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毛白杨多态SSR引物库和种质资源指纹图谱库构建

韩志强 任勇谕 夏宇飞 耿喜宁 杜康 康向阳

韩志强, 任勇谕, 夏宇飞, 耿喜宁, 杜康, 康向阳. 毛白杨多态SSR引物库和种质资源指纹图谱库构建[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(7): 10-18. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190040
引用本文: 韩志强, 任勇谕, 夏宇飞, 耿喜宁, 杜康, 康向阳. 毛白杨多态SSR引物库和种质资源指纹图谱库构建[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(7): 10-18. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190040
Han Zhiqiang, Ren Yongyu, Xia Yufei, Geng Xining, Du Kang, Kang Xiangyang. Construction of polymorphic SSR primer library and germplasm resource fingerprint database of Populus tomentosa[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(7): 10-18. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190040
Citation: Han Zhiqiang, Ren Yongyu, Xia Yufei, Geng Xining, Du Kang, Kang Xiangyang. Construction of polymorphic SSR primer library and germplasm resource fingerprint database of Populus tomentosa[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(7): 10-18. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190040

毛白杨多态SSR引物库和种质资源指纹图谱库构建

doi: 10.13332/j.1000-1522.20190040
基金项目: “十三五”国家重点研发计划课题(2016YFD0600403),北京市共建项目专项
详细信息
    作者简介:

    韩志强,博士。研究方向:细胞遗传与细胞工程。Email:zhiqiangybfq@163.com 地址:410004湖南省长沙市韶山南路498号

    通讯作者:

    康向阳,教授,博士生导师。主要研究方向:林木细胞遗传与细胞工程育种。Email:kangxy@bjfu.edu.cn 地址:100083北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院

Construction of polymorphic SSR primer library and germplasm resource fingerprint database of Populus tomentosa

  • 摘要: 目的针对毛白杨优树种质资源形态学差异小、不易区分等问题,利用多态SSR引物构建优树种质资源指纹图谱,为毛白杨种质资源管理、新品种选育、知识产权保护等提供参考。方法本研究以山东冠县毛白杨种质资源库469个优树无性系为对象,从毛白杨SSR多态引物筛选入手,通过荧光SSR引物PCR扩增和毛细管电泳仪检测筛选SSR引物,并构建指纹图谱。结果在2 317对SSR引物中,共计得到清晰、特异、多态、稳定扩增的SSR引物406对,这些SSR引物在19条染色体上的分布数量介于3 ~ 39对之间,利用BLAST比对分析可将其中389对SSR引物定位到毛果杨基因组,构建了毛白杨优树种质资源多态SSR引物库。应用多态性较高的SSR核心引物,以及特异的SSR辅助引物相结合的技术策略,筛选出25对多态性较高的SSR核心引物,以及13对特异的SSR辅助引物,构建了毛白杨种质资源库内469个优良无性系指纹图谱库,并完成了指纹图谱的QR编码。结论本研究成功构建了毛白杨种质资源多态SSR引物库和优树无性系指纹图谱库,对与毛白杨类似的林木种质资源遗传变异研究以及品种鉴定、系谱分析等具有重要意义。
  • 图  1  毛白杨优株无性系指纹图谱QR编码

    仅列举了18个毛白杨优株无性系材料的二维指纹图谱QR编码。The two-dimensional fingerprinting QR codes of only 18 superior clone materials of Populus tomentosa are listed.

    Figure  1.  Fingerprinting QR codes of Populus tomentosa superior clones

    表  1  毛白杨优良无性系种质特异SSR引物库信息

    Table  1.   Specific SSR primer information of Populus tomentosa superior clonal germplasm

    引物
    Primer
    上游引物(5′−3′)
    Forward primer sequence (5′−3′)
    下游引物(5′−3′)
    Reverse primer sequence (5′−3′)
    染色体
    Chromosome
    位置a
    Locationa
    等位标记配置类型
    Allele configuration type
    GCPM_1053-1 AAAAATGATAACCAGGAAAAA TCGAGTTATCTCAGCCTCAT Chr01 14.84 188/196, 188/215, 186/188, 188/227, 188/188
    GCPM_1153-1 TTCCTTTCACACAATGACAA TTTAAAAACTGGGTCCGTAA Chr11 11.14 176/179, 179/182, 189/189, 171/174, 180/189
    GCPM_1056-1 CCACATTTATGTCCCTCTGT AAGCTGAAGCTGCTCTCTTA Chr06 11.08 134/134, 132/132, 144/144, 124/124
    GCPM_1063 AGTTAATTGCGCATGTTCTT AAACAAACTCCAGCAAACAT Chr05 6.00 166/187, 166/185, 166/191, 167/174
    GCPM_1065 TGCAATCATATATTCCTCCC ATAAAATTACTGCGTGCCAT Chr06 24.97 178/178, 184/184, 172/172, 163/163
    GCPM_1005-1 CTAAGTAGTGAAAGAGGCGG CTCCTGTAAATGTATCCCCA Chr18 0.26 123/123, 128/128, 121/121, 126/130
    GCPM_108-1 CTGCAAGATGTAAGTGATCG CAGCATTAGAGCCAAGCTA Chr18 15.09 121/121, 123/123, 126/126, 117/117
    GCPM_1120-1 TGCAAATCCAAACACAGATA ACGAATCATCTTACGCACTT Chr10 6.05 236/257, 245/245, 236/265, 236/260
    GCPM_1157-1 CCTCCTACCACATATTCCAA AGTGGTTAAAATGCGAGTGT Chr14 17.49 170/170, 173/175, 172/172, 170/175
    GCPM_122-2 GAAACCAGAAAGCAACAATC TGTTTCAACATCACCATGTC Chr02 1.05 201/206, 203/203, 206/206, 201/206
    GCPM_1223-1 CCTGAAGATGAAGATTTTGC TTGAAGTTTGAAGGGAGAAA Chr12 1.04 117/123, 114/117, 117/117, 117/122
    GCPM_1224-2 TGTCTTCTCTCTACAGCAAGG CACCGAGAAGAAACTTTCAG Chr09 11.04 153/153, 109/153, 112/153, 142/142
    GCPM_1033-1 TGAATTAAAGGTGGTGGTTC GGGTGAAATTGCATTTGTAT Chr16 9.83 223/230, 228/228, 230/230
    GCPM_1036-1 AAGTGGAATATTCGCCAAC GCTGGGATGGATCTAGAAA Chr01 35.79 163/163, 170/170, 172/175
    GCPM_1002-1 AAGAACCAGCACTTCCTGTA ATGACTAATCACTTGTGGGC Chr01 11.45 149/149, 159/168, 159/159
    GCPM_1054-1 AGGTCTGTGCAAGGAATAAA GTCTGTAATCAAGCCAAAGC Chr07 0.86 159/164, 159/166, 159/172
    GCPM_1224-1 AAAATGAATTGGCAGAAAGA GCTTCTTAGCTCAACCAGAA Chr09 11.04 196/216, 196/205, 196/207
    GCPM_1023-1 AGAAtAATTGTGGATGGACG TTTAATTGAGATTCGGGCTA Chr11 2.13 114/114, 110/110, 118/118
    GCPM_1175-1 TCATCAACCTGACCTCTACC CAAAGCAAAAACAAACACAA Chr14 13.38 190/209, 190/221, 193/196
    GCPM_1072-2 AGGAAAACAAAGGAGAGGAG ATGCTTAAAAGGGGATCTCT Chr06 4.20 141/146, 143/156, 152/157
    GCPM_11-1 TTGCTGTTAGCATCATTTTC TTGCTCTCTTTGTTGGAGAT Chr01 47.40 154/154, 151/151, 151/154
    GCPM_1116-1 GGGGCTAATATCAGTTTCCT TGAGAAAACCCTGGAAAATA Chr04 0.40 193/199, 199/199
    GCPM_1092-1 TTCTAAATATAAGAtAACC
    AATGAATG
    TATTCCCGCTTGTAATTCCT Chr01 4.82 217/217, 224/224
    GCPM_112-1 TTAGAGGAGAGAACTGCTGC TGGTCTGCAACACAAGATT Chr16 0.14 132/142, 128/132
    GCPM_1145-1 CTGAGAAATCCAACTCCTTG TACAGTAAGAAAGTGCTGCG Chr02 15.10 171/171, 191/191
    GCPM_1041-2 ATGACTTCATTGGGAAGAAA GACGATTTGGACTCCACTAA Chr13 14.59 167/167, 159/159
    GCPM_1079-1 CAAATTGGAGACTTCTCTGC TATTTCAATCTCCCATCGTC Chr05 20.82 222/222, 210/219
    GCPM_1184-1 TCTTGGCGAGAGAAGTAGAG GGATTTGGTGAAAATTGAAG Chr03 14.83 156/168, 154/164
    GCPM_1187-1 TGCTCTTGTATTGTTCCCTT TCTCAAGTAGGGTCCAGCTA Chr03 13.98 192/192, 189/189
    GCPM_1209-1 CGCTGTTGATGGATTACAA GAAAACATAGGAAAGTCGGA Chr12 12.35 132/137, 136/136
    GCPM_1220-1 ACTCTTGTTAAACCAAGCCA ACTACCTTTCTTCCCCTCAC Chr13 10.27 215/215, 204/215
    GCPM_1017-1 GTTTAATTCCCACGTCGTTA CGAATGAAGAAAAACCATTC Chr06 22.44 161/167, 169/173
    GCPM_1025-1 AAGGTGCTCCCACTTACTTT TGTGGCTAGGTAGTTTGGTT Chr03 10.31 135/230, 186/186
    GCPM_124 TTTGAGCACTTCAACTACCA TGTCTTCCCTTAGTCACCAC Chr01 6.33 205/208, 199/208
    GCPM_1242-1 TCGTGCAAATAAAAGCATTA ATGGATATTGTGCTCCTTTG Chr02 15.83 231/231, 229/229
    GCPM_1246 TCAAGTCAGAAACACTTCCA TTGATTCTATGGGTTTCACC Chr10 16.43 222/222, 222/236
    GCPM_1251-1 CTGCATTTGTTTCCTAATTTT AAAATGATAAGCTCGTTTGG Chr04 5.51 143/143, 130/130
    注:a表示SSR标记位点在染色体上的分布位置。Note: a SSR markers were distributed in chromosomes (size in Mb) of Populus.
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    表  2  毛白杨多态SSR引物库基本信息

