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胡杨PeREM1.3过表达提高烟草耐盐性的机制

张会龙 武霞 尧俊 赵楠 赵瑞 李金克 沈昕 陈少良

张会龙, 武霞, 尧俊, 赵楠, 赵瑞, 李金克, 沈昕, 陈少良. 胡杨PeREM1.3过表达提高烟草耐盐性的机制[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(1): 1-9. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180338
引用本文: 张会龙, 武霞, 尧俊, 赵楠, 赵瑞, 李金克, 沈昕, 陈少良. 胡杨PeREM1.3过表达提高烟草耐盐性的机制[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(1): 1-9. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180338
Zhang Huilong, Wu Xia, Yao Jun, Zhao Nan, Zhao Rui, Li Jinke, Shen Xin, Chen Shaoliang. Overexpression mechanism of PeREM1.3 from Populus euphratica enhancing salt tolerance in transgenic tobacco[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(1): 1-9. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180338
Citation: Zhang Huilong, Wu Xia, Yao Jun, Zhao Nan, Zhao Rui, Li Jinke, Shen Xin, Chen Shaoliang. Overexpression mechanism of PeREM1.3 from Populus euphratica enhancing salt tolerance in transgenic tobacco[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(1): 1-9. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180338

胡杨PeREM1.3过表达提高烟草耐盐性的机制

doi: 10.13332/j.1000-1522.20180338
基金项目: 

高等学校学科创新引智计划项目 111Project

中央高校基本科研业务费专项 2017ZY07

国家自然科学基金项目 31570587

国家自然科学基金项目 31770643

北京市自然科学基金项目 6182030

教育部科学技术研究(科学技术类)项目 113013A

北京市自然科学基金项目 6172024

高等学校学科创新引智计划项目 B130007

详细信息
    作者简介:

    张会龙,博士生。主要研究方向:树木逆境生理。Email: hlzhang1988@sina.cn  地址:100083北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院

    通讯作者:

    沈昕,教授。主要方研究向:分子生物学。Email: xinshen77@126.com  地址:同上

    陈少良,博士,教授。主要方研究向:树木逆境生理。Email:lschen@bjfu.edu.cn  地址:同上

  • 中图分类号: S718.43;S792.119;Q943.2

Overexpression mechanism of PeREM1.3 from Populus euphratica enhancing salt tolerance in transgenic tobacco

  • 摘要: 目的盐害作为一类非生物胁迫严重危害了农作物的生存以及产量。Remorin作为一类植物特有的蛋白质在植物适应环境过程中具有重要功能。本研究克隆了胡杨remorin蛋白PeREM1.3的编码基因PeREM1.3,并研究PeREM1.3基因在植物耐盐性中的作用。方法笔者将基因构件35S::PeREM1.3转入模式植物烟草中, 在盐胁迫条件下,通过生理生化的方法对表达PeREM1.3的转基因烟草进行基因功能的分析。结果研究显示PeREM1.3蛋白定位于细胞质膜上,其编码基因PeREM1.3的开放阅读框(ORF)长600 bp,编码199个氨基酸。胡杨中PeREM1.3能够响应盐胁迫和渗透胁迫表达上调。结果表明,在烟草中过表达PeREM1.3明显地提高了耐盐性。过表达PeREM1.3的烟草转基因株系中抗氧化物酶如SOD、POD和CAT活性显著提高,降低了活性氧水平,调控活性氧平衡。另外植物抗逆相关基因SOS1、HAKNHA1、VAG1和PMA4的转录水平显著增高,调控K+/Na+平衡。结论这些结果说明PeREM1.3蛋白通过维持植物的活性氧平衡和K+/Na+平衡来提高植物的耐盐性。
  • 图  1  不同胁迫处理下胡杨PeREM1.3基因在胡杨叶片中的表达量变化

    A.NaCl处理下PeREM1.3的表达量;B.甘露醇处理下PeREM1.3的表达量;不同字母表示在P<0.05水平上差异显著。

    Figure  1.  Expression changes of PeREM1.3 in leaf under different stress treatments in Populus euphratica

    A.Expression of PeREM1.3 under NaCl treatment; B. Expression of PeREM1.3 under mannitol treatment; different letters mean significant difference at P < 0.05 level.

