芥苗生长12 d后,每天用150 mmol/L盐溶液浇灌。对照组浇同样量的水。取同一位置,处理0、1、2、3、4、5 d后的叶片。每组3个重复。

      用购自南京建成生物工程研究所的试剂盒测定酶活;过氧化氢酶活力测定采用可见光法;超氧化物歧化酶活力测定采用氮蓝四唑(NBT)法,以抑制NBT光化还原的50%为1个酶活性单位U;过氧化物酶活力测定采用愈创木酚法,以每分钟内D470增加0.01为1个酶活单位U;丙二醛测定采用硫代巴比妥酸法;可溶性蛋白采用考马斯亮蓝法。采用Excel和SPSS软件对数据进行分析。

    • 采用3-3-二氨基联苯胺(DAB)染色来检测拟南芥叶片中的活性氧定位[27],取WT、L1、L2、L4拟南芥株系生长6周,状况良好成熟叶片5片,对照组无任何处理,实验组分别以100 mmol/L盐和H2O2处理。随后取DAB染液(TIANGEN公司,北京)将A液和B液提前预混合,每管中加入1 mL混合液,置于37 ℃恒温箱中避光过夜,次日倾倒染液吸干水分,加入70%酒精70 ℃煮沸脱色,观察染色结果,棕色斑点越多,说明活性氧积累越多,亦即自身清除活性氧能力越低,抗氧化能力越差。

    • 使用DNAMAN将扩增结果与毛果杨中的同源基因PtPEX11基因进行比对分析,确定胡杨PePEX11编码区长度543 bp,编码180个氨基酸(图 1a)。与毛果杨中的同源基因PtPEX11基因编码区相似度为98.34%,与其编码的氨基酸仅存在2个氨基酸的差异,基因保守性高。

      图  1  PePEX11蛋白生物信息学分析

      Figure 1.  Bioinformatics information analysis of the PePEX11 protein

    • PePEX11蛋白质化学方程式为C900H1 482N240O250S7,预测分子量为19 889.55,蛋白等位点为9.68,不稳定系数为29.34,属稳定性蛋白,脂肪系数为112.56。

      亲水/疏水性预测分析结果显示,PePEX11蛋白大约在第60个氨基酸、第100~120个氨基酸之间具有很强的亲水性;而在第40~50氨基酸之间、第130~145氨基酸之间具有较强的疏水性(图 1b)。

      跨膜结构域预测结果显示,PePEX11蛋白可能在第65~85、126~145和154~173氨基酸为中心位置形成3个由膜内到膜外的跨膜区域,表明该蛋白可能行使细胞内外信号转导的作用,推测为跨膜蛋白(图 1b)。

      三维结构预测结果显示,该蛋白的单体180个氨基酸中,可能形成4个α螺旋和5个无规则卷曲,可能不形成β折叠;并且形成同源八聚体行使其功能(图 1c)。

    • 为了解胡杨PePEX11蛋白与毛果杨PePEX11蛋白及其他物种的进化关系,进化树中选取的蛋白分别为拟南芥中的PEX11A(At1g47750)、PEX11B(At3g47430)、PEX11C(At1g01820)、PEX11D(At2g45740)和PEX11E(At3g61070),水稻中PEX11-1(Os03G0117100)、PEX11-2(Os03G 0301950)、PEX11-3(Os03G0302000)、PEX11-4 (Os04G0534600)和PEX11-5(Os06G0127000)(图 1d)。结果表明,胡杨PePEX11蛋白和毛果杨PtPEX11蛋白在同一分支,亲缘关系上最为相近,杨树的PEX11蛋白与拟南芥PEX11D蛋白亲缘关系接近,可能具有相似的功能。

    • PePEX11基因在胡杨成熟叶中表达量最高,显著高于幼叶和其他组织,表达量是在根中的18倍,而在茎中表达量极少,仅有根中的1/3,其表达模式存在组织特异性,表明PePEX11基因与胡杨叶片的成熟和衰老过程相关(图 2a)。

      图  2  PePEX11基因表达模式分析,表达载体的构建以及转基因株系oxPePEX11的检测

      Figure 2.  Expression patterns of PePEX11, construction of pCAMBIA1301-35S:: PePEX11 expression vector, PCR and qRT-PCR assay of oxPePEX11

    • 在长期干旱胁迫下,随着干旱程度的增加,表达量呈现下降趋势,特别是在重度干旱胁迫下,其表达量显著降低,说明其在干旱胁迫下PePEX11表达受到抑制(图 2c)。在盐胁迫下,PePEX11基因的表达随时间的增加而逐渐上升,说明该基因受盐胁迫响应诱导(图 2b)。