    Table  2.   Basic information of polymorphic SSR primer library in Populus tomentosa

    项目 Item    所在染色体 Chromosomal localization未定位引物 Unlocated chromosome
    染色体 Chromosome 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
    引物对数 Number of primers 39 39 17 37 28 32 23 31 13 7 13 18 12 6 6 22 3 15 16 17
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    表  3  38对SSR核心引物信息表

    Table  3.   38 pairs of SSR core primer information

    编号
    No.
    引物
    Primer
    引物序列(5′−3′)
    Primer sequence (5′−3′)
    NaNeI杂合性
    Heterozygosity
    鉴定效率
    Identification efficiency
    PICHoHe区分种质数
    Distinguishing germplasm number
    区分率
    Distinguishing rate/%
    1 GCPM_1571-1 F: AAGAAGGGTGGTAAGCTTTT 14 1.694 0.958 0.392 0.054 0.410 81 17.27
    R: TCCGTAGATCTCTCTCCAAA
    2 GCPM_1063 F: AGTTAATTGCGCATGTTCTT 11 2.492 1.160 0.520 0.990 0.599 60 14.74
    R: AAACAAACTCCAGCAAACAT
    3 PMGC_2606 F: AATTTACATTTCTTTATCATCACC 10 2.756 1.225 0.569 0.990 0.638 50 12.29
    R: GCTGTCTAACATGCCATTGC
    4 GCPM_1411-1 F: TCAACGACTTTTTCATTGTG 10 1.476 0.778 0.312 0.206 0.323 48 11.79
    R: AGCATTCTTGCTGGTGTTAT
    5 PMGC_2571 F: TCTCGCAGATTCATGTAACCC 10 2.360 1.048 0.491 0.941 0.577 50 12.29
    R: GACTGTATGTTGACCATGCCC
    6 GCPM_1184-1 F: TCTTGGCGAGAGAAGTAGAG 9 1.696 0.913 0.389 0.435 0.411 39 9.58
    R: GGATTTGGTGAAAATTGAAG
    7 GCPM_1504-1 F: AGGTCTGTGCAAGGAATAAA 9 2.400 1.078 0.497 0.995 0.584 41 10.07
    R: GTCTGTAATCAAGCCAAAGC
    8 GCPM_1072-2 F: AGGAAAACAAAGGAGAGGAG 8 2.677 1.198 0.558 0.966 0.627 35 8.60
    R: ATGCTTAAAAGGGGATCTCT
    9 PMGC-2818 F: AAGCTTCATCGTCCTGCTTG 8 2.171 0.903 0.435 0.872 0.540 33 8.11
    R: CGTATCAATTCACGACTCTCG
    10 GCPM_112-1 F: TTAGAGGAGAGAACTGCTGC 7 2.647 1.168 0.548 0.990 0.623 25 6.14
    R: TGGTCTGCAACACAAGATT
    11 GCPM-2012 F: GGTGATGAAGATCTGGGATA 7 2.549 1.067 0.528 0.980 0.608 24 5.90
    R: ACCCAAATTACAGAACAACG
    12 GCPM_88-1 F: TAAACTGCTTTTAGTTGCCC 7 1.088 0.230 0.080 0.025 0.081 21 5.16
    R: TCCATGTTGTGTGATCTGAG
    13 PMGC_2088-2 F: TCACAAAAGGTTAACGACTTCG 7 1.381 0.561 0.254 0.017 0.276 24 5.89
    R: CAGTACTCAGCTGCAGGTCC
    14 GCPM_2627-1 F: TAAGTCCCACTACACCCAAC 6 2.325 0.950 0.477 0.995 0.571 20 4.91
    R: GAGTTCGAGAGAGGGAATCT
    15 LG_V-2 F: AAAGAAACCAGACCACACAC 6 2.312 0.967 0.473 0.995 0.568 19 4.67
    R: CGCTTGCCTTAATTAACAGT
    16 GCPM-2768 F: CAGCAAAATCATCACAAATC 6 2.136 0.852 0.422 0.988 0.532 19 4.67
    R: AGGGTTTGGTAGAGAAGACC
    17 GCPM_2570-1 F: AACCCACTTCCTCTCTCTGT 6 2.362 0.996 0.495 0.928 0.577 19 4.67
    R: TGAGACTTCCGACTCGTAG
    18 LG_VIII-3 F: ATCCGACTTCGATATCTTCA 6 1.544 0.698 0.328 0.032 0.353 20 4.91
    R: CTACCTGAAACACAGGAAGC
    19 GCPM_1153-1 F: TTCCTTTCACACAATGACAA 6 1.381 0.633 0.265 0.273 0.276 18 4.42
    R: TTTAAAAACTGGGTCCGTAA
    20 GCPM_3652-1 F: TAAACTGCTTTTAGTTGCCC 6 1.069 0.180 0.065 0.015 0.065 18 4.42
    R: TCCATGTTGTGTGATCTGAG
    21 PMGC_223 F: CGATGAGGTTGAAGAAGTCG 5 2.309 0.939 0.472 0.831 0.568 14 3.44
    R: ATATATGTACCGGCACGCCAC
    22 GCPM_3474-1 F: GATCCGAAAACAACAACAAT 5 2.212 0.901 0.445 0.985 0.549 13 3.19
    R: ACCCCTTTCTCTTCTCAATC
    23 GCPM-124 F: TTTGAGCACTTCAACTACCA 5 2.045 0.757 0.391 0.993 0.512 11 2.70
    R: TGTCTTCCCTTAGTCACCAC
    24 LG_XVI-9 F: CTCGCAGCTCTTCTCATAGT 5 2.326 0.953 0.476 0.946 0.571 13 3.19
    R: CCTACCCATTTATGACCAAA
    25 PMGC_2140 F: GCTGTCAGAATCAAACACTTC 5 1.405 0.617 0.274 0.197 0.289 11 2.70
    R: AAGCAGATAACTAAGACATGCC
    26 GCPM_1056-1 F: CCACATTTATGTCCCTCTGT 5 1.485 0.589 0.288 0.017 0.327 13 3.19
    R: AAGCTGAAGCTGCTCTCTTA
    27 ORPM-221 F: TGGAGGCTGTCTGTTTTGTG 5 1.035 0.106 0.034 0.0074 0.034 10 2.26
    R: AGATTTGAGCGACTCCGAAA
    28 GCPM_1832-1 F: TTACTTGCTAGCTGCCAATC 5 1.222 0.428 0.176 0.039 0.182 10 2.46
    R: CCTAAAAGTTTGTCTATGCGA
    29 LG_XVI-7 F: ACAAATCAAAGTCACAGCCT 4 2.201 0.861 0.441 0.985 0.546 8 1.97
    R: ATAGTGTTCAATCGGACCTG
    30 GCPM_1572-2 F: TGTTGTGGATTGTGATTAGG 4 2.074 0.781 0.402 0.995 0.519 9 2.21
    R: ACACTTCCAAACAGAACACC
    31 LG_VIII-4 F: ATCTTTCAAGAAGCTTGACG 4 1.125 0.240 0.106 0.017 0.112 7 1.72
    R: AGCATTCTTGCTGGTGTTAT
    32 GCPM_3367-1 F: CAGGACATTTAACTCCTTCG 4 1.110 0.236 0.096 0.015 0.099 8 1.97
    R: TTAAGTCCTCAACAGAGGGA
    33 GCPM_XIX-11 F: CAACATGAAATGAGCTGCTA 3 2.043 0.746 0.391 0.872 0.511 10 2.46
    R: TCCACATGATGTCTGATTTG
    34 GCPM_1524-1 F: TTCAATGGAAAGGGATAATG 3 2.359 0.933 0.485 0.961 0.577 9 2.21
    R: TCATTTGTAAAACATCACGC
    35 LG_XVI-6 F: ATAGCGATCATCAAAGGAAA 3 2.295 0.906 0.470 0.985 0.565 8 1.97
    R: AAATATTCATGTGGAGGCAC
    36 LG_IX-1 F: CCAACTTCAATGCTAGGAAC 3 2.260 0.894 0.463 0.948 0.558 5 1.06
    R: TGGTAAGCCTGAGGATACAC
    37 ORPM_197 F: GTCAGTTTGCCCTCTTCGTC 2 1.380 0.447 0.237 0.138 0.275 3 0.74
    R: TGAGGGCGTCTCCTCTTTTA
    38 LG_III-2 F: ATTGATTATATTTGCCGCAT 2 1.244 0.347 0.177 0.202 0.197 2 0.49
    R: TGGACATCTCACTACCTTCC
    均值 Average value 6.017 1.912 0.770 0.378 0.601 0.427
    注:Na. 等位标记数量;Ne. 有效等位标记数量;I. Shannon’s信息指数;Ho. 观察杂合度;He. 期望杂合度;PIC. 多态性信息含量。Notes: Na, number of alleles per locus; Ne, effective number of alleles; I, Shannon’s information index; Ho, observed heterozygosity; He, expected heterozygosity; PIC, polymorphism information content.
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    表  4  毛白杨指纹图谱构建最佳引物组合筛选