    图  2  胡杨PeREM1.3序列分析

    A.胡杨PeREM1.3氨基酸序列与其他物种REM多重系列比对; B.胡杨PeREM1.3的系统进化树分析。Pe.胡杨; Pt.毛果杨; At.拟南芥。

    Figure  2.  Analysis of the amino acid sequence encoded by PeREM1.3

    A, multiple amino acid sequence alignment of PeREM1.3 with other REM from different plant species; B, phylogenetic tree analysis of PeREM proteins; Pe, Populus euphratica; Pt, Populus trichocarpa; At, Arabidopsis thaliana.

    图  3  PeREM1.3的亚细胞定位

    PeREM1.3-GFP.GFP荧光场;FM4-64.膜染料;Merged.叠加场。

    Figure  3.  Subcellular location of PeREM1.3

    PeREM1.3-GFP, GFP field; FM4-64, plasma membrane dye; Merged, merged field.

    图  4  转基因烟草各株系荧光定量和半定量RT-PCR检测PeREM1.3

    PeREM1.3基因在野生型(WT)、转空载体(VC)和转基因烟草(OE1、OE6、OE7、OE9、OE11、OE16、OE18、OE22)中的表达量,EF1α为内参基因。A为荧光定量PCR分析;B为半定量PCR分析。不同字母表示在P<0. 05水平上差异显著。下同。

    Figure  4.  Quantitative reverse transcription PCR and semi-quantitative reverse transcription PCR analysis of each line in tobacco plants

    Expression level of PeREM1.3 of wild-type (WT), vector control (VC) and PeREM1.3-transgenic tobacco (OE1, OE6, OE7, OE9, OE11, OE16, OE18, OE22) plants, EF1α was used as the internal control. A, real-time PCR analysis. B, semi-quantitative sRT-PCR analysis. Different letters mean significant difference at P < 0.05 level. The same below.

    图  5  烟草在含有不同浓度NaCl培养基上的根长生长情况

    A. NaCl对根长生长的影响; B.根系生长的定量分析;烟草播种在普通1/2MS培养基上,垂直生长7 d后,移植到含有0、150、175 mmol/L NaCl培养基上,生长5 d后统计根长生长情况并拍照,不同字母表示在P<0.05水平上差异显著。

    Figure  5.  Root length of tobacco on MS medium supplemented with different NaCl concentrations

    A, effect of NaCl on root length; B, quantitative analysis of root growth; seeds of each line were sowed on 1/2 MS medium for 7 days, then transferred to new MS medium with 0, 150, 175 mmol/L NaCl, after 5 days, root length was measured and photographed. Different letters mean significant difference at P < 0.05 level.

    图  6  盐处理后烟草中SOD酶活性(A)、POD酶活性(B)和CAT酶活性(C)变化

    A.盐处理下SOD酶活性;B.盐处理下POD酶活性;C.盐处理下CAT酶活性。不同字母表示在P<0.05水平上差异显著。

    Figure  6.  Activity of SOD (A), POD (B) and CAT (C) in tobacco plants after salt treatment

    A, activity of SOD under NaCl treatment; B, activity of POD under NaCl treatment; C, activity of CAT under NaCl treatment; different letters mean significant difference at P < 0.05 level.

    图  7  盐胁迫对PeREM1.3转基因烟草抗逆相关基因SOS1、HAKNHA1、VAG1和PMA4表达的影响

    内参基因:EF1α,n=3。不同字母表示在P<0.05水平上差异显著。

    Figure  7.  Effects of NaCl on relative expression of stress- resistance related genes in transgenic tobacco plants

    Reference gene: EF1α, n=3. Different letters mean significant difference at P < 0. 05 level.

