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UPLC-MS/MS测定植物组织中植物激素的含量

邓文红 赵欣蕊 张俊琦 郭惠红

邓文红, 赵欣蕊, 张俊琦, 郭惠红. UPLC-MS/MS测定植物组织中植物激素的含量[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(8): 154-160. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190052
引用本文: 邓文红, 赵欣蕊, 张俊琦, 郭惠红. UPLC-MS/MS测定植物组织中植物激素的含量[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(8): 154-160. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190052
Deng Wenhong, Zhao Xinrui, Zhang Junqi, Guo Huihong. Determination of plant hormones in plant tissues by UPLC-MS/MS[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(8): 154-160. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190052
Citation: Deng Wenhong, Zhao Xinrui, Zhang Junqi, Guo Huihong. Determination of plant hormones in plant tissues by UPLC-MS/MS[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(8): 154-160. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190052

UPLC-MS/MS测定植物组织中植物激素的含量

doi: 10.13332/j.1000-1522.20190052
基金项目: 国家自然科学基金面上项目(31870650)
详细信息
    作者简介:

    邓文红,博士,高级实验师。主要研究方向:色质谱分析。Email:dengwh@bjfu.edu.cn 地址:100083 北京市海淀区清华东路35号北京林业大学分析测试中心

  • 中图分类号: S718.43; S792.11; Q503

Determination of plant hormones in plant tissues by UPLC-MS/MS

  • 摘要: 目的植物激素在植物生长发育和响应生物和非生物胁迫过程中起着非常重要的作用,研究植物激素的合成、运输、代谢和分子作用机理,需要对植物激素进行定量分析。针对植物激素在大多数植物组织中的含量很低,性质不稳定,与其共存的次生代谢产物背景干扰严重,此外有些植物材料非常珍稀,材料量少的问题,以毛白杨叶片为材料,建立了超高效液相色谱−串联质谱(UPLC-MS/MS)同时测定植物组织中吲哚乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)、赤霉素(GA3)、茉莉酸(JA)和水杨酸(SA)的新方法,为植物激素的研究提供技术支撑。方法在用异丙醇、水和盐酸(2∶1∶0.002,vvv)混合液4 ℃提取激素时,定量加入IAA、ABA、GA3、JA和SA内标(2H5-IAA、2H6-ABA、2H-JA和2H5-SA各10 ng,2H2-GA3 20 ng),激素提取液经二氯甲烷萃取后,UPLC-MS/MS定量测定。乙腈−0.1%乙酸水溶液为流动相,梯度洗脱,流速 0.8 mL/min,柱温30 ℃,C18色谱柱分离,多反应监测(MRM)、电喷雾电离源(ESI)负离子模式下进行分析,内标曲线法定量。结果5种植物激素在5 min内实现完全分离,检出限为0.01 ~ 0.05 pg/g,定量限为0.05 ~ 0.15 pg/g。在实验所采用的浓度范围内线性相关系数r在0.999 4 ~ 0.999 9之间,精密度和重现性均较好,峰面积的相对标准偏差为1.1% ~ 3.9%。经检测毛白杨叶片中IAA、ABA、GA3、JA、SA的含量分别为(74.38 ± 4.62)ng/g、(193.80 ± 6.04)ng/g、(674.67 ± 18.08)ng/g、(286.62 ± 7.48)ng/g、(746.02 ± 13.93)ng/g。结论本法操作简单,灵敏度高,分析时间短,适用于多种植物激素的测定。
  • 图  1  电喷雾电离模式下植物激素质谱图

    Figure  1.  Mass spectra of plant hormones under electrospray ionization mode

    图  2  毛白杨叶片MRM色谱图

    Figure  2.  MRM chromatogram of Populus tomentosa leaves

    表  1  优化的质谱分析参数

    Table  1.   Optimized MS/MS parameters for quantitative analysis

    植物激素
    Plant hormone
    保留时间
    Retention time/min
    母离子
    Precursor ion
    子离子
    Product ion
    碰撞能量
    Collision energy/eV
    碎裂电压
    Fragmentor voltag/eV
    2H5-IAA 4.10 179.0 135.0 − 15 − 8
    IAA 4.12 174.0 130.0 − 14.2 − 13
    2H6-ABA 4.31 269.1 159.1 − 15 − 15
    ABA 4.32 263.2 153.0 − 17 − 14
    2H2-GA3 3.62 347.2 143.0 − 18 − 11
    GA3 3.63 345.2 143.1 − 33 − 10
    2H-JA 4.81 211.0 59.1 − 17 − 28
    JA 4.55 209.1 59.1 − 17 − 7
    2H5-SA 3.81 142.0 98.0 − 22 − 8
    SA 3.82 137.0 93.1 − 22 − 8
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    表  2  植物激素的线性范围、线性方程、相关系数、精密度、检出限和定量限

    Table  2.   Linear range, linear equation, correlation coefficient, precisions, limits of detection (LODs), limits of quantitation (LOQs) of five plant hormones