    Table  4.   Optimum primer combination applied to construction of the fingerprint of Populus tomentosa

    引物组合
    Primer combination
    鉴定效率
    Identification efficiency
    区分种质数
    Distinguishing
    germplasm number
    区分率
    Distinguishing rate/%
    No.1—No.5 156 33.17
    No.1—No.10 262 55.77
    No.1—No.15 361 76.97
    No.1—No.20 448 95.52
    No.1—No.25 456 97.29
    No.1—No.30 463 98.77
    No.1—No.38 469 100.00
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    表  5  毛白杨优株无性系SSR指纹代码

    Table  5.   SSR fingerprint code of Populus tomentosa superior clones

    编号 No.SSR指纹代码 SSR fingerprint code
    2-3 1A391/396B236/246C165/184D206/206E191/191F178/178G388/388H237/237I133/143J237/257K387/387L157/164M242/242N196/207O180/189P170/173Q115/130R221/234S138/140T194/196U352/368V126/138W152/152X121/121Y145/145Z144/144AA121/133AB398/398AC178/178AD118/118AE151/157AF185/185AG153/163AH166/191AI146/146AJ106/118AK220/220AM205/209
    314 1A396/396B236/246C165/184D206/206E191/191F176/178G388/405H237/237I131/133J237/257K387/387L157/162M236/236N196/207O180/180P170/175Q115/130R218/221S138/140T194/204U352/364V129/138W156/156X121/121Y145/145Z144/144AA121/133AB398/405AC178/178AD118/123AE148/151AF185/185AG153/153AH166/185AI146/146AJ106/118AK220/220AM205/209
    3-3-4 2A396/396B236/246C165/184D206/208E191/191F176/178G388/405H237/237I131/133J237/257K387/387L157/162M220/236N196/207O180/180P170/173Q115/130R218/221S138/140T194/204U352/364V129/138W156/156X121/121Y145/145Z144/144AA121/133AB398/405AC178/178AD118/123AE148/151AF185/185AG153/153AH166/185AI146/146AJ106/118AK220/220AM205/209
    3000-4 1A396/396B236/246C165/184D206/206E191/191F176/178G388/405H237/237I131/133J237/257K387/387L157/162M236/236N196/207O180/180P170/173Q115/130R218/221S138/140T194/204U352/364V129/138W156/156X121/121Y145/145Z144/144AA121/133AB405/405AC178/178AD118/123AE185/185AF185/185AG153/153AH166/185AI146/146AJ106/118AK220/220AM205/209
    6319 2A396/396B236/246C165/184D206/206E191/191F176/178G388/405H237/237I131/133J237/257K387/387L157/162M236/236N196/207O180/180P170/170Q115/130R218/221S138/140T194/204U352/364V129/138W156/156X121/121Y145/145Z144/144AA121/133AB398/405AC178/178AD118/123AE148/151AF185/185AG153/153AH166/185AI146/146AJ106/118AK220/220AM205/209
    注:本表格只示例部分毛白杨优株无性系指纹代码。Note: only part of the clone fingerprint code of Populus tomentosa is showed in this table as example.
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    [15] 韦艳葵, 刘鹏举, 李国雷, HUALi_zhong, 任强, 汪杭军1, 李生宇, 方升佐, 耿玉清, 张冬梅, 周传艳, 王兰珍, 段文霞, 薛康, 吴丽娟, 王立海, 赵铁珍, 李义良, 李雪华, 党文杰, 刘剑锋, 朱小龙, 王旭, 雷加强, 方陆明, 杨慧敏, 何茜, 刘勇, 宋永明, 刘勇, 周亮, 黎明, 余新晓, 尹光彩, 高岚, 崔同林, 杨娅, 周宇飞, JIANGXi_dian, 韩士杰, 朱波, 周国逸, 苏晓华, 李建章, 阎秀峰, 李振基, 宗文君, 刘锐, 喻理飞, 虞木奎, 唐小明, 王新杰, 玲, 王春林, 周国逸, 孙向阳, HEXiu_bin, 徐新文, 赖志华, 徐扬, 鹿振友, 李吉跃, 柯水发, 王清文, 程云清, 沈熙环, 张冰玉, 宋爱琴, 齐涛, 3, 郭蓓, 王伟宏, , 李丙文, 张志毅, 陈培金, 国庆, 陈实, 温亚利, 李俊清, 陈峻崎, 周晓梅, 李晓兰, 孙阁, 茹广欣, 姚永刚, 周玉平, 唐旭利, 王旭, 王建林, 张可栋, 蒋德明, 王晓静, 刘志明, 长山, 陈放, 王春林, 赵双荣, 宋湛谦, 关少华, 闫俊华, 杨伟伟, 郑凌峰.  黄芩种质资源及培育技术研究进展 . 北京林业大学学报, 2007, 29(2): 138-146.
    [16] 孙月琴, 姚娜, 贺窑青, 孙青, 石娟, 金莹, 熊丹, 陈佳, 欧阳杰, 李莉, 刘美芹, 李艳华, 段旭良, 胡海英, 周章义, 乔海莉, 王丰俊, 胡晓丹, 程堂仁, 李在留, 刘丽, 王莉, 隋金玲, 郝晨, 范丙友, 张玲, 雷庆哲, 曲红, 阎伟, 张志毅, 张香, 陆海, 续九如, 李云, 李凤兰, 骆有庆, 沈昕, 郭锐, 骆有庆, 王建中, 陈发菊, 武彦文, 郑彩霞, 冯秀兰, 张德权, 孙爱东, 赵亚美, 尹伟伦, 周燕, 陈晓阳, 冯菁, 康向阳, 张艳霞, 尹伟伦, 路端正, 田呈明, 胡德夫, 吴晓成, 高述民, 骆有庆, 安新民, 赵蕾, 马钦彦, 阎晓磊, 孙爱东, 王华芳, 李忠秋, 胡晓丹, 史玲玲, 郝俊, 梁华军, 王百田, 卢存福, 姜金仲, 沈繁宜, 王晓东, 骆有庆, 武海卫, 蒋湘宁, 梁宏伟, 郑永唐, 郭晓萍, 邹坤, 于京民2, 吴坚, 严晓素, 温秀凤3, 王瑛, 冯晓峰, 王玉兵, 尹伟伦, 骈瑞琪, 张志翔, 王华芳, 谢磊, 崔彬彬