    表  1  本研究中使用的引物序列以及名字

    Table  1.   Gene-specific primer sequences and names used in this work

    引物名称
    Primer name
    上游引物
    Forward primer(5′-3′)
    下游引物
    Reverse primer(5′- 3′)
    HAKATCCACACCGAGCTTGTTTCAGGATGGGTCCAATTCTTCCCACCAAGA
    SOS1GCGTGCTTATTTCCACCTTTTGTTTGATGACGGCTCCCCAGT
    PMA4TTTCCCGAGCACAAGTATGAGGTAACCTCCAAGAACAACAC
    NHA1CCTTATGCTTGTCGGTGCTTTCGCCCATTGTGCTTCCCTTTC
    VAG1GGCACGTAACCACAGTGAAGAGAAGCAGCCATGCCTAGTC
    EF1αGCTGTGAGGGACATGCGTCAAAGTAGTAGATATCGCGAGTACCACCA
    PeActinATTGGCCTTGGGGTTAAGAGCACACTGGAGTGATGGTTGG
    PeREM1.3-0029GFPGCTGCAGCATGGCAGAGGAGGAGCCAAAGCCCGGGTAAAAAAATTCCAAGAAGCTTC
    PeREM1.3-2300CGGGATCCATGGCAGAGGAGGAGCCAAAGGCGTCGACCTATAAAAAAATTCCAAGAAGCTT
    PeREM1.3GTCCAAAGCAGAAAACAAAGCTCACACGTTTAGCTTCGATAATCGCC
    PeREM1.3-FulllengthATGGCAGAGGAGGAGCCAAAGCTATAAAAAAATTCCAAGAAGCTT
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    , 王建中, 刘艳, 林善枝, 王玉春, 孙建华, 丁霞, 张庆, 沈应柏, 李凤兰, 王民中, 陶凤杰, 呼晓姝, 李镇宇, 杨伟光, 陈卫平, 张兴杰, 刘玉军, 汪植, 蒋平, 付瑞海, 马建海, 赵新丽.  新疆天然胡杨林土壤微生物多样性的研究 . 北京林业大学学报, 2007, 29(5): 127-131.
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出版历程
  • 收稿日期:  2018-10-19
  • 修回日期:  2018-11-29
  • 刊出日期:  2019-01-01

胡杨PeREM1.3过表达提高烟草耐盐性的机制

doi: 10.13332/j.1000-1522.20180338
    基金项目:

    高等学校学科创新引智计划项目 111Project

    中央高校基本科研业务费专项 2017ZY07

    国家自然科学基金项目 31570587

    国家自然科学基金项目 31770643

    北京市自然科学基金项目 6182030

    教育部科学技术研究(科学技术类)项目 113013A

    北京市自然科学基金项目 6172024

    高等学校学科创新引智计划项目 B130007

    作者简介:

    张会龙,博士生。主要研究方向:树木逆境生理。Email: hlzhang1988@sina.cn  地址:100083北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院

    通讯作者: 沈昕,教授。主要方研究向:分子生物学。Email: xinshen77@126.com  地址:同上; 陈少良,博士,教授。主要方研究向:树木逆境生理。Email:lschen@bjfu.edu.cn  地址:同上
  • 中图分类号: S718.43;S792.119;Q943.2

摘要: 目的盐害作为一类非生物胁迫严重危害了农作物的生存以及产量。Remorin作为一类植物特有的蛋白质在植物适应环境过程中具有重要功能。本研究克隆了胡杨remorin蛋白PeREM1.3的编码基因PeREM1.3,并研究PeREM1.3基因在植物耐盐性中的作用。方法笔者将基因构件35S::PeREM1.3转入模式植物烟草中, 在盐胁迫条件下,通过生理生化的方法对表达PeREM1.3的转基因烟草进行基因功能的分析。结果研究显示PeREM1.3蛋白定位于细胞质膜上,其编码基因PeREM1.3的开放阅读框(ORF)长600 bp,编码199个氨基酸。胡杨中PeREM1.3能够响应盐胁迫和渗透胁迫表达上调。结果表明,在烟草中过表达PeREM1.3明显地提高了耐盐性。过表达PeREM1.3的烟草转基因株系中抗氧化物酶如SOD、POD和CAT活性显著提高,降低了活性氧水平,调控活性氧平衡。另外植物抗逆相关基因SOS1、HAKNHA1、VAG1和PMA4的转录水平显著增高,调控K+/Na+平衡。结论这些结果说明PeREM1.3蛋白通过维持植物的活性氧平衡和K+/Na+平衡来提高植物的耐盐性。