    植物激素
    Plant hormone
    线性范围
    Linear range/(ng·mL− 1)
    线性方程
    Linear equation
    相关系数
    Correlation coefficient (r)
    精密度
    Precision/%
    检出限
    LOD/(pg·g− 1)
    定量限
    LOQ/(pg·g− 1)
    IAA 0 ~ 500 y = 0.067 9x − 0.136 6 0.999 8 3.9 0.04 0.13
    ABA 0 ~ 500 y = 0.037 0x + 0.089 7 0.999 7 1.3 0.02 0.07
    GA3 0 ~ 500 y = 0.067 2x + 0.193 3 0.999 5 2.5 0.05 0.15
    JA 0 ~ 500 y = 0.011 4x + 0.025 7 0.999 9 1.1 0.01 0.05
    SA 0 ~ 500 y = 0.035 8x − 0.057 8 0.999 4 3.5 0.04 0.13
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    表  3  毛白杨叶片中5种植物激素的含量

    Table  3.   Contents of five plant hormones in Populus tomentosa leaves ng.g− 1

    IAA ABA GA3 JA SA
    74.38 ± 4.62 193.80 ± 6.04 674.67 ± 18.08 286.62 ± 7.48 746.02 ± 13.93
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  • [1] 陈康, 刘娟, 周修腾, 等. UPLC-MS/MS测定人参花中5种内源植物激素含量[J]. 中国现代中药, 2018, 20(6):705−710.

    Chen K, Liu J, Zhou X T, et al. Determination of various endogenous hormones in flower buds of Panax ginseng by UPLC-MS/MS[J]. Modern Chinese Medicine, 2018, 20(6): 705−710.
    [2] 文静, 孔维军, 罗红梅, 等. 植物内源激素检测方法新进展[J]. 中南药学, 2014, 12(1):47−52. doi:  10.7539/j.issn.1672-2981.2014.01.011

    Wen J, Kong W J, Luo H M, et al. Progress in detection of plant endogenous hormones[J]. Central South Pharmacy January, 2014, 12(1): 47−52. doi:  10.7539/j.issn.1672-2981.2014.01.011
    [3] 缪颖, 伍炳华, 陈德海, 等. 植物激素研究中的遗传学和分子生物学方法[J]. 植物生理学通讯, 2000, 36(3):281−288.

    Miao Y, Wu B H, Chen D H, et al. The genetic and molecular biological manipulations on study of plant hormones[J]. Plant Physiology Communications, 2000, 36(3): 281−288.
    [4] Campos-Rivero G, Osorio-Montalvo P, Sánchez-Borges R, et al. Plant hormone signaling in flowering: an epigenetic point of view[J]. Journal of Plant Physiology, 2017, 214: 16−27. doi:  10.1016/j.jplph.2017.03.018
    [5] Podlešáková K, Ugena L, Spíchal L, et al. Phytohormones and polyamines regulate plant stress responses by altering GABA pathway[J]. New Biotechnology, 2019, 48: 53−65. doi:  10.1016/j.nbt.2018.07.003
    [6] 曹慧颖, 王可, 高何瑞, 等. 植物激素相关microRNA研究进展[J]. 植物生理学报, 2013, 49(11):1121−1126.

    Cao H Y, Wang K, Gao H R, et al. Research progress on microRNA involved in phytohormone response and biosynthesis[J]. Plant Physiology Journal, 2013, 49(11): 1121−1126.
    [7] 刘翠梅, 李冬梅, 郭超, 等. 植物激素测定的挑战与方法学进展[J]. 中国科学, 2017, 47(12):1355−1364.

    Liu C M, Li D M, Guo C, et al. Challenges and recent advances in the determination of plant hormones[J]. Scientia Sinica Chimica, 2017, 47(12): 1355−1364.
    [8] 吴倩, 王璐, 吴大朋, 等. 植物激素样品前处理方法的研究进展[J]. 色谱, 2014, 32(4):319−329.

    Wu Q, Wang L, Wu D P, et al. Recent advances in sample preparation methods of plant hormones[J]. Chinese Journal of Chromatography, 2014, 32(4): 319−329.
    [9] Walton A, Stes E, Smet I D, et al. Plant hormone signalling through the eye of the mass spectrometer[J]. Proteomics, 2015, 15: 1113−1126. doi:  10.1002/pmic.201400403
    [10] Zou Y L, Meng L Y, Cui M Y, et al. Fast on-fiber derivatization and GC/MS analysis of phytohormones in wheat based on pencil-type coated carbon fibers[J]. Food Chemistry, 2019, 274: 254−260. doi:  10.1016/j.foodchem.2018.09.009
    [11] Mijangos L, Ziarrusta H, Olivares M, et al. Simultaneous determination of 41 multiclass organic pollutants in environmental waters by means of polyethersulfone microextraction followed by liquid chromatography–tandem mass spectrometry[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2018, 410: 615−632. doi:  10.1007/s00216-017-0763-2
    [12] Mhlongo M I, Tugizimana F, Piater L A, et al. Untargeted metabolomics analysis reveals dynamic changes in azelaic acid-and salicylic acid derivatives in LPS-treated Nicotiana tabacum cells[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2017, 482: 1498−1503. doi:  10.1016/j.bbrc.2016.12.063
    [13] Pan X Q, Welti R, Wang X M. Quantitative analysis of major plant hormones in crude plant extracts by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry[J]. Nature Protocols, 2010, 5(6): 986−992. doi:  10.1038/nprot.2010.37
    [14] 符继红, 孙晓红, 王吉德, 等. 植物激素定量分析方法研究进展[J]. 科学通报, 2010, 55(33):3163−3176.