    , 王冬梅, 王晓楠, 高荣孚, 王建中, 赵兵, 冯仲科, 李凯, 刘玉军, 李凤兰, 刘艳, 刘玉军, 陶凤杰, 孙建华, 王民中, 王玉春, 丁霞, 呼晓姝, 杨伟光, 张兴杰, 沈应柏, 林善枝, 陈卫平, 张庆, 李镇宇, 马建海, 汪植, 蒋平, 付瑞海, 赵新丽.  林木和花卉种质资源信息共享平台的设计与开发 . 北京林业大学学报, 2007, 29(5): 147-152.
    [17] 刘常富, 王玉涛, 齐春辉, 邹大林, 张求慧, 张灿, 王云琦, 李贤军, 李吉跃, 吴斌, 谭炳香, 段爱国, 冯夏莲, 
    ZHAOGuang-jie, 李雪萍, 赵燕东, 李雪峰, 温俊宝, 常德龙, 鲁绍伟, 郑凌凌, 徐文铎, 刘金福, 匡文慧, 程占红, 王玉杰, 温俊宝, 张建国, 白陈祥, 张树文, 何正权, 赵广杰, 李增元, 洪伟, 余新晓, 何友均, 韩士杰, 李吉跃, 翟洪波, LUOWen-sheng, 宋湛谦, 朱天辉, 韩烈保, 吴庆利, 何承忠, 何兴元, 张路平, 吴斌, 骆有庆, 梁小红, 姜伟, 刘凤芹, 郭忠玲, 陈尔学, 骆有庆, 李俊清, 林秦文, 匡秋明, ]魏晓霞, FurunoTakeshi, 张志毅, ]陈玮, 黄文豪, 何静, 张养贞, 童书振, 陈发菊, 许志春, 胡伟华, 张璧光, 庞勇, 曾会明, 赵桂玲, 梁宏伟, 郑兴波, 崔国发, RENQian, 许志春, 张军, 安新民, 张振明, 李颖, PaulWolfgang, 杨凯, 侯伟, 雷渊才, 郑杰, 李福海, 赵广亮, 曹川健, 刘君, 李凤兰, 宋国正, 张有慧, 姚永刚, 董建生, 张全来, 李考学, 田桂芳, 李永波, 赫万成, 李长明, 张世玺.  毛白杨幼林间作效应研究 . 北京林业大学学报, 2006, 28(3): 81-85.
    [18] 程占红, 冯夏莲, 齐春辉, 张灿, 段爱国, 谭炳香, 匡文慧, 李贤军, 张求慧, 李雪峰, 吴斌, 王玉涛, 王云琦, 赵燕东, 
    ZHAOGuang-jie, 刘金福, 李吉跃, 刘常富, 邹大林, 常德龙, 郑凌凌, 鲁绍伟, 温俊宝, 徐文铎, 李雪萍, 白陈祥, 吴斌, 李增元, 李吉跃, 洪伟, 吴庆利, 韩烈保, 何兴元, 翟洪波, 赵广杰, 温俊宝, 何正权, 何友均, 王玉杰, 宋湛谦, 张树文, 余新晓, 何承忠, 韩士杰, 朱天辉, 张路平, 张建国, LUOWen-sheng, 刘凤芹, 李俊清, 骆有庆, 陈发菊, 骆有庆, 何静, 黄文豪, 匡秋明, 张养贞, 陈尔学, 张志毅, 姜伟, 郭忠玲, ]陈玮, FurunoTakeshi, 林秦文, ]魏晓霞, 童书振, 梁小红, 安新民, 庞勇, 张振明, 梁宏伟, 李颖, 许志春, 张军, 胡伟华, 崔国发, 张璧光, 郑兴波, 许志春, RENQian, 赵桂玲, 曾会明, PaulWolfgang, 刘君, 宋国正, 雷渊才, 曹川健, 侯伟, 李福海, 杨凯, 郑杰, 李凤兰, 赵广亮, 姚永刚, 董建生, 张全来, 张有慧, 李考学, 田桂芳, 李永波, 赫万成, 李长明, 张世玺.  毛白杨ISSR反应体系的建立及优化 . 北京林业大学学报, 2006, 28(3): 61-65.
    [19] 颜容, 范丙友, 谭伟, 肖生春, 徐双民, 张宇清, 孙晓梅, 杨振德, 王玉杰, 南海龙, 高峻, 时尽书, 陈文汇, 张冰玉, 吕建雄, 金小娟, 翟明普, 李绍才, 朱教君, 潘存德, 窦军霞, 李发东, 胡晓丽, 李世东, 韩海荣, 三乃, 刘红霞, 朱清科, 田小青, 康宏樟, 师瑞峰, 肖洪浪, 孙海龙, 王云琦, 张守攻, 张一平, 胡诗宇, 周春江, 李建章, 刘俊昌, 冯仲科, 苏晓华, 孟平, 骆秀琴, 谢益民, 宋献方, 张雁, 杨志荣, 吴斌, 陆海, 赵博光, 姜伟, 赵双菊, 马钦彦, 蔡怀, 周文瑞, 蒋佳荔, 李智辉, 齐实, 李义良, 刘昌明, 王笑山, 齐实, 岳良松, 蒋湘宁, 于静洁, 葛颂, 张永安, 姚山, 蒲俊文, 张岩, 张德荣, 朱金兆, 伊力塔, 赵有科, 宋清海, 何磊, 张劲松, 齐力旺, 褚建民, 杨聪, 马超德, 曲良建, 石丽萍, 康峰峰, 崔保山, 吴庆利, 刘元, 吕守芳, 朱林峰, 刘鑫宇, 刘相超, 王建华, 王玉珠, 田颖川, 胡堃, 唐常源.  三倍体毛白杨无性系的AFLP分子标记鉴定 . 北京林业大学学报, 2006, 28(2): 9-14.
    [20] 殷亚方, 张一平, 符韵林, 侯亚南, 宋小双, 马文辉, 杜华强, 龙玲, 饶良懿, 刘震, 黄国胜, 李景文, 
    王保平, 李全发, 王明枝, 杨晓晖, 张秋英, 李慧, 李景文, 熊瑾, 李梅, 杨海龙, 詹亚光, 李俊清, 张克斌, 韩海荣, 李吉跃, 范文义, 朱金兆, 朱金兆, 耿晓东, 赵敏, 徐峰, 梁机, 王洁瑛, 王雪军, 吕建雄, 窦军霞, 秦瑶, 刘文耀, 李发东, 李俊清, 李妮亚, 陆熙娴, 陈晓阳, 尹立辉, 秦素玲, 陈素文, 赵宪文, 倪春, 李凤兰, 孙玉军, 刘雪梅, 陈晓阳, 李云, 唐黎明, 毕华兴, 于贵瑞, 欧国强, 乔杰, 沈有信, 刘桂丰, 齐实, 康峰峰, 李黎, 慈龙骏, 赵双菊, 李伟, 魏建祥, 宋献方, 王玉成, 文瑞钧, 马钦彦, 张桂芹, 李伟, 韦广绥, 任海青, 王雪, 黎昌琼, 刘伦辉, 蒋建平, 朱国平, 张万军, 丁霞, 周海江, 杨谦, , 孙涛, 宋清海, 李慧, 孙晓敏, 刘莹, 孙志强, 李宗然, 
    , .  毛白杨转rolB基因植株生根能力的研究 . 北京林业大学学报, 2005, 27(5): 54-58.
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-01-15
  • 修回日期:  2019-05-12
  • 网络出版日期:  2019-07-04
  • 刊出日期:  2019-07-01

毛白杨多态SSR引物库和种质资源指纹图谱库构建

doi: 10.13332/j.1000-1522.20190040
    基金项目:  “十三五”国家重点研发计划课题(2016YFD0600403),北京市共建项目专项
    作者简介:

    韩志强,博士。研究方向:细胞遗传与细胞工程。Email:zhiqiangybfq@163.com 地址:410004湖南省长沙市韶山南路498号

    通讯作者: 康向阳,教授,博士生导师。主要研究方向:林木细胞遗传与细胞工程育种。Email:kangxy@bjfu.edu.cn 地址:100083北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院

摘要: 目的针对毛白杨优树种质资源形态学差异小、不易区分等问题,利用多态SSR引物构建优树种质资源指纹图谱,为毛白杨种质资源管理、新品种选育、知识产权保护等提供参考。方法本研究以山东冠县毛白杨种质资源库469个优树无性系为对象,从毛白杨SSR多态引物筛选入手,通过荧光SSR引物PCR扩增和毛细管电泳仪检测筛选SSR引物,并构建指纹图谱。结果在2 317对SSR引物中,共计得到清晰、特异、多态、稳定扩增的SSR引物406对,这些SSR引物在19条染色体上的分布数量介于3 ~ 39对之间,利用BLAST比对分析可将其中389对SSR引物定位到毛果杨基因组,构建了毛白杨优树种质资源多态SSR引物库。应用多态性较高的SSR核心引物,以及特异的SSR辅助引物相结合的技术策略,筛选出25对多态性较高的SSR核心引物,以及13对特异的SSR辅助引物,构建了毛白杨种质资源库内469个优良无性系指纹图谱库,并完成了指纹图谱的QR编码。结论本研究成功构建了毛白杨种质资源多态SSR引物库和优树无性系指纹图谱库,对与毛白杨类似的林木种质资源遗传变异研究以及品种鉴定、系谱分析等具有重要意义。