English Abstract

张会龙, 武霞, 尧俊, 赵楠, 赵瑞, 李金克, 沈昕, 陈少良. 胡杨PeREM1.3过表达提高烟草耐盐性的机制[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(1): 1-9. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180338
引用本文: 张会龙, 武霞, 尧俊, 赵楠, 赵瑞, 李金克, 沈昕, 陈少良. 胡杨PeREM1.3过表达提高烟草耐盐性的机制[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(1): 1-9. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180338
Zhang Huilong, Wu Xia, Yao Jun, Zhao Nan, Zhao Rui, Li Jinke, Shen Xin, Chen Shaoliang. Overexpression mechanism of PeREM1.3 from Populus euphratica enhancing salt tolerance in transgenic tobacco[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(1): 1-9. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180338
Citation: Zhang Huilong, Wu Xia, Yao Jun, Zhao Nan, Zhao Rui, Li Jinke, Shen Xin, Chen Shaoliang. Overexpression mechanism of PeREM1.3 from Populus euphratica enhancing salt tolerance in transgenic tobacco[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(1): 1-9. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180338
  • Remorin是一种植物细胞质膜的附膜蛋白,于1989年首先在马铃薯(Solanum tuberosum)脂膜中被发现[1]并在20世纪90年代初得到分离、纯化。根据对DNA数据库的搜索、分析已知remorin仅存在于被子植物、裸子植物、蕨类和苔藓植物中,是植物专一性的蛋白家族。2000年Peskan等人[2]首次报道利用类似于动物脂筏研究的方法获得高等植物Triton X-100不溶的质膜,这部分质膜富含固醇和鞘脂,缺少不饱和磷脂,被称为植物脂筏,Mongrand等[3]以番茄(Lycopersicon esculentum )为材料,研究发现remorin存在于去污剂不溶的质膜上并且是脂筏的主要成分。鉴于脂筏与信号转导密切相关,remorin蛋白作为附着植物脂筏的蛋白引起了学界的广泛关注,Kreps等[4]研究发现拟南芥(Arabidopsis thaliana)remorin基因响应盐胁迫、渗透胁迫和寒冷处理,表达量上升;同年Bray等[5]在研究拟南芥缺水胁迫下响应ABA调控的基因中发现remorin表达上升,另外Reddy等[6]发现在干旱胁迫水稻(Oryza sativa)秧苗中remorin基因表达上调;Lin等[7]研究发现外施ABA可诱导水稻remorin同源基因转录上调;Malakshah等[8]在耐盐水稻的盐胁迫蛋白质组研究中发现remorin蛋白大量表达。在remorin功能研究方面,Gui等[9]近期报道水稻中一个remorin蛋白家族成员OsREM4.1是ABA信号途径与油菜素内酯信号途径交叉应答中起衔接作用的分子,研究显示水稻remorin蛋白家族中OsREM4.1响应ABA转录水平上调,OsREM4.1蛋白则通过识别、结合水稻油菜素内酯信号途径中的激酶对油菜素内酯信号的输出产生负调控,水稻中油菜素内酯信号通过油菜素内酯受体蛋白激酶复合体OsBRI1-OsSERK1进行传递,OsREM4.1通过识别、结合OsSERK1抑制激酶二聚体的形成,从而遏制油菜素内酯信号的传递,产生ABA对油菜素内酯的拮抗效应。已有的研究报道说明作为植物脂筏的主要蛋白成分remorin可能在植物抗逆机制中起着重要作用。

    在中国新疆和内蒙古等干旱盐碱的荒漠和戈壁地带,胡杨(Populus euphratica)是唯一能够形成天然森林的高大乔木,对非生物胁迫适应性极强,耐盐碱水湿,是进行木本植物抗盐碱性研究的优良材料。胡杨的耐盐机制受到国内外广泛关注,在胡杨耐盐性的生理及分子机制方面已有较多的研究报道[10-16],但目前对胡杨的remorin蛋白家族的情况还缺乏了解,迄今为止关于胡杨remorin蛋白在耐盐机制中的作用尚缺乏研究。因此,本文拟重点研究胡杨remorin蛋白在植物耐盐性中的作用; 检测了PeREM1.3在胡杨中的表达模式,克隆了胡杨remorin蛋白的编码基因PeREM1.3,并将该基因转入模式植物烟草中,通过对转基因烟草表型及生理生化反应的研究,探究了PeREM1.3在活性氧平衡和离子平衡调控及提高耐盐性中的作用。

    • 胡杨1年生实生苗购于新疆,于北京林业大学苗圃进行培养,培养基质为沙土,混合比例为1:1。烟草(Nicotiana tabacum)、农杆菌GV3101、过表达载体pCMBIA2300以及定位载体pGreen0029由笔者所在实验室保存;大肠杆菌TOP10感受态细胞以及质粒小提试剂盒购自天根生化科技有限公司;无内毒素质粒小提试剂盒购自康为世纪有限公司;Premix TaqTM (TaKaRa TaqTM Version 2.0)和PMD18T载体购于TaKaRa公司;RNA提取试剂盒购自于艾德莱科技有限公司;cDNA反转录试剂盒购自于promega生物技术有限公司;其余试剂由北京拜尔迪生物科技有限公司提供。引物合成由上海生工生物工程股份有限公司完成,测序服务由北京华大基因提供。