    Fu J H, Sun X H, Wang J D, et al. Progress in quantitative analysis of plant hormones[J]. Chinese Science Bulletin, 2010, 55(33): 3163−3176.
    [15] 曾少华, 高洁莹. 植物激素理化检测方法的研究进展[J]. 农产品加工, 2013, 316(5):62−66.

    Zeng S H, Gao J Y. Recent development in physical and chemical determination of phytohormones[J]. Academic Periodical of Farm Products Processing, 2013, 316(5): 62−66.
    [16] 王芳, 陈子林. 茉莉酸类植物激素分析研究进展[J]. 生命科学, 2010, 22(1):45−58.

    Wang F, Chen Z L. Advance in the analysis of plant hormone jasmonates[J]. Chinese Bulletin of Life Sciences, 2010, 22(1): 45−58.
  • [1] 王兵, 程子义, 张蕾, 赵芝婧, 陆海, 刘頔.  过表达毛白杨线粒体APX基因烟草提高抗逆能力的研究 . 北京林业大学学报, 2020, 42(7): 33-39. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190390
    [2] 毛秀红, 朱士利, 李善文, 华辉, 田书勇, 仲伟国, 董玉峰, 安新民.  基于荧光SSR标记的毛白杨核心种质构建 . 北京林业大学学报, 2020, 42(7): 40-47. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190413
    [3] 张晋岚, 张祥雪, 冉苒, 伍敏, 吴尚, 贾黎明.  基于植物分割理论的毛白杨干旱落叶研究 . 北京林业大学学报, 2020, 42(9): 19-27. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190411
    [4] 尹玢, 陆海.  转录组分析氧化胁迫对毛白杨悬浮细胞生长发育的影响 . 北京林业大学学报, 2019, 41(9): 90-98. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190157
    [5] 张永卓, 刘雅琳, 陆海, 李慧.  转录组分析组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA对毛白杨悬浮细胞表达谱的影响 . 北京林业大学学报, 2018, 40(9): 1-14. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180158
    [6] 旻昱, 康宁, 索玉静, 田菊, 康向阳.  毛白杨杂种三倍体的2n雌配子形成途径鉴定 . 北京林业大学学报, 2017, 39(5): 17-24. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170001
    [7] 康向阳.  新一轮毛白杨遗传改良策略的思考和实践 . 北京林业大学学报, 2016, 38(7): 1-8. doi: 10.13332/j.1000-1522.20160148
    [8] 康宁, 白凤莹, 张平冬, 康向阳.  高温诱导胚囊染色体加倍获得毛白杨杂种三倍体 . 北京林业大学学报, 2015, 37(2): 79-86. doi: 10.13332/j.cnki.jbfu.2015.02.021
    [9] 白凤莹, 曾青青, 康宁, 索玉静, 廖婷, 张平冬, 康向阳.  毛白杨基因库优树倍性检测及性状对比分析 . 北京林业大学学报, 2015, 37(4): 113-119. doi: DOI:10.13332/j.1000-1522.20140247
    [10] 于来, 安新民, 曹冠琳, 陈仲, 张志毅.  PtAP3不育结构转化毛白杨的研究 . 北京林业大学学报, 2010, 32(5): 15-20.
    [11] 李金克, 陈华君, 陈少良.  GC--MS内标法定量分析植物组织中的JA、 IAA和ABA . 北京林业大学学报, 2010, 32(5): 143-148.