English Abstract

韩志强, 任勇谕, 夏宇飞, 耿喜宁, 杜康, 康向阳. 毛白杨多态SSR引物库和种质资源指纹图谱库构建[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(7): 10-18. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190040
引用本文: 韩志强, 任勇谕, 夏宇飞, 耿喜宁, 杜康, 康向阳. 毛白杨多态SSR引物库和种质资源指纹图谱库构建[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(7): 10-18. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190040
Han Zhiqiang, Ren Yongyu, Xia Yufei, Geng Xining, Du Kang, Kang Xiangyang. Construction of polymorphic SSR primer library and germplasm resource fingerprint database of Populus tomentosa[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(7): 10-18. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190040
Citation: Han Zhiqiang, Ren Yongyu, Xia Yufei, Geng Xining, Du Kang, Kang Xiangyang. Construction of polymorphic SSR primer library and germplasm resource fingerprint database of Populus tomentosa[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(7): 10-18. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190040
  • 毛白杨(Populus tomentosa)是中国特有的乡土树种,栽培和利用历史悠久,一直是黄河流域及华北平原地区用材林、农田林网和城乡绿化的主栽树种之一,也是重要的能源、纸浆、胶合板等用材树种[1]。20世纪80年代初,朱之悌组织中国10省研究人员开展毛白杨基因资源调查、选优和收集工作,建立了含1 047株源于优树根萌苗材料的“档案库”和850株源于优树花枝嫁接苗材料的“标本园”,在保存了日益减少的毛白杨基因资源同时,也为毛白杨的种质资源保护和遗传改良奠定了基础[2]。在我国近几十年来迅速发展的杨树育种工作中,育种学家们已经培育出了大量的优良新品种。然而,由于新品种的遗传基础较为狭窄,同时品种之间的形态学差异也越来越小,这给杨树知识产权保护和新品种的鉴定带来了困难。因此,对杨树新品种进行快速、准确地鉴别已成为目前急需解决的问题。

    DNA指纹图谱是品种纯度和真实性鉴定的有效途径,直接反映植物遗传物质在DNA分子水平上的差异[3],其中简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)标记具有多态性高、重复性好、共显性、多等位基因变异等优点,是动植物品种鉴定、系谱分析和遗传多样性分析等的有利工具[4],为利用现代分子生物学技术实现毛白杨种质资源准确、快速区分和有效管理提供了有利条件。随着毛果杨(P. trichocarpa)全基因组序列的发布,国际杨树基因组委员会公布了大量杨树SSR引物信息,为杨树DNA指纹图谱构建提供了便利条件。Dayanandan等最早开展了涉及36个美洲山杨(P. tremuloides)基因型的SSR分子标记研究[5]。随着分子生物学快速发展,尤其是毛果杨全基因组测序顺利完成,大量的杨树SSR引物信息于国际杨树基因组委员会的官方网站逐渐公布,促进了SSR标记在杨树中的应用,主要集中于美洲黑杨、欧洲黑杨及其杂种的遗传图谱构建[6]、品种指纹图谱构建[7]、系谱关系鉴定[8]等方面。但是,有关毛白杨多态SSR引物库和种质资源指纹图谱库构建等工作尚未见报道。

    目前,毛白杨优树种质资源库内尚保存选自9省的优树469个基因型[9],丰富的种质资源储备为毛白杨的遗传改良工作奠定了良好的基础。本论文基于为今后开展毛白杨群体遗传研究以及分子标记辅助选择育种提供公共资源和便利条件的目的,以山东冠县毛白杨种质资源库469个优树无性系为对象,采用TP-M13-SSR毛细管电泳自动检测法,筛选毛白杨SSR多态引物,构建毛白杨多态SSR引物库,以及涉及469份毛白杨优良无性系种质的指纹图谱库,为毛白杨种质资源库管理、品种鉴定以及知识产权保护和系谱分析等提供技术支撑,同时为杨树的育种工作奠定基础。

    • 1983—1984年,北京林业大学(中国,北京)组织全国省(市)毛白杨良种选育攻关协作组,在前期资源普查的基础上,从黄淮海流域100万km2(30° ~ 40°N、105° ~ 125°E)毛白杨分布区的10省100个县市,选取了1 047株毛白杨优树,于1986年建立山东省冠县毛白杨种质资源库。目前,种质资源库尚保存选自北京、河北、山东、河南、山西、陕西、甘肃、江苏和宁夏9省的优树469个基因型,包括75个雌性无性系、394个雄性无性系,其中天然三倍体28株[9]

    • 利用植物基因组DNA提取试剂盒(Tiangen Biotech Co. Ltd, Beijing,China)进行毛白杨总DNA的提取。本研究根据Schuelke的方法共需要3种引物[10],包括5′端接有M13序列(5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′)的上游引物,普通的下游引物以及标有荧光(ROX, FAM, TAMRA, HEX)的M13引物。PCR具体程序如下:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,待测引物的最适退火温度30 s,72 ℃ 30 s共25个循环;94 ℃ 30 s,53 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s共8个循环;72 ℃ 8 min,4 ℃保存。PCR产物委托睿博兴科生物科技(北京)有限公司在ABI-3730XL基因分析仪上进行测试,其结果应用GeneMarker 1.75软件等[11],进行读取及分析。

    • 随机选取国际杨树基因组协会(International Populus Genome Consortium)公布的SSR数据库(IPGC;http://www.ornl.gov/sci/ipgc/ssr_resource.htm)中的2 317对SSR引物为筛选对象。在上游引物5′端加以Ml3荧光染料标记,所有引物(上游引物,下游引物以及M13荧光标记引物)均委托北京睿博兴科生物技术有限公司进行合成。应用上述引物,以469个毛白杨优株DNA为模板进行TP-M13-SSR PCR,筛选在不同优树样本间具有多态性的引物。通过软件POPGEN VERSION 1.32计算所有多态性引物的等位标记位点数(Na)、有效等位标记数(Ne)、期望杂合度(He)、观察杂合度(Ho)、Shannon’s多态性指数(I)等遗传参数[12]

    • 利用CERVUS 3.0软件,进行个体鉴定以判断个体基因型在所鉴定群体中是否唯一,确认后参考马红勃等[13]和王静毅等[14]图谱代码构建方法编辑毛白杨无性系指纹图谱代码,即记录各毛白杨种质在每个SSR位点上的等位标记配置(略去单位bp,仅记录数字,并用“/”连接),再将SSR位点按固定顺序进行编码,SSR位点依次记为字母A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T、U、V、W、X、Y、Z、AA、AB、AC、AD、AE、AF、AG、AH、AI、AJ、AK、AM,字母A前面数字1、2分别代表雌、雄。每个无性系的DNA经不同的引物扩增后将会形成由字母和阿拉伯数字组成的一系列编号,便形成了该无性系的SSR指纹图谱代码。即每一条字符串能唯一标识一份毛白杨无性系,可以将每一条字符串作为每一份无性系材料的分子身份证号码。

    • 应用QRCode转化工具进行编码,将各个无性系的名称、性别、类型、植物学分类和指纹图谱代码等情况录入该软件(https://www.the-qrcode-generator.com),形成指纹图谱QR编码。

    • 以469个毛白杨优株DNA为模板进行TP-M13-SSR PCR,在2 317对SSR引物中共计筛选到在不同优树样本间具有多态性的引物中有差异的稳定多态的SSR引物406对,初步完成了毛白杨多态SSR引物库的构建。如表1,引物库部分引物示例中信息包括引物序列,PCR产物碱基长度,以毛白杨DNA为模板的等位标记配置类型以及所在染色体具体位置。

      表 1  毛白杨优良无性系种质特异SSR引物库信息

      Table 1.  Specific SSR primer information of Populus tomentosa superior clonal germplasm