    • 选取种植于北京林业大学苗圃的长势良好的胡杨幼苗,分别用175 mmol/L NaCl或255 mmol/L甘露醇溶液处理胡杨幼苗,分别在0、2、6、12、24、48 h取胡杨叶片以液氮速冻并提取其总RNA,利用M-MLV逆转录酶反转录合成cDNA。使用PeREM1.3特异性荧光定量引物以胡杨Actin基因作为内参基因(引物序列见表 1)。通过qRT-PCR检测,反应条件为:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35个循环;72 ℃ 10 min。反应结束后,分析胡杨PeREM1.3基因在NaCl和甘露醇处理下的相对表达量。

      表 1  本研究中使用的引物序列以及名字

      Table 1.  Gene-specific primer sequences and names used in this work

      引物名称
      Primer name
      上游引物
      Forward primer(5′-3′)
      下游引物
      Reverse primer(5′- 3′)
      HAKATCCACACCGAGCTTGTTTCAGGATGGGTCCAATTCTTCCCACCAAGA
      SOS1GCGTGCTTATTTCCACCTTTTGTTTGATGACGGCTCCCCAGT
      PMA4TTTCCCGAGCACAAGTATGAGGTAACCTCCAAGAACAACAC
      NHA1CCTTATGCTTGTCGGTGCTTTCGCCCATTGTGCTTCCCTTTC
      VAG1GGCACGTAACCACAGTGAAGAGAAGCAGCCATGCCTAGTC
      EF1αGCTGTGAGGGACATGCGTCAAAGTAGTAGATATCGCGAGTACCACCA
      PeActinATTGGCCTTGGGGTTAAGAGCACACTGGAGTGATGGTTGG
      PeREM1.3-0029GFPGCTGCAGCATGGCAGAGGAGGAGCCAAAGCCCGGGTAAAAAAATTCCAAGAAGCTTC
      PeREM1.3-2300CGGGATCCATGGCAGAGGAGGAGCCAAAGGCGTCGACCTATAAAAAAATTCCAAGAAGCTT
      PeREM1.3GTCCAAAGCAGAAAACAAAGCTCACACGTTTAGCTTCGATAATCGCC
      PeREM1.3-FulllengthATGGCAGAGGAGGAGCCAAAGCTATAAAAAAATTCCAAGAAGCTT
    • 根据实验室前期实验数据以及NCBI数据库信息,采用primer 5软件进行引物设计。依照RNA提取试剂盒提供方法提取胡杨叶片的总RNA,采用逆转录试剂盒合成了胡杨叶片cDNA,以胡杨叶片cDNA为模板进行PeREM1.3 cDNA的扩增和后续的基因克隆,扩增体系以及程序依据TaKaRa公司提供方案进行,通过琼脂糖凝胶回收PeREM1.3 cDNA的扩增产物,纯化后与pMD18-T载体连接,连接产物通过热激法转化至E. coli DH5α感受态细胞中,在含有氨苄青霉素的LB平板进行阳性克隆的筛选,通过测序选取和鉴定含pMD18-T-PeREM1.3 cDNA重组质粒的克隆,用于后续实验。

    • 通过生物学数据库(NCBI,http://www.ncbi.nhn.nih.gov/)分析胡杨PeREM1.3编码的氨基酸序列,使用Mega 5软件进行多重序列比对分析以及进化树构建。

    • BamH ISalI双酶切pMD18-T-PeREM1.3 cDNA重组质粒和植物表达载体pCAMBIA2300,琼脂糖凝胶回收、纯化PeREM1.3 cDNA和pCAMBIA2300载体酶切片段, 连接后转至E.coli TOP10感受态细胞中,在含有卡那霉素的LB平板上进行阳性克隆的筛选。通过测序选取、鉴定含有pCAMBIA2300-PeREM1.3构件的克隆用于后续实验。