    [12] 董雯怡, 聂立水, 李吉跃, 沈应柏, 张志毅, .  应用15N示踪研究毛白杨苗木对不同形态氮素的吸收及分配 . 北京林业大学学报, 2009, 31(4): 97-101.
    [13] 杨伯钢, 冯仲科, 张保钢, 韩光瞬, 全明玉, .  北京市朝阳区温榆河畔毛白杨胸径的生长模型研究 . 北京林业大学学报, 2008, 30(增刊1): 202-207.
    [14] 刘美芹, 贺窑青, 李在留, 张玲, 李艳华, 程堂仁, 孙青, 王丰俊, 曲红, 雷庆哲, 胡晓丹, 李莉, 金莹, 欧阳杰, 姚娜, 范丙友, 熊丹, 石娟, 乔海莉, 刘丽, 陈佳, 王莉, 周章义, 隋金玲, 孙月琴, 郝晨, 胡海英, 段旭良, 武彦文, 李云, 李凤兰, 陈晓阳, 阎伟, 冯秀兰, 陆海, 郑彩霞, 续九如, 尹伟伦, 尹伟伦, 张艳霞, 田呈明, 陈发菊, 王建中, 张志毅, 康向阳, 沈昕, 骆有庆, 周燕, 赵亚美, 孙爱东, 骆有庆, 张香, 冯菁, 张德权, 路端正, 郭锐, 孙爱东, 骆有庆, 沈繁宜, 阎晓磊, 王百田, 李忠秋, 梁华军, 史玲玲, 郝俊, 梁宏伟, 马钦彦, 王晓东, 卢存福, 安新民, 姜金仲, 胡德夫, 赵蕾, 武海卫, 高述民, 骆有庆, 蒋湘宁, 胡晓丹, 王华芳, 郑永唐, 吴晓成, 张志翔, 崔彬彬
    , 王晓楠, 刘玉军, 尹伟伦, 谢磊, 冯仲科, 严晓素, 高荣孚, 李凯, 郭晓萍, 冯晓峰, 温秀凤3, 于京民2, 吴坚, 赵兵, 王瑛, 王冬梅, 王玉兵, 邹坤, 骈瑞琪, 王华芳, 王建中, 李凤兰, 王民中, 丁霞, 陶凤杰, 张兴杰, 孙建华, 张庆, 刘玉军, 陈卫平, 杨伟光, 王玉春, 李镇宇, 刘艳, 林善枝, 呼晓姝, 沈应柏, 赵新丽, 付瑞海, 马建海, 蒋平, 汪植.  毛白杨叶片离体再生培养的基因型效应 . 北京林业大学学报, 2007, 29(5): 38-43.
    [15] 杨平, 高黎, 李瑞, 王芳, 黄荣凤, 郑小贤, 白岗栓, 胡胜华, 毛俊娟, 何亚平, 周永学, 张莉俊, 颜绍馗, 胡万良, 殷亚方, 袁怀文, 魏潇潇, 张璧光, 秦爱光, 王费新, 吴彩燕, 刘杏娥, 邓小文, 张洪江, 王兆印, 杜社妮, 张岩, 崔赛华, 王正, 王晓欢, 王胜华, 常旭, NagaoHirofumi, 李猛, 费世民, 刘燕, 赵天忠, 樊军锋, 王小青, 谭学仁, 张克斌, 罗晓芳, 戴思兰, 汪思龙, 孙向阳, 乔建平, 李昀, 张占雄, KatoHideo, 江泽慧, 徐嘉, 张旭, 陈放, 韩士杰, , 王海燕, 刘云芳, 江玉林, 高荣孚, 范冰, 龚月桦, 张双保, 孔祥文, 李华, 杨培华, 常亮, 李媛良, 陈秀明, 丁磊, 侯喜录, 陈宗伟, , 刘秀英, 任海青, 郭树花, IdoHirofumi, 李晓峰, 薛岩, , 徐庆祥, 高建社, 费本华, 李考学, , 蒋俊明, 张代贵, 陈学平, 张桂兰, 刘永红, 王晓东, 涂代伦, 续九如, 李雪峰, , 金鑫, , 张红丽, , 丁国权, .  毛白杨巯基蛋白酶抑制剂基因cDNA的克隆及序列分析 . 北京林业大学学报, 2007, 29(6): 23-28.
    [16] 颜容, 范丙友, 谭伟, 肖生春, 徐双民, 张宇清, 孙晓梅, 杨振德, 王玉杰, 南海龙, 高峻, 时尽书, 陈文汇, 张冰玉, 吕建雄, 金小娟, 翟明普, 李绍才, 朱教君, 潘存德, 窦军霞, 李发东, 胡晓丽, 李世东, 韩海荣, 三乃, 刘红霞, 朱清科, 田小青, 康宏樟, 师瑞峰, 肖洪浪, 孙海龙, 王云琦, 张守攻, 张一平, 胡诗宇, 周春江, 李建章, 刘俊昌, 冯仲科, 苏晓华, 孟平, 骆秀琴, 谢益民, 宋献方, 张雁, 杨志荣, 吴斌, 陆海, 赵博光, 姜伟, 赵双菊, 马钦彦, 蔡怀, 周文瑞, 蒋佳荔, 李智辉, 齐实, 李义良, 刘昌明, 王笑山, 齐实, 岳良松, 蒋湘宁, 于静洁, 葛颂, 张永安, 姚山, 蒲俊文, 张岩, 张德荣, 朱金兆, 伊力塔, 赵有科, 宋清海, 何磊, 张劲松, 齐力旺, 褚建民, 杨聪, 马超德, 曲良建, 石丽萍, 康峰峰, 崔保山, 吴庆利, 刘元, 吕守芳, 朱林峰, 刘鑫宇, 刘相超, 王建华, 王玉珠, 田颖川, 胡堃, 唐常源.  三倍体毛白杨无性系的AFLP分子标记鉴定 . 北京林业大学学报, 2006, 28(2): 9-14.
    [17] 刘常富, 王玉涛, 齐春辉, 邹大林, 张求慧, 张灿, 王云琦, 李贤军, 李吉跃, 吴斌, 谭炳香, 段爱国, 冯夏莲, 