      引物
      Primer
      上游引物(5′−3′)
      Forward primer sequence (5′−3′)
      下游引物(5′−3′)
      Reverse primer sequence (5′−3′)
      染色体
      Chromosome
      位置a
      Locationa
      等位标记配置类型
      Allele configuration type
      GCPM_1053-1 AAAAATGATAACCAGGAAAAA TCGAGTTATCTCAGCCTCAT Chr01 14.84 188/196, 188/215, 186/188, 188/227, 188/188
      GCPM_1153-1 TTCCTTTCACACAATGACAA TTTAAAAACTGGGTCCGTAA Chr11 11.14 176/179, 179/182, 189/189, 171/174, 180/189
      GCPM_1056-1 CCACATTTATGTCCCTCTGT AAGCTGAAGCTGCTCTCTTA Chr06 11.08 134/134, 132/132, 144/144, 124/124
      GCPM_1063 AGTTAATTGCGCATGTTCTT AAACAAACTCCAGCAAACAT Chr05 6.00 166/187, 166/185, 166/191, 167/174
      GCPM_1065 TGCAATCATATATTCCTCCC ATAAAATTACTGCGTGCCAT Chr06 24.97 178/178, 184/184, 172/172, 163/163
      GCPM_1005-1 CTAAGTAGTGAAAGAGGCGG CTCCTGTAAATGTATCCCCA Chr18 0.26 123/123, 128/128, 121/121, 126/130
      GCPM_108-1 CTGCAAGATGTAAGTGATCG CAGCATTAGAGCCAAGCTA Chr18 15.09 121/121, 123/123, 126/126, 117/117
      GCPM_1120-1 TGCAAATCCAAACACAGATA ACGAATCATCTTACGCACTT Chr10 6.05 236/257, 245/245, 236/265, 236/260
      GCPM_1157-1 CCTCCTACCACATATTCCAA AGTGGTTAAAATGCGAGTGT Chr14 17.49 170/170, 173/175, 172/172, 170/175
      GCPM_122-2 GAAACCAGAAAGCAACAATC TGTTTCAACATCACCATGTC Chr02 1.05 201/206, 203/203, 206/206, 201/206
      GCPM_1223-1 CCTGAAGATGAAGATTTTGC TTGAAGTTTGAAGGGAGAAA Chr12 1.04 117/123, 114/117, 117/117, 117/122
      GCPM_1224-2 TGTCTTCTCTCTACAGCAAGG CACCGAGAAGAAACTTTCAG Chr09 11.04 153/153, 109/153, 112/153, 142/142
      GCPM_1033-1 TGAATTAAAGGTGGTGGTTC GGGTGAAATTGCATTTGTAT Chr16 9.83 223/230, 228/228, 230/230
      GCPM_1036-1 AAGTGGAATATTCGCCAAC GCTGGGATGGATCTAGAAA Chr01 35.79 163/163, 170/170, 172/175
      GCPM_1002-1 AAGAACCAGCACTTCCTGTA ATGACTAATCACTTGTGGGC Chr01 11.45 149/149, 159/168, 159/159
      GCPM_1054-1 AGGTCTGTGCAAGGAATAAA GTCTGTAATCAAGCCAAAGC Chr07 0.86 159/164, 159/166, 159/172
      GCPM_1224-1 AAAATGAATTGGCAGAAAGA GCTTCTTAGCTCAACCAGAA Chr09 11.04 196/216, 196/205, 196/207
      GCPM_1023-1 AGAAtAATTGTGGATGGACG TTTAATTGAGATTCGGGCTA Chr11 2.13 114/114, 110/110, 118/118
      GCPM_1175-1 TCATCAACCTGACCTCTACC CAAAGCAAAAACAAACACAA Chr14 13.38 190/209, 190/221, 193/196
      GCPM_1072-2 AGGAAAACAAAGGAGAGGAG ATGCTTAAAAGGGGATCTCT Chr06 4.20 141/146, 143/156, 152/157
      GCPM_11-1 TTGCTGTTAGCATCATTTTC TTGCTCTCTTTGTTGGAGAT Chr01 47.40 154/154, 151/151, 151/154
      GCPM_1116-1 GGGGCTAATATCAGTTTCCT TGAGAAAACCCTGGAAAATA Chr04 0.40 193/199, 199/199
      GCPM_1092-1 TTCTAAATATAAGAtAACC
      AATGAATG
      TATTCCCGCTTGTAATTCCT Chr01 4.82 217/217, 224/224
      GCPM_112-1 TTAGAGGAGAGAACTGCTGC TGGTCTGCAACACAAGATT Chr16 0.14 132/142, 128/132
      GCPM_1145-1 CTGAGAAATCCAACTCCTTG TACAGTAAGAAAGTGCTGCG Chr02 15.10 171/171, 191/191
      GCPM_1041-2 ATGACTTCATTGGGAAGAAA GACGATTTGGACTCCACTAA Chr13 14.59 167/167, 159/159
      GCPM_1079-1 CAAATTGGAGACTTCTCTGC TATTTCAATCTCCCATCGTC Chr05 20.82 222/222, 210/219
      GCPM_1184-1 TCTTGGCGAGAGAAGTAGAG GGATTTGGTGAAAATTGAAG Chr03 14.83 156/168, 154/164
      GCPM_1187-1 TGCTCTTGTATTGTTCCCTT TCTCAAGTAGGGTCCAGCTA Chr03 13.98 192/192, 189/189
      GCPM_1209-1 CGCTGTTGATGGATTACAA GAAAACATAGGAAAGTCGGA Chr12 12.35 132/137, 136/136
      GCPM_1220-1 ACTCTTGTTAAACCAAGCCA ACTACCTTTCTTCCCCTCAC Chr13 10.27 215/215, 204/215
      GCPM_1017-1 GTTTAATTCCCACGTCGTTA CGAATGAAGAAAAACCATTC Chr06 22.44 161/167, 169/173
      GCPM_1025-1 AAGGTGCTCCCACTTACTTT TGTGGCTAGGTAGTTTGGTT Chr03 10.31 135/230, 186/186
      GCPM_124 TTTGAGCACTTCAACTACCA TGTCTTCCCTTAGTCACCAC Chr01 6.33 205/208, 199/208
      GCPM_1242-1 TCGTGCAAATAAAAGCATTA ATGGATATTGTGCTCCTTTG Chr02 15.83 231/231, 229/229
      GCPM_1246 TCAAGTCAGAAACACTTCCA TTGATTCTATGGGTTTCACC Chr10 16.43 222/222, 222/236
      GCPM_1251-1 CTGCATTTGTTTCCTAATTTT AAAATGATAAGCTCGTTTGG Chr04 5.51 143/143, 130/130
      注:a表示SSR标记位点在染色体上的分布位置。Note: a SSR markers were distributed in chromosomes (size in Mb) of Populus.

      通过表2可知,引物库内定位到各染色体上的引物对数范围为7 ~ 39,其中有17对引物未能在基因组内定位。

      表 2  毛白杨多态SSR引物库基本信息

      Table 2.  Basic information of polymorphic SSR primer library in Populus tomentosa

      项目 Item    所在染色体 Chromosomal localization未定位引物 Unlocated chromosome
      染色体 Chromosome 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
      引物对数 Number of primers 39 39 17 37 28 32 23 31 13 7 13 18 12 6 6 22 3 15 16 17
    • 利用初步筛选出的稳定变异等位标记的38对SSR引物对469个毛白杨优株无性系进行荧光标记毛细管电泳检测。由表3可知,38对SSR引物共检测出231个等位标记,不同引物扩增的等位标记数明显不同,可检测到有效等位标记数为2(LG_III-2)至14(GCPM_1571-1)个,平均每个引物6.079个等位标记。平均多态性信息含量(PIC)变动范围为0.034(ORPM-221)至0.569(PMGC_2606),平均值为0.378。平均期望(Ho)及观察杂合度(He)分别为0.601和0.427,Shannon信息指数(I)为0.106 ~ 1.225,每个引物平均值为0.770(表3),说明这套引物有较好的鉴别能力。其中,引物PMGC_2606、GCPM_112-1、GCPM-2012、GCPM_1072-2、GCPM_1063为鉴定效率最高的引物,PIC大于0.5,等位变异数范围为7 ~ 14,在以后毛白杨DNA指纹数据库的构建中应重点应用。