    • 用pCAMBIA2300-PeREM1.3构件和pCAMBIA 2300载体分别通过热激法转化至农杆菌GV3101中。在含有利福平和卡那霉素的LB平板上筛选阳性克隆。通过DNA测序鉴定然后分别选取含pCAMBIA2300-PeREM1.3构件农杆菌克隆和含有pCAMBIA2300空载体的农杆菌克隆,通过烟草叶盘法进行转化。在含有卡那霉素的MS培养基上筛选阳性植株。将阳性植株移至营养土里进行培养获得T1代种子,种子萌发后提取RNA通过半定量以及荧光定量PCR进行鉴定。选取鉴定为阳性的转基因烟草继续用卡那霉素进行筛选直至获得纯合植株。再次提取纯合烟草的RNA通过半定量以及荧光定量PCR进行鉴定,选取表达量较高的株系用于后续实验。

    • 通过内切酶PstIXmaI将去掉终止密码子的PeREM1.3连接到定位载体pGreen0029上,将连接产物转至E.coli TOP10感受态细胞中,在含有卡那霉素的LB平板上进行筛选,挑取阳性克隆进行PCR初步鉴定,通过DNA测序进一步鉴定阳性克隆。选取测序正确的阳性克隆,提取质粒,转化农杆菌GV3101菌株,在含有利福平和卡那霉素的LB平板进行筛选。选取含pGreen0029-PeREM1.3重组质粒的阳性菌株,通过注射的方法将pGreen0029-PeREM1.3转入到烟草中,注射后2 d利用激光共聚焦显微镜检测PeREM1.3蛋白的亚细胞定位。

    • 将野生型烟草和转基因烟草株系的种子播种于1/2MS培养基上进行培养,待萌发后5 d选取长势相似的烟草移至含有氯化钠的MS培养基上进行耐盐性实验。设置盐浓度梯度为0、150、175 mmol/L。每个株系做3个重复。处理5 d后进行观察、拍照记录,统计根长数据。

    • 过氧化氢酶(CAT)活性测定采用紫外吸收法[17],以1 min内ΔA240减少0.1的酶量为1个过氧化氢酶活性单位(U);超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用NBT(氮蓝四唑)光化还原法[18],以抑制NBT光还原50%的酶量为1个酶活力单位(U);过氧化物酶(POD)活性测定采用愈创木酚法[19],以每分钟OD值变化(升高)0.01为1个酶活性单位(U)。采用考马斯亮蓝G250法测定蛋白含量,标准蛋白为小牛血清白蛋白(BSA)。

    • 将野生型烟草和转基因烟草的种子播种于1/2MS培养基上进行培养,萌发后5 d将长势相似的烟草移至含有150 mmol/L NaCl的MS培养基上进行处理。处理10 d后收取样品,提取RNA并反转录为cDNA,通过荧光定量PCR检测抗逆相关基因SOS1(Na+/H+逆向转运蛋白基因),HAK(钾离子转运体蛋白基因),NHA1(质膜H+-ATP酶1基因),VAG1(液泡膜H+-ATPase基因)和PMA4(质膜H+-ATP酶4基因)的转录水平表达情况,各抗逆基因荧光定量引物见表 1

    • 所有数据使用软件SPSS(SPPS Statistics 17.0)进行统计学分析,P < 0.05为显著性差异。

    • 根据本实验室前期研究结果,本实验以175 mmol/L NaCl处理胡杨,提取胡杨叶片的总RNA,通过荧光定量PCR的方法分析胡杨PeREM1.3在盐胁迫后的表达情况。从图 1可见,在NaCl处理后,随着处理时间的增加,胡杨PeREM1.3的表达量逐渐增加(图 1A),在12 h的时候出现了一定下降,但是相对于未处理时依然为上调。处理24 h后呈现显著上调,在24和48 h其表达量分别为对照的2.4和3.3倍。

      图  1  不同胁迫处理下胡杨PeREM1.3基因在胡杨叶片中的表达量变化

      Figure 1.  Expression changes of PeREM1.3 in leaf under different stress treatments in Populus euphratica

      另一方面用255 mmol/L甘露醇处理胡杨,提取叶片总RNA,通过荧光定量PCR的方法分析胡杨PeREM1.3在渗透胁迫处理后的相对表达量(图 1B)。从图中可以看到,在甘露醇处理后,随着时间的延长,胡杨PeREM1.3的表达量逐渐增加,处理24 h后,其表达量为未处理时的2.3倍。