    ZHAOGuang-jie, 李雪萍, 赵燕东, 李雪峰, 温俊宝, 常德龙, 鲁绍伟, 郑凌凌, 徐文铎, 刘金福, 匡文慧, 程占红, 王玉杰, 温俊宝, 张建国, 白陈祥, 张树文, 何正权, 赵广杰, 李增元, 洪伟, 余新晓, 何友均, 韩士杰, 李吉跃, 翟洪波, LUOWen-sheng, 宋湛谦, 朱天辉, 韩烈保, 吴庆利, 何承忠, 何兴元, 张路平, 吴斌, 骆有庆, 梁小红, 姜伟, 刘凤芹, 郭忠玲, 陈尔学, 骆有庆, 李俊清, 林秦文, 匡秋明, ]魏晓霞, FurunoTakeshi, 张志毅, ]陈玮, 黄文豪, 何静, 张养贞, 童书振, 陈发菊, 许志春, 胡伟华, 张璧光, 庞勇, 曾会明, 赵桂玲, 梁宏伟, 郑兴波, 崔国发, RENQian, 许志春, 张军, 安新民, 张振明, 李颖, PaulWolfgang, 杨凯, 侯伟, 雷渊才, 郑杰, 李福海, 赵广亮, 曹川健, 刘君, 李凤兰, 宋国正, 张有慧, 姚永刚, 董建生, 张全来, 李考学, 田桂芳, 李永波, 赫万成, 李长明, 张世玺.  毛白杨幼林间作效应研究 . 北京林业大学学报, 2006, 28(3): 81-85.
    [18] 程占红, 冯夏莲, 齐春辉, 张灿, 段爱国, 谭炳香, 匡文慧, 李贤军, 张求慧, 李雪峰, 吴斌, 王玉涛, 王云琦, 赵燕东, 
    ZHAOGuang-jie, 刘金福, 李吉跃, 刘常富, 邹大林, 常德龙, 郑凌凌, 鲁绍伟, 温俊宝, 徐文铎, 李雪萍, 白陈祥, 吴斌, 李增元, 李吉跃, 洪伟, 吴庆利, 韩烈保, 何兴元, 翟洪波, 赵广杰, 温俊宝, 何正权, 何友均, 王玉杰, 宋湛谦, 张树文, 余新晓, 何承忠, 韩士杰, 朱天辉, 张路平, 张建国, LUOWen-sheng, 刘凤芹, 李俊清, 骆有庆, 陈发菊, 骆有庆, 何静, 黄文豪, 匡秋明, 张养贞, 陈尔学, 张志毅, 姜伟, 郭忠玲, ]陈玮, FurunoTakeshi, 林秦文, ]魏晓霞, 童书振, 梁小红, 安新民, 庞勇, 张振明, 梁宏伟, 李颖, 许志春, 张军, 胡伟华, 崔国发, 张璧光, 郑兴波, 许志春, RENQian, 赵桂玲, 曾会明, PaulWolfgang, 刘君, 宋国正, 雷渊才, 曹川健, 侯伟, 李福海, 杨凯, 郑杰, 李凤兰, 赵广亮, 姚永刚, 董建生, 张全来, 张有慧, 李考学, 田桂芳, 李永波, 赫万成, 李长明, 张世玺.  毛白杨ISSR反应体系的建立及优化 . 北京林业大学学报, 2006, 28(3): 61-65.
    [19] 殷亚方, 张一平, 符韵林, 侯亚南, 宋小双, 马文辉, 杜华强, 龙玲, 饶良懿, 刘震, 黄国胜, 李景文, 
    王保平, 李全发, 王明枝, 杨晓晖, 张秋英, 李慧, 李景文, 熊瑾, 李梅, 杨海龙, 詹亚光, 李俊清, 张克斌, 韩海荣, 李吉跃, 范文义, 朱金兆, 朱金兆, 耿晓东, 赵敏, 徐峰, 梁机, 王洁瑛, 王雪军, 吕建雄, 窦军霞, 秦瑶, 刘文耀, 李发东, 李俊清, 李妮亚, 陆熙娴, 陈晓阳, 尹立辉, 秦素玲, 陈素文, 赵宪文, 倪春, 李凤兰, 孙玉军, 刘雪梅, 陈晓阳, 李云, 唐黎明, 毕华兴, 于贵瑞, 欧国强, 乔杰, 沈有信, 刘桂丰, 齐实, 康峰峰, 李黎, 慈龙骏, 赵双菊, 李伟, 魏建祥, 宋献方, 王玉成, 文瑞钧, 马钦彦, 张桂芹, 李伟, 韦广绥, 任海青, 王雪, 黎昌琼, 刘伦辉, 蒋建平, 朱国平, 张万军, 丁霞, 周海江, 杨谦, , 孙涛, 宋清海, 李慧, 孙晓敏, 刘莹, 孙志强, 李宗然, 
    , .  毛白杨转rolB基因植株生根能力的研究 . 北京林业大学学报, 2005, 27(5): 54-58.
    [20] 谢力生, 程广有, 李红, 李利平, 赵东, 贺康宁, 王跃思, 周存宇, 高莉萍, 孙仁山, 王继强, 吕建雄, 包仁艳, 李吉跃, 包满珠, 孙扬, 邢韶华, 向仕龙, 殷亚方, 姜春宁, 李文彬, 李世荣, 于志明, 高峰, 高林, 周国逸, 赵有科, 王迎红, 郑彩霞, 史常青, 田勇臣, 刘娟娟, 孙磊, 曹全军, 赵勃, 葛春华, 孙艳玲, 丁坤善, 唐晓杰, 张德强, 姜笑梅, 周心澄, 王清春, 华丽, 高亦珂, 刘世忠, 崔国发, 张启翔, .  植物外源激素对大花蕙兰体胚发生影响的研究 . 北京林业大学学报, 2005, 27(4): 65-68.
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-01-18
  • 修回日期:  2019-03-08
  • 网络出版日期:  2019-07-05
  • 刊出日期:  2019-08-01