    • 为进一步研究PePEX11基因功能,构建植物表达载体pCAMBIA1301-35S::PePEX11(图 2d)转化野生型拟南芥,潮霉素筛选得到的6个阳性株系oxPePEX11,分别提取DNA进行PCR检测(图 2e),提取RNA进行qRT-PCR表达量检测(图 2f)。筛选相对表达量较高的3个株系(L1、L2、L4),逐代单株收种筛选至T3代纯合子,用于后续实验。

    • 根长实验结果显示,在正常培养基中,转PePEX11基因拟南芥和野生型的根长和长势相同,无明显差异;在100 mmol/L NaCl培养基中,转基因株系的根长均显著长于野生型,叶片长势也较野生型好(图 3a3b)。

      图  3  盐胁迫处理的拟南芥的生长状况

      Figure 3.  Phenotypes of Arabidopsis thaliana under NaCl stress

      对移栽后正常生长12 d的拟南芥进行盐胁迫处理2周。图 3c上为对照组正常浇水,转基因株系营养生长时间更长,叶片相对更宽大,但抽薹开花时间晚于野生型;图 3c下为盐胁迫处理,各株系生长均受到抑制,野生型叶片萎蔫发黄严重、抽薹细软易倒伏、种子干瘪不饱满,转基因株系叶片仍能保持绿色、叶面积相对较大、对盐的耐受度要好于野生型,更不容易受到盐胁迫,但抽薹时间晚于野生型。以上结果说明超表达PePEX11基因能增强植株的耐盐性。

    • 为进一步探究PePEX11基因与抗氧化能力之间的关联,我们对拟南芥植株进行盐胁迫处理,并检测其抗氧化酶SOD、POD、CAT活性以及丙二醛(MDA)和可溶性蛋白含量,结果如图 4所示。

      图  4  盐胁迫下转PePEX11拟南芥的SOD、POD、CAT活性以及MDA、可溶性蛋白含量

      Figure 4.  CAT activity, SOD activity, POD activity, MDA content and soluble protein content of oxPePEX11 plants under salt stress

    • 盐胁迫后,转基因植株的CAT活性显著高于野生型(P<0.01),说明其抗氧化能力较强,其中野生型、L1和L4在第2天CAT活性达到最大值,L2在第3天达到最大值。POD活性显著高于野生型(P<0.01),且在第2天达到最大值。SOD活性显著高于野生型(P<0.01),在胁迫2 d时SOD活性达到最高,反应迅速,这表明PePEX11的超表达增加了植株的抗氧化能力,提高了防御细胞衰老的能力。

    • MDA是膜脂过氧化的主要产物之一,能够使膜中的酶蛋白发生交联失活,导致细胞膜的进一步损伤。因此植物MDA积累量的多少能够间接反应膜脂过氧化程度的高低。结果表明,盐胁迫能够迅速使拟南芥MDA含量增加,而转基因植株的MDA含量明显(P<0.01)低于野生型,在胁迫后第3~4天含量达到最低值,说明超表达PePEX11基因显著降低植株体内的MDA含量,降低膜脂过氧化的程度。

    • 可溶性蛋白是盐胁迫下一种重要的渗透调节物质,常用作筛选抗性的指标之一。结果显示,在盐胁迫条件下,转基因植株的可溶性蛋白含量在各个时期均显著(P<0.01)高于野生型,随盐胁迫逐渐递增,在第3天达到最大值随后下降。

    • 采用DAB染色来检测拟南芥叶片中的ROS定位。在盐处理和H2O2处理下,对各株系离体叶片进行DAB染色,在对照组中,各株系叶片均有零星且分散的棕色斑点;在盐处理下,各拟南芥株系棕色斑点增多,但WT叶片表面棕色斑点明显多于转PePEX11株系L1、L2、L4而且密集,并偶见大斑点;在外源H2O2 处理下,各株系表面均有明显的较大棕色斑点。进行灰度分析,灰度值越高,叶片棕色面积越大,WT在各组的灰度值都显著高于转基因株系,表明转基因株系叶片表面棕色斑点数目显著比WT少,抗氧化能力更强(图 5)。

      图  5  离体叶片盐处理(100 mmol/L)及外源H2O2处理(100 mmol/L)30 min后组织化学染色检测活性氧

      Figure 5.  Histochemical staining assay detection of H2O2 and O2 accumulation with diaminobenzidin followed by NaCl treatment (100 mmol/L)and H2O2 treatment (100 mmol/L)for 30 min