      表 3  38对SSR核心引物信息表

      Table 3.  38 pairs of SSR core primer information

      编号
      No.
      引物
      Primer
      引物序列(5′−3′)
      Primer sequence (5′−3′)
      NaNeI杂合性
      Heterozygosity
      鉴定效率
      Identification efficiency
      PICHoHe区分种质数
      Distinguishing germplasm number
      区分率
      Distinguishing rate/%
      1 GCPM_1571-1 F: AAGAAGGGTGGTAAGCTTTT 14 1.694 0.958 0.392 0.054 0.410 81 17.27
      R: TCCGTAGATCTCTCTCCAAA
      2 GCPM_1063 F: AGTTAATTGCGCATGTTCTT 11 2.492 1.160 0.520 0.990 0.599 60 14.74
      R: AAACAAACTCCAGCAAACAT
      3 PMGC_2606 F: AATTTACATTTCTTTATCATCACC 10 2.756 1.225 0.569 0.990 0.638 50 12.29
      R: GCTGTCTAACATGCCATTGC
      4 GCPM_1411-1 F: TCAACGACTTTTTCATTGTG 10 1.476 0.778 0.312 0.206 0.323 48 11.79
      R: AGCATTCTTGCTGGTGTTAT
      5 PMGC_2571 F: TCTCGCAGATTCATGTAACCC 10 2.360 1.048 0.491 0.941 0.577 50 12.29
      R: GACTGTATGTTGACCATGCCC
      6 GCPM_1184-1 F: TCTTGGCGAGAGAAGTAGAG 9 1.696 0.913 0.389 0.435 0.411 39 9.58
      R: GGATTTGGTGAAAATTGAAG
      7 GCPM_1504-1 F: AGGTCTGTGCAAGGAATAAA 9 2.400 1.078 0.497 0.995 0.584 41 10.07
      R: GTCTGTAATCAAGCCAAAGC
      8 GCPM_1072-2 F: AGGAAAACAAAGGAGAGGAG 8 2.677 1.198 0.558 0.966 0.627 35 8.60
      R: ATGCTTAAAAGGGGATCTCT
      9 PMGC-2818 F: AAGCTTCATCGTCCTGCTTG 8 2.171 0.903 0.435 0.872 0.540 33 8.11
      R: CGTATCAATTCACGACTCTCG
      10 GCPM_112-1 F: TTAGAGGAGAGAACTGCTGC 7 2.647 1.168 0.548 0.990 0.623 25 6.14
      R: TGGTCTGCAACACAAGATT
      11 GCPM-2012 F: GGTGATGAAGATCTGGGATA 7 2.549 1.067 0.528 0.980 0.608 24 5.90
      R: ACCCAAATTACAGAACAACG
      12 GCPM_88-1 F: TAAACTGCTTTTAGTTGCCC 7 1.088 0.230 0.080 0.025 0.081 21 5.16
      R: TCCATGTTGTGTGATCTGAG
      13 PMGC_2088-2 F: TCACAAAAGGTTAACGACTTCG 7 1.381 0.561 0.254 0.017 0.276 24 5.89
      R: CAGTACTCAGCTGCAGGTCC
      14 GCPM_2627-1 F: TAAGTCCCACTACACCCAAC 6 2.325 0.950 0.477 0.995 0.571 20 4.91
      R: GAGTTCGAGAGAGGGAATCT
      15 LG_V-2 F: AAAGAAACCAGACCACACAC 6 2.312 0.967 0.473 0.995 0.568 19 4.67
      R: CGCTTGCCTTAATTAACAGT
      16 GCPM-2768 F: CAGCAAAATCATCACAAATC 6 2.136 0.852 0.422 0.988 0.532 19 4.67
      R: AGGGTTTGGTAGAGAAGACC
      17 GCPM_2570-1 F: AACCCACTTCCTCTCTCTGT 6 2.362 0.996 0.495 0.928 0.577 19 4.67
      R: TGAGACTTCCGACTCGTAG
      18 LG_VIII-3 F: ATCCGACTTCGATATCTTCA 6 1.544 0.698 0.328 0.032 0.353 20 4.91
      R: CTACCTGAAACACAGGAAGC
      19 GCPM_1153-1 F: TTCCTTTCACACAATGACAA 6 1.381 0.633 0.265 0.273 0.276 18 4.42
      R: TTTAAAAACTGGGTCCGTAA
      20 GCPM_3652-1 F: TAAACTGCTTTTAGTTGCCC 6 1.069 0.180 0.065 0.015 0.065 18 4.42
      R: TCCATGTTGTGTGATCTGAG
      21 PMGC_223 F: CGATGAGGTTGAAGAAGTCG 5 2.309 0.939 0.472 0.831 0.568 14 3.44
      R: ATATATGTACCGGCACGCCAC
      22 GCPM_3474-1 F: GATCCGAAAACAACAACAAT 5 2.212 0.901 0.445 0.985 0.549 13 3.19
      R: ACCCCTTTCTCTTCTCAATC
      23 GCPM-124 F: TTTGAGCACTTCAACTACCA 5 2.045 0.757 0.391 0.993 0.512 11 2.70
      R: TGTCTTCCCTTAGTCACCAC
      24 LG_XVI-9 F: CTCGCAGCTCTTCTCATAGT 5 2.326 0.953 0.476 0.946 0.571 13 3.19
      R: CCTACCCATTTATGACCAAA
      25 PMGC_2140 F: GCTGTCAGAATCAAACACTTC 5 1.405 0.617 0.274 0.197 0.289 11 2.70
      R: AAGCAGATAACTAAGACATGCC
      26 GCPM_1056-1 F: CCACATTTATGTCCCTCTGT 5 1.485 0.589 0.288 0.017 0.327 13 3.19
      R: AAGCTGAAGCTGCTCTCTTA
      27 ORPM-221 F: TGGAGGCTGTCTGTTTTGTG 5 1.035 0.106 0.034 0.0074 0.034 10 2.26
      R: AGATTTGAGCGACTCCGAAA
      28 GCPM_1832-1 F: TTACTTGCTAGCTGCCAATC 5 1.222 0.428 0.176 0.039 0.182 10 2.46
      R: CCTAAAAGTTTGTCTATGCGA
      29 LG_XVI-7 F: ACAAATCAAAGTCACAGCCT 4 2.201 0.861 0.441 0.985 0.546 8 1.97
      R: ATAGTGTTCAATCGGACCTG
      30 GCPM_1572-2 F: TGTTGTGGATTGTGATTAGG 4 2.074 0.781 0.402 0.995 0.519 9 2.21
      R: ACACTTCCAAACAGAACACC
      31 LG_VIII-4 F: ATCTTTCAAGAAGCTTGACG 4 1.125 0.240 0.106 0.017 0.112 7 1.72
      R: AGCATTCTTGCTGGTGTTAT
      32 GCPM_3367-1 F: CAGGACATTTAACTCCTTCG 4 1.110 0.236 0.096 0.015 0.099 8 1.97
      R: TTAAGTCCTCAACAGAGGGA
      33 GCPM_XIX-11 F: CAACATGAAATGAGCTGCTA 3 2.043 0.746 0.391 0.872 0.511 10 2.46
      R: TCCACATGATGTCTGATTTG
      34 GCPM_1524-1 F: TTCAATGGAAAGGGATAATG 3 2.359 0.933 0.485 0.961 0.577 9 2.21
      R: TCATTTGTAAAACATCACGC
      35 LG_XVI-6 F: ATAGCGATCATCAAAGGAAA 3 2.295 0.906 0.470 0.985 0.565 8 1.97
      R: AAATATTCATGTGGAGGCAC
      36 LG_IX-1 F: CCAACTTCAATGCTAGGAAC 3 2.260 0.894 0.463 0.948 0.558 5 1.06
      R: TGGTAAGCCTGAGGATACAC
      37 ORPM_197 F: GTCAGTTTGCCCTCTTCGTC 2 1.380 0.447 0.237 0.138 0.275 3 0.74
      R: TGAGGGCGTCTCCTCTTTTA
      38 LG_III-2 F: ATTGATTATATTTGCCGCAT 2 1.244 0.347 0.177 0.202 0.197 2 0.49
      R: TGGACATCTCACTACCTTCC
      均值 Average value 6.017 1.912 0.770 0.378 0.601 0.427
      注:Na. 等位标记数量;Ne. 有效等位标记数量;I. Shannon’s信息指数;Ho. 观察杂合度;He. 期望杂合度;PIC. 多态性信息含量。Notes: Na, number of alleles per locus; Ne, effective number of alleles; I, Shannon’s information index; Ho, observed heterozygosity; He, expected heterozygosity; PIC, polymorphism information content.

      Shannon’s指数和PIC均高于平均值的引物25对,PMGC_2606、GCPM_112-1、GCPM-2012、GCPM_1072-2、GCPM_1063、PMGC_2571、GCPM_1504-1、GCPM_2570-1、PMGC_223、GCPM_1571-1、GCPM_1411-1、GCPM_2627-1、LG_V-2、GCPM_1524-1、LG_XVI-6、LG_XVI-9、PMGC-2818、GCPM-2768、LG_XVI-7、GCPM_1572-2、GCPM_3474-1、GCPM_XIX-11、LG_IX-1、GCPM-124、GCPM_1184-1。25对SSR引物可区分的种质从5份到78份不等,平均为26.4份。区分率最高的引物是GCPM_1571-1(17.27%),最低的为LG_IX-1(1.06%)。

      利用CERVUS 3.0软件进行个体鉴定,确认每一个基因型在所鉴定的种质资源库内是唯一的。选取No.1—No.5号引物,鉴定其对毛白杨种质的区分率,可以区分156份毛白杨种质,区分率为33.17%;其次是No.1—No.10号引物组合,可以区分262份毛白杨种质,区分率为55.77%;再次是No.1—No.15号引物组合,可以区分361份毛白杨种质,区分率为76.97%;No.1—No.20号引物组合,可以区分448份毛白杨种质,区分率为95.52%(表4)。继续增加引物对数,将No.1—No.25号引物组合在一起,可以区分的毛白杨种质数量增加到456份,区分率为97.29%,已基本将材料区分开。以上25对引物可以作为毛白杨种质鉴定的核心引物。此时,仍有13个毛白杨种质不能够相互区分,参考以13份毛白杨种质为模板的等位变异的SSR引物,进一步增加引物的数量,直至再增加13对,总引物数增加为38对时,可全部区分469份毛白杨种质。这样,在增加13对辅助引物后,区分率达到100%。

      表 4  毛白杨指纹图谱构建最佳引物组合筛选

      Table 4.  Optimum primer combination applied to construction of the fingerprint of Populus tomentosa