UPLC-MS/MS测定植物组织中植物激素的含量

doi: 10.13332/j.1000-1522.20190052
    基金项目:  国家自然科学基金面上项目(31870650)
    作者简介:

    邓文红,博士,高级实验师。主要研究方向:色质谱分析。Email:dengwh@bjfu.edu.cn 地址:100083 北京市海淀区清华东路35号北京林业大学分析测试中心

  • 中图分类号: S718.43; S792.11; Q503

摘要: 目的植物激素在植物生长发育和响应生物和非生物胁迫过程中起着非常重要的作用,研究植物激素的合成、运输、代谢和分子作用机理,需要对植物激素进行定量分析。针对植物激素在大多数植物组织中的含量很低,性质不稳定,与其共存的次生代谢产物背景干扰严重,此外有些植物材料非常珍稀,材料量少的问题,以毛白杨叶片为材料,建立了超高效液相色谱−串联质谱(UPLC-MS/MS)同时测定植物组织中吲哚乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)、赤霉素(GA3)、茉莉酸(JA)和水杨酸(SA)的新方法,为植物激素的研究提供技术支撑。方法在用异丙醇、水和盐酸(2∶1∶0.002,vvv)混合液4 ℃提取激素时,定量加入IAA、ABA、GA3、JA和SA内标(2H5-IAA、2H6-ABA、2H-JA和2H5-SA各10 ng,2H2-GA3 20 ng),激素提取液经二氯甲烷萃取后,UPLC-MS/MS定量测定。乙腈−0.1%乙酸水溶液为流动相,梯度洗脱,流速 0.8 mL/min,柱温30 ℃,C18色谱柱分离,多反应监测(MRM)、电喷雾电离源(ESI)负离子模式下进行分析,内标曲线法定量。结果5种植物激素在5 min内实现完全分离,检出限为0.01 ~ 0.05 pg/g,定量限为0.05 ~ 0.15 pg/g。在实验所采用的浓度范围内线性相关系数r在0.999 4 ~ 0.999 9之间,精密度和重现性均较好,峰面积的相对标准偏差为1.1% ~ 3.9%。经检测毛白杨叶片中IAA、ABA、GA3、JA、SA的含量分别为(74.38 ± 4.62)ng/g、(193.80 ± 6.04)ng/g、(674.67 ± 18.08)ng/g、(286.62 ± 7.48)ng/g、(746.02 ± 13.93)ng/g。结论本法操作简单,灵敏度高,分析时间短,适用于多种植物激素的测定。

English Abstract

邓文红, 赵欣蕊, 张俊琦, 郭惠红. UPLC-MS/MS测定植物组织中植物激素的含量[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(8): 154-160. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190052
引用本文: 邓文红, 赵欣蕊, 张俊琦, 郭惠红. UPLC-MS/MS测定植物组织中植物激素的含量[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(8): 154-160. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190052
Deng Wenhong, Zhao Xinrui, Zhang Junqi, Guo Huihong. Determination of plant hormones in plant tissues by UPLC-MS/MS[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(8): 154-160. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190052
Citation: Deng Wenhong, Zhao Xinrui, Zhang Junqi, Guo Huihong. Determination of plant hormones in plant tissues by UPLC-MS/MS[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(8): 154-160. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190052
  • 植物激素是植物体产生的、极其微量并对植物生长发育起至关重要作用的信号分子[1],吲哚乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)、赤霉素(GA3)、茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)是5种重要的植物激素[2]。IAA、ABA、GA3参与了植物从种子休眠、萌发、营养生长到生殖生长,以及成熟和衰老的整个生命过程[3],JA、SA是2种主要的胁迫激素,受到生物和非生物胁迫的调控,在植物的胁迫耐受性和抗性中发挥着重要作用[4]。植物细胞的生理活动由多种激素共同参与,存在着错综复杂的交互作用[5],植物激素几乎调控着植物生长发育及环境适应的方方面面[6]。而且在大多数组织中的含量很低,通常在10− 6 ~ 10− 9 g之间,性质不稳定[7],与其共存的成分非常复杂,容易受到干扰[8]。同时有些植物材料非常珍贵,材料量少,因此要求检测的方法必须简便、快速、灵敏、专一。

    目前,植物激素的测定主要采用色谱/质谱联用技术[9]。气相色谱(GC)/质谱(MS)联用在灵敏度问题上能满足植物激素的测定要求,但样品需要纯化、浓缩和衍生化处理,增加了样品前处理步骤[10]。超高效液相色谱(UPLC)/质谱(MS)联用具有高灵敏度和高选择性的特点[11],能够满足植物粗提液中植物激素的定量测定,大大简化了样品前处理过程,成为植物激素定量分析领域广泛被接受的技术手段[12]