    • 基因序列分析表明,PeREM1.3的开放阅读框(ORF)有600 bp、编码199个氨基酸,蛋白质大小为22.34 kD。胡杨、毛果杨(Populus trichocarpa)、拟南芥3种植物中的remorin蛋白(REM蛋白)同源序列的氨基酸多重序列比对和系统进化树分析显示。PeREM1.3与其他物种中的REM存在显著的亲缘关系,表明PeREM1.3属于REM同源蛋白,PeREM1.3与毛果杨REM的亲缘关系最为接近,说明杨属(Populus)树种在REM的分子进化上具有高度保守性。另外由进化关系可以看出PeREM1.3与拟南芥中AtREM1家族亲缘关系较近。

    • 用带有GFP绿色荧光标签的重组载体转化至烟草叶片中进行瞬时表达,观察绿色荧光在细胞内的分布情况。从图 3中可以看出,PeREM1.3-GFP融合蛋白存在于质膜上,使用膜特异性染料FM4-64进行染色,结果显示PeREM1.3-GFP融合蛋白与FM4-64存在共定位,PeREM1.3在质膜上呈现点状分布,说明PeREM1.3定位于质膜的微结构域上。

      图  2  胡杨PeREM1.3序列分析

      Figure 2.  Analysis of the amino acid sequence encoded by PeREM1.3

      图  3  PeREM1.3的亚细胞定位

      Figure 3.  Subcellular location of PeREM1.3

    • 用Trizol法提取野生型烟草、T2代纯合子转PeREM1.3烟草和转空载体烟草的叶片总RNA,进行半定量和荧光定量PCR检测。结果显示(图 4):在烟草内参基因EF1α表达一致的情况下,8个转PeREM1.3基因株系均扩增出目的片段(约250 bp),分别为OE1、OE6、OE7、OE9、OE11、OE16、OE18、OE22。野生型(WT)和转空载体(VC)烟草中未检测到目的基因PeREM1.3的表达。采用荧光定量PCR的方法检测以上株系,结果显示与半定量结果一致。因此选择表达量高的两个转基因株系OE11、OE22进行之后的生理生化实验,从转空载体烟草中选择一个株系作为对照。

      图  4  转基因烟草各株系荧光定量和半定量RT-PCR检测PeREM1.3

      Figure 4.  Quantitative reverse transcription PCR and semi-quantitative reverse transcription PCR analysis of each line in tobacco plants

    • 为了检测PeREM1.3转基因烟草的耐盐性,本实验采用了不同浓度的NaCl对野生型植株、转空载体株系和转PeREM1.3基因株系OE11和OE22进行处理。结果显示,在0 mmol/L NaCl处理的情况下,各个株系之间生长状况没有显著性差异(图 5A),其根长也没有明显的差异(图 5B)。在150 mmol/L氯化钠处理条件下,OE11和OE22长势明显优于野生型和转空载体株系,根长数据同样显示OE11和OE22相对于野生型和转空载体株系更加抗盐。在175 mmol/L氯化钠处理条件下,各个株系生长状况相对于0 mmol/L氯化钠处理的条件下明显更差,根长也受到了显著的抑制,但是OE11和OE22的长势和根长仍好于野生型和转空载体植株(图 5)。说明过表达PeREM1.3可以提高烟草的耐盐性。

      图  5  烟草在含有不同浓度NaCl培养基上的根长生长情况

      Figure 5.  Root length of tobacco on MS medium supplemented with different NaCl concentrations

    • 为了检测转基因烟草在盐胁迫下抗氧化物酶的差异,本实验测定了150 mmol/L NaCl处理后各株系中SOD、POD和CAT的活性。由图 6可以看出,在盐胁迫处理下OE11和OE22株系的SOD、POD和CAT的活性显著高于野生型植株和转空载体株系。实验结果说明PeREM1.3能够通过提高抗氧化物酶的活性来调节ROS平衡,进而提高了植物的耐盐能力。

      图  6  盐处理后烟草中SOD酶活性(A)、POD酶活性(B)和CAT酶活性(C)变化

      Figure 6.  Activity of SOD (A), POD (B) and CAT (C) in tobacco plants after salt treatment