      引物组合
      Primer combination
      鉴定效率
      Identification efficiency
      区分种质数
      Distinguishing
      germplasm number
      区分率
      Distinguishing rate/%
      No.1—No.5 156 33.17
      No.1—No.10 262 55.77
      No.1—No.15 361 76.97
      No.1—No.20 448 95.52
      No.1—No.25 456 97.29
      No.1—No.30 463 98.77
      No.1—No.38 469 100.00
    • 对引物进行组合以鉴定组合引物的区分率,利用CERVUS 3.0软件明确38个SSR标记可建立469份毛白杨优株无性系的DNA指纹图谱。标记LG_III-2、GCPM_2570-1、PMGC_2606、ORPM_197、PMGC_2140、PMGC_223、LG_IX-1、LG_VIII-3、GCPM_112-1、GCPM_2627-1、LG_VIII-4、GCPM_1504-1、GCPM_1411-1、LG_V-2、GCPM_1153-1、GCPM_1524-1、LG_XVI-6、LG_XVI-9、PMGC-2818、GCPM-2768、LG_XVI-7、GCPM-2012、GCPM_1832-1、GCPM_3367-1、GCPM_88-1、GCPM_3652-1、GCPM_3474-1、GCPM_XIX-11、GCPM_1571-1、GCPM_1572-2、GCPM_1072-2、PMGC_2088-2、GCPM_1184-1、GCPM_1063、GCPM_1056-1、PMGC_2571、ORPM-221、GCPM-124依次记为字母A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T、U、V、W、X、Y、Z、AA、AB、AC、AD、AE、AF、AG、AH、AI、AJ、AK、AM,记录每份材料经不同的38对SSR标记扩增出现的等位标记碱基长度(bp),依据试验之前设计的指纹图谱代码构建方法,为469份供试材料建立能够相互区别于其它供试材料的指纹图谱代码(表5)。例如无性系2-3,指纹代码第一个数字1,代表其为雌株,A391/396代表位点LG_III-2的等位标记配置为391 bp/396 bp,以此类推。

      表 5  毛白杨优株无性系SSR指纹代码

      Table 5.  SSR fingerprint code of Populus tomentosa superior clones

      编号 No.SSR指纹代码 SSR fingerprint code
      2-3 1A391/396B236/246C165/184D206/206E191/191F178/178G388/388H237/237I133/143J237/257K387/387L157/164M242/242N196/207O180/189P170/173Q115/130R221/234S138/140T194/196U352/368V126/138W152/152X121/121Y145/145Z144/144AA121/133AB398/398AC178/178AD118/118AE151/157AF185/185AG153/163AH166/191AI146/146AJ106/118AK220/220AM205/209
      314 1A396/396B236/246C165/184D206/206E191/191F176/178G388/405H237/237I131/133J237/257K387/387L157/162M236/236N196/207O180/180P170/175Q115/130R218/221S138/140T194/204U352/364V129/138W156/156X121/121Y145/145Z144/144AA121/133AB398/405AC178/178AD118/123AE148/151AF185/185AG153/153AH166/185AI146/146AJ106/118AK220/220AM205/209
      3-3-4 2A396/396B236/246C165/184D206/208E191/191F176/178G388/405H237/237I131/133J237/257K387/387L157/162M220/236N196/207O180/180P170/173Q115/130R218/221S138/140T194/204U352/364V129/138W156/156X121/121Y145/145Z144/144AA121/133AB398/405AC178/178AD118/123AE148/151AF185/185AG153/153AH166/185AI146/146AJ106/118AK220/220AM205/209
      3000-4 1A396/396B236/246C165/184D206/206E191/191F176/178G388/405H237/237I131/133J237/257K387/387L157/162M236/236N196/207O180/180P170/173Q115/130R218/221S138/140T194/204U352/364V129/138W156/156X121/121Y145/145Z144/144AA121/133AB405/405AC178/178AD118/123AE185/185AF185/185AG153/153AH166/185AI146/146AJ106/118AK220/220AM205/209
      6319 2A396/396B236/246C165/184D206/206E191/191F176/178G388/405H237/237I131/133J237/257K387/387L157/162M236/236N196/207O180/180P170/170Q115/130R218/221S138/140T194/204U352/364V129/138W156/156X121/121Y145/145Z144/144AA121/133AB398/405AC178/178AD118/123AE148/151AF185/185AG153/153AH166/185AI146/146AJ106/118AK220/220AM205/209
      注:本表格只示例部分毛白杨优株无性系指纹代码。Note: only part of the clone fingerprint code of Populus tomentosa is showed in this table as example.
    • 利用QRCode转化工具对所有毛白杨优株无性系材料指纹图谱代码进行转换,为每份毛白杨种质构建一份二维指纹代码图(图1),图1中仅列举了18个毛白杨优株无性系材料的二维指纹图谱代码图,QR编码中包含了毛白杨优株无性系编号、毛白杨优株无性系性别、毛白杨优株无性系类型、毛白杨优株无性系植物学分类、毛白杨优株无性系指纹图谱代码等信息。图1中毛白杨优株的QR编码中2-3包含以下信息,物种:毛白杨;名称:2-3;种源:山东;性别:雌;倍性:二倍体;植物学分类:杨柳科杨属白杨组;指纹代码如下:1A391/396B236/246C165/184D206/206E191/191F178/178G388/388H237/237I133/143J237/257K387/387L157/164M242/242N196/207O180/189P170/173Q115/130R221/234S138/140T194/196U352/368V126/138W152/152X121/121Y145/145Z144/144AA121/133AB398/398AC178/178AD118/118AE151/157AF185/185AG153/163AH166/191AI146/146AJ106/118AK220/220AM205/209。

      图  1  毛白杨优株无性系指纹图谱QR编码

      Figure 1.  Fingerprinting QR codes of Populus tomentosa superior clones

    • SSR分子标记是检测种质资源遗传信息的有效工具,直接反映植物遗传物质在DNA分子水平上的差异,具有多态性高、重复性好、共显性、多等位标记变异等优点,能有效检测DNA水平上的遗传变异,并提供大量的遗传变异信息[15]。本研究中构建了由406对SSR引物组成的毛白杨多态SSR引物库,其中包括引物在染色体上的定位以及等位标记的片段大小等信息,首次为毛白杨品种鉴定、系谱分析和遗传多样性评价等提供了可供参考的SSR引物公共资源。

    • 选择合适的引物是建立动植物分子指纹图谱进而构建其分子身份证的重要前提[16]。构建种质资源的指纹图谱,要求用最少的引物对数区分最多的种质[17]。本研究首先筛选出稳定的多态SSR引物406对,初步完成了毛白杨多态SSR引物库的构建。在此基础上,采取应用多态性较高的SSR核心引物,以及特异的SSR辅助引物相结合的策略,完成毛白杨优树种质资源指纹图谱库核心引物的筛选。在SSR引物库构建中首先进行了多态性较高的SSR核心引物筛选,主要依据获得的多态SSR引物对毛白杨种质鉴别的区分率,引物扩增等位标记数、Shannon’s指数、多态性信息含量(PIC)等指标,从5对引物开始,由高到低选择多态性高的SSR引物,并逐步增加引物组合的数量,直至再增加多态性SSR引物也难以显著增加鉴别材料数量为止,以获得可对毛白杨种质资源库大多数无性系实现鉴别的引物组合,达到以最少的引物区分最多的种质的目的。本研究筛选25对高多态性SSR核心引物,可鉴别毛白杨种质资源库中469个优树无性系的97.29%,即456个优树无性系。此外,SSR引物库构建还应用了部分多态性不高的引物,主要是由于随着供试材料的增加,会出现诸多相同SSR位点而难以检测差异的材料,尤其是变异极少的材料,此时继续采用Shannon’s指数及多态性信息较高的SSR引物已难以显著提高种质的区分率。因此,从足够多的毛白杨多态SSR引物库中筛选一些特殊差异位点而获得少数特异种质材料可鉴别的指纹图谱,即通过筛选添加毛白杨特异的SSR辅助引物,达到区分全部毛白杨种质的目的。本研究在筛选了25对高多态的核心SSR引物的基础上,同时也应用了13对特异的SSR辅助引物,实现了毛白杨种质资源库469个优良无性系指纹图谱构建,为今后毛白杨遗传资源管理、品种鉴定、系谱分析和知识产权保护等奠定了基础。

    • QR编码QR Code 属于矩阵式二维条码,为日本Denso 公司研制,是一种新型图形符号自动识读处理码制。QR Code 是目前应用最广泛的二维条码之一(Denso wave. QRCode Features [EB/OL]. http://www.densowave.com/qrcode/index-e.html,2010−12−20)。本研究在构建毛白杨种质资源库469个优良无性系指纹图谱的基础上,进一步构建了指纹图谱QR编码。指纹图谱代码易于理解,但其包含信息量少。而指纹图谱QR编码虽然比较抽象,但是可以录入较多相关信息,所包含的信息量较大,可以随时修改,只需对QR编码进行解码,即可得到种质相关信息,具有高效、方便等特点,有利于毛白杨种质鉴定工作的高效开展。

参考文献 (17)

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