    • PEX11基因对过氧化物酶体的增殖和植物发育具有重要的意义。本研究首次克隆了胡杨基因PePEX11,其cDNA全长543 bp,编码180个氨基酸,蛋白具有多个跨膜结构域,推断其在膜上行使功能。PEX11基因在不同物种中具有一定保守性,PePEX11与AtPEX11A亲缘关系接近,推测与其具有相似的功能。过氧化物酶参与植物衰老,Orth等[10]发现拟南芥AtPEX11CAtPEX11E在自然衰老组织中的表达水平较高,基因AtPEX11AAtPEX11E在莲座叶中的衰老组织中表达较高。本文对PePEX11基因在胡杨不同组织中的表达量进行分析的结果与Orth等[10]的研究结果一致,PePEX11基因同AtPEX11A一样在自然衰老组织中的表达水平较高。前人研究显示植物PEX11蛋白可分为两类:一类包含拟南芥AtPEX11C到AtPEX11E,水稻OsPEX11-1和OsPEX11-2;另一类包含AtPEX11A、AtPEX11B和OsPEX11-3、-4、-5。后一组可以进一步划分为两个亚类:其一是AtPEX11A,OsPEX11-3和-5;另一是AtPEX11B和OsPEX11-4[22]。系统发育分析的结果与其一致,胡杨PePEX11蛋白和毛果杨PePEX11蛋白亲缘关系上最为相近,杨树的PEX11蛋白与拟南芥PEX11D蛋白在亲缘关系上接近,同属于第一类PEX11蛋白。

      为了方便测量,Fahy等[1]在测定过氧化物酶体丰度时,以盐为诱导剂,明显观察到过氧化物酶体增殖。在我们的研究中,盐胁迫下胡杨叶片中PePEX11基因的表达量上调,说明其受盐胁迫响应。而长期干旱处理时表达量下调,说明PePEX11基因不能响应干旱胁迫。但植物对逆境中的适应是相互联系的,即交叉适应。康建宏等[28]发现短期的干旱预处理会提高玉米(Zea mays)幼苗对干旱、冷胁迫、热胁迫和盐胁迫的抗性,SOD、CAT、POD活性升高,增强了整体抗逆性。因此超表达PePEX11是否能提高植株抗旱能力还有待进一步研究。

      过氧化物酶体是细胞内的许多代谢网络中必不可少的“节点”,它与线粒体、叶绿体等细胞器联系紧密,它们不但在脂肪酸的β氧化和H2O2的降解中起作用,也介导光呼吸、茉莉酸生物合成、吲哚3-丁酸(IBA)代谢、乙醛酸循环、嘌呤降解等途径[3, 29-30]。过氧化物酶体作为抗氧化的场所,当细胞H2O2信号分子增多时,会对过氧化物酶体的生成基因进行诱导[31]。当植物受到盐胁迫时,细胞内产生过量ROS,植物体内产生的SOD、POD和CAT等抗氧化酶类可以有效清除ROS。过氧化氢酶CAT是最丰富的过氧化物酶体蛋白之一,存在于所有的植物细胞中,能将H2O2迅速分解为H2O和O2。POD广泛存在于植物体内,可以反映植物体的生长发育、代谢情况以及对环境的适应性。一方面在逆境或者衰老初期表达,清除H2O2;另一方面,POD也可以在逆境或者衰老后期表达,参与ROS的生成,叶绿素的降解,并能引发膜脂过氧化作用,表现为伤害效应,是植物衰老到一定阶段的产物,甚至可以作为衰老的指标。POD同工酶超多,是由多个基因编码的。SOD能够防止氧自由基破坏细胞的形成、结构和功能,保护细胞免受氧化损伤,一般存在于植物的叶绿体、细胞质、线粒体、乙醛酸循环体和过氧化物酶体中。过氧化物酶体在胁迫条件下能调控细胞应答,并在维持细胞氧化还原动态平衡中发挥重要作用[31-32]。超表达PePEX11增强拟南芥对盐胁迫的适应力,转基因植株的根长显著长于野生型,叶片长势好于野生型,酶活力高于野生型,总体呈现出一个先上升后下降的趋势,MDA和可溶性蛋白含量低于野生型。抗氧化酶活力的变化规律与肖国增等[33]对0.2 mol/L盐胁迫下盐敏感的匍匐翦股颖(Agrostis stolonifera)的SOD活性变化一致,也与刘凤歧等[34]研究盐胁迫下燕麦(Avena sativa)的SOD变化一致。盐胁迫时,植物体内过量的活性氧会启动膜脂过氧化,破坏植物体的生物膜,造成MDA的积累,测定MDA含量可以辅助评价转基因株系的抗逆性[35]。可溶性蛋作为一种渗透调节物质,其含量与植物对盐胁迫的响应能力正相关,本研究的结果也与其他研究结果一致[36]。DAB组织染色在细胞水平上评价了各株系的抗氧化能力,在盐处理和H2O2处理下,转PePEX11基因拟南芥株系叶片表面棕色斑点显著少于野生型,说明转PePEX11基因能提高拟南芥的抗氧化能力。

      本文的研究表明,超表达PePEX11能够提高拟南芥抗氧化酶活性,增强了植株对氧化胁迫的耐受力,以减轻对膜系统的过氧化损伤。综上所述,胡杨PePEX11基因能够响应盐胁迫,提高转基因拟南芥对盐胁迫的抗性,并调控拟南芥植物中的活性氧清除系统,提高抗氧化能力。

参考文献 (36)

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