    本文旨在研究内标法同时测定植物粗提液中IAA、ABA、GA3、JA和SA的方法。即在提取植物激素的同时,定量加入5种植物激素内标,根据内标曲线对植物组织中的植物激素进行准确的定性和定量测定。

    • 毛白杨(Populus tomentosa)盆栽苗木叶片,样品采集后立即置于液氮罐中,− 80 ℃低温冰箱储藏备用。

    • Agilent 1260超高效液相色谱串联AB Qtrap 5500质谱仪,Thermo 481恒温制冷摇床(美国),Beckman Avanti J-26 XP高速离心机(美国),Organomation氮吹仪(美国)。

    • 盐酸、异丙醇、二氯甲烷为分析纯(北京化工厂),实验用水为美国Milli-Q plus超纯水机生产的超纯水,乙腈、甲醇、乙酸为色谱纯(美国Fisher公司),IAA、ABA、GA3、JA、SA标准品购自Sigma公司,2H5-IAA、2H6-ABA、2H2-GA3、2H-JA、2H5-SA标准品购自OlChemim公司。

    • 分别准确称取IAA、ABA、GA3、JA、SA、2H5-IAA、2H6-ABA、2H2-GA3、2H-JA、2H5-SA标准品5 mg于10 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,配制成0.5 mg/mL的储备液,− 20 ℃冰箱中保存,用时稀释成一系列质量浓度的标准溶液。

    • 将毛白杨叶片在液氮条件下低温研磨至粉末,准确称取50 mg,加入0.5 mL异丙醇∶水∶盐酸(2∶1∶0.002,vvv)溶液,同时加入2H5-IAA、2H6-ABA、2H-JA、2H5-SA各10 ng,2H2-GA3 20 ng,摇匀,在4 ℃摇床上100 r/min摇动30 min,然后加入1 mL二氯甲烷,继续摇动30 min,13 000 g离心5 min,取下层溶液,氮吹仪吹干,加入0.1 mL甲醇溶液溶解样品,13 000 g离心5 min[13],取上层清液进行UPLC-MS/MS分析。

    • 色谱条件为Agilent SB-C18色谱柱(4.6 mm × 50 mm,1.8 μm),流动相为乙腈−0.1%乙酸水。梯度洗脱:0 ~ 0.5 min,10%乙腈;0.5 ~ 5 min,10% ~ 95%乙腈;5 ~ 5.1 min,95% ~ 10% 乙腈;5.1 ~ 8.0 min,10%乙腈。流速为0.8 mL/min,柱温30 ℃,进样量10 μL。

      质谱条件为 电喷雾离子源(ESI),负离子扫描,检测方式为多反应监测(MRM),气帘气压力为30 psi,离子化电压为− 4 500 V,离子源温度600 ℃,喷雾气压力为40 psi,辅助气压力为50 psi,数据处理用Analyst软件进行分析。

    • 分别精确吸取一定量的植物激素标准储备液,用甲醇稀释成0、1、10、100、500 ng/mL的标准溶液,在5个浓度的标准溶液中分别加入等量的相应内标标准溶液,使其内标的浓度为10 ng/mL,按上述色质谱条件依次分析各标准溶液,测得植物激素标准品的峰面积为Ai,内标的峰面积为As,以浓度为横坐标,Ai/As为纵坐标作图,绘制标准曲线,用来计算各植物激素的回归方程。用10 ng/mL的标准品溶液连续进样5次,考察方法的精密度,以3倍的信噪比计算方法的检出限,10倍的信噪比计算方法的定量限。

    • 根据植物激素的特征离子对及标准品的保留时间进行定性,内标曲线法定量,每个样品重复3次,实验数据用Excel软件进行分析。

    • 当甲醇作流动相时,离子化程度受到抑制,峰强度明显降低,导致灵敏度下降,而乙腈的离子化效率明显优于甲醇,因此采用乙腈作为流动相。在流动相中加入乙酸能增加酸性植物激素在ESI模式下的离子化效率。分别配制0.05%、0.1%、0.2%的乙酸水溶液作为流动相,实验表明0.1%乙酸水溶液能提供最佳离子化条件,峰面积信号最强,灵敏度最高。

    • IAA、ABA、GA3、JA、SA分子中均含有羧基,在离子源中易产生[M-H]离子,因此采用负离子模式,通过对植物激素标准品进行二级质谱扫描,得到特征离子谱图(图1)。

      图  1  电喷雾电离模式下植物激素质谱图

      Figure 1.  Mass spectra of plant hormones under electrospray ionization mode

    • 图1中选择强度最强的子离子,与母离子组成定量离子对。分别取10 ng/mL的各植物激素标准溶液,以流动注射方式进行ESI源质谱分析,对质谱条件进行充分优化,确定其最佳碰撞能量、碎裂电压(表1),使定量离子对的响应强度达到最大,从而获得最佳的检测灵敏度。