    • 为了进一步阐释PeREM1.3在抗盐中的作用,本实验检测了盐胁迫后转基因株系和野生型植株以及转空载体株系中几个植物抗逆的关键基因的表达水平。结果显示,150 mmol/L NaCl处理条件下转基因株系OE11和OE22中SOS1、HAKNHA1、VAG1和PMA4表达水平均高于野生型植株和转空载体株系。其中PMA4的表达量变化最明显,相较于野生型植株和转空载体株系,OE11和OE22中PMA4的转录水平提高了4~6倍。SOS1和HAK的转录水平也有较大的提高(图 7)。表明抗逆相关基因SOS1、HAKNHA1、VAG1和PMA4对盐胁迫的响应与PeREM1.3蛋白有关。

      图  7  盐胁迫对PeREM1.3转基因烟草抗逆相关基因SOS1、HAKNHA1、VAG1和PMA4表达的影响

      Figure 7.  Effects of NaCl on relative expression of stress- resistance related genes in transgenic tobacco plants

    • 胡杨在NaCl或Mannitol处理后,叶片中PeREM1.3的表达水平显著提高(图 1),通过氨基酸多重序列比对和进化树分析,表明PeREM1.3是一类remorin蛋白,另外由进化关系可以看出PeREM1.3与拟南芥中的AtREM1家族亲缘关系较近(图 2),亚细胞定位结果说明其定位与质膜的微结构域脂筏上(图 3)。脂筏是质膜上富含胆固醇和鞘磷脂的微结构域,在动物细胞中脂筏的功能十分明确,即作用于信号转导和蛋白分选,参与信号转导的膜蛋白分布于脂筏的区域[3, 20]。为了进一步研究PeREM1.3在盐胁迫下的功能,本实验将PeREM1.3基因转入到模式植物烟草中进行功能分析(图 4)。

      本实验采用不同浓度的NaCl对烟草进行胁迫处理,结果显示过表达PeREM1.3的烟草根长受抑制程度显著低于野生型和转空载体烟草(图 5),说明过表达PeREM1.3可以提高烟草的耐盐性。在盐处理后,我们也检测到过表达PeREM1.3烟草中抗氧化酶SOD、POD和CAT活性明显增加(图 6),提示胡杨有可能受到盐胁迫后通过提高PeREM1.3蛋白表达水平,上调细胞抗氧化酶活性,有效地减少了盐诱导的活性氧积累,降低了质膜氧化损伤程度,维持了活性氧平衡。研究表明,植物的耐盐性与活性氧平衡的关系密切,耐盐的植物一般有较高的抗氧化酶活性或者能够上调抗氧化酶的活性;不耐盐的品种其抗氧化酶系统效率则较低[20-23]。因此推测PeREM1.3可能通过调控活性氧平衡提高胡杨的耐盐性。

      本研究显示,盐胁迫条件下过表达PeREM1.3的烟草中,SOS1、HAKNHA1、VAG1和PMA4等多个抗逆相关基因表达均上调(图 7)。有研究报道,Na+ /H+逆向转运蛋白(SOS1)具有外排Na+的功能,对于避免植物由于Na+过量造成盐毒害具有重要意义[25]。Wu等[26]研究发现,在盐胁迫条件下,GhNHX1在耐盐棉花(Gossypium hirsutun)品种中转录水平显著提高;同时在耐盐水稻品种中,OsNHX1在根系和幼芽中也被NaCl显著诱导[27]。也有报道显示,在盐胁迫处理下转基因植株中HAK1的表达量也显著提高了[28]。有报道显示胡杨液泡膜H+-ATPase的活性在盐胁迫中具有重要作用[29]。另外Moriau等[30]发现皱叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia)中PMA4在调控K+离子吸收中具有重要作用。实验室前期结果表明,过表达胡杨质膜H+-ATPase可以维持转基因株系的K+/Na+平衡,从而提高转基因株系的耐盐性[31]。同时,K+/Na+平衡在植物耐盐性中具有重要作用[32]。与盐敏感植物相比较,在盐胁迫下胡杨能够更好地维持K+/Na+平衡[12-13, 15, 24],因此PeREM1.3可能通过调控离子平衡提高胡杨的耐盐性。

      综上所述,胡杨PeREM1.3基因通过提高抗氧化物酶活性维持活性氧平衡,另一方面通过提高离子平衡相关基因的表达调控K+/Na+平衡。总之,本文从分子水平上证实了胡杨PeREM1.3通过调控植物活性氧平衡和离子平衡提高植物的耐盐性。

参考文献 (32)

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