      表 1  优化的质谱分析参数

      Table 1.  Optimized MS/MS parameters for quantitative analysis

      植物激素
      Plant hormone
      保留时间
      Retention time/min
      母离子
      Precursor ion
      子离子
      Product ion
      碰撞能量
      Collision energy/eV
      碎裂电压
      Fragmentor voltag/eV
      2H5-IAA 4.10 179.0 135.0 − 15 − 8
      IAA 4.12 174.0 130.0 − 14.2 − 13
      2H6-ABA 4.31 269.1 159.1 − 15 − 15
      ABA 4.32 263.2 153.0 − 17 − 14
      2H2-GA3 3.62 347.2 143.0 − 18 − 11
      GA3 3.63 345.2 143.1 − 33 − 10
      2H-JA 4.81 211.0 59.1 − 17 − 28
      JA 4.55 209.1 59.1 − 17 − 7
      2H5-SA 3.81 142.0 98.0 − 22 − 8
      SA 3.82 137.0 93.1 − 22 − 8
    • 表2中可以看出,线性回归方程的相关系数r为0.999 4 ~ 0.999 9。检出限范围为0.01 ~ 0.05 pg/g,定量限范围为0.05 ~ 0.15 pg/g。5种植物激素峰面积精密度为1.1% ~ 3.9%。可见各植物激素线性关系良好,检出限均低于0.05 pg/g,说明该方法对植物激素有很高的检测灵敏度。

      表 2  植物激素的线性范围、线性方程、相关系数、精密度、检出限和定量限

      Table 2.  Linear range, linear equation, correlation coefficient, precisions, limits of detection (LODs), limits of quantitation (LOQs) of five plant hormones

      植物激素
      Plant hormone
      线性范围
      Linear range/(ng·mL− 1)
      线性方程
      Linear equation
      相关系数
      Correlation coefficient (r)
      精密度
      Precision/%
      检出限
      LOD/(pg·g− 1)
      定量限
      LOQ/(pg·g− 1)
      IAA 0 ~ 500 y = 0.067 9x − 0.136 6 0.999 8 3.9 0.04 0.13
      ABA 0 ~ 500 y = 0.037 0x + 0.089 7 0.999 7 1.3 0.02 0.07
      GA3 0 ~ 500 y = 0.067 2x + 0.193 3 0.999 5 2.5 0.05 0.15
      JA 0 ~ 500 y = 0.011 4x + 0.025 7 0.999 9 1.1 0.01 0.05
      SA 0 ~ 500 y = 0.035 8x − 0.057 8 0.999 4 3.5 0.04 0.13
    • 按照本文所建立的分析方法,对毛白杨叶片中的5种植物激素进行了检测(图2),根据测得的植物激素的峰面积与加入的内标峰面积的比值,在相应的内标曲线上查得其浓度,按下式计算其含量。

      图  2  毛白杨叶片MRM色谱图

      Figure 2.  MRM chromatogram of Populus tomentosa leaves

      $$ {\text{植物激素的含量}} = \frac{{CV}}{W} $$

      式中:C为实验中测得的样品植物激素的峰面积与加入的内标峰面积的比值,从相应的内标曲线上查得的植物激素的浓度(ng/mL);V为样品的定容体积(mL);W为样品鲜质量(g)。经计算得到毛白杨叶片中5种植物激素的含量,见表3

      表 3  毛白杨叶片中5种植物激素的含量

      Table 3.  Contents of five plant hormones in Populus tomentosa leaves ng.g− 1

      IAA ABA GA3 JA SA
      74.38 ± 4.62 193.80 ± 6.04 674.67 ± 18.08 286.62 ± 7.48 746.02 ± 13.93
    • 本文建立了超高效液相色谱−串联质谱法同时测定毛白杨叶片中植物激素的分析方法。该方法具有简便、灵敏、选择性好、分析时间短、准确度和精密度高等优点,完全适用于多种植物中植物激素的检测。

      (1)此法取样量很少,只需要50 mg左右的鲜质量,能满足植物样品某一特定部位或微小器官中植物激素的测定,可以用来研究植物生理过程或来源稀少而珍贵的植物。

      (2)此法前处理简单,样品只需要浸提0.5 h,二氯甲烷萃取后直接进样分析,减少了操作步骤,缩短了操作时间,使前处理过程在1 h内完成,从而减少了样品的损失,同时又能得到良好的分离结果,是理想的前处理过程。

      (3)内标法定量,所测植物激素与其内标的结构式非常相近,只是有几个1H被2H取代(茉莉酸内标为二氢茉莉酸,其分子中比茉莉酸多2个1H),因此同位素内标与对应的植物激素几乎有着完全相同的物理化学性质,在整个分析过程中,内源与内标均同步进行,两者同时进入色谱柱,几乎有相同的保留时间,利用MRM工作模式检测植物提取物中植物激素与同位素内标比率的变化来进行定量测定,从而校正了样品在提取和测定过程中带来的损失和误差,使测定结果更能反映植物样品中的实际情况[14]

      (4)采用UPLC-MS/MS对植物激素进行分析,它结合了色谱对复杂样品的高分离能力和质谱的高选择性、高灵敏度的特点,大幅提高了检测灵敏度,极大地降低了检测过程中产生假阳性的几率,保证了定性和定量结果的可靠性[15]。同时又避免了GC-MS分析中需将待测植物激素制备成易挥发的衍生物的过程[16],UPLC-MS/MS测定植物激素是近年来发展起来的一种新方法。

参考文献 (16